（农业昆虫与害虫防治专业论文）用dna指纹技术鉴定布氏田鼠种群内亲缘关系的初步研究.pdf

摘要 布氏田鼠( m i c r o t u sb r a n d t i ) 是典型的草原鼠种，其种群内亲缘关系的确定对r 研究种群动态 具重要意义。传统确定亲缘笑系的方法是根据布氏田鼠的彳了为观察及形态生理特征来判别。d n a 指纹技术的诞生为亲缘关系的鉴定提供了客观准确的依据。本文对分子标记中能用于个体亲缘 识别的d n a 标记技术r f l p 、r a p d 、多位点小p 星d n a 指纹技术、多位点微卫星d n a 指纹技术 及单位点微卫星指纹技术进行了探讨比较，认为单位点的微卫星指纹技术是进行亲缘鉴别的首选 方法。 从g e n b a n k 中t h en u f f i e dd e p a r t m e n to f s u r g e r y 克隆测试的小家鼠( m u sm u s c u l u sd o m e s t i c u s ) 微卫星位点中选择1 9 个位点扩增筛选出布氏田鼠基冈组d n a 中8 个多态性明显的位点，对一个 有2 雄1 雌亲本的家族、一个亲缘关系明晰的家族及一个捕自野外个体亲缘关系不清的家族分别 进行单位点微卫星指纹分析，判别亲缘关系。结果对丁2 雄l 雌亲本的家族，成功排除了非生物 学父亲；亲缘关系明晰的家族d n a 指纹幽谱符合盂德尔遗传定律；对丁野外捕获的家族，先进行 年龄结构划分，区分开代别，然后分析单位点微卫星指纹图谱，鉴定清楚了个体关系。证实单位点微 卫星d n a 指纹技术鉴定布氏田鼠种群内亲缘关系的可靠性，为实际应j _ i j 奠定了基础。 关键词：布氏田鼠，d n a 指纹，单位点微卫星，亲缘鉴别 a b s t r a c t b r a n d t sv o l e s ( m i c n 7 l u sb r a n d t i ) i s o n e o f t h e t y p i c a ls p e c i e so f t h ep a s t u r er o d e n t s ，i ts i m p o r t a n t t oe s t i m a t et h ek i n s h i po ft h ei n d i v i d u a l si nag r o u pw h e ni n v e s t i g a t i n gt h ep o p u l a t i o nd e v e l o p m e n t t r a d i t i o n a l l y ，t h ek i n s h i p w a se s t i m a t e d b y t h e e c o l o g i c a l m e t h o d sb a s e do ni t sb e h a v i o r , t h e m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e ra n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a t e r n o wb yd n af i n g e r p r i n t i n g ，w e c a na c c u r a t e l y i d e n t i f yt h ek i n s h i pw ec o m p a r e dt h e m o l e c u l a rm a r k e r sw h i c hc a ni d e n t i f yt h ek i n s h i po ft h e i n d i v i d u a l ，i n c l u d i n gr f l p r a p d ，m u l t i l o c u sm i n i s a t e l l i t e sa n dm i c r o s a t e l l i t e sd n a f i n g e r p r i n t i n g a n dm o n o l o c u sm i c r o s a t e l l i t e sd n af i n g e r p r i n t i n g ，w i t ht h er e s u l tt h a tt h em o n o l o c u sm i c r o s a t e l l i t e s d n a f i n g e r p r i n t i n gi st h eb e s t i nt h i ss t u d y 1 9m i c r o s a t e l l i t e si o c io f t h em o u s e ( m u sm u s e u h md o m e s t i c u s ) w e r ec h o s e nf r o mt h e g e n b a n k ，w h i c hh a db e e n s u b m i a e db yt h en u f f i e l dd e p a r t m e n to fs u r g e r y ，8o ft h ei9l o c iw e r e f o u n dp o l y m o r p h i c ，a n dw e r eu s e di nt h em o n o l o c u sm i c r o s a t e l l i t ed n a f i n g e r p r i n t i n gt oi d e n t i f yt h e k i n s h i pa m o n g t h ei n d i v i v a l si nt h r e eg r o u p sf o rt h et h r e eg r o u p s ，t h e r ew e r e2m a l e sa n dlf e m a l e p a r e n t si no l q eg r o u p ，a n dt h ek i n s h i pw a sc l e a ri na n o t h e rg r o u p ，w h i l et h ek i n s h i po f t h ei n d i v i v a l s c a p t u r e df r o mt h ep a s t u r ew a sn o tc l e a ri nt h et h i r dg r o u p i nt h ee n d ，t h en o b f a t h e rw e r em a d eo u t f r o mt h eg r o u pii i i ，a n dt h ei n d i v i d u a lf i n g e r p r i n t i n gm a pi nt h eg r o u p1 1w a sf o u n da c c o r d i n gw i t h t h em e n d e lsl a w t ot h ei n d i v i v a l sc a p t u r e df r o mt h ep a s t u r e ，w ei d e n t i f i e dt h ep a r e n ta g e sa n dt h e o f f s p r i n ga g e sa c c o r d i n g t ot h ea g e a n dt h e nc o m p a r e dt h em o n o l o c u sm i c r o s a t e l l i t ed n a f i n g e r p r i n t m a pa n di d e n t i f i e dt h e i rk i n s h i p w ec o n f i r m e di t w a sa c c u r a t et ou s em o n o l o c u sm i c r o s a t e u i t ed n a f i n g e r p r i n t i n g t oe s t i m a t et h e k i n s h i pw i t h i ns o c i a lg r o u p so f b r a n d t s v o l e s k e y w o r d s ：b r a n d tsv o l e s ( m i c r o t u sb r a n d t i ) - d n a f i n g e r p r i n t i n g m o n o l o c u sm i c r o s a t e l l i t e s k i n s h i pi d e n t i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：孟毯时间： 。争年月加日研究生签名： 血乏登 时间： 一争年6 月2 一日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：，王整时划：卯争年月加 e | 导师签名 时间：萨 丫年，月z 。日 1 1 引言 第一章绪论 鼠害是我国草原重大的自然灾害之一。布氏田鼠( m i c r o t u sb r a n d t i ) 是典刑草原害鼠分布， 俄罗斯外贝加尔、蒙古国中部与东部以及我国内蒙占。在内蒙，主要分布在呼伦贝尔和锡林郭勒 草原( 施人钊，1 9 9 8 ) 。布氏田鼠的活动，不但宦接影响草原上植物的生k ，铍上f 、植被，使十地 裸露而且其挖 l f | 活动改变了十壤结丰勾和微地形，使植被向着不利丁放牧的方向演化。即使灭鼠 之后仍需3 - 5 年才能恢复严重影响畜牧业的发展。布氏田鼠的活动对丁草原更新起延缓作 ，是 长期影响草原生产力的主要因素之( 呼伦贝尔草原鼠害调查组1 9 7 5 ) 。 脚l l 群居布氏鼠的删群外越( - - 个家族的居件 h 东， i _ u 为那氏简) 拦j 一2 内敲古典型孽暾布氏i l 鼠桐系 ：璺垒些奎兰罂：兰鳘鎏兰。，。，。，。二譬：耋。釜童 草原害鼠不仅大量啃食牧草，还危害植物根系，尤其是靠根蘖繁殖的禾本科优良牧草的比例 大幅度f 降，在严重地段，草地其至完全火去其利用价值( 陈军，2 0 0 3 ) 。内蒙古太仆寺旗的布 氏田鼠在中等数量年份平均有鼠洞8 7 0 2 1 5 0 个h m 2 ，日消耗牧草l i 植物生艮鼙1 ，2 以上。优良 牧草羊草、冰草等基本消火，其余植物人多为革质低劣的杂类草。而且草群低矮t 在植物生欧旺 季的8 月份，牧草平均高度仅1 4 8e m ，草场己基本火去了放牧价值( 施人钊海淑珍，1 9 9 6 ) 更 为重要的是大量鼠类的挖掘改变了士壤的表层结构，深层钙积十被抛到地面这些土不仅抑制植 物生氏，而且极易被风吹起，形成扬沙天气或被雨水冲散，覆盖植物，加剧了草原的沙漠化进 程( 图1 2 ) 。鼠类挖掘形成的“十r ”在风蚀、径流的作用r 成为我国北方沙尘暴的重要源头( 陈 军，2 0 0 3 ) 。 1 2 亲缘关系的确定对研究布氏田鼠种群的意义 亲缘关系( k i n s h i p ) 。“义上说，就是分享等伉基冈。一般来说，就是通过较近的共同祖先而在个 体间分享可遗传的表现型特征。( h u r s tjl a n db a m a r dcj ，1 9 9 2 ) 亲缘关系与社会行为的研究源丁- 行为生态学，其研究内容包括种群动态( c h a r n o v e l a n d f i n e r t yjp ，1 9 8 0 ) 、配偶选择、领域行为及般亲行为等方面( h u r s tjl ，e ta l ，1 9 9 4 ) 。其对社 会行为的影响在l 啮齿类动物中作用更加明显，甚至对种群动力学和种群波动变化都发挥着重要作 用( c h a m o vel a n df i n e r t yjp ，1 9 8 0 ；l a m b i nx a n dk r e b scj ，1 9 9 3 ：l a m b i nx a n dy o c c o z n g 。1 9 9 8 ) 。 1 2 1 对布氏田鼠种群动态研究的意义 布氏田鼠( m i c r o t u s b r a n d t i ) 通常有几只至l o 多只，多时可达2 0 几只共栖于一个洞内。在繁殖 季节有明显的巢域行为，全年以洞群形式居住，形成特殊的洞穴结构和洞口配嚣( 图i 2 ) 。张洁等 ( i 9 8 1 ) 从洞群中布氏田鼠的种群组成利巢域行为分析，认为共栖的个体可能属于同一“家族”， 其成员组成有季节和年度变化。变化特点表现在群体的大小，成员的组成和比例以及雌雄性比。 这些特点都和繁殖情况直接有关系，它影响数链变化和洞口系数也影响洞群内群体组成。但从 单纯的生态观察角度难以肯定洞群内个体均为一个“家族”。臆大钊等通过野外标志流放和实验 室观察研究洞群内布氏田鼠 t 群结掏变动的过挫中，发现标志方法无法判断大多数消火鼠的实际 存活情况。但从历年标忠的资料加上实验室现察的结果，推断社群内部的稳定基础可能是亲缘关 系。同洞群内亲缘关系以亲代中的同代为多，饥孙代亦普遍存在施人铡等，1 9 9 9 ) 。这种亲缘关 系有两个明显的阶段。一是繁殖期( 3 - 7 月) ，当气候转暖，牧草萌发时洞群内均为越冬成体( 或老 体) ，频繁的交配活动使鼠的短距离迁徙成这期阐的活动特点。无亲缘关系洞群的比例亦降至最低， 仅为 5 0 。当5 7 月当年出生的鼠长至胍成体后部分个体离开母鼠进人陌生洞群，其中有的被其它洞 群接受，有的在废弃洞定居，有的利用临时洞扩展为新洞群，其亲缘比例也较低。二是贮草期间 ( 8 1 0 月) ，鼠开始为越冬而贮草时，洞群内成员相对稳定。所有的洞群均保持有亲缘个体。尽 管仍有新成员进入，但洞群内具有亲缘关系的成员显然对维系其稳定起着重要作用。甚至这一时 期出生的大多数幼鼠也留在出生洞群内与亲鼠共同贮草越冬( 施人钊等，1 9 9 8 ) h a l ( 1 9 9 7 ) 认为动物的群体在繁殖期间的竞争、合作及其优势序位对动物种群的保存乃至进化 具有重要的作用。据此，探究其稳定的基础对深入认识群居田鼠的种群特性具有现实的意义。在 研究布氏田鼠社群结构数量变动的过程中发现，数讨增艮期布氏田鼠洞群内个体间亲缘关系的比 例较大，具有明显的阶梯型年龄结构，其序位等级比较稳定：迁入的个体对原序位影响不显著。 这种格局有利于“家族”的稳定。而数餐r 降删7 6 新组成的“家族”内个体间很少亲缘关系， 其年龄接近，个体间的序位竞争激烈：造成社群个体存活率r 降。并有6 5 的洞群内的母鼠未能 繁殖，且出生个体存活率极低( 旋大钊等，1 9 9 9 ) 。 亲缘关系对减少群内竞争，增加群体亲合程度是有现实意义的。从这点分析，将洞群内的个 体组合视为“家族”是有依据的。鼠群内部个体间依靠一定的“秩序”减少竞争彼此共存，进而 可保持种群的稳定。在箨时期，布氏田鼠洞群内成员间均保持一定的亲缘关系对于稳定鼠群可能是 必要的。h c s k e 等( 1 9 8 4 ) 对m i c r o t u so e h r o g a s t e r 的研究发现幼鼠与母鼠间在一定时期内共栖对种 群是有利的，其结果与布氏田鼠相似。 在自然条件下，由了二无法判断雄鼠与其后代的_ 芙系，所以实际洞群内个体问的亲缘关系可能 更为复杂多样，常用的标志方法的局限使得洞群内 = f ：l 孙鼠问的关系只能根据其洞群内状况判断， 甚至母鼠与子代鼠的关系也只能依靠出生期判断。 1 2 2 对婚配关系研究的意义 对于布氏田鼠的婚配制度，一些学者在研究其雌雄性比、空问分布格局、巢域和洞群内群体 结构时作过分析但大都末给出肯定明确的结论。其土要原冈就是滩以理清种群中个体之间的关 系，进而影响了对其行为作出正确的判断。 对鼠类婚配制度的深入研究，人们正试图确立一定的研究范式。建立一定的标准但由丁对 鼠类社群结构、种群生态、个体行为等还缺乏更全面、更深刻的认识，这些范式、标准还存在不 少问题，若不同学者运用不同的指标进行分析，可能会得出不同的结论。这些都是由丁所采川的 指标不够客观肯定。 动物个体行为是长期进化的产物，是其生活环境和遗传相互作用的结果。环境条件的变化， 必然引起动物个体行为的改变。其各种性状最终都可归结为遗传物质的作用，要全面研究布氏田 鼠的婚配制度尚需野外种群的行为学研究，如在初春和秋季捕尽个洞群内的全部个体。探讨 个体间的亲缘关系。 1 2 3 对巢域行为研究的意义 雌雄鼠交配后 雒鼠是否不和垛鼠共巢，不参与双亲抚育，抚育幼仔的任务是否完全由雌鼠承 3 担? 中科院动物研究所生态一组( 1 9 7 9 h ) 对其巢域研究时指出，布氏田鼠是属- 家族共f i 一定 巢域，巢域闻有某些区域相重叠的类型，但并没有提出“家族”由哪些成员组成不同时期家族 成员的活动距离与家族的亲缘关系是否有关等问题。这些问题有的室内研究与野外研究结果不 同，不能说明野外的实际情况，有的则不能在室内研究而野外研究的行为观察必须与亲缘关系 的准确判别结合才能说明问题。 1 2 4 对双亲行为研究的意义 布氏田鼠在野外是以洞群为单位进行活动的，这种包含复杂亲缘关系的居群生活自然会影响 到顺亲行为的投资方向( 尹峰等，1 9 9 8 ) 。检验双亲行为利杀婴行为是否受亲缘关系影响，可为初 步了解布氏田鼠调节社群结构的机制提供一定的理论依据，这也需要对亲缘关系的准确判别。 1 3 宏观生态学中确定布氏田鼠种群亲缘关系和年龄结构的方法 1 3 1 “家族”的区分 因为布氏田鼠共栖的个体可能属于同一“家族”，野外首先必须界定出独立“家族”的洞 系，划分出属于这一“家旗”的个体，然后再根据行为特征进行采缘辨划年i i 排除。目前，亲缘辨别 的机制主要有两个途径：一是由个体间的交往经历而形成的熟悉性( f a m i l i a r i t y ) ，另一个是个体间 的表现型匹配( p h e n o t y p em a t c h i n g ) ，这两种途径已经在啮齿动物中得到广泛证实( h e p p e rpg 1 9 9 1 ：于晓东等，1 9 9 1 ) 。据此，在宏观生态中依据巢域行为、嗅闻信号等因素可判别布氏田鼠 的家簇中的个体成员。 1 3 1 1 巢域行为 巢域( h o m er a n g e ) 是一个动物或一个“家族”在正常生活期间，进行取食、交尾、隐蔽等活 动的区域。巢域有一定的范围，但是，其中的某些区域可以允许其它个体进人。在自然情况f 布氏田鼠是以“家族”形式共d i 据一定的巢域。一个洞群内在繁殖季诲( 5 - 8 月) 通常雌性成 体多于雄性成体，而且成年雄鼠往往只有一只，到了秋季准备越冬时，雄鼠才慢慢多于雄性( 谢 小明等，1 9 9 4 ) ，所以，同一洞群内。生殖季节可能只是一雄多雌。布氏田鼠“家族”活动范围 的大小及其聚敞决定了鼠洞的聚集程度。当种群数龄上升时，鼠洞密度随之增加很难分辨山洞 系问的界限，使得其洞口早弥散式的随机分布。此时巢域重盏面积也人，家系之间不易辨认。而 当处于数最低峰时，洞系间可出现较人的“空白”地带，节现山明显的聚集分布刑。家系间间隔 明显( 张洁钟文勤，1 9 8 1 ) 。房继明( 1 9 9 1 ) 等研究发现布氏田鼠繁殖后期，母体与几个幼体共 占的巢域与其它的巢域互相隔离，朱成年幼鼠总是在母体的巢域内活动。重叠区逐渐减少。 中国科学院动物研究所生态室一组( 1 9 7 9 b ) 的研究发现几个比较岗定的幼体总是在母体巢 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 域内活动，极少有超出者。幼体的活动范围，随年龄增陈而急剧增长。研究还表明布氏田鼠巢域 中，存在着一个更小范围的巢域中心其活动更多集中在巢域中心。因此可根据一个家系的巢域 范围及其行为表现确认个体是否属丁同一“家族”。 1 3 1 2 嗅闻信号 嗅闻信号在田鼠属动物的鼠群辨别中起着重要作用( b r o w nr e e ta l l 9 8 5 ) ，b r o w n 对 l o n g - e v e a n s 大鼠的研究表明i 断乳前的幼体更偏好自身巢的气味，这可能是以亲体基因型为基础 的嗅觉印记( o i f a c t o 叫i m p r i n t i n g ) 的一种表现( b r o w nr e e l a l 1 9 8 2 ) 。 布氏田鼠出生后至扩散前的个体行为发育过程中，哺乳中的幼鼠对所有哺乳期雌鼠气味都表 现出明显的偏好，而不能分辨其母体与陌生雌鼠的气味。山生后2 4 日龄起，幼体对自身群体巢垫 物的挖掘频次开始显著多丁对陌生群体巢垫物的挖掘：2 7 日龄后，幼体对不同群体气味的嗅闻行 为在频次和时间上才现出明显的偏好。说明幼体能够利用气味信号来辨别自身群体和陌生群体 ( 张立等，2 0 0 0 ) 。张立等还发现与幼体不同，5 0 - - - 9 0 日龄的成年雄鼠对陌生群体气味探究行为 的频次和持续时间明显多于对自身群体气味的探究( 张立房继明，1 9 9 6 ) 。s t o r e y 等发现，在 给予成年雄鼠熟悉的幼鼠群体气味时，将有效地减少其对幼体的攻击倾向，而且暴露在熟悉气味 下的雄鼠对陌生幼鼠的攻击也会减少( s t o r e y ae p t 口，】9 9 4 ) 。 1 3 2 年龄结构的划分 在自然界布氏田鼠的寿命一般为一年左右。往往来能进到老年组就死亡，中国科学院动物研 究所生态室一组( 1 9 7 8 ) 根据体长将其划分为四个年龄组( 见表l 一1 ) ，武晓东( t 9 9 0 ) 根据体 重将其分为5 个年龄组( 见表1 - - 2 ) 。 周延林等( 1 9 9 4 ) 根据体重、体长、尾长、眼晶体干重、头骨的颅全长、颅基长，颅高、后 头宽、腭长、颧宽、眶间宽、鼻骨长、上齿隙宽、上齿列及f 齿列路块1 5 项指标进行的主分 量分析表明头骨的上齿隙宽冈不存在性别差异，容易准确度鼙，操作简便，可用作划分年龄组的指 标，据此将布氏田鼠划分为5 个年龄组( 见表1 - 3 ) 。 表l l 按体长将布氏田鼠划分为4 个年龄组f 单位：r a m ) 表i 一2 按体重 f 布氏鼠划分为5 个年龄组( 甲位：喜) 表i 一3 按j 齿隙宽将布氏 | 鼠划分为5 个年龄组( 单位：r a m ) 幼体组 弧成体组成体一组成体二组老体纽 9 4 4 1 3 3 代际划分 由于布氏田鼠寿命短暂、种群更新很快幼仔生长发育及性成熟速度具有明显季节性，其生 理年龄与时间年龄多数存在着不一致。在删各种形态指标划分年龄组时应该将其生艮发育利性成 熟的季节考虑进去，即春季和秋季不能使用同一体艮体重等形态指标。 根据生理年龄分析布氏田鼠的年龄结构动态，可大致判断代际关系。刘志龙、孙儒泳( 1 9 9 3 ) 根据胴体重分布和繁殖状况将其分为3 个生理年龄组：越冬鼠、性成熟的当年成鼠和性未成熟的 当年幼鼠。 越冬鼠与当年鼠：当年鼠生长很快，最火胴体量逐渐增加，越冬雌鼠胴体重变化不人。在 3 到7 月上半月很容易区分两类鼠，其根据就是越冬鼠胴体重，当年鼠胴体轻，两者之间有明显 的断裂。 当年成鼠与当年幼鼠：区分当年成鼠与幼鼠的主要根据为生理上的性成熟指标，即雄鼠副 翠丸中具有成熟精子( 只根据睾丸大小、储精囊大小及睾丸下降到腹腔等特征，还不能确定是否性 成熟) ：雌鼠的子宫有受孕的状态，即有明显固定于胎座的胚胎和尚朱形成胎座但子宫中有游离状 态的胚胎( 此时黄体很明显) ，此外阴道中具有交配后形成的阴道栓的雌鼠都看作成年鼠。 罗泽殉0 9 7 5 ) 运_ i = j 体重分布频次核对方法区分越冬个体与当年个体，超过4 5 9 为越冬老年个 体，小于4 5 9 为当年生个体。 如果结合标志重捕技术，进一步将当年鼠划分为春季出生，夏季出生和秋季出生的并结合 各亚组的性成熟程度来研究种群结构可获得更深入、更有意义的规律性。 1 4 鉴定晡乳动物亲缘关系的常用分子生物学手段 生态学是研究有机体与其环境全部关系的科学，其中心是研究宏观自然规律的形成与发展。 而分子生物学立足丁生命的微观机制，从逻辑上讲二者也是相互补充的学科。肋着学科的发展生 态学出现了需要由分子生物学来解决的问题，分子生物学也将其触角伸向了生态学领域。生态学 中的一些问题，如个体问亲缘关系，实际是遗传多样性问题，而遗传多样性检测的方法多种多样， 不同的技术从不同角度、不同层次揭示了物种的遗传背景信息。白1 9 6 6 年h a r r i s 、j o h n s o n 录l h u b b y 等采用蛋f 质电泳技术首次研究了同工酶和蛋白质的多态性以来，各种新的技术不断涌 现，并逐渐从蛋向质水平深入到d n a 水平t 如d n a 指纹图谱、d n a 限制性长度多态性分析( d n a 6 r f l p ) 、随机扩增多态d n a 分析( r a p d ) 、d n a 序列分析等( 季维智宿兵，1 9 9 9 ) 。 这里着重介绍一f 可用于鉴定亲缘关系的遗传多样性检测手段，主要由同上酶分析技术、随 机扩增多态d n a 分析( r a p d ) 、d n a 指绞图谱技术，这些技术是随着分子生物学的发展而不 断发展，优劣各异。 1 4 ，1 同工酶电泳技术 蛋白电泳( p r o t e i ne t e c t r o p h o r e s i s ) 技术是根据同i 酶( i s o z y m e ) 或1 f 酶蛋向质电荷性质的差 异在一定的电泳支持介质中( 如淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺等) ，将由不同遗传鹰传( g e n e t i cl o c i ) 编码或由同一座位不同等位基冈编码的酶一“等位酶”( a l l o z y m e ) 或蛋白质分开，从而达到鉴剐基 因型、判断出亲缘关系的目的。 因铸位酶直接对应于等位基冈，故2 0 i 廿：纪6 0 年代以来，其被发展为广泛麻用的分子标记 用来探测种群的遗传结构，分析等位基冈频率。对比不同个体足够多的等位酶谱。就可鉴别它 f 的 亲缘关系。该技术相对于d n a 分析技术而言，操作简便，花费较少，统计方法标准。并有大萤的前 人研究的资料可供借鉴。但蛋白质是基冈表达加i 后的产物，不能真实反映遗传物质本身的变异 性：其能够分析的遗传座位数少再者蛋自电泳技术因为蛋向水平进化较慢，对于一些狭域分布 的地方种群，往往缺乏多态性位点，无法进行等位酶分析。这些都限制了其应用。 1 4 2 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r a p d ) r a p d 技术是以随机引物( 一般为8 - 1 0 b p ) 通过p c r 反麻1 定点扩增d n a 片段然后用凝胶 电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增d n a 片段的多态性；其所用的一系列引物的d n a 序列各 不相同但对于任一特定的引物，它同基e ! i | 组d n a 序列有其特定的结台值点，如果基因组在这 些区域d n a 发生片段的插入、缺失或碱基突变就可以导致这些特定结合位点分布发生相应的变 化，而使p c r 产物增加、减少或发生分子簟的改变。 r a p d 用于亲缘识别有其自身的优劣其优点是无需知道被测有机体基冈纽的d n a 序列， 因而能应用于所有的生物体：绝大多数的r a p d 标记为孟德尔式遗传，故可用于亲缘i 9 , j ；! j ：由于 所用引物较短且序列随机，闪此能够提供大苗的遗传标记； r a p d 的操作很简便，且费用相对 较低但r a p d 无法分辨纯合子和杂合子因为就随机引物的某一识别位点来说无论纯台子还 是杂合子均能通过p c r 扩增出相麻的片段，这点在亲缘识别时极易产生误导；另外。由于r a p d 标记引物很短，很容易产生人为的扩增产物，所以r a p d 需要严格保证d n a 的质量，需保持扩增条 件严格一致。故稳定性和重复性著。 1 4 3d n a 指纹技术 真核生物基因纽中存在着许多非编码的重复序列，按其在d n a 分子上分布的方式，可分为数 布重复序列和串联重复序列而串联重复序列义撤据重复单位大小不同可分为：小卫星序列。 7 重复单元核心序列含有6 0 0 b p 中间无间隔，总k 度一般小于1 k b ；微卫星序列，或称简单重复序 列( s i m p i es e q u e n c er e p e a t 简称s s r ) 重复单元含有i - - - 6b p 。小卫星和徽卫星d n a 分布于箍个 基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，从而构成丰富的眭度多态 性。 1 4 3 1 多位点的d n a 指纹图谱分析 1 9 8 0 年，w y m a n 和w h i t e 发现井描述了人类基冈组中的第一个高变区，1 9 8 2 年，b e l l 等证实这 些高度多态性区域都是由一短序列( 核心序列) 首尾相连、多次重复而成，重复单位数目的差异导 致了这种高度多态性，这些高变压后来被称为小卫星( m i n i s a t e l l i t e ) ( j e f f r e y se ta l 1 9 8 5 a ) 或称可 变数目串联重复序列( v a r i a b l en u m b e r o f t a n d e mr e p e a t s ) ( n a k m u r ae t a l ，1 9 8 7 ) 。在小卫星d n a 区域内。同源染色体可能有不同数目的重复单位利用限制性内切酶可产生d n a 指纹。1 9 8 5 年。 英国来斯特大学遗传系的j e f f r e y s 等在 ( n a t u r e ) ) 杂志上首次提出d n a 指纹分析技术。 小卫星d n a 由一个核心序列串联重复多次组成，核心序列一般氏度为1 5 3 0 b p ，由于许多具 有相同核心序列的小卫星区域弥散分布于整个基因组中，具同源序列的探针就能检测到多个位 点，并产生复杂的带型模式。在许多种群中，这种带型模式具有个体特异性( j e f f r e y se t a l 1 9 8 5 a , b ： b u r k ea n db r u f o r d ，1 9 8 7 ：w e s t n e a t ，1 9 9 0 ) 。通过两个个体共有带型的比较，可以估计遗传相似度， 将种群水平的变异考虑在内，就可以进一步估计亲缘关系( r e e v ee la l ，1 9 9 2 ) 。小卫星d n a 指纹具有以下一些特点， 多位点性，哺乳动物基因组中存在着上千个小卫星位点，某些位点的小卫星重复单位含有 相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件卜一个小卫艰探针可以同时与十儿个甚至儿十个小 卫星位点上的等位基因杂交。一般来说，一个d n a 指纹探针( 又称多位点探针) 产生的某个个体 d n a 指纹图谱由1 0 - - 2 0 多条肉眼可分辨的圈带组成。由丁人部分杂合小卫星位点，仅一个等位基 因出现在i 訇谱的可分辨区内( 两个等位基因由于重复单位、重复次数不同，在氐度上差异很大) ， 困而每条可分辨圈带代表一个位点。很多的研究表明，个体d n a 指纹酗谱中的带报少成对连锁 遗传。 高变异性d n a 指纹图谱的变异性由两个因素所决定一是可分辨的图带数，二是每条 带在群体中出现的频率。d n a 指纹图谱反映的是基因组中高变区，由多个位点上的等位基因所 组成的图谱必然具有很高的变异性。不同的个体或群体有不同的d n a 指纹图谱。一般选_ f ：i j 任何 一种识别4 个碱基的限制性内切酶，这种变异性就能表现出来。j e f f r e y s 等对人的d n a 指纹豳谱 的研究表明，d n a 指纹图谱中的大部分谱带都以杂合状态存在，平均杂合率火7 - 7 0 ，某些人 片段的杂台率甚至高达1 0 0 。用探针3 3 1 5 进行d n a 指纹分析时，发现两个无血缘关系的个 体具有相同d n a 指纹图谱的概率仅为3 1 0 。1 ：而将探针3 3 l5 和3 3 6 产生的d n a 指纹蚓 谱综合起来分析时- 则这种概率为5 1 0 。9 ，可见d n a 指纹图谱具有高度的个体特异性。但是 同卵双胞胎的d n a 指纹图谱冈其有完全相同的基冈组而是相同的。由r 琼脂糖凝胶电泳分辨宰 的限制，d n a 指纹图谱大片段区域的变异性往往很高。而小片段区域的变异性则很低，因此在 实际操作时往往将小于2 k b 的小片段电泳出胶外或不作统计。 简单而稳定的遗传性t j e f f r e y s 等通过家系分析表明d n a 指纹图谱中的谱带能够稳定地 3 三星查当奎耋罂：耋堡篓耋，。，。，。，。，。耋：，垒彗 从上一代遗传给，f 一代。子代d n a 指纹图谱中的每一条带都能在其双亲之一的圈带中找到，而 产生新带的概率( 由基因突变产生) 仅在0 0 0 1 - - 0 0 0 4 之间。d n a 指纹图谱中的朵合带遵守孟德尔 遗传规律，双亲的各图带平均传递给5 0 的子代。d n a 指纹图谱还具有体细胞稳定性 当然多位点小卫旱及微m 星d n a 指纹技术在分析个体亲缘关系时也存在不足之处：在 作群体水平的分析时，无法知道个体间共享的条带是否来自同一个遗传位点，因此容易产生误差。 谱带的分辨率有一定限度。无法区分纯合子和杂合子，对丁较为复杂的交配系统，如群居 性动物的研究，在技术上、理论上和统计方法上仍存在一定的困难。 1 4 3 2 单一位点d n a 指纹图谱一微卫星分析技术 1 4 ，3 2 1 微卫星含义与结构特点 d n a 指纹图谱的重要发展是微卫星d n a 指纹图谱。微卫星是由2 “个核甘酸组成的重复单 位串联排列而成的d n a 序列。早在1 9 7 4 年，s k i n n e r 等就在奇居蟹( h e r m i tc r a b ) 基因组中发现了 微卫星d n a ，当时叫做简单串联重复序列( s s r ) 。s i n g h 等人在1 9 8 0 年发现蛇的w 性染色体 上也存在着这种序列，它是由g a t a g a c a 重复单位组成的。以后的研究表明在真核生物甚 至原核生物的基因组中都普遍存在这种序列( j o n e se ta 1 ，1 9 8 1 ) 。微甲星的重复类型有单核苷 酸重复如a 厂r 、c g ，四种二二核苷酸重复a t 厂r a 、a c t g 、a g t c 、c g g c 以及三、四核苷酸重 复类型等，但研究发现较多的为a c t g ，约占5 7 ，其它的类型较少( m o o r e ，1 9 9 1 ) 。微卫 星在基因组中是均匀分布的，除着丝粒及端粒区域外其它区域均j h 泛散布有微卫星位点( w i n t e r 由，1 9 9 2 ) 。真核生物中每1 0 k b 就存在一个简单重复的d n a ( t a u t z ，1 9 8 9 ) 。 1 4 。3 2 2 微卫星位点的多态性及其特异性 微卫星是一种多态的标记，但本身却无位点的特异性。不能确切定位，利_ ；i 时只能同小卫星 d n a 一样，仅限于作为多位点探针制作d n a 指纹。为解决这一问题，o l s o n 等( 1 9 8 9 ) 提出了 序列示踪位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e ，s t s ) 的概念，此后b e c k m a n n 等( 1 9 9 0 ) 提出使用微卫 星序列构成s t s ；一以微卫星基序为中心，两侧各加一段侧翼序列即序列示踪微卫晕位点( s t m s ) 。 由于侧翼序列在基因组中是单拷贝的，且具有位点的特异性，因此，这两段侧翼序列可以将包含 于他中间的微卫星特异地定位于基因组的某一部位，微卫星本身重复数目的变异，构成了微卫蔗 位点丰富的多态性但其同位点的侧翼序列在不同物种基因组中具有同源性义使其具有高度的 保守性。 1 4 3 2 3 微卫星与个体及亲缘关系的鉴定 微卫星序列的两侧顺序常较保守，在等能基因间多相同。由丁多数微卫星无功能作j _ 增加戏 减少几个重复序列的重复数不影响生物的止常生欧发育，因而在个体闻具，“泛位点变异，两不同个 体( 除同卵双生子) 足够多的微卫星位点产生的d n a 指纹相同的概率接近予零徽卫星遗传也 9 遵循孟德尔遗传规律，能够g 上- - 代遗传给下一代，子代的d n a 指纹图几乎每条带都能在双亲 指纹图中找到，因此可以将其应崩于个体或群体亲缘关系的鉴定。 由于徽卫星位点核心序列的相同，可以进行多位点指纹分析，1 9 8 6 年，a l i 等人首次用合成 的g a t a g a c a 寡聚核甘酸作探针悄丁人的d n a 指纹分析，成功地开创了利用微卫星d n a 探 针进行d n a 指纹分析这一新的领域。撒卫星探针易于合成，可直接与固定在干胶中的d n a 片段 杂交，所检测的位点普遍具有高度的变异性。但同样存在着与多位点小卫星d n a 指纹同样的缺 陷。 1 9 9 3 年w u 和t a n k s l e y 改变用小卫星探针显示带谱的方法，创造了j is s r 侧翼序列作引物的 一部分，用来扩增重复序列本身，由于侧翼序到在基因组中是单拷贝的，且具有位点的特异性，冈 此这两段侧翼序列可以将包含于它中间的微卫星特异地定位丁基因组的某一部位，由于重复序列 的长度变化极大，阁此是检测多态性的一种有效的方法。在某个体基因组两条同源染色体的相对位 置上，若侧翼序列包含的微卫星重复单位数目相同，则该个体在该微卫星位点是纯合的：若微卫 星重复单位数目不同，则该位点基因型为杂合体。以某微卫星侧翼序列作为特异引物，以不同个 体的基因组总d n a 为模板进彳亍p c r 扩增，观察其扩增产物在测序凝胶上特异性带型，即可进行个 体阈的亲缘判别。w e b e r 对人类基因组中重复序列( c a ) 。的研究表明，当u 低丁- 1 2 时，徽卫星 主要表现为单态行为，超过这个值时，出现多态的可能性随微卫星的长度而增加。该技术一般检 测到的是一个单一的多等位基因位点，此标记为共显性所得的结果重复性高。为了提高分辨率常 使用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，它可检测出单拷贝差异。 1 43 2 4 微卫星分析的一般步骤 常规微卫星分子标记技术一般经过以下步骤；基因组文库的构建一含育微卫星克隆的识 别和筛选一测序一引物设计一检测所设计的引物。由于要建基因组文库，并需要对每个克隆进行微 卫星筛选和鉴定，工作量非常大，找到一个有用的微卫星位点需要花费大量的人力物力，也需要花费 大量的时间，影响了该方法的推j “普及。 利用已发现的微卫星位点寻找新的位点。1 9 9 1 年，m o o r e 发现了哺乳动物基因组中微卫 星位点侧翼序列的保守性。微卫星序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性使得微下 星可以进行跨物种使用a 随后一系列的研究证实对同属、科、目的不同物种也可以使用异种引 物扩增微卫星t 从而推动了微卫星分析的麻用。使用g c g ( o e n e t i e sc o m p u t e r g r o u p ) 序，o 分析软件 包在d n a 数据库【如g e n b a n k ( 美国) 、m m d b j ( 日本) 和e m b l ( 欧洲) 】齑寻或利用其他文献中 已有位点根据找到的位点，设计相应的引物。在目标d n a 中进干亍p c r 扩增。然后对扩增产物 进行分析。这种方法较为简单、方便，最犬的好处是：p c r 的引物和p c r 的反应条件都已知， 在优化反应条件上少花时间。 1 4 3 2 ，5 微卫星分析中的一些需注意问题 有些物种的微卫星位点的获得很困难另外p c r 反应本身会产生一些问题，如由于引物位 点的突交可能导致无效等位基因的出现，d n a 聚合酶可能产生易观察的滑动产物特剐是单接苷 0 ：曼奎兰垡塞圭茎鲨耋。，。，。，。，。，茎二：。，丝警 酸位点，因而使得等位基因难以观察。所以在使川微卫星分析研究动物的遗传关系时必须尽力 消除一些误差来源。因此枉样品d n a 的制备、电泳胶的装载、结果的观测和计算等必须将其误 差机率减小到晟小程度，如无效等位基因的排除、电泳误差造成的不l e 确的基因型可能导致错误 地排除其个体的真正父母或错误地接受假的父母。 1 4 3 2 6 基因芯片技术与d n a 分析 基因芯片是近几年发展的技术，它以核酸杂交为基本原理，在多态性检测领域有广泛府用。 将基因芯片与微卫星技术结合起来，将更加有利其在遗传多样性检测中的应用。如用基因芯片可 较快地一次大量地筛选微卫星位点：可利_ i j 芯片一次进行人数耸的p c r 扩增；对于微卫星位点 知道较多的物种可将微卫星位点制成芯片进行多态性检测从而人大减少【：作量。 1 5 国内外研究现状 d n a 指纹图谱技术于8 0 年代末在国外已被厂泛应用f 行为学尤其是动物繁殖行力学研究中， 国内在此方面的应用尚少。 1 9 7 9 年w e t t o n 的实验小组就在b r a c k e n b u r s t 农学院附近的农田中研究家麻雀( p a s s e r d o m e