（内科学专业论文）遗传性扩张型心肌病lmna基因突变的致病机理研究.pdf

独创性声明 f f f f 舢 y 17 7 5 9 1 百。 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 一躲知蜀每槲期：孙年孓月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j 匕塞协塑医堂院有关保存、使用学位论文的管理办 法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j 匕塞协麴医堂院可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 撕翕 导师签名： 签字同期： 劲【存s 月易日 签字r 期： 加f d 年 学位论文作者毕业后去向： 主篆盖房向 电话： 邮编： 舛旧 v ，b p 疗 月 r l 北京协和医学院中国医学科学院 博f j 研究生论文 缩略语表 摘要 目录 第一部分遗传性扩张犁心肌病l m n a 基肉突变体表达载体的构建 第二部分致遗传性扩张型心肌病房室伴传导阻滞的核纤层蛋白基冈突变下调钠电流密度 s 7 7 7 第三部分致遗传性扩张型心肌病伴房室传导阻滞的核纤层蛋白基因突变引起缝隙连接4 3 重构8 a b s t r a c t9 p a r t1c o n s t r u c t i o no f t l l ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c c o ro f t h el m n ag e n em u t a t i o n e 8 2 k 、 r 6 4 4 c 、n 1 9 5 k9 p a r t2f a m i l i a id i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y r e i a t e dl a m i na cg e n em u t a t i o ne 8 2 kr e d u c e ss o d i u m c u l l r e n td e n s i 够1 0 p a r t3c o n n e x i n 4 3r e m o d e l i n gi n d u c e db yl m n ag e n em u t a t i o n si nf a m i i yd i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y w i t ha 仃i a lv e n t r i c u l a rb l o c kl o 第一部分遗传性扩张型心肌病l mn a 基因突变体表达载体的构建 前言 材料与方法 实验结果 1 2 1 2 1 4 2 9 第二部分致遗传扩张型心肌病房室伴传导阻滞的核纤层蛋白基因突变下调 钠电流密度 3 2 前言 1 材料和方法 结果 讨论 3 2 3 3 4 6 5 1 第三部分致遗传性扩张型心肌病伴房室传导阻滞的核纤层蛋白基因突变引 起缝隙连接4 3 重构 6 0 前言 方法 6 0 6 0 3 博l ：研究尘论文 6 9 7 2 7 7 9 3 1 0 1 1 0 4 北京协和医学院l | i 固跃学科学院 缩略语 缩写 b p c c c d d c m d m s o e f b s k h e k l m n a i i v n 英语 b a s e p a i r c y t o s i n e c a r d i cc o n d u c t i o nd is e a s e d il a t e dc a r d i o m y o c y t e d i m e t h y ls u l f o x i d e g 1 u f e t a lb o v in es e r u m l y s i n e h u m a ne m b r y o n i ck i d n e yc e ll l 鲫i n ag e n e s o d iu mc u r r e n t c u r r e n t v o l t a g ec u r v e a s p a r a g i n e r a r g i n i n e p c r s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c ti o n s e r 北京协和医学院f f i 困跃学科学院 博l ：研究生论文 北京办和医学院l l 闽医学科学院 博士研究生论文 遗传性扩张型心肌病l m n a 基因突变的致 病机理研究 北京协和医学院 博士研究生 中国医学科学院 孙莉萍 摘要 核纤层蛋白基因突变可以引起扩张型心肌病，其特点是以房室传导阻滞为 首发症状，心脏扩张症状出现迟于电生理异常；患者猝死率高，死因常为恶性心 律失常。其发病机制现在尚不清楚，本研究从分子电生理机制方面探讨传导阻滞 首发的原因，为疾病表型的发生机理提供一个可能的假说。 第一部分遗传性扩张型心肌病l m n a 基因突变体表达 载体的构建 目的：构建遗传性扩张型心肌病l m n a 基因e 8 2 k 、r 6 4 4 c 、n 1 9 5 k 突变体表达载体。 方法：利用快速p c r 定点突变技术，设计一对引物( 包含预定的突变) ，通过p c r 扩 增出含突变位点的质粒，然后转化到超级感受态细胞中，用碱裂解法抽提质粒， 进行测序鉴定，得到构建遗传性扩张型心肌病l 心ae 8 2 k 、r 6 4 4 c 、n 1 9 5 k 突变体 h e k 2 9 3 细胞异源表达载体：通过测序验证突变的正确性。结果：测序验证我们成 功构建了遗传性扩张型心肌病l 心a 基因e 8 2 k 、r 6 4 4 c 、n 1 9 5 k 突变体表达载体。结 论：成功构建表达载体为下一步研究奠定基础。 第二部分致遗传性扩张型心肌病房室伴传导阻滞的核 纤层蛋白基因突变下调钠电流密度 目的：传导阻滞和恶性心律失常常与钠通道障碍有关。因此，本部分研究核纤层 蛋白基因突变对钠通道功能的影响。方法：采用聚合酶链反应法制备相关l m n a 突 变体：e 8 2 k 、r 6 4 4 c 和n 1 9 5 k 。将突变和野生的l 删a 突变体和s c n 5 a 的c d n a 共转到 h e k 2 9 3 细胞，应用全细胞膜片钳技术记录通道电流；利用实时定量r t p c r 和 北京协和医学院- i 圉医学科学院 博1 ：研究，上论文 w e s t e r nb l o t 分析s c n 5 a 基因表达水平。结果：相比于野生型，l m n ae 8 2 k 明显降低 h e k 2 9 3 细胞钠电流密度l m n a ( 8 6 1 9 9 3 6 p a p f ，n = 3 0v s 1 5 5 7 3 1 9 0 9 p a p f ， n = 4 7 ；p = 0 0 0 1 ) ，而l m n ar 6 4 4 c 和n 1 9 5 k 对此无明显影响。l m n a 突变体不影响s c n 5 a 的转录水平，但是l m n ae 8 2 k 会抑制s c n 5 a 蛋白表达，幅度达到30 。其他两个 突变对蛋白表达水平并无影响。结论：核纤层蛋白导致的钠电流密度减小可能是 核纤层蛋白突变致心脏传导阻滞的机制之一，它通过抑制蛋白表达水平抑制电流， 而不影响转录水平；但它并非是唯一机制，l m n an 1 9 5 k 可能通过其它机制引起临 床上传导阻滞的疾病表型。 第三部分致遗传性扩张型心肌病伴房室传导阻滞的 核纤层蛋白基因突变引起缝隙连接4 3 重构 目的：核纤层蛋白基因突变引起的扩张型心肌病的特点是以房室传导阻滞为首发 症状，心脏扩张症状出现较迟。这种疾病表型与缝隙链接蛋白异常引起的心脏疾 病相似。本部分研究核纤层蛋白基因突变对缝隙链接蛋白的影响。方法：利用野 生和突变( e 8 2 k 和r 6 4 4 c ) 的核纤层蛋白基因转染乳鼠心肌细胞，通过共聚焦 显微镜和蛋白印迹分析探索缝隙链接改变。结果：e 8 2 k 突变使缝隙链接蛋白4 3 的 表达量减少4 0 ，其定位也发生改变，由细胞连接处转移到细胞内；但该突变对缝 隙链接蛋白4 0 影响不显著。而r 6 4 4 c 突变对缝隙链接蛋白4 3 和4 0 都无明显影响。结 论：核纤层蛋白基因突变导致的缝隙链接蛋白表达和定位的改变可能是导致心脏 传导阻滞表现的机制之一。 关键词：核纤层蛋白；核纤层蛋白基因突变；s c n 5 a ：缝隙链接蛋白4 3 ；房室 传导阻滞 北京踟和跃学院i f l 翻跃学科学院 t h em e c h a n i s m so fl m n am u t a t i o n s c a u s i n gf a m i i i a ld i i a t e dc a r d i o m y o p a t h y a b s t r a c t c h i n e s ea c a d e m yo fm e d i c a ls c i e n c e s p e k i n gu n i o nm e d i c a lc o l l e g e d o c t o r ：s u nl i p i n g m u t a t i o n sj nt h el a m i na ，c g e n e ( l m n a ) m a yc a u s ef a m j i i a i d j i a t e d ， c a r d j o m y o p a t h y ( d c m ) c h a 陷c t e r i z e db ye a r l yo n s e to fa t r i o v e n t r i c u i a rb i o c k ( a v b ) b e f o r et h em a n i f e s t a t i o no fd c m t h em o i e c u l a rm e c h a n i s m su n d e r i y l n g t h ed i s e a s eh a v en o tb e e nf u yc i a r i f i e d v v bs u g g e s tah y p o t h e s i st h a ti ti sd u e t oa b n o r m a i t i e so fs c n ! ；aj o nc h a n n e ja n dg a pj u n c “o n se x p l o r e du s j n g m o i e c u i a rb i o l o g ya n dp a t c hc i a m p i n gt e c h n i q u e s p a r t1c o n s t r u c t i o no ft h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv r e c t o r o ft h el m n ag e n em u t a t i o n e 8 2 k ，r 6 4 4 c ， n 19 5 k 0 b j e c t i v e ：r oc o n s t r u c tt h ee u k a r y o “ce x p r e s s j o nv e c t o ro ft h ehe r gg e n ea n d e p f e s si nh e k 2 9 3c e m e t h o d s ：a m i n 0a c i ds u b s t t u t i o no fg l u t a m i cf i ) r a s p a r t i ca tp o s i t i o n8 2 、6 4 4a n d19 5 ( e 8 2 k 、r 6 4 4 c 、n19 5 k ) i nl m n aw a s p e r f o r m e db yp o i y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) m u t a g e n e s i sw a sp e r f o r m e db y s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sp c r t h ep r i m e r sc o n t a i n e dt h em u t a n ts i t e t h e m u t a n tp i a s m i dw a sc o n f i r m e db ys e q u e n c ea n a i y s i s r e s u l t s ：t h ee u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e dc o r r e c t i y c o n c i u s i o n s ：t h ec o n s t r a u t sw a s m a d es u c c e s s f u i i y i tw a st h ef o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rf u nc t j o n a is t u d y 9 北京协和医学院中田i 爰学科学院博i ：研究生沦文 p a r t2f a m i a id i i a t e dc a r d i o m y o p a t h y r e l a t e di a m i na ，c g e n em u t a t i o ne 8 2 kr e d u c e ss o d i u mc u r r e n td e n s i 0 b j e c t i v e ：t h ep h e n o t y p eo fl m n 芦卜r e i a t e dd c m i sv e 哆s i m i l a rt ot h ep h e n o t y p e o fs c n 5 a 陀i a t e dd c m t h e r e f o r e w es t u d i e dt h ee 仟e c t so fl m n am u t a t j o n so n s c ：l 、1 5 ac h a n n e i s m e t h o d sa n dr e s u i t s ：t h es o d i u mc u r r e n td e n s i t j e sw e r e s t u d i e di nh e k 2 9 3c e nl i n e sc o t r a n s f e c t e dw i t hw i i d 甘p e ( w t ) o rm u t a n tl m n a ( e 8 2 ka n dr 6 4 4 c ) a n ds c n 5 ac d n au s i n gw h o i e c e i ip a t c h c i a m pr e c o r d i n g t e c h n i q u e s t h ep e a ks o d l u mc u r r e n td e n s i t yw a sr e d u c e ds i g n i f i c a n t i yi nt h e c e l l st r a n s f e c t e dw i t hl m n ae 8 2 kc o m p a r e dt ot h a ti nc e st 阳n s f e c t e dw i t h1 w t l m n a ( 8 6 19 9 3 6 p a ，p f ：n = 3 0v s 15 5 7 3 19 0 9 p a ，p f ：n = 4 7 ：p = 0 0 0 1 ) t h e n e d u c t i o no fs o d i u mc u r r l n td e n s i t i e si nl m n ae 8 2 kn l u t a n tc e sw a sd u et o 几e p r e s s e ds c n 5 ag e n et r a n s l a t i o n t h ei e v e l o fs o d i u mc h a n n e ip r o t e i nw a s 0 7 2 0 1 4i nl m n ae 8 2 kc e sr e i a t i v et oc o n t r o iv s 1 0 1 3i n 、 厂rl m n ac e s ( p 0 0 5 ) ： h o w e v e r t r a n s c r p t i o n o ft h es c n 5 ag e n ew a sn o ta l t e r e d c o n c l u s i o n s ：o u rf i n d i n g ss u g g e s tt h a tt h el m n ae 8 2 km u t a t i o nd o w n r e g u j a t e s s o d i u mc h a n n e if u n c t i o nb yi n h i b i t - n gs c n 5 at r a n s i a t i o nr a t h e rt h a nt r a n s c r i p t i o n ， a n dp r o v i d e sn e wi n s i g h t si n t ot h em e c h a n i s m so fd c ：i v ii nt h e s ep a t i e n t s t h e e a c tm e c h a n i s mo ft h ee 仟e c to ft h el m n ae 8 2 km u t a t i o no ns c n 5 at r a n s i a 髓o n r e m a i n st ob ee i u c i d a t e d p a r t3c o n n e x i n 4 3r e m o d e n gi n d u c e db yl m n ag e n e m u t a t i o n si nf a m i i yd a t e dc a r d i o m y o p a t h yw i t ha t r a l v e n t r i c u l a rb l o c k o b j e d ：m u t a t o n si nt h ei a m i n 芦v cg e n e ( l m n a ) m a yc a u s ef a m i l i a ld - l a t e d c a r d i o m y o p a t h y ( d a t e dc a r d i o m y o p a t h y ) c h a 阳c t e r - z e db ye a r l yo n s e ta t r i o v e n t r j c u i a rb i o c k ( a vb l o c k ) b e f o r et h em a n l f e s t a t i o no fd i i a t e dc a r d i o m y o p a t h y a n dh i g hr s ko fs u d d e nd e a 廿1d u et ov e n tr c u i a ra r r h y t h m i a ，w h i c hi sv e 吖s i m i l a r t ot h ep h e n o t y p eo fg a pj u n c t i o nr e l a t e dh e a d i s e a s e 1 nt h i sp a r t ，w es t u d i e d t h ee f r e c t 0 fl mn am u t a t i o n so nc o n n e x i n s m e t h o d s ：t h ec 4 3a n dc x 4 0 e x p r e s s i o ni nc u i t u r e dn e o n a t a im y o c y t e st r a n s f e c t e dw t hw i d t y p e ( 、，、厂r ) o r l o 北京涛和医学院i 1 困医学科学院 博+ i 二研究生论文 m u t a n tl m n a ( e 8 2 ka n df 1 6 4 4 c ) w e r es t u d i e du s i n gc o n f o c a ii m a g i n ga n d w e s t e mb i o ta n a i y s i s r e s u l t s ：c 4 3p r o t e i ne x p r e s s i o nw a sr e d u c e db y4 0 i n c e st r a n s f e c t e dw i t hl m n ae 8 2 kt h a nt h a ti nc e st r a n s f e c t e dw i t h 、，v tl m n a c d n a c o n f o c aj i m a g j n gs h d w e dt h a tt h ec x 4 3i o c a t e di n s j d eo ft h ec e s b y c o n t r a s t ，l m i 、| ae 8 2 km u t a t i o nh a dn 0e 仟e d0 ne x p r e s s i o na n dl o c a i i z a t i o no f c x 4 0 l mn ar 6 4 4 ct r a n s f e c t i o nd i dn o ts h o wa n ys i g n j f i c a n te 仟e d so ng a p j u n c t i o n s a ta 1 1 c o n c i u s j o n s 一一o u r f i n d i n g ss u g g e s t t h a tl m n ae 8 2 k s i g n i f i c a n t i yr i e d u c e dt h ec x 4 3e x p r e s s i o na n da i t e r e dj t si o c a l i z a t i o nw h i c hm a y b e0 n eo ft h ep a t h o i o g i c a im e c h a n i s m su n d e r f i el m j 、j a r e i a t e dh e a r td i s e a s e k e yw o r d s ：i a m i na c ：l m n am u t a t i o n s ：s c n 5 a ：c o n n e i n 4 3 ：a t r - o - v e n t r i c u i a r b l o c k 北京协希j 医学院i i 困医学科学院博i ：研究生沦文 ，!第一部分 遗传性扩张型心肌病l m n a 基因突变体表达载体的构建 前言 a 型核纤层蛋白源自l m n a 基因，l 心a 基因位于l q 2 1 2 一q 2 1 3 基因组序列全长 5 6 7 k b ，编码区域约2 4 k b ，包含1 2 个外显子。人体的4 种a 型核纤层蛋白( a 、c 、 c 2 和a ) 由m r n a 的选择剪切而得。其中a 和c 型核纤层蛋白( l i i l a i n a c ) 研究最多， l a m i na c 的结构不同主要表现为c 端球型“尾 部长短不同。它们在发育过程中 以一种组织特异性方式开始表达。与其他的中间纤维蛋白一样，核纤层蛋白由n 末 端的头部区域，中部二聚化的螺旋杆状区域以及个大的球状c 末端尾部组成。尾部 包括一个免疫球蛋白( i m u n o g l o b u l i n ，i g ) 折叠区，由4 3 0 5 4 5 个氨基酸残基组 成。核纤层蛋白是多细胞真核生物核骨架的主要成分，具有一定的机械强度， 核纤层蛋白主要分布在核膜内侧组成核纤层，是组成细胞核纤层的重要成分，参 与核被膜的装配，决定核的形状，起维持核膜正常形态的作用。核纤层蛋白将内 层核模蛋白连接为一体，定位核孔复合体( n u c l e a rp o r ec o m p l e x e s ) 、结合核膜 蛋白。参与细胞周期和分化调节；另外，核纤层蛋白也是d n a 复制和m r n a 转录所必 需，与a 型核纤层蛋白有关的多种疾病提示其蛋白结合位点及其所结合蛋白对核的 功能很重要。核纤层蛋白通过其“杆”状功能区与染色质作用，与核稳定染色质 锚着发挥作用。核纤层蛋白还参与d n a 复制、r n a 转录的调控，同时，还在细胞有 丝分裂过程中发挥重要作用 1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 ，8 ，9 ，1 0 ，1 1 ，1 2 ，1 3 ，1 4 。 扩张型心肌病伴传导阻滞可能是l 心a 基因突变的首先的或者惟一的表现。据 统计大约5 的家族性扩张型心肌病其致病基因是l a 基因 1 5 ，近年随着扩张型 心肌病家系的研究越来越多，己发现在扩张型心肌病伴有传导阻滞的患者中， l 删a 基因突变携带者占3 0 ，4 4 个l m n a 基因位点导致扩张型心肌病伴传导系统异 常，1 2 个外显子上均有突变，但多数突变位于l 绷i na c 蛋白的“杆状功能 区。其中包括我国阜外心血管病医院发现的突变e 8 2 k 1 6 。 l m n a 基因的g 1 u 8 2 l y s 突变是我们实验室在中国人扩张型心朋病家系中发现的 一个新的致病恶性突变，家系中年龄大于3 0 的4 名携带者均发生心肌扩张，且随年 龄增长有症状加重的趋势，该突变导致的d c m 伴有严重的房室传异阻滞( 表1 ) 。 l m n a 基因的n 1 9 5 k ( 表2 ) 突变是f a t k i n 1 7 等在扩张型心朋病家系中发现的一个致 病恶性突变，家系中年龄大于3 0 携带者均发生心肌扩张，且随年龄增长有症状加 重的趋势，该突变导致的d c m 也伴有严重的房室传异阻滞。 1 2 北京协和医学院叶1 因医学科学院 博：j ：研究生论文 l m n a 基因的r 6 4 4 c ( 图1 ) 1 8 ，1 9 突变是在扩张型心朋病家系中发现的一个 致病恶性突变，家系中年龄大于3 0 携带者均发生心肌扩张，且随年龄增长有症状 加重的趋势，但该突变导致的d c m 不伴有严重的房室传异阻滞。 f a m e j 1 砧c h n 虻a lc h a f a c t e r 敏i c so fl h cp a i j c n t l p a l 如l 霉c “似n s e xn y l a c 6l v e d dl 哪le fi c a r d j a c 廿m p t o n 媾l a m l na ，c 咎l i e a to n 螂 a 萨)m u t a u o n 玎i 1 s4 ，mf v v & i l l 。i f 如m a k c r r h ) t l l 巾 - o1 2 3 2 l u 34 3ml i la 川l 7 84 5) 3 lv - 7 4 s 。ml v 、_ j u 嘣嗍i 嘲p c b t 文s t tc h a n 擎 3 2 g l u l c 2 l n kl j4 3mf vs v r v 弛1 1 l ) p ：i 蚪m d k c ff h ! l b m6 s 4 i3 2 6 1 u # 2 t 。y $ l v i s3 s ml l l a v j u l ：l 如n i l ie 蛐弹b 姻l s 加4 33 2 o u l 2 l y s lv 1 93 4m n f5 ，s 5，2g i u s 2 l s l u 4 02 5min ( ，m 谢 s 26 i ； 一 j l t l h ：l ，y s v s”f l n o m 嘲 4 5弱 一 j l u 8 2 l 抖 v 92 4fis i 骷u s 封r h 妯m h 4 7转 一g l u s 2 l ” v 2 21 2fls i l u sa r r h 州1 m 妇4 ih一( ；1 l i 粑1 y | n y h a 、l 斜y o h 怡r t 轴代却讧mc a r d ，a cl u n d i l ) nd 孙u 6 c a l 主1 ) n ：s v t 埘，m e n l n 妇l 粒b y 龆r 矗a ：a f a l n a in 啪轴油；a v & a m a v 曲t r j c i i l a r b i c 吐i ，v d d k nv 棚l f ，c “a rm d o j a s t o i i cd i n 把n - 伽i ：f ，吣“o nl r a c t 帅 。p a 6 a t d l 一甜h r tf a d u f ca h ca g co f 2y 龆伟 嘶t h o u ld n as 邮n 脚n op a b d j 。do f h c 扪i 越h l f c 矗t t ka 辨o f 鹄y 龆鸺f 垴伽o u l d n 张m n 表2l 心an 1 9 5 k 家系 甄晡虹b l l | l n 1 3 l l i 1 王 n 1 1 3 1 l v8 。l o l v 1 6 ，- l v 2 坼 图l d 酗 s o wa 出0 矗b r l “掬o n 阿“u n c md 帆f m a k r i b ；p 竹m 狮c n tp k 啊舱k 竹 、f e s 协 s l 瀚扯r i 0 蝻b r m 牡b n 时m 毒， ”l m tp a c c m 矗c f s l 【雕a 矾一6 k 壤h i o r l s 亡c d o e 贸* 铆c “撕“l | r b l u c k k i 甄m 壮h 翟如a | d i i n o l m n ar 6 4 4 c 家系 y 鹳 y 雌 协 y 瞄 括 y 静 y 舔 t 璐 y 幅 y 瞄 n o y a y e s y 矗 y 8 y 雌 n o r “c i 矧h 半a m 妒h n l 飘落 n o 协 n d n o s u j k n 蛔hh c 缸t 粕抛球 s u d 辆d c 蕾h s n | 汝nd c 甜h 轴“e n i c m h s n d 出nd 隐t i e m b o l l c 甜廊；c 辩柏n cb n a ”， 7 2l t i i 犍rf 2 2 0l j h 蝌。； i n l tf l m t h “n 岛i w e i 瞳a u “c n i 甜班翻虻n # ；c r 嗽l 激b n 2 ”1 6 ll 7 i i 犍rl 2 s 0l t l h 竹) 艮j 埘白i l l m c r 蚰n j k i n 3 骈12 8l j b 攒 f 1 7 0l l i t 玎 ( 擒“mh i m c ，8 3b ，l i i ：2 0l i i 撑r ( 知a n wk l m ，2 4 3u l i 自竹 f 2 7 0l h 雠r 触嘲r y p o s i s + ：r 6 4 4 ch e t e r o z y g 。t e d | a 剐c a 腻m y o p a 协y 三黜a 叫硒4 4 c d i a b e t e s 1 3 挎霉； 昭 的凹n 约 骆 珥 拶 n 圬 o o o 北京协和医学院- 困跃学科学院 博：j ：研究生论文 材料与方法 、 7 、0 41 - 1 、主要试剂 试剂名称试剂提供或生产厂家 感受态细胞d h 一5q北京天根生化科技有限公司 胰蛋白胨t r p t o n es i g i i l a ，北京鼎国生物技术公司 分装 酵母s i g m a ，北京鼎国生物技术公司 分装 氨苄青霉素s i g m a ，北京鼎国生物技术公司 分装 卡那霉素 s i g m a ，北京鼎国生物技术公司 分装 n a 。h p 0 4北京化工厂 l ( h ：p 0 。北京化工厂 蔗糖北京鼎国生物技术公司 d m e mg i b c o ，美国 胎牛血清f b sg i b c o ，美国 胰蛋白酶t r p s i nm e r c k ，美国 e d t a北京化工厂 l 一谷氨酰胺( l g 1 n )上海生工生物工程技术服务有限 公司 二甲基亚砜d m s o 上海生工生物工程技术服务有限 公司 t 4 连接酶t a k a r a ，宝生物工程( 大连) 有 限公司 限制性内切酶e c o ri ( 1 0 u u lp r o m e g a ，友谊中联 ) 限制性内切酶x b ai ( 1 0 u u 1 )p r o m e g a ，友谊中联 1 4 北京冼和医学院中国医学科学院 d n am a r k e pd l l 5 0 0 0 琼脂 l i p o f e c t a m i n e 佃2 0 0 0 兔抗山羊i g g t r i t c ( 罗丹明) t r i t o n x 一1 0 0 丙酮 甲醇 牛血清白蛋白b s a 抗淬灭剂d a b c o e n d o f r e ep l a s m i d p u r i f i c a t i o nk i t q i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t 甘油 h e p e s 天门冬氨酸钾k a s p a r t a t e k 2 a t p 肌酸磷酸二钠n a ：一 p h o s p h o c r e a t in e 乙二醇一双四乙酸( e g t a ) 盐酸胺碘酮a m i o d a r o n e 北京协和医学院l f l 困医学科学院 博 ：研究生沦文 2 、主要溶液 l b 培养基：( 1 l ，p h 7 0 ) t r p t o n e y e a s t n a c l 1 0 9 5 9 1 0 9 加蒸馏水8 0 0 m l ，磁力搅拌1 0 m i n ，调p h 至7 o ( 加n a 0 h ) ，移入容量瓶，定容至 l o o o m l 。高温高压灭菌后，4 保存。 l b 培养板( 氨苄抗性或卡那抗性) ： l b 培养基l l 内加入琼脂1 5 9 ，高压灭菌，凉至5 0 一6 0 ，加入2 m l 抗生素，铺板。 1 0 f b s 细胞培养基： 高糖d m e m 粉末加蒸馏水8 0 0 m 1 ，充分搅拌，加n a h c 0 。3 7 9 ，调p h 至7 2 ，移入容量 瓶，定容至1 0 0 0 m l 。滤器过滤后，4 保存。9 0 m ld e m 助口1 0 m lf b s 配成1 0 f b s 培 养基。 尼蕤酶：0 2 5 t r p sin + o 0 2 e d t a o 2 5 9 胰蛋白酶加p b s l o o m l ，加e d t a 2 0 u l ，过滤，4 保存 l g 1 n ：0 2 m l 贮存液 2 9 2 2 9 溶于1 0 0 m l 蒸馏水，每1 0 0 m 1 细胞培养液加l m ll - g l n 。 1 0 p b s ： k h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 n a c l k c l 2 9 2 9 8 0 9 2 9 加蒸馏水8 0 0 m l ，充分搅拌，调p h 至7 2 ，移入容量瓶，定容至l 0 0 0 m l 。高温高压 灭菌后，4 保存。 3 、主要仪器 北京协和医学院巾围医学科学院 博_ j ：研究生论文 仪器名称 厂家或品牌 1 3 2 2 冰箱( 一8 0 ) m i l l i q 纯水机 超净工作台y s 一13 0 0 v 恒温c o 。培养箱 液氮罐 空气恒温摇床 压力蒸汽灭菌器 电热恒温干燥箱d g g - 9 2 4 9 倒置显微镜 微电极拉制仪s u t t e rp 一9 7 抛光仪m f 一8 3 0 a x o n7 0 0 b 放大器 a d 和d a 数据转换器d i g i d a t a 三维操纵器m p 一2 2 5 荧光发生器 恒流泵h l 一2 b p c l a m p e x1 0 0 软件 o r i g i n6 o 软件 激光共聚焦显微镜 t h e r m o ( 美国) m i l l i o p o r e 公司( 美国) 苏州安泰空气技术有限公司 s a n y 0 ( 日本) 四川乐山压力容器厂 湘仪离心机仪器有限公司 上海东亚压力容器制造有限公司 上海森信实验仪器公司 日本0 l y m p u s 公司 美国s u t t e r 公司 日本n a r i s h i g e 公司 美国a x o n 公司 美国a x o n 公司 美国s u t t e r 公司 日本o l y m p u s 公司 上海沪西分析仪器厂 美国a x o n 公司 美国m ic r o c a ls o f t w a r e 公司 l e i c a ，美国 ( 二) 实验方法 表1实验所需质粒 p t r a c e r + l m n a p c d n a 3 1 + s c n 5 a p e g f p c 1 表2插入l m n ac d n a 序列及开放阅读框n m _ 1 7 0 7 0 7l q 2 1 2 一q 2 1 3 g e n e i d ：4 0 0 0 1 7 北京坍和医学院f f i 国医学科学院博i ：研究生论文 at g g a g a c c c cg t c c c a g c g gc g c g c c a c c cg c a g c g g g g cg c a g g c c a g ct c c a c t c c g c t g t c g c c c a cc c g c a t c a c cc g g c t g c a g g a g a a g g a g g ac c t g c a g g a gc t c a a t g a t c g c t t g g c g g tc t a c a t c g a cc g t g t g c g c tc g c t g g a a a cg g a g a a c g c ag g g c t g c g c c t t c g c a t c a c c g a g t c t g a ag a g g t g g t c ag c c g c g a g g tg t c c g g c a t c a a g g c c g c c t a c g a g g c c g ag c t c g g g g a tg c c c g c a a g ac c c t t g a c t ca g t a g c c a a gg a g c g c g c c c g c c t g c a g c t g g a g c t g a g ca a a g t g c g t ga g g a g t t t a ag g a g c t g a a a g c g c g c a a t ac c a a g a a g g ag g g t g a c c t ga t a g c t g c t ca g g c t c g g c tg a a g g a c c t g g a g g c t c t g ct g a a c t c c a ag g a g g c c g c ac t g a g c a c t gc t c t c a g t g ag a a g c g c a c g c t g g a g g g c g a g c t g c a t g at c t g c g g g g cc a g g t g g c c aa g c t t g a g g c a g c c c t a g g t g a g g c c a a g aa g c a a c t t c ag g a t g a g a t gc t g c g g c g g gt g g a t g c t g ag a a c a g g c t g c a g a c c a t g aa g g a g g a a c tg g a c t t c c a ga a g a a c a t c ta c a g t g a g g ag c t g c g t g a g a c c a a g c g c cg t c a t g a g a cc c g a c t g g t gg a g a t t g a c aa t g g g a a g c ag c g t g a g t t t g a g a g c c g g ct g g c g g a t g cg c t g c a g g a ac t g c g g g c c ca g c a t g a g g ac c a g g t g g a g c a g t a t a a g