（内科学专业论文）stat5a、stat5b在非小细胞肺癌中的表达及意义.pdf

一翻降卅 j；，jjjlq“、q，1 l1 嗍鞘 s t a t s a 二s t a t 5 b 在非小细胞肺癌中的表达及意义 摘要 目的：检测信号转导与转录激活因子5 a ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o r o ft r a n s c r i p t i o n5 a , s t a t 5 a ) 和信号转导与转录激活因子5 b ( s i g n a l t r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n5 b ，s t a t 5 b ) 在非小细胞肺癌 ( n o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r , n s c l c ) 组织和正常肺组织中的表达，初步 探讨它们在n s c l c 的发生、侵袭和转移中的作用。方法：利用免疫组织 化学s p 法检测4 0 例n s c l c 组织和2 0 例正常肺组织中s t a t 5 a 蛋白与 s t a t 5 b 蛋白表达水平。n s c l c 组织均为手术切除获得，术前未作任何放 疗或化疗。其中，男性2 9 例，女性1 1 例；年龄为3 5 7 8 岁， 3 c m 者2 6 例；有淋巴结转移者1 8 例，无淋巴结转移者2 2 例；i i i 期 者2 4 例，i 期者1 6 例；高一中分化者3 0 例，低分化者1 0 例。标本组 织经福尔马林固定，石蜡包埋，4l a r n 厚连续切片，切片常规脱蜡水化后， 蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e ，p b s ) 浸泡，高温抗 原修复，3 h 2 0 2 阻断内源性过氧化物酶活性，并用正常山羊血清封闭交 叉反应。滴加一抗( s t a t 5 a 兔抗人多克隆抗体，s 仉锕5 b 兔抗人多克隆抗 体) 孵育，p b s 冲洗后滴加生物素标记二抗孵育，p b s 冲洗后滴加辣根酶 标记链霉卵白素工作液( s a h r p ) 孵育，p b s 冲洗，d a b 显色，苏木素 复染，透明，封片观察。以胞质或胞核内出现棕黄色颗粒、网织状或棕褐 色团块为阳性细胞。其中，s t a t 5 a 蛋白及s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织中 ；噎秀毫建讲冀d算。疆墨赫嚣翟节 的阳性表达信号主要位于细胞质，少数位于细胞核；按每张切片的阳性细 胞比例及着色深浅划分一、+ 、+ + 、+ + + 四级，基本不着色或着色细胞少于 5 为阴性( 一) ，着色浅淡或着色细胞占5 一2 5 为弱阳性( + ) ，着 色适中或着色细胞占2 6 一5 0 为中度阳性( + + ) ，着色深或着色细胞大 于5 0 为强阳性( + + + ) 。结果：( 1 ) s t a t 5 a 及s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织中的表达与在正常肺组织中的表达比较，差异有显著统计学意义 ( p o 0 5 ) ；但是s t a t 5 b 蛋白表达与 性别相关( p o 0 5 ) ，而s t a t 5 a 蛋白在n s c l c 中关系比 s t a t 5 b 蛋白密切。结论：( 1 ) s t a t 5 a 及s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 中的表达 增高，显著高于正常肺组织。( 2 ) s t a t 5 a 蛋白及s t a t 5 b 蛋白与n s c l c 中的表达与患者的年龄、肿瘤大小、组织分化程度及类型、淋巴结转移和 t n m 分期无关，提示它们可能只在肿瘤发生过程中发挥作用，而与肿瘤进 展、侵袭和转移无关。但是s t a t 5 b 蛋白表达与患者的性别上有相关性( p o 0 5 ) 。( 3 ) s t a t 5 a 蛋白与及s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 中 的表达无相关性，说明它们在促进细胞转化，导致肿瘤的发生过程可能是 各自独立发挥作用的，无协同作用，而s t a t 5 a 在n s c l c 中关系比s t a t 5 b 密切。 关键词：非小细胞肺癌；信号转导与转录激活因子5 a ；信号转导与转 录激活因子5 b ； c l i n i c a ls i g n i f i c a n c ea n d e x p r e s s i o no fs t a t 5 aa n d s t a t 5 bi nh u m a nn o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fs t a t 5 a ( s i g n a l t r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t o n5 a ) a n ds t a t 5 b ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n d a c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t o n5 b ) i nn s c l c ( n o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r ) a n d n o r m a ll u n gt i s s u e ，a n dt oe x p l o r et h e i rp o s s i b l er o l e si nt h et u m o r i g e n e s i so f n s c l co rt u m o ri n v a s i o na n dm e t a s t a s i s m e t h o d ：4 0c a s e so fn s c l c s p e c i m e n e s a n d2 0c a s e so f n o r m a l l u n g t i s s u e sw e r e s u b je c t e d t o i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g ( s p ) f o rs t a t 5 a , s t a t 5 b t h en s c l c t i s s u e s w e r eo b t a i n e df r o m4 0 p a t i e n t su n d e r g o i n gl u n gc a n c e rr e s e c t i o na tt h e d e p a r t m e n to fs u r g e r y , t h ea f f i l i a t e dh o s p i t a lo fl u z h o um e d i c a lc o l l e g e n o p a t i e n th a dr e c e i v e dc h e m o t h e r a p yo rr a d i a t i o nt h e r a p yb e f o r es u r g e r y d e t a i l e d c l i n i c o p a t h o l o g i c a lp a r a m e t e r si n c l u d i n ga g e ，g e n d e r , t u m o rd i a m e t e r , s t a g e ， l y m p hn o d em e t a s t a s i s ，a n dd e g r e eo fd i f f e r e n t i a t i o na r ea sf o l l o w i n g t h e r e w e r e2 9 m a l e sa n d1 1f e m a l e s t h e i ra g e sr a n g e df r o m3 5t o7 8 w h o s ea g e 16 0w e r e18 t h e r ew e r e2 6s q u a m o u sc a r c i n o m a sa n d14 a d e n o c a r c i n o m a s t h es p e c i m e n e sw h o s et u m o rd i a m e t e r 3 c mw e r e2 6 c o m p a r e d1 4s p e c i m e n e sw h o s et u m o rd i a m e t e r 弋 3 c m t h em e t a s t a t i cl y m p h n o d e s p e c i m e n sw e r e 18 ，w h i l e2 2 s p e c i m e n sh a d n on o d a lm e t a s t a s i s p e r f o r m a n c e n s c l ct i s s u e st h a tb e l o n g d et oi i is t a g ew e r e2 4a n dt h a t b e l o n g e d t oi i i i vs t a g ew e r e16 m o d e r a t e l yd i f f e r e n t i a t e d a n d 4 a c t i v i t yw a sb l o c k e du s i n g3 h 2 0 2s o l u t i o na n dn o n s p e c i f i eb i n d i n gs i t e s w e r eb l o c k e db yi n c u b a t i n gw i t hg o a ts e r u m t h es l i d e sw e r ei n c u b a t e dw i t h a p p r o p r i a t ep r i m a r ya n t i b o d y ( r a b b i ta n t i s t a t 5 ap o l y c l o n a la n t i b o d y， r a b b i ta n t i s t a t 5 bp o l y c l o n a la n t i b o d y ) w a i t2h o u r sa n dt h e nw a s ht h e m w i t hp b s t h es e c o n da n t i b o d yw i t hb i o t i nl a b e l i n gw e r ed r o p p e dt ot h es l i d e s a n di n c u b a t e d w a i t15m i n u t e sa n dt h e nw a s ht h e mw i t hp b s a f t e rt h a t ，t h e s l i d e sw e r ei n c u b a t e dw i t hs a h r pf o r15m i n u t e sa n dt h e nw a s h e dw i t hp b s i m m u n o l o g i c r e a c t i o nw a s d e v e l o p e du s i n gd a b t h e s l i d e sw e r e c o u n t e r s t a i n e dw i t h h e m a t o x y l i n ，m o u n t e d a n dt h e no b s e r v e d t h r o u g h m i c r o s c o p e c o n s i d e rt h ec e l l sw h o s ec y t o p l a s mo rn u c l e u sh a db r o w n i s h y e l l o wm a t t e ra sp o s i t i v ec e l l s s t a t 5 aa n ds t a t 5 bp o s i t i v es i g n a lw a s l o c a l i z e di nb o t hc y t o p l a s ma n dn u c l e u s ，b u tp r e d o m i n a n t l yi nc y t o p l a s m t l l e y w e r ed i v i d e di n t o4l e v e l sa c c o r d i n gt op r o p o r t i o no f p o s i t i v ec e l l sa n dc o l o u r d e p t ho fe a c hs l i c e r e s u l t s ：( 1 ) p r o t e i nl e v e l so fs t a t 5 aa n ds t a t 5 bw e r e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nn s c l c t i s s u ec o m p a r e dw i t hn o r m a lt i s s u e ( 尸 5 0 0 5 ) s t a t 5 bo v e r e x p r e s s i o nw a sa s s o c i a t i o nw i t hg e n d e ro fp a t i e n t si n n s c l c ( p 0 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no ff e m a l ep a t i e n t st h a nm a l e p a t i e n t s ( p o 0 5 ) t h eo v e r e x p r e s s i o n o fs t a t 5 ac l o s e l yt h a ns t a t 5 bi nn s c l c c o n c l u s i o n ：( 1 ) t h el e v e l so f s t a t 5 a ，s t a t 5 bp r o t e i n sw e r eh i g h e ri nn s c l ct h a ni nn o r m a ll u n gt i s s u e t h eo v e r e x p r e s s i o no fs t a t 5 a ，s t a t 5 bm i g h tp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h e t u m o r i g e n e s i so fn s c l c ( 2 ) t h e r ew a sn oa s s o c i a t i o nb e t w e e ns t a t 5 a ， s t a t 5 bo v e r e x p r e s s i o na n dt h ea g eo fo n s e t ，t u m o rd i a m e t e r , l y m p hn o d e m e t a s t a s i s ，t u m o rd i f f e r e n t i a t i o na n ds t a g e si nn s c l c i ti n d i c a t e st h a tt h o s e t w op r o t e i n sh a v en oe f f c to nt u m o rp r o g r e s s i o n ，i n v a s i o na n dm e t a t a s i s ， s t a t 5 bo v e r e x p r e s s i o nw a sa s s o c i a t i o nw i t hg e n d e ro f p a t i e n t si nn s c l c ， b u ts t a t 5 ao v e r e x p r e s s i o nw a s n ta s s o c i a t i o nw i t h g e n d e ro fp a t i e n t s i n n s c l c t h ee x p r e s s i o no ff e m a l ep a t i e n t st h a nm a l ep a t i e n t s ( 3 ) t h e r ew a s a l s on oc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o n so fs t a t 5 aa n ds t a t 5 b p r o t e i n s o t h e ym i g h th a v en os y n e r g i s t i ca c t i o nw i t he a t ho t h e ri nn s c l c t h e ym i g h t p l a yi n d e p e n d e n tr o l e s i no n c o g e n e s i so fn s c l c ，t h eo v e r e x p r e s s i o no f s t a t 5 ac l o s e l yt h a ns t a t 5 bi nn s c l c k e yw o r d s ：n o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r s t a t 5 a s t a t 5 b 6 -上-jl- 刖吾 原发性支气管癌( p r i m a r yb r o n c h o g e n i cc a r c i n o m a ) ，简称肺癌( 1 u n g c a n c e r ) 是起源于支气管粘膜或腺体的恶性肿瘤。肺癌发病率为男性肿瘤 的首位，并由于早期诊断不足致使预后差。据世界卫生组织( w h o ) 2 0 0 3 年公布的资料显示，肺癌无论是发病率( 1 2 0 万年) 还是死亡率( 1 1 0 万 年) ，均居全球癌症首位。在我国，肺癌已超过癌症死因的2 0 ，且发生率 及死亡率均迅速生长。自2 0 0 0 年至2 0 0 5 年，我国肺癌的发病人数在这5 年内增加了1 1 6 万，死亡人数增加了1 0 1 万。英国肿瘤学家r p e t o 预言： 如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2 0 2 5 年我国每年肺癌发病人数将 超过1 0 0 万，成为世界第一肺癌大国。肺癌是一种预后极差的疾病，8 6 的患者在确诊后5 年内死亡，只有1 5 的患者在确诊时因病变局限，其5 年生存率可达5 0 ，因此肺癌已经成为一个严重威胁人民健康和生命的疾 病。目前认为，肺癌的发生与吸烟、职业性致癌因子、空气污染、电离辐 射、饮食与营养、其他诱发因素( 结核、病毒及真菌毒素等) 、遗传和基因 改变等有关，但肺癌的发病机制仍不清楚1 捌。 肺癌发病率高，预后差，已经引起了越来越多的重视。肺癌按组织学 分类，可以分为小细胞肺癌( s m a l lc e l ll u n gc a n c e r ) 和非小细胞肺癌 ( n o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r ) 两种。小细胞肺癌是肺癌中恶性程度最高的， 早期就发生血行和淋巴转移。即使局部生长的肿瘤，也显示侵袭性行为。 对放疗和化疗均敏感。非小细胞肺癌在肺癌中约占7 5 一8 0 ，包括鳞癌、 腺癌、大细胞癌和腺鳞癌四类。现在对非小细胞肺癌的治疗是以手术为主， 7 辅以化疗、放疗及免疫治疗等综合治疗【3 4 1 。 信号转导因子与转录激活因子( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o r o f t r a n s c r i p t i o n ，s t a t ) 是一类具有信号转导和转录调节功能的蛋白质，存在 于细胞胞浆并在激活后能够转入核内与d n a 结合的蛋白家族，在哺乳动 物，已经发现有7 种s t a t 家族成员：包括s t a t l 、s t a t 2 、s t a t 3 、s t a t 4 、 s t a t 5 a 、s 仉盯5 b 、s t a r 6 ，分别由不同的基因编码，但是它们具有相似的 氨基酸序列。虽然s t a t 蛋白和细胞自身识别、修复d n a 损伤之间的关系 尚难定论，但是，它们与生长因子信号系统、凋亡过程、血管发生等方面 紧密相连，因此可以促进肿瘤的发生。 s t a t 5 对维持细胞的正常功能，调节细胞的增殖与分化负有重要的使 命，s t a t 5 有广泛的生理作用，它具有调控细胞的生长、分化、生存和免 疫发育的作用1 。s t a t 5 随后被证实具有促进细胞增生和抑制细胞凋亡的 作用，参与肿瘤的发生、凋亡和细胞的增生1 。激活的s t a t 5 可以促进t 细胞的细胞周期进程，而s t a t 5 缺乏还可引起免疫功能缺陷口3 。s t a t 5 在 造血细胞凋亡的调控中也有重要的功能陋3 。最近大量研究发现，在多种肿 瘤细胞系和多种转化细胞系中，尤其是白血病和乳腺癌中s t a t s 持续活 化，持续活化的s t a t 5 增强了细胞的转化，同时也阻断了细胞的凋亡。国 内王鸿程等最近的研究发现s t a t 5 在n s c l c 组织中也有明显的高表达 p l o 】 o s t a t 5 具有6 个保守的结构域：包括嘛端结构域、卷曲螺旋结构 域、d n a 结合结构域、连接结构域、s h 2 酪氨酸活结构区域、羧基端的转 录活化结构域。卜末端结构域大约由1 3 0 个氨基酸组成，具有结构的保守 性，有促进与d n a 结合和调节向核内转位的作用。相邻的卷曲螺旋结构域 由4 个螺旋结构组成，为转录因子和调节蛋白提供作用位点。d n a 结合域 结构独特，决定了与s t a t 5 结合的d n a 特异序列。连接结构域起着稳定 d n a 结合域的作用。s h 2 结构域是s t a t 5 蛋白中最高度保守的结构域，它 不仅参与s t a t 5 蛋白的酪氨酸磷酸化，而且参与s t a t 5 二聚体的形成。 转录活化结构域位于c 端，序列保守性较差，但对于s t a t 5 发挥作用是必 需的。最近研究发现s t a t 5 有两个相关的基因编码s t a t 5 a 和s t a t 5 b ， 其编码基因位于人类第1 7 号染色体上。这两种s t a t 5 蛋白9 6 以上是同 源的，它们能被许多细胞因子所激活，包括催乳激素、生长激素、促红细 胞生成素、血小板生成素和白介素一2 等。 信号转导和转录激活因子5 a ( s n 玎5 a ) 中是参与乳腺发育和造血多个 生理过程的关键转录因子。生长激素，催乳激素，促红细胞生成素细胞因 子和白细胞介素2 刺激激活s t a t 5 a 酪氨酸磷酸化，s t a t 5 a 酪氨酸磷酸化 能够引起具体的d n a 构象和约束能力的变化。s t a t 5 a 作为信号分子和转 录因子起作用的过程中，准确细胞定位是必不可少的，通过对研究s t a t 5 a 非酪氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化前后进行对比，观察s t a t 5 a 穿梭于细胞 核的过程，同时通过突变或缺失评价标识s t a t 5 a 结构的一系列区域，发 现卷曲螺旋域是非酪氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化s t a t 5 a 进入细胞核的关 键区域。通过调节核孔复合物来调节s t a t 5 a 进入细胞核的过程，单独的 酪氨酸磷酸化的s t a t 5 a 对细胞核无明显影响，然而，酪氨酸磷酸化的 s t a t 5 a 累积与d n a 结合，引起具体的d n a 构象和约束能力的变化。这 些研究成果为进一步研究s t a t 5 a 活动奠定了基础【l l 】。有研究证实，通过 9 增殖和凋亡2 氨基。l - 甲基6 苯基咪唑 4 ，5 b g e 啶诱导的大鼠乳腺肿瘤 的中高、低磷酸化水平的s t a t 5 a 表达不同，发现在癌细胞中高磷酸化水 平的s t a t 5 a 比低磷酸化水平的更能促进其增生，并且，高磷酸化水平的 s t a t 5 a 在细胞周期蛋白d 1 与雌激素受体仅表达增高。此外，癌细胞中， s t a t 5 a 表现为降低细胞凋亡b c l 2 蛋白与b a x 的比例【1 2 1 。 s t a t 5 b 最初是在绵羊的乳腺中作为催乳素诱导剂被分离到得，后在 人、小鼠、大鼠的乳腺、肝脏、肌肉、脂肪、前列腺、等组织器官中都能 监测到s t a t 5 b 。s t a t 5 b 受许多细胞因子、激素、生长因子调解，参与它 们的信号转导。其作用方式主要有两种：( 1 ) 在被受体激活后形成同( 异) 二聚体，转位到胞核，结合于靶基因的启动子部位，参与靶基因转录的 正或负性调控。( 2 ) 激活后再去磷酸化信号通路中其他重要信号蛋白活化， 调节下游信号转导，从而调控细胞增殖、分化、凋亡等生命活动。s t a t 5 b 参与免疫炎症反应，s t a t 5 b 基因突变的小鼠的研究发现，s t a t 5 b 与白细 胞介素( i l ) 2 p 受体d n a 的结合能力减弱，导致其蛋白表达减少，从而 影响了细胞的正常免疫调节功能 1 3 1 。它还通过参与干扰素( i fn ) 丫、 i l 3 、i l - 5 、粒一巨细胞集落刺激因子( g m c s f ) 等的信号转导来调节 免疫反应。近些年认为研究s t a t 5 b 已经成为调节肿瘤生成的关键点， s t a t 5 b 对抑制肿瘤细胞的生长及转移提供了分子靶向n 钊。s t a t 5 b 蛋白的 异常组成性激活引起许多肿瘤的形成。 综上所述，s t a t 5 a 、s t a t 5 b 与多种人类恶性肿瘤的关系密切但与 n s c l c 的关系目前尚缺乏研究，本实验利用免疫组化方法研究它们在非小 细胞肺癌中的表达及其相互关系，从信号传导途径方向研究肺癌的发生、 发展过程中存在的可能机制，对肺癌的临床诊断，寻求肺癌基因治疗的新 的靶点等有着潜在重要意义。 材料与方法 1 实验材料与仪器 1 1 实验材料 收集泸州医学院附属医院病理科2 0 0 8 年1 月- - 2 0 0 9 年1 2 月临床病理资 料完整的4 0 例非小细胞肺癌组织标本。其中，男性2 9 例，女性1 l 例；年龄 为3 5 7 8 岁， 6 0 岁者1 8 例。按w h o 标准进行组织学分类、 t n m 分期，其中鳞癌2 6 例，腺癌1 4 例；肿瘤直径弋 3 c m 者2 6 例；有淋巴结转移者1 8 例，无淋巴结转移者2 2 例；i i i 期者2 4 例，i 期者1 6 例；高一中分化者3 0 例，低分化者1 0 例。所有标本均经福尔马林固 定，常规石蜡包埋。并取2 0 例正常肺组织作对照。以上标本均为手术切除 获得，术前未作任何放疗或化疗。 2 主要实验试剂 2 1s t a t 5 a 及s t a t 5 b 兔抗人多克隆抗体由美国b i o w o r l d 公司提供。 2 2 免疫组化染色试剂盒( s p 试剂盒) 和p o l y l l y s i n l 主l ： l 京中杉金桥生 物有限公司提供。 2 3 d a b 显色剂由美 雪s i g m a 公司提供。 2 4p b s 磷酸盐缓冲液、l m o l l 氢氧化钠、浓盐酸、3 过氧化氢、0 5 淡氨水、1 0 0 乙醇、二甲苯和封片剂等由泸州医学院附属医院病理科实验 室提供。 3 主要实验仪器 3 1 德国l e i c a 切片机。 3 2 上海d h g 9 0 7 0 型电热恒温干燥箱。 3 3 重庆g s 2 0 2 1 型电热恒温孵箱。 3 4四川p h s 3 c 型酸度计。 3 5 浙江苏泊尔压力锅，不锈钢，内径1 8 m ，i 作压力9 0 k p a 。 3 6 日本o l y m p u sp m c b a d 型光学显微镜。 3 7 德国l c i c ad mi r b 荧光倒置显微镜。 4 实验方法 4 1 主要试剂的组成和配制 ， 4 1 1 a a f ( 酒精、冰醋酸、甲醛) 液 ( 1 ) 配制比例 9 5 酒精 4 0 甲醛 冰醋酸 ( 2 ) 配制方法 8 0m l 1 5m l 5m l 将9 5 的酒精8 0m l ，4 0 甲醛1 5m l ，冰醋酸5m l 混匀后即配成a a f 液( 1 0 0 m 1 ) 。 4 1 2m a y e r 苏木精溶液 ( 1 ) 配制比例 钾明矾 m a y e r 苏木精 枸橼酸 碘酸钠 水合氯醛 蒸馏水 ( 2 ) 配制方法： 5 0g 1g 1g 0 2g 5 0g 1 0 0m l 先将1 9 苏木精加温溶于蒸馏水中，再力l a 5 0 9 碘酸纳和5 0 9 钾明矾，促 其速溶后加入枸橼酸l g i f l 水合氯醛5 0 9 ，继续搅拌溶化，使其变成紫红色， 用前过滤。 4 1 3o 0 1m p h 6 0 枸橼酸盐缓冲液( c i t r a t eb u f f e r ) ： ( 1 ) 储存液： “ a o 1 m 枸橼酸溶液：称取2 1 0 1 9 枸橼酸溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。 b o 1 m 枸橼酸钠溶液：称取2 9 4 1 9 枸橼酸三钠溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水 中。 ( 2 ) 工作液： 取9 m la 液和4 1 m lb 液加入4 5 0 m l 蒸馏水中，溶液p h 值应为5 9 6 1 。 4 1 4 p b s 磷酸盐缓冲液( o 0 1 mp h 7 2 7 4 ) 取z l i 9 0 6 1p b s 溶于1 0 0 0 m l 的蒸馏水中，混匀，将p h 值调至7 2 7 4 。 4 1 5 4 多聚甲醛溶液 将4g 多聚甲醛加入l o om l 蒸馏水，充分混匀即可。 4 2 免疫组化s p 法染色步骤 4 2 1 将标本组织固定，脱水，透明，浸蜡后制成组织蜡块，常规4 1 a m 连 续切片。 4 2 2 石蜡切片依次进入以下溶液，常规脱蜡至水。 ( 1 ) 二甲苯i8m i n ； ( 2 ) 二甲苯i i8m i n ； ( 3 ) 二甲苯i i i8m i n ； 1 4 ( 4 ) 无水乙醇8m i r a ( 5 ) 9 5 乙醇8m i r a ( 6 ) 7 5 乙醇8m i n ； 4 2 3 蒸馏水冲洗，p b s 浸泡5 m i n 。 4 2 4 高压热修复抗原：将2 0 0 m l 的枸橼酸盐缓冲液( 工作液，p h 为6 o ) 注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于修复架上，放入锅内，使切 片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始喷气时，计时3 m i n ，然后将 压力锅端离热源，取下气阀，打开锅盖，取出切片，冷却至常温，蒸馏 水冲洗后，o 0 1mp b s 磷酸盐缓冲液冲洗3m i n x 3 次。 4 2 5 用3 过氧化氢孵育1 0 m i n ，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4 2 6 滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育1 5m i n 后甩去多余液 体，不水洗，用吸水纸除去样本边缘的液体。 4 2 7 滴加一抗( s t a t 5 a 兔抗人多克隆抗体的稀释度为1 ：1 0 0 ；s t a t 5 b 兔抗人多克隆抗体的稀释度为121 0 0 ；) ：3 7 。c ，孵育3h ，o 0 1mp b s 磷 酸盐缓冲液冲洗3m i n x 3 次。用p b s 代替一抗作为阴性对照。 4 2 8 滴加生物素标记二抗：3 7 ，孵育1 5m i n ，o 0 1mp b s 磷酸盐缓 冲液冲洗3m i n x 3 次。 4 2 9 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液( s a h r p ) ：3 7 。c ，孵育1 5m i n ， o o lmp b s 磷酸盐缓冲液冲洗3m i n x 3 次。 4 2 1 0d a b 显色：取1m l 蒸馏水加入d a b 液各1 滴混合，室温下，镜下 控制显色时间2m i n ，蒸馏水洗涤5 次。 4 2 1 1 m a y e r 苏木精溶液轻度复染( 室温下4m i n ) ，酸化( 1 盐酸酒精) ， 蓝化( o 5m l 氨水加入1 0 0m l 蒸馏水) ，梯度脱水( 7 5 酒精、9 5 酒精、 1 0 0 酒精) ，透明( 二甲苯i3m i n ，二甲苯1 1 3r a i n ) ，封片，显微镜观 察。 4 3注意事项t 4 3 1 石蜡切片脱蜡要彻底。 4 3 2 正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前不能用p b s 缓冲液洗。 4 3 3 抗体稀释应遵循“现用现配 的原则；滴加抗体应完全覆盖组织， 避免引起组织边缘效应；孵育时切片应放置水平，否则会导致抗体流失。 4 3 4 抗体孵育切片后冲洗要充分。 4 3 5 d a b 显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。 4 4 结果判断 以胞质或胞核内出现棕黄色颗粒、网织状或棕褐色团块为阳性细胞。 s t a t 5 a 及s t a t 5 b 蛋白的阳性表达信号主要位于细胞质，少数位于细胞核； 并按每张切片的阳性细胞比例及着色深浅划分一、+ 、+ + 、+ + + 四级。 ( 1 ) 阴性( 一) ：基本不着色或着色细胞少于5 。 ( 2 ) 弱阳性( + ) ：着色浅淡或着色细胞占5 一2 5 。 ( 3 ) 中度阳性( + + ) ：着色适中或着色细胞占2 6 一5 0 。 ( 4 ) 强阳性( + + + ) ：着色深或着色细胞大于5 0 。 4 5 统计分析 采用s p s s1 3 0 统计软件进行分析。等级资料的两样本比较用秩和检 验，双变量资料的等级相关性用s p e a r m a n 等级相关作统计分析。p 0 0 5 有统计学意义，p 0 0 1 有显著统计学意义。 结果 1 s t a t 5 a 蛋白、s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达 1 1 s t a t 5 a 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达情况 1 1 1s t a t 5 a 蛋白在n s c l c 组织中的表达 s t a t 5 a 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表达信号主要位于细胞质，少数 位于细胞核，( 图片1 - 4 ) 。在4 0 例n s c l c 组织中，s t a t 5 a 蛋白阳性表达 3 6 例( 其中弱阳性表达6 例，阳性表达8 例，强阳性表达2 2 例) ，阴性表达4 例，阳性表达率为9 0 。 1 1 2s t a t 5 a 蛋白在正常肺组织中的表达 在2 0 例正常肺组织中，s t a t 5 a 蛋白阳性表达4 例( 其中弱阳性3 例，阳 性1 例，强阳性无) ，阴性表达1 6 例，阳性表达率为2 0 。如图片5 。 1 1 3s t a t 5 a 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达比较 s t a t 5 a 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达比较，经过统计学 分析，差异有显著性( 尸 o 0 1 ) ，s t a t 5 a 在n s c l c 组织中的表达水平明 显高于正常肺组织，( 见表1 ) 。 表1s t a t 5 a 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达 t a b l e1 e x p r e s s i o no fs t a t 5 ap r o t e i ni nn s c l c t i s s u ea n dn o r m a ll u n gt i s s u e 注：a p 0 0 1v s 正常肺组织 1 2s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达 1 7 1 2 1s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织中的表达 s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表达信号主要位于细胞核，( 图 片6 9 ) 。在4 0 例n s c l c 组织中，s t a t 5 b 蛋白阳性表达3 2 例( 其中弱阳 性1 2 例，阳性6 例，强阳性1 4 例) ，阴性表达8 例，阳性表达率为8 0 。 1 2 2 s t a t 5 b 蛋白在正常肺组织中的表达 在2 0 例正常肺组织中，s t a t 5 b 蛋白阳性表达3 例( 其中弱阳性1 例，阳 性2 例) ，阴性表达1 7 例，阳性表达率为1 6 6 7 。( 图片1 0 ) a 1 2 3s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达比较 s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中表达比较，经过统计学分 析，两者有显著性差异( 尸 o 0 5 ) ，但是与患者的 性别有一定的相关性( 尸 o 0 5 ) 。( 见表4 ) 。 表3 s t a t 5 a 蛋白表达与n s c l c 各临床病理因素的关系 t a b l e3c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fs t a t 5 a p r o t e i na n d d i f f e r e n te l i n i e o p a t h o l o g i ef a c t o r si nn s c l c 表4s t a t 5 b 蛋白表达与n s c l c 各临床病理因素的关系 t a b l e4c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fs t a t 5 bp r o t e i na n d d i f f e r e n tc l i n i c o p a t h o l o g i cf a c t o r si nn s c l c 2 。3s t a t 5 b 在n s c l c 中的表达在男女患者中表达不同( 伊o 0 2 5 ，p o 0 5 ) 。( 见表8 ) 表8s t a t s a 蛋白与s t a t 5 b 蛋白在n s c l c 组织中表达的相关性 t a b l e 6c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fs t a t 5 aa n ds t a t 5 bi nn s c l c c o r r e l a t i o n s 甄讯5 a飘心5 b s p e a r m a n sr h o s t a t 5 ac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t1 0 0 02 2 8 s i g ( 2 - t a i l e d ) 1 5 7 n 4 04 0 铤5 bc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t 2 2 81 0 0 0 s i g ( 2 - t a i l e d ) 1 5 7 n 4 04 0 图1s t a t 5 a 蛋白在鳞癌组织中的表达( s p 法4 0 0 ) f i g 1 e x p r e s s i o no fs t a t 5 ap r o t e i ni ns q u a m o u sc a r c i n o m a 图2s t a t 5 a 蛋白在鳞癌组织中的表达( s p 法4 0 0 ) f i g 2e x p r e s s i o no fs t a t 5 ap r o t e i ni ns q u a m o u sc a r c i n o m a 图3s t a t 5 a 蛋白在腺癌组织中的表达( s p 法x 4 0 0 ) f i g 3e x p r e s s i o no fs t a t 5 ap r o t e i ni na d e n o c a r c i n o m ao fl u n g 图4 s t