（作物遗传育种专业论文）拟南芥NPR1和水稻Chi11基因导入小麦的研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论拟南芥n p r l 和水稻c h i l l 基因导入小麦 学位 硕士 文题目的研究 级别 学生 郑磊 学科导师 姓名专业 作物遗传育种牛吉山 姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人呈交的论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加 以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获 得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。 与我- - n r _ 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢 意。 研究生签名：乒f 彳凡师签名才苕吻莎叼 日期：列年月。3 日 日期：掰年石月移日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学 所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：趼私 导师签名：才季力 学院领导签名： 日期：硼年易月7 i 日日期：脾莎月多日 日期：年月日 致谢 本论文是在导师牛吉山副研究员的全面指导下完成的，从论文的选题、试验 方案的设计、实施到论文的完成，都倾注了导师大量的心血和汗水。三年来，导 师严肃认真、严谨求实的科研态度、渊博的专业知识，忘我的工作精神，宽厚正 直的做人准则是我永远学习的榜样。这三年，我的科研能力有了很大进步，生活 态度和人生观方面有了很大的改变。恩师对我的生活、学习和科研都非常关心， 使我终生难忘、永远受益。在此，我衷心地感谢导师对我的关心和指导! 实验的完成得到了国家小麦中心及河南农业大学遗传育种教研室在仪器上 的支持，在此表示感谢! 感谢师兄洪德峰、梁清志，师姐刘瑞、王映红在实验技术上的指导，同窗王 保勤，师妹常阳、倪永静在实验中的帮助。感谢实习生张坤、刘春红、荆留萍、 程洁、刘迪、唐俊闯在试验中所做的工作! 感谢沈向磊、郅胜军、李伟、程俊跃 及其他关心我的朋友们在我学习、生活上的帮助。是老师和同学们的帮助，才使 我的论文得以顺利完成。 感谢陈军营副教授和郑永战副研究员在百忙中对论文的审阅及提出的宝贵 修改意见。 最后感谢我的父母和亲人在学习、生活上对我的帮助和照顾，是他们无私的 支持，才使我顺利地完成了学业。在此，我向他们表示深深的感谢! 郑磊 2 0 0 8 年6 月于郑州 河南农业大学硕士毕业论文 摘要 小麦是重要的粮食作物。白粉病是小麦的重要病害，严重影响产量和品质。随着抗病分 子生物学的发展。利用外源植物的抗病相关基因来提高小麦抗病性，已成为一种有效的抗病 改良新途径。在植物的抗病中，抗病基因和防卫反应基因是两类重要的基因。几丁质酶基因 是植物中的一类防卫基因，它们参与植物对多种真菌病原菌的抗性反应。c h i l l 是水稻的一 个几丁质酶基因。拟南芥n p r i 基因是植物产生系统获得性抗的关键调节基因，参与对白粉 病的抗性反应。本研究利用现代基因工程技术，将n p r l 和c h i l l 基因转入高产、但感白粉 病的小麦新品种“周麦1 8 ”，获得了转基因植株。通过研究获得以下结果： 1 通过酶切切除p a h c 2 5 表达载体上的g u $ 基因，将拟南芥n p r l 全长基因插入到 p a h c 2 5 表达载体的u b i 启动子下游，构建成p a h - n p r l 植物表达载体，保存于大肠杆菌 d h 5 a 中 2 利用花粉管通道法，将表达载体p a h - n p r l 导入小麦新品种“周麦1 8 ”。通过对t o 代 植株的p p t 抗性筛选及p c r 鉴定，获得了2 5 个转基因植株。 3 利用花粉管通道法，将水稻几丁质酶基因c h i l l 表达载体导入小麦新品种“周麦1 8 ”， 获得了t 0 代种子。通过对t o 代植株的p p t 抗性筛选及p c r 鉴定，获得了5 9 株转基因植株。 对t 1 和t 2 代种子连续检测，得到纯合的转基因株系1 个。通过离体叶段培养法和大田白粉 病抗性鉴定，转基因植株的自粉病抗性得到了提高。转基因株系在农艺性状上与受体没有显 著差异。 关键词：小麦；白粉病；n p r l 几丁质酶；基因；表达载体；花粉管通道；转基因 拟南芥船融和水稻c h i l l 基因导入小麦的研究 第一章文献综述 l 植物转基因研究现状 植物基因的遗传转化是指将外源d n a 通过载体媒体或其他物理化学方法导入植物细胞 并得到整合和表达的过程，实现这一转化的途径称为转化系统。目前已经建立了十多种基因 转化方法，按转化系统的原理进行分类，可以分为三大转化系统类型：( 1 ) 以质粒d n a 为 载体的转化系统，如农杆菌法；( 2 ) 通过物理化学方法直接将外源d n a 导入受体细胞的直 接转化系统，如基因枪法、p e g 法、电击法等；( 3 ) 以植物自身的生殖系统细胞，如花粉 管或其他细胞等为媒体的转化系统，如花粉管通道法等。 自1 9 8 3 年人类首次获得转基因烟草【1 】以来，植物基因工程技术在世界范围内取得了飞 速的发展，转基因植物的研究与开发取得了一系列令人瞩目的发展国际上已成功地把具有 实用价值的目的基因如抗虫基因( b t 毒蛋白、豌豆胰蛋白抑制剂c 1 r n 、外源凝集素l e c 和 昆虫毒素等) 、抗病毒基因( 病毒外壳蛋白c p 、病毒移动蛋白m p 、病毒卫星r n a 、病毒反 义r n a 等) 、抗真菌病害的基因( 几丁质酶、b - 1 ，3 葡聚糖酶、核糖体失活蛋白r i p 、抗 真菌蛋白等) 、抗细菌病害基因( 杀菌肽、溶菌酶、番茄的p t o 基因等) 、抗除草剂( 降解 b a s r a 、b i o l a p h o s 等含草丁磷乙酰c o a 转移酶、降解2 ，4 d 的t f a a 、水解溴苯腈的b x n 基因 等) 、改良品质的基因( 编码高必需氨基酸含量蛋白质的基因h e a a e - 7 、种子储存蛋白基因 等) 、雄性不育( b a r n a s e 、r n a s et 等) 、抗干旱和盐碱等环境胁迫的基因( 脯氨酸合成酶、 甜菜碱合成酶、调渗蛋白、抗冻蛋白、苯丙氨酸裂解酶p a l 和苯基乙烯酮合成酶等) 等基 因分别转入了多种植物，并获得了转基因植株，如水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、番茄等， 并且有的已经进行田间试验，甚至商业生产阶段。 迄今为止，利用基因工程向小麦中导入的目标基因主要有：( 1 ) 抗虫基因：胰蛋白酶 抑制基因( b t i c m e ) 【2 】、慈姑胰蛋白酶抑制剂基因a p h a p i b 1 3 】、豌豆胰蛋白酶抑制剂 ( c p t d 基因【4 】；( 2 ) 抗病基因：病毒外壳蛋白基因【5 】，芪合酶( v s n 和v s t 2 ) 基因【6 】；( 3 ) 抗除草剂基因：b x n 基因m 、b a r 基因【8 】、e p s p s 基因【9 】；( 4 ) 抗逆及品质改良基因：甜菜醛 脱氢酶基因b a d h t l o l ，i d x 5 和i d x l 0 8 l ；( 5 ) 雄性不育基因：t a 2 9 b a m a s e 1 1 - 1 2 1 t a 2 9 - a n t i - a c t i n p 3 。如上基因的成功导入为小麦工程育种奠定了坚实的基础。 在转基因文献中，截止2 0 0 3 年，农杆菌介导法是转基因文献中最多的方法( 占5 7 ) ， 其次是基因枪法( 占2 5 ) 在禾本科作物转化中，2 0 实际9 0 年代，基因枪转化法是的主 要方法 1 4 1 第一例转基因小麦就是用基因枪法产生的【1 5 1 。1 9 9 5 年以后，禾本科作物的转化 通过农杆菌方法迅速增多【1 6 1 。农杆菌介导法之所以取得成功，是因为它在转入后常常是单 拷贝的，并且它能使不同的外源基因的整合到同源性并不高的部位。 1 7 2 0 。因此，近年来， 人们在致力于开发应用基因枪转化禾本科作物的同时也一直在探索农杆菌介导的转化技术， 2 河南农业大学硕士毕业论文 并取得了可喜的进展，从而又成为研究热点。 花粉管通道法以变异频率离，性状变异广泛，类型丰富，稳定快，一次导入片段多及低 成本等诸多优点受到人们的亲睐，随着分子水平证据的进一步明确和优良品系的推出，更是 确立了作为转基因技术地位。在小麦转化中，花粉管通道法尤其表现了其优越的特性，成为 国内普遍采用的转化技术。 现代生物技术飞速发展，迄今为止各种转基因方法已有十几种，它们各有特点分别使用 于不同植物受体。对单子叶植物来说，这些转化技术还不十分完善，需进一步改进。 2 植物转基因方法 目前转基因方法有很多种，它们各有特点。下面介绍几种最常见的转基因方法： 2 1 农杆菌介导法 2 1 1 转化机理 在现今多种植物基因遗传转化方法中，农杆菌豇质粒和质粒介导的遗传转化方法是 应用最早和最广泛的方法【2 1 1 。砸质粒是根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 的一种环 状质粒，斑质粒是发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 的一种质粒。根癌农杆菌和发根 农杆菌均是革兰氏阴性菌。在植物基因转化上应用最早和较多的是根癌农杆菌。t i 质粒 ( t u m o ri n d u c i n gp l a s m i d ) 质粒，包括两个主要区域：毒性区( v t r - r e g i o n ) 和t - d n a 区。 毒性区又称致瘤区域，长度约为3 5 妫，包含着6 个毒性遗传位点( v i r a 、v i r b 、v i r c 、v i r e 和v i x g ) 。v i r 基因的表达决定t - d n a 的加工和转移过程。t - d n a ( t - d n ar e g i o n ) 即转移 - d n a 区( t r a n s f c r - d n ar e g i o n ) ，其长度约为1 2 2 4k b 。它是面质粒上可以整合进植物基 因组中的d n a 片段它可以将携带的任何基因整合到植物基因组中，但这些基因本身与 t - d n a 的转移与整合无关，仅左右两端各2 5b p 的同向重复序列为其加工所必需。 植物细胞受伤后。细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的仓n 伤诱导分子，它们是一些酚类 化合物，如乙酰丁香酮( a c e t o s y r i n g o n e ，a s ) 和a - 羟基乙酰丁香酮( a - h y d r o x a c e t o s y r i n g o n e , o h a s ) 。根癌农杆菌对这类物质具有趋化性受这些创伤诱导分子的刺激，砸质粒血区 毒性基因被激活和表达v t ra 作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导，自身磷酸化 后进一步磷酸化激活v u g 蛋白；后者是一种d n a 转录活化因子，被激活后可特异性的结 合到其他v t r 基因启动子区上游的一个n qv i r 框( rb o x ) 的序列，启动这些基因的转录。 其中v l r d 基因产物对t - d n a 进行剪切，产生t - d n a 单链，然后以类似于细菌结合转移过 程的方式将t - d n a 与v i r d 2 组成的复合物转入植物细胞，在那里与许多v i r e 基因所表达的 v t r e 2 蛋白分子( d n a 结合蛋白) 相结合，形成t - 链复合物( t - c o m p l e x ) 。这一复合物在 v i r d 2 和v i r e 2 核定位信号( m l s ) 引导下，以r d 2 为先导被转运进细胞核，转入细胞核 3 拟南芥n p r l 和水稻c h i l l 基因导x , j , 麦的研究 的t - d n a 以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上，其中优先整合到转录活跃区，而 且在t - d n a 的同源区与d n a 的高度重复区t - d n a 的整合频率也较高，而整合进植物基因 组的t - d n a 会有一定程度的缺失、重复和超界等现象发生。 2 1 2 壤农杆菌对单子叶植物的转化 在正常情况下，土壤农杆菌只能感染双子叶植物，而对单子叶植物则很困难，最早获得 转化成功的单子叶植物是石刁柏。b y t e b i e r 等 2 2 1 ( 1 9 8 7 ) 用含有，拼懈基因的重组n 质 粒感染石刁柏愈伤组织，获得抗卡那霉素的再生植株，并获得了外源基因整合的分子证据。 此前曾有农杆菌转化单子叶的报道，但分子和遗传方面的证据不很充分。之后，在玉米l 、 小型冽、大麦嘲、甘蔗嘲等主要经济作物中均获得了农杆菌的转基因植株，并且有分子和 遗传方面的证据t e r a d a 等唧( 2 0 0 4 ) 建立了一个利用1 5 0 粒种子产生1 0 3 稳定转化的 高效转化水稻方案。h i e i 等【1 6 1 ( 1 9 9 4 ) 对转基因水稻的g u s 和h p t 两个基因的硒一代分 析均未发现有丢失现象，证明其遗传稳定。这些研究说明农杆菌转化水稻己取得了相当的成 功。但是，除了水稻，其他的单子叶作物利用农杆菌介导成功的例子只是零星的，并且仅限 于特定的品种类型渊有研究认为影响农杆菌对植物细胞的转化的几个因素包括：用于转 化的基因型和外植体，所用农杆菌菌株、双元载体、启动子和选择标记基因、侵染和共培养 状态、组织培养和再生培养基【2 9 】单子叶植物与双子叶植物的创伤反应不同，在单子叶植 物的伤口附近往往发生木质化或硬化，且没有明显的细胞分裂发生，因而大多数单子叶植物 不是农杆菌的天然宿主，需要进一步的研究以优化转化体系及条件来提高转化效果。 2 2 基因枪法 2 2 1 转化机理 基因枪转化法是美国康乃尔大学j c s a n f o r dp o 于1 9 8 7 年发明的，针对于不能利用农杆 菌介导的作物( 大多是谷物) 转基因而产生的。又称粒子轰击技术、生物发射技术或高速微 粒子发射技术，它是将载有外源d n a 的金粒或钨粒通过基因枪、氦气或电击等技术获得足 够的加速度，射入完整的植株、组织外柏体、愈伤组织或细胞悬液。它应用氯化钙沉淀技术 把带有目的基因的克隆载体d n a 包裹在直径仅为1g m 的钨粒或金粒的外表面，如此便形 成了所谓的微弹，然后将此微弹固定在基因枪筒内的塑料子弹的头部。同时把待试的目标植 物的组织或悬浮细胞安放在基因枪口正前方的样品室内这些塑料子弹通过基因枪、氦气或 电击等办法获得足够的加速度，向前发射，它撞到挡板时，它携带的微弹便会径直穿过挡板 的空隙以4 3 0m s 的高速度轰击细胞，处于发射通路上的植物细胞被杀死，但也有一定位置 4 河南农业大学硕士毕业论文 的细胞虽经轰击但未致死。枪筒和样品室必须是抽真空的，否则空气的阻力会使微弹的速度 减缓。植物细胞能够忍受2 分钟长的真空环境仍保持生命力，经过轰击之后，把细胞转移到 培养皿，并再生成转基因的植株。 该技术成功的关键在于能够从转化的细胞再生出可育的植株，即所用细胞系的再生能 力，因此建立单子叶植物的有效再生体系是最为重要的因素。 2 2 2 研究进展 近年来，基因枪法已广泛地用于将外源d n a 稳定地转化给单子叶及双子叶植物的各类 型细胞，并且对于水稻【3 1 1 、玉米【3 2 l 、小麦噼3 3 1 、大豆p q 、甘蔗【3 5 1 和高粱跚等多种重要的农 作物的细胞核基因组转化也都取得了成功。基因枪法仍作为小麦转化外源基因的一种主要方 法而广泛使用鲫，到目前为止获得小麦转基因植株的报道中，基因枪法占9 0 左右，其它 方法仅占1 0 ，包括农杆菌介导法、花粉管通道法、低能氩离子束介导法等【3 引。转化频率 为0 1 。5 7 ，但基因枪法目前的研究仅限于2 3 个模式材料。小麦基因枪法转化率 仍较低；由于当基因枪轰击后，各个品种d n a 的修复能力不同，受基因型的影响较大【3 7 】， 并且转化后从分子上看，常常是整合位点极其复杂【3 9 1 ，还不能满足基n t 程的要求。 2 3 花粉管通道法 2 3 1 转化机理 花粉管通道法( p o u c h - t u b ep a t h w a y ) 就是将供体生物总d n a 的片段，在受体白花受粉 后一定时期，使其能沿着花粉管的通道进入胚囊转化受精卵或其前后的细胞( 卵细胞、早期 胚细胞) 而自然发展成种子。王艳杰等人 4 0 l ( 2 0 0 6 ) 的认为，花粉管通道是花粉管在相关 组织中生长时，将周围组织的细胞挤压，从而使花粉管与相应组织的细胞之间形成的缝隙。 1 9 8 0 年，h e s s 等报道了利用花粉萌发时吸收外源d n a ，然后经由受精作用将外源d n a 导入矮牵牛受精卵中，得到具有外源d n a 表型的花色变异子代。中科院上海植物生理研究 所周光宇等结合我国远缘杂交成功的经验提出的d n a 片段杂交假设【4 1 1 的基础上，于1 9 8 3 年成功地将外源海岛棉d n a 导入陆地棉【4 2 】，培育出抗枯萎病的栽培品种，创立了花粉管通 道法。d n a 片段假说认为，从近代分子生物学水平看，虽然就整株而言，亲缘关系愈远的 生物问的染色体和染色体外d n a 的结构愈不亲和，很容易相互排斥，但从局部d n a 片段 来看，两种植物的部分基因间的结构却可能保持一定的亲和性。远缘花粉的基因组进入母体 后分解为许多片段，其中大部分片段被受体分解，仅有少数片段被保留下来，这些保留的 d n a 片段有可能被整合进入受体染色体，使子代中有些个体表现出某些变异。这种参与杂 交d n a 片段可能带有亲和远缘物种的结构基因，调控基因甚至是断裂的无意义d n a 片段， 后两种d n a 片段如果整合到母本基因组中，将同样可能影响母本基因表达而变异。 这一机理为同位素示踪方法所证实一中科院上海生化所与江苏省农科院经作所脚j 应 5 拟南芥n p r l 和水稻c h i l l 基因导入小麦的研究 用缺口翻译的啊标记棉花总d n a 于自花受粉2 4h 后从棉花子房顶部注入，分时取样，冷 冻切片，放射自显影后，发现3 h 标记d n a 注入子房3 0 r a i n 后部分胚囊内已有d n a 进入， 2 4h 后8 0 以上的胚囊均有d n a ，除从珠孔到胚囊间的花粉管通道外，珠心的任何其他 部位均无自显影斑点。进入胚囊的花粉管管内无同位素，即使有d n a 可以渗入，但和花粉 管通道比较也微不足道，说明d n a 不是进入花粉管后再进入胚囊，而是经过花粉管所经过 的通道进入胚囊的，花粉管的珠心通道是d n a 从珠孔到达胚囊的唯一途径。 p o t r y k u s l “ ( 1 9 9 0 ) 对受精过程的研究认为，在受体组织中，同时具备再生感受态和 转化感受态是转化成功的关键，当受精过程开始后，卵细胞发生急剧的脱分化过程，形成合 子后，彻底消除了以前的分化特性，变成核大、质浓和分裂活跃的细胞，具有再生和转化感 受态细胞的特性。亚显微结构的观察揭示在精子进入时，卵细胞的细胞壁还未形成，一些壁 物质分散地聚集在细胞膜的表面，似小岛状。这类卵细胞类似未完全酶解的原生质体，为外 源基因的进入提供可能。 赵炳然等 4 5 1 ( 1 9 9 8 ) 通过对几例外源总d n a 直接导入植物后的变异研究分析，提出 外源d n a 导入植物后，在种细胞中先与蛋白结合形成小“染色体”，同源结构单元经“拟联会 复合体”与受体基因组发生重组，而非同源性外源d n a 可能以“b 染色体”方式存在或被降 解，当供体中的d n a 片段( 结构单元) 在受体基因组中存在同族的基因或假基因结构域时， 二者才可能或有更多机会通过“杂交”发生置换。而进化慢的d n a 区域在供受体发生d n a 片段杂交的机会更多。因此，异染色质区d n a 尽管占很大比重，由于进化快，同源性小， 共受体间重组的几率就可能不如进化相对较慢的常染色体区功能基因的重组。从t l 代常具 有相对较高的变异频率( 1 0 2 。1 0 1 ) 和将牛胸腺d n a 不同年份同样的条件处理，同一受体 在性状变异上获得重演的实验结果，可以说明种细胞最终降解或重组外源d n a 不是完全随 机的，而是取决于外源d n a 与种细胞的同源性及蛋白酶的亲和能力。 曾君社等【拍l ( 1 9 9 9 ) 研究表明小麦受粉后相当长一段时间内( 4 8h ) ，大量花粉管及其 内含物仍然经过花柱等组织不断流向胚囊，在卵细胞受精后甚至合子分裂时都可看到后来的 花粉管内含物以及精子进胚囊或卵细胞。 邓德旺等踟( 2 0 0 0 ) 采用激光共聚焦显微镜技术也验证了花粉管通道技术的可行胜。 外源d n a 以高亲和力荧光探针( t o t o 3 ) 标记后导入授粉后的子房，通过l e i c a 共聚焦显 微镜观察到花粉管从花粉进入中轴胎座时，需要经过一个折向沿中轴的外周向上生长，在胚 珠着生处，再折向进珠孔，外源d n a 经过胎座上传输组织中的花粉管外缝隙，胎座表面珠 孔珠心通道进入胚囊，直接转化处于融合时期的无壁生殖细胞而不是受精卵，这个观察结果 与一般认为的受体细胞是卵细胞或极早期受精卵是有差别的 王艳杰等嗍( 2 0 0 6 ) 从细胞胚胎学出发，研究认为：外源d n a 进入胚囊的途径，即外源 d n a 沿着连接柱头与胚囊的花粉管外界面渗入胚囊：外源d n a 转化的受体应为合子；外 源d n a 转化的时期应限定在精卵融合至合子分裂前这一段时期，此时合子细胞壁尚未封阂； 6 河南农业大学硕士毕业论文 外源d n a 转化受体的机制可能是外源d n a 与处于原生质体状态的合子的随机融合。 上述研究工作均为花粉管通道法转化机理提供了相应的证据和理论假设，尽管观点不一， 但有一点是清楚的：花粉管通道途径导入外源d n a 选在受精过程或细胞分裂最旺盛的胚胎 发育早期，此时卵细胞和合子不具有细胞壁或细胞壁不完全，易于异源遗传物质进入，因此 导入易于成功；前人的大量实验已经充分地证明了外源d n a 从花粉管进入胚囊这一途径的 确定性；后代变异性状的出现虽然具有一定的偶然性、随机性，却是供体与受体基于d n a 分子局部亲和性而产生片段杂交的必然结果；外源d n a 导入和诱变是一种综合作用的结果。 总之，花粉管通道法同其他许多直接转化法一样，其外源基因的整合机理还不清楚，因此对 后代中出现的基因沉默及拷贝数量对表达水平的影响等问题还需要进一步的研究。 2 3 2 研究进展 花粉管通道法自创立以来，在小麦、水稻、棉花等多种农作物育种上取得了显著成绩， 因为该法是外源d n a 或单基因导入植物简便有效的途径，其成本尤其适合我国广大育种工 作者，因而，得以在国内迅速推广发展。 o h t a 4 a l ( 1 9 8 6 ) 报道应用外源d n a 与玉米花粉混和授粉得到当代高频率的基因转移 胚乳。1 9 8 8 年，l u o 等 4 9 1 人利用花粉管通道法以含有标记基因的质粒d n a 作为供体对一水 稻品种2 5 9 朵小花进行转化处理，得到5 4 粒种子，这些种子发芽后，对发芽6d 的根尖d n a 和生长8 周的叶片进行经s o u t h e r n 杂交和酶学鉴定，筛选出1 0 株为转化子，证实外源d n a 已整合到水稻基因组中，转化率达2 0 。1 9 9 3 年，曾君扯凹垮将带g u s 标记基因的质粒 p b l l 2 1 导入普通小麦，经过杂交初步筛选，再经s o u t h e r n 杂交鉴定，确定获得了转基因植 株，同时用荧光法和x - g l u 染色法检测，证实这些植株中有g u s 基因的表达产物b 葡聚糖 苷酶存在，证明g u s 基因己整合到小麦植株中，并在植株中表达。他们对小麦转基因植株 后代连续4 代遗传表现的观察，证明转入的外源基因可以稳定遗传，转化率为4 7 ，其遗 传规律与其它转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法等的结果相似。郭三堆等 s a 】( 1 9 9 9 ) 采用花粉管通道法将含有g f m c r y l a 杀虫基因和经过修饰的c p 玎基因的高效双价杀虫基因 表达载体g b l l 2 1 s 4 a b c 转入到中棉所1 9 号、石远3 2 1 、3 5 1 7 和5 4 1 中国棉花主产品种中， 首次获得了双价转基因抗虫棉株系，叶片室内抗虫生物学鉴定表明，抗性好的株系棉铃虫幼 虫死亡率为9 0 ，经分子检测，证实了双价杀虫基因棉花基因组的整合与表达。侯文胜等【5 2 】 ( 2 0 0 3 ) 利用适用于禾谷类作物的表达载体p g u 4 a g b a r 和p g b i u 4 a g b a r ，采用花粉管通 道法，将人工合成的雪花莲凝集素基因s g n a 导入了优良冬小麦品系西农2 2 0 8 和西农1 3 2 ， 经p c r 和s o u t h e r nb l o t 鉴定，证明获得了2 0 株导入了s g n a 基因的转基因植株，转化率 约为0 2 8 0 8 4 ，并通过w e s t e r nb l o t 鉴定检测到了目的蛋白的表达。侯文胜等【5 3 1 还 利用适用于禾谷类作物的表达载体p g u 4 a b b a r ，采用花粉管通道法，将人工合成的苏云金 7 拟南芥n p r i 和水稻c h i l l 基因导入小麦的研究 芽孢杆菌杀虫蛋白基因c r yl a 导入了优良冬小麦品系西农2 2 0 8 和西农1 3 2 ，经p c r 和 s o u t h e r nb l o t 鉴定，证明获得了2 7 株导入了c r yl a 基因的转基因植株，转化率约为 1 1 3 1 2 1 ，并通过w e s t e r nb l o t 鉴定检测到了目的蛋白的表达。奚亚军等t 5 4 ( 2 0 0 4 ) 利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因p s a a l 抑r 导入普通小麦品种西农1 3 7 6 ，经p c r 、 g u s 组织化学染色、点杂交和s o u t h e r n 杂交分析，证明带有特异启动子的目的基因已整合 到5 个植株的基因组中，且在大部分转基因植株中能够稳定遗传。通过叶片细胞分裂素含量、 叶绿素含量、叶片衰老进程及农艺性状分析，初步证明p s a a l 妒2 基因在部分转基n d , 麦的 衰老叶片中特异表达，叶片衰老受到明显抑制刘太国等【5 5 1 ( 2 0 0 5 ) 构建了大麦黄矮病毒 g p v 株系串联结构复制酶基因植物表达载体p p p l 2 9 ，通过花粉管通道法转化了c a 8 6 8 6 小 麦，对t 0 代种子进行了分子检测，获得6 株转基因小麦，转化率达到0 4 5 ；对获得的t o 代转基因小麦进行了田间抗病性鉴定，结果表明4 株转基因小麦对g p v 株系表现为高抗， 可以推迟发病2 3 d 用花粉管通道法将人工构建的带标记性状的目的基因导入受体植株，不但为该技术提 供了理论依据，而且也取得了相当的成果，但距育成品种还有一定的距离。 2 3 3 影响转化率的因素 2 3 3 1d n a 导入时期 花粉管通道法转化成功与否决定于经花粉管进入胚囊的外源d n a 能否参与受精，因而， 精确掌握最佳导人时间是花粉管通道法应用的关键。王艳杰等删( 2 0 0 6 ) 认为，既然外源 d n a 导入胚囊是以连续不断的花粉管外表面为依托，为此花粉管必须先形成，而后才能进 行外源d n a 导入的技术处理。从胚胎学研究的角度来看，外源d n a 导人的最适宜时期应 限定在精卵融合至合子分裂前这段时间。如小麦授粉后4 0r a i n 4h 形成花粉管通道，是 滴加外源质粒的最佳时期。不过，申家恒等嗍( 2 0 0 6 ) 认为授粉后2 1 6h 。 2 3 3 2 供体d n a 的片段大小 周光宇 5 7 1 ( 1 9 8 8 ) 认为应不小于1 0 6 1 0 7 道尔顿为好，以保证d n a 片段带有完整基因， 不致使供体的性状无法表达。此外，供体d n a 片段的纯度对导人后代的表型变异也有一定 的影响。 2 3 4 花粉管通道法的优缺点 用基因枪、电激、微束激光等方法都离不开组织培养诱导再生植株的过程，而且这一步 骤受基因型的影响大，使许多好品种不能用做受体，因此人们希望能用原位转化系统进行操 作。花粉管通道法就有其自身的优势。 1 、目前从花粉管通道法转化结果看，有如下优点： 8 河南农业大学硕士毕业论文 ( 1 ) 直接得到转化种子，不依赖植物组织培养和诱导再尘植株等一整套人工培养过程， 减少基因型的影响和各种无法预测的体细胞变异对后代的不利影响，一般不会形成嵌合体， 纯合速度快。 ( 2 ) 由于花粉管通道是天然存在的普通现象，故利用花粉管通道法进行外源基因的遗传 转化，可基本上应用与任何开花植物，进行任何物种之间包括人工合成基因的转移，从而极 大的扩大了基因工程的目的基因的来源和受体植物的范围。 ( 3 ) 操作简便、经济，易于常规育种者掌握，适合大规模的农作物遗传转化。由于直接 获得转基因植株，在进行转基因目标性状和转基因分子鉴定的同时，即可针对转基因植株的 农艺性状进行定向筛选，故能够与转基因育种直接结合，形成转基因农作物新品种的效率得 到提高，周期可能大大缩短。 ( 4 ) 转化频率高，效果好，变异广泛，为育种提供了大量有价值的种质资源等。 ( 5 ) 利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行转化，直接获得的产品即是转 基因植株。因此，在转基因表达的目标性状鉴定上，完全可以直接针对目标性状的表现型进 行，从而避免在植物组培的鉴定过程中，大量依赖抗生素进行筛选的弊端。 2 、缺点： ( 1 ) 进行外源基因转化目标植物的工作时间受自然花期限制，同时必须充分了解每一种 植物的开花受精的时间过程。 ( 2 ) 在田间进行操作，受环境条件的影响很大。 ” ( 3 ) 花粉管通道法操作的经验性很强，需要一定的技术摸索和技巧，另一方面，对单籽 粒的小花农作物操作难度较大，工作量比较大由于获得大量的转基因的种子比较困难，工 作效率较低。 3 小麦抗病转基因的目标基因 根据分子植物病理学的研究认为，小麦抗白粉病反应包括：病原一寄主相互识别、信号 传导和防卫基因表达等几个环节。对寄主小麦来说，对应的抗病相关基因应为抗病基因、信 号传导基因和防卫反应基因等，目前这三类基因都作为目标基因应用于基因工程中嘲1 ，在本 研究中我们利用的是信号传导基因( 拟南芥n r ) 和防卫反应基因( 水稻几丁质酶基因) 。 3 1 拟南芥n p r l 基因的研究进展 1 9 9 4 年c 【5 9 】等在分析植物& 堰的信号传导途径时分离到印突变体，由于该突变株的 n p r l 基因突变而导致了p r 基因的鼢j 泣答性表达被彻底破坏，对病原微生物的敏感性大大 提高1 9 9 7 年两个科研小组都用图位克隆( m a p - b a s e dc l o n i n g ) 的方法克隆了该基因【缸咧。 n p r l 蛋白含有两个a 蛐重复和一个b t b p o z 结构域。山蛐重复是与蛋白一蛋白 之间相互作用有关的结构模式，存在于许多与细胞结构、转录调控及细胞分化等有关的蛋白 质中。n p r l 蛋白与属于b z i p 家族的动物中的转录因子i b a 有很高的同源性，i b a 与陌o g b 相 9 拟南芥n p r i 和水稻c h i l l 基因导入小麦的研究 互作用调控后者的转录活性。b 1 【b p o z 结构域位于锌指蛋白及含i p r 0 0 6 6 5 2 模块的蛋白( 如 k e l c h 和p o x 病毒蛋白家族) 的n 末端附近，涉及蛋白质与蛋白质之间的相互作用嘲。 对加r j 基因的抗病分子机理的研究已经取得了很大进展，n p r i 基因被证实是植物产生 系统获得性抗性的关键调节基因删，它的表达可导致下游抗病基因的一系列反应，从而赋 予植物对病原物的抗性。n p r l 基因调控职基因的表达是通过与转录调节因子形成核蛋白复 合物来进行的，z , h a n g 等证实n p r l 与含有碱性区域的亮氨酸拉链转录子的t g a _ 亚类家族成员 ( a h b p 1 b 和t g a 6 ) 发生物理相互作用，n p r i 上的四点突变中的每一点突变都会完全阻塞 n p r l 与t g a z 间的这种作用。研究同时还发现了这些t g a 因子可以结合到咫j 基因启动子 应答性水杨酸( s a ) 的a s - 1 元件上，n p r l 突变前的特征也揭示了 谚磁基因是在s a 信号分子的下 游发挥功能吲除此功能外，有研究认为n p r l 还在胞质参与在s a 和j 蜡号传导途径信息 交换【碣】。 3 2 几丁质酶基因的研究进展 3 2 1 几丁质酶的功能 自然界中很多动物、植物和微生物都可以产生几丁质酶。几丁质酶( c h i t i n a s e ，e c 3 2 1 1 4 ) 是一种以几丁质( b 1 ，4 乙酰葡萄糖胺线性同聚物) 为底物的水解酶，为单基因所编 码，既有分泌于胞外的，也有定位于胞内的，根据水解切口位置的不同又分为：内切几丁质 酶( e n d o c h k i n a s e , 水解位点为同聚物内部8 - 1 ，4 - 连键) 和外切几丁质酶( e x o c h i t i n a s e ，水 解位点为同聚物线性末端b 1 ，4 - 连键) 目前研究最清楚，应用最广泛的为内切几丁质酶。 几丁质酶广泛存在于植物中，植物几丁质酶不仅存在于被子双子叶植物和单子叶植物 中，而且还存在于裸子植物和蕨类植物中。在植株中，几丁质酶可分布于根、茎、叶、花器、 果实、种子中。种子、根、花器中的几丁质酶含量一般比其他器官高【6 9 1 。 植物受到病原菌侵染后，迅速表达积累病程相关蛋白( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n ，p r p r o t e i n ) ，病程相关蛋白是植物抗病反应中直接抑制和杀死病原菌的物质。植物几丁质酶是 这类p r 蛋白中的主要类型，其中，p r - 3 ，- 4 ，- 8 ，1 1 均为内源几丁质酶( e n d o c h i f i n a s e s ) 。 几丁质是真菌细胞壁的主要成分，不存在于植物细胞中刑。病原真菌侵染可诱导植物几丁 质酶基因表达，因而几丁质酶被认为参与植物抗病反应过程，属于植物防卫反应基因。 植物体内几丁质酶的主要作用应该是自身防卫，尤其是抵抗真菌的侵染危害。分离、纯 化的植物几丁质酶可在体外抑制真菌生长，几丁质酶基因的转基因植物对真菌的抗性比未经 转基因的野生种强1 7 0 - 7 1 1 ，从而进一步证实了几丁质酶在植物抗病中的重要作用。此外，真菌 诱导物、水杨酸、干旱等因素均可诱导几丁质酶基因表达阎几丁质酶还参与植物抗低温 r 7 螂1 及植物发育过程r 7 例；植物几丁质酶还具有参与释放信号分子；参与共生固氮调控【7 8 】； 抑制细菌生长、虫类消化和发育几丁质酶也可对豇豆象鼻虫 7 9 1 、蝴蝶幼虫【舳1 等产生抑制 1 0 河南农业大学硕士毕业论文 或致死作用。 线虫的卵壳和螨类均含有几丁质物质，几丁质酶对这两种病原物也起作用 【8 l 蚓。 3 2 2 几丁质酶在抗病基因工程中的应用 几丁质酶具有广泛的生理功能，特别是抑制真菌的生长发育、植物抗真菌感染和几丁质 的开发利用中具有良好的应用前景。 目前至少有1 0 种植物用几丁质酶基因进行了转化研究，如烟草、黄瓜、番茄、马铃薯、 苹果、玫瑰、小麦、水稻、胡萝卜、芸苔、花生等。其中目的基因主要来源于植物，如水稻、 烟草、菜豆等，也有来源于昆虫和微生物；转化方法以根癌农杆菌介导法为主，由于不同的 几丁质酶的抗菌谱不一，因而，转基因植株的抗性表现对不同的真菌有不同的反应。 1 9 9 1 年，b m g l i ei s 3 1 等首次报道转几丁质酶基因的植物抗真菌病。b m g l i e 等首次将组成 型表达的菜豆i 类碱性几丁质酶基因导入烟草，获得的转基因植株对立枯丝核菌具有较强抗 性。 g r i s o n a 4 l ( 1 9 9 6 ) 等人将组成型表达的几丁质酶基因导入甘蓝型油菜中并用柱胞霉菌 ( c y l i n d r o s p o r i u mc o n c e n t r i c u m ) 、茎点霉菌( p h o m al i n g a m ) 和菌核菌( s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m ) 三种病原菌做接种试验，结果表明转基因植株对病害的田间耐性比对照明显增 强。 m a r c h a n t 酷l ( 1 9 9 8 ) 等人将水稻i 类碱性几丁质酶基因导入玫瑰( r o s ah y b r i d a ) 中， 从而使玫瑰增强了对黑斑病菌( d i o k i c a r p p o nr o s a e ) 的抗性 n i s h i z a w ayi s 6 ( 1 9 9 9 ) 等利用农杆菌介导法，以潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记， 在c a m v 3 5 s 强启动子的控制下，将水稻类几丁质酶基因c h i - 2 和c h l - 3 转入2 个日本普 通水稻品种中。转基因水稻均显著地提高了对稻瘟病病原菌( m a g n a p o r t h e gr i s e a ) 0 0 7 0 和 3 3 3 号小种的抗病性，且这种抗病性能在多个品系中稳定地遗传给下一代。 b l i f f i e d s t l ( 1 9 9 9 ) 将来源于大麦种子抗真菌的几丁质酶基因导入小麦，获得了对禾白粉 菌( e r i s i p h eg r a m i n i s ) 侵染具有抗性的转基因植株。 叶兴国等嗍( 2 0 0 5 ) 利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和b 1 ，3 葡聚糖酶双价基因导入 小麦品种扬麦l o 号和b o b w h i t e ，共得到了1 3 株t o 代转基因植株，2 个小麦品种的转化效 率分别为1 4 和1 0 。t o 代植株赤霉病抗性鉴定结果表明，转基因植株对赤霉病具有一 定抗性，小穗发病率4 7 6 1 1 7 6 ，低于抗病对照和感病对照。t l 代植株分子检测结 果表明，外源基因分离比例为2 3 3 ：1 ，较低的分离比例可能与外源基因的丢失有关。 3 2 3 利用外源几丁质酶基因增强植物抗病性研究中存在的问题和展望 尽管目前几丁质酶基因的研究利用取得了较大的进展，但仍存在不少问题。 由于基因转移的难度较大，得到的转基因植物群体不大，用于生物测定的植株数偏小， 拟南芥n p r i 和水稻c h i l l 基因导入小麦的研究 所以结果的可信度有限，一般无统计分析。在做了统计分析的转细菌几丁质酶基因的烟草抗 立枯病试验中， 在个别场合转基因植株的发病程度或株重无异于未转化对照【8 9 】。 转入的目的基因的表达量是一个不容忽视的问题，传统上认为表达量的高低和抗病性增 强的程度密切相关：一般转植物源几丁质酶基因对某些病原的抗性均有所增强，且大多数转 化植物增强的抗性与其所表达的几丁质酶量呈正相关，但也有一些例外。n i e l s e n 等嗍将甜 菜几丁质酶基因转入烟草中，尽管这种酶在甜菜中受病原诱导时迅速累积，抗病品种远较敏 感品种迅速且活性高，但在烟草中表达该基因并不能增强其抗病性，在花椰菜【9 1 】、葡萄1 9 2 等上也有类似的报道。这一问题可能和选用的基因来源有关，p u a j a 等【7 1 蠕矮牵牛、烟草和 赤小豆的几丁质酶基因分别转入黄瓜中，转化株对丝核菌、链酶菌和葡萄孢菌的抗性并未提 高；在以胡萝卜为材料的转化试验中发现，对抵抗同样的病原菌，烟草几丁质酶基因的效果 大大优于矮牵牛几丁质酶基因。证明了转基因效果随所用的植物物种、表达的几丁质酶类型 及病原菌习性的不同而改变。几丁质酶与植物病原菌互作的具有专化性。 多数病原菌对植物的侵染从细胞间隙开始，主要是以体外寄生的方式摄取所需要的营养 物质，破坏植物组织，影响其生长。因此，为了使植株能抵抗真菌侵染，抗真菌蛋白最好在 胞间表达。k i s h i m o t o 等】指出，转基因水稻中外源几丁质酶基因的高效表达和在胞间的定 位是转基因水稻表现出较高抗病性的重要原因由于抗菌活性最高的i 类几丁质酶定位于液 泡中，为了使液泡中的几丁质酶从细胞中释放出来，必须对上述两种基因进行修饰。g r o v e r 等刚认为，如果移走该酶的液泡定位信号，使其分泌到胞间，可以更好地起抑菌作用，他 们利用两个终止子人为地使该信号失活，将这种人工修饰的几丁质酶基因置于c a m v 3 5 s 启 动子的控制下并导人烟草，成功地将经修饰的几丁质酶基因定位于胞间，其生物学活性没有 发生变化，这一结果对几丁质酶基因在植物抗病基因工程中更为有效的利用有着重要的意 义。 此外，外源几丁质酶基因的沉默【9 5 】及其在目标植物染色体上的定位胁l 等问题均与最终 的转化结果有关，这些不同的研究将有可能使目的基因实现定向导人，并使其表达水平可调 节，最终使得转基因策略更加有效。 目前植物抗真菌基因工程研究取得了令人鼓舞的突破性进展，采用基因工程手段改良植 物抗病性的研究已进入一个振奋人心的时期，相信随着遗传转化体系的改进、新的抗病基因 的分离克隆、特异性或诱导型启动子的利用、为公众认可的可靠的环境安全风险性评价系统 的建立等技术的不断完善