（农业昆虫与害虫防治专业论文）基于16S+rDNA序列的14株致病杆菌属细菌的分子鉴定.pdf

题目： 专业： 硕士生： 指导老师： 基于1 6 sr d n a 序列的1 4 株致病杆菌属细菌的分子鉴定 农业昆虫与害虫防治 彭小明 邱礼鸿博士 摘要 昆虫病原线虫共生茵属肠杆菌科，现己定名的有致病杆菌( x e n o r h a b d u s ) 和光杆菌( p h o t o r h a b d u s ) 两个属，它们都存在于昆虫病原线虫肠道内并与之互 惠共生。近年来的研究发现这类细菌能产生多种有生物活性的次级代谢产物，包 括杀虫毒素、抗生素、抗癌药物等，已成为一类新型的具有开发潜力和应用前景 的生物资源。为此，人们越来越重视对共生菌的采集、分离以及分类鉴定工作。 本研究以1 6 sr d n a 为分子标记对本实验室近年从我国采集到的1 4 株昆虫 病原线虫共生菌进行分类鉴定。p c r 扩增测序了待鉴定菌株的全长1 6 sr d n a 序 列再与g e n b a n k 中现有的昆虫病原线虫共生菌同源序列进行比对，构建系统进 化树，初步确立各个菌株的分类地位，结果显示y n b l l 2 ， y n d 3 9 3 ，y n d 7 2 ， g d h 7 ，g d c 3 2 8 ，y n c 215 等可能是x e n o r h a b d u s 属的六个新种，而y n c 2 3 0 ， y n d 2 7 8 ，与g d c 3 1 8 是同一个待鉴定新种下的三个菌株，y n d 3 3 ，y n c l 7 4 和 y n d 4 3 3 可能是xb o v i e n i i 的三个菌株，而g d c 3 3 9 和y n a l11 可能分别是x i n d i c a 和xb u d a p e s t e n s i s 的新菌株。本室最近对上述部分菌株进行的一些形态和 生理生化的鉴定也与所得的结果相符合。因此，以1 6 sr d n a 作为分子标记昆虫 病原线虫共生菌进行分类鉴定是可行的。 建立完善线虫和共生菌分类鉴定体系，研究确定它们的分类地位并描述发 表新种，是进一步研究和开发利用这些线虫及其共生菌的基础。本研究基本确立 了本实验室近年采集的1 4 号昆虫病原线虫所携带的共生菌的地位，为这些细菌 的开发利用打下了基础，也为研究共生菌与线虫的协同进化提供了依据。 关键词：昆虫病原线虫共生菌，1 6 sr d n a ，邻接法，相似性，遗传距离 t i t l e ：m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o no f14s t r a i n so fx e n o r h a b d u s , t h es y m b i o t i cb a c t e r i a o fe n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e sb a s e do n16 s r d n as e q u e n c e m a j o r ：a g r i c u l t u r ei n s e c t sa n dp e s t sc o n t r o l n a m e ：p e n gx i a o m i n g s u p e r v i s o r ：q i ul i h o n g p h d a b s t r a c t x e n o r h a b d u sa n dp h o t o r h a b d u s ( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) a r es y m b i o t i cb a c t e r i a ( s b ) o fe n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ( e n ) s bh a v eb e c o m ei m p o r t a n tb i o r e s o u r c e s a st h e yp r o d u c em a n yb i o a c t i v es u b s t a n c e s ，s u c ha si n s e c t i c i d a lt o x i n s ，a n t i b i o t i c sa n d p h a r m a c e u t i c s c o l l e c t i o na n dc o r r e c ti d e n t i f i c a t i o no fs bi sc r i t i c a lf o ra l lr e l a t e d s t u d i e s t h et a x o n o m i cs t a t u so f14s t r a i n so fs br e c e n t l yc o l l e c t e df r o mc h i n aw a s d e t e r m i n e dp r e l i m i n a r i l yu s i n g16 sr d n aa sam o l e c u l a rm a r k e r t h ec o m p l e t e16 s r d n ao fa l ls bt ob ei d e n t i f i e dw a sp c ra m p l i f i e da n ds e q u e n c e d 一t h es e q u e n c e s o b t a i n e dw e r ea l i g n e dw i t ht h eh o m o l o g i c a ls e q u e n c e so ft h ed e s c r i b e dx e n o r h a b d u s c u r r e n t l ya v a i l a b l ef r o mt h eg e n b a n k t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es y m b i o t i c b a c t e r i ao f y n d 7 2 ，y n b l l 2 ，y n d 3 9 3 ，y n c 2 1 5 ，g d h 7 ，g d c 3 2 8a r el i k e l yt ob es i x n e ws p e c i e so f x e n o r h a b d u s a n dy n c 2 3 0 ，y n d 2 7 8 ，a n dg d c 318a r el i k e l yt ob e3 s t r a i n so fan e ws p e c i e so f x e n o r h a b d u s y n b 3 3 ，y n c17 4a n dy n d 4 3 3a r el i k e l yt o b en e ws t r a i n so fx b o v i e n i i g d c 3 3 9a lel i k e l yt ob en e ws t r a i n so fx i n d i c a y n a l11a r el i k e l yt ob en e ws t r a i n so f x b u d a p e s t e n s i s u n d e r s t a n d i n gt h et a x o n o m i cs t a t u so f t h e s eb a c t e r i as e tas o l i df o u n d a t i o nf o r f u r t h e rs t u d ya n du t i l i z a t i o no f t h e s eb a c t e r i a k e y w o r d s ：s y m b m t i cb a c t e r i a ，e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ，16 sr d n a , n j ， s e q u e n c es i m i l a r i t y , d i v e r g e n c e 彭小明中山大学硕士论文 第1 章前言 昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s 。 e p n s ) 肠道内与之互惠共生的细菌。这类细菌随其共生线虫进入昆虫体内后， 会在虫体内分泌杀虫毒素，在短时间内使昆虫致死。对这类杀虫毒素的深入研究 有助于将其基因转入植物，或者构建高效表达系统生产杀虫毒素直接应用于防治 害虫。在转基因抗虫植物中转入苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 6 内 毒素基因后，产生的昆虫的抗性越来越受到人们的关注。对昆虫抗性管理的一个 有效方法是探索新的不同的毒素基因，通过在同一植物共表达不同的毒素，有助 延缓害虫对转b t 基因抗虫作物的抗性压力，扩大转基因抗虫作物的抗虫谱。 昆虫病原线虫对害虫有很强的致病力，其中起关键性作用的是共生菌( 蒲蛰 龙1 9 9 4 ) 。近几年，共生菌外毒素蛋白的发现，为人类提供了新的杀虫蛋白和基 因；共生菌分泌产生的多种抗菌素，有很强的抑菌活性。这一切使得共生菌的研 究越来越为人们所重视。人们对共生菌的认识也远远超出了原有水平一“细菌 与线虫的共生关系”；现在许多学者已认识到：昆虫病原线虫共生菌是一种亟待 开发的、既能杀虫又能防病的生物资源。随着共生菌有益功能越来越多地被发现， 对这些有益功能的开发日益受到科学家的重视。了解昆虫病原线虫及共生菌的一 些特性是进行其它相关研究的基础，现对共生菌的分类研究进展进行介绍： 1 9 6 6 年p o i n a r 和t h o m a s 首次描述了共生菌的形态特征和生理生化特性，他 们将从线虫n e o p l e c t a n ac a p o c a p s a ed d 1 3 6 中分离到的共生菌归入肠杆菌科 ( e m e r o b a c t e r i a c e a e ) 无色杆菌( 么c h r o m o b a c t e r ) 属( p o i n a r & t h o r i m s , 1 9 6 6 ) 。 1 9 7 9 年，t h o i m s 和p o i n a r 以x e n o r h a b d u s 代替a c h r o m o b a c t e r 来代表昆虫病原 线虫的共生菌，同时在这个属中描述了两个新种：与斯氏线虫s t e i n e r n e m a 共生 的xn e m a t o h p i l a 和与异小杆线虫h e t e r o r h a b d i t i s 共生的xl u m i n e s c e n s ( t h o m a s & p o i n a r , 1 9 7 9 ) 。之后，a k h u r s t 根据共生菌的特性，将zn e m a t o h p i l a 定为四个 亚种( a k h u r s t ，1 9 8 3 ) ，后来又提升为种( a k h u r s t & b o c m a r e ，1 9 8 8 ) 。1 9 9 6 年确 认了x e n o r h a b d u s 属中与线虫& k u s h i d a i 共生的新种xj a p o n i c a ( t a c h i b a n ae t a l ，1 9 9 6 ) 。从h e t e r o r h a b d i t i s 中分离到的xl u m i n e s c e n s 各菌株在菌落颜色、荧 光、同工酶、脂肪酶等方面与x e n o r h a b d u s 其他种的细菌存在较大的差别，因此 彭小明 中山大学硕士论文 b o e m a r e 等人将xl u m i n e s c e n s 转入新属p h o t o r h a b d u s ( b o e m a r ee t a l ，1 9 9 3 ) 。目 前，根据d n a d n a 杂交、1 6 sr d n a 测序等分子生物学实验结果以及共生茵生 理生化特性的不同，将共生菌描述为两个属：和斯氏线虫共生的为x e n o r h a b d u s 属，和异小杆线虫共生的为p h o t o r h a b d u s 属。其中，x e n o r h a b d u s 中现已描述的 有2 0 个种：前几年己定名的5 个种xn e m a t o p h i l a 、xp o i n a r i i 、xb o v i e n i i 、x b e d d i n g i i 和x j a p o n i c a ：最近g e n b a n k 中登录了4 种1 6 sr d n a 为首次测定的新 共生菌，分别命名为xb u d a p e s t e n s i s 、xe h l e r s i i 、xi n n e x i 和xs z e n t i r m a i i ( l e n g y e le ta 1 ，2 0 0 4 ) ，2 0 0 6 年p a t r i c kt a i l l i e z 等又在i j s e m 上描述发表了十个 新种分别为：xc a b a n i l l a s i i 、xd o u c e t i a e 、xg r i 够n i a e 、xh o m i n i c k i i 、x k o p p e n h o e y e r i 、x k o z o d o i i 、x m a u l e o n i i 、x m i r a n i e n s i s 、x r o m a n i i 稻x s t o c k i a e ( p a t r i c kt a i l l i e ze la 1 ，2 0 0 6 ) 。之前，所有的p h o t o r h a b d u s 被描述为一个 种p d f d 砌a 6 砌sl u m i n e s c e n s 。a k h u r s t ( 1 9 9 0 ) 认为pl u m i n e s c e n s 是一个多 种类群，可能包含4 5 个种。最近p h o t o r h a b d u s 属被定名成3 个种( f i s c h e r - l e e t a ，1 9 9 9 b ：a k h u r s te t a l ，2 0 0 4 ) ：p l u m i n e s c e n s 、p t e m p e r a t a 和pa s y m b i o t i c a ， 其中pl u m i n e s c e n s 定名为3 个亚种，分别是l u m i n e s c e n s ，a k h u r s t i i 和l a u m o n d i i ， pa s y m b i o t i c a 描述为两个亚种：a s y m b i o t i c a 和a u s t r a l i s ( p e e le la ，1 9 9 9 ) 。下 表1 - 1 介绍的是生菌两个属的差异 表1 - 1 共生菌两个属之间的差异( f o r s te t 以1 9 9 6 ；f o r s t ，1 9 9 7 ) t a b l e1 - 1c h a r a c t e r i s t i c sd i s t i n g u i s h i n gx e n o r h a b d u sf r o mp h o t o r h a b d u s 2 彭小明中山大学硕士论文 2 0 0 7 在过去的几年内，世界各地的多位科学家分别独立的提出了把d n a 技术引入 分类学研究的思路，并就其实施的可能性进行了认真的讨论( g o d f l a y ，2 0 0 2 ； b i s b ye ta 1 ，2 0 0 2 ；l e e ，2 0 0 2 ；w i e n s & p e n k r o t ，2 0 0 2 ) 。这个思路在2 0 0 2 年趋 于成熟，并正式提出了d n a 分类学( d n at a x o n o m y ) 的概念。d n a 分类学的核 心内容是应用d n a 序列进行物种鉴定。由于d n a 具有稳定性高，易于取样，数 据便于计算机化等优点，d n a 分类数据库将成为世界通用的永久性数据库。一 旦一个类群的大多数物种录入数据库，常见种类的鉴定便可由d n a 自动测序设 备和计算机来完成。d n a 分类学的建立不是为了取代传统分类学系统学，而是 把传统分类学现代化。过去由于d n a 测序较费时、昂贵，应用的较少，随着测 序费用的降低，现在已经越来越多的应用于分类和系统学分析。该技术已经被用 来研究昆虫病原线虫共生菌的分类以及系统进化等。细菌分类的最基本方法是形 态分类和生理生化特性分类，共生菌大部分已被描述的种的表型特征都非常相 似，而且在区分种的典型鉴定特征上又都是阴性反应，同时缺少足够多的菌株用 于比较，因此对于新分离的菌株或种的鉴定是比较困难的( 庞在堂等，2 0 0 3 ) 。 随着分子生物学技术的发展，分子分类方法的应用极大地促进了共生菌分类和菌 种鉴定的发展。1 9 9 7 年b r u n e l 等人通过分析1 6 sr d n a 基因的限制性酶切图谱， 快速并有效地确认了x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 的各个种：只需要三种限制性 内切酶c f o i ，a l u l 和h a e l i i 就可以区分x e n o r h a b d u s 的四个有效种和其他未定菌 株以及只l u m i n e s c e n s 。2 0 0 1 年j i el i u 等通过比较共生菌的1 6 sr d n a 部分序 彭小明 中山大学硕七论文 列，也得到与已往分类方法所得到分类系统相同的结果( j i e l i ue t a l ，2 0 0 1 ) ， 说明1 6 sr d n a 序列可以作为共生菌分类的分子标记。pa s y m b i o t i c a 描述成两个 亚种a s y m b i o t i c a 和a u s t r a l 括，则是通过g y _ r b 基因的序列对比得到的( a k h u r s te t a 1 ，2 0 0 4 ) 。对p h o t o r h a b d u s 属来说，g y r b 基因比1 6 sr d n a 更适合用与定义属 内的各种，因其与d n a - d n a 杂交，表型数据分析的结果更为符合。不同种或 品系的共生菌所产生的代谢产物有明显的不同( w e b s t e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。对 x e n o r h a b d u s 来说，1 6 sr d n a 适合用与定义属内的各种，实验室的一些形态和生 理生化的鉴定也于所得的结果相符合。1 6 sr d n a 具有分子大小适中，功能同源 且为所有具有细胞结构的生物所共有，序列既有保守区又含多变区，序列同源性 与分化时间的相关性较高等特点，已成为细菌分类鉴定中应用最广泛的分子标 记。伯杰氏系统细菌学手册第二版的分类系统就是基于该序列建立的。 由于积累共生菌种质资源和准确的分类是进行其它有关研究的基础。本实验 室近几年在广东和云南等地进行了系统的e n 资源调查，这些线虫均已储存在液 氮中，它们所携带的共生菌也已初步分离纯化并储存在液氮中，但还未进行分类 鉴定。本研究采用1 6 sr d n a 全序列分析并构建系统发育树的方法对这些共生细 菌进行鉴定，以确定它们的分类地位以及与其它己描述共生菌的关系，为开发利 用这些共生菌打基础，也许大家可能会发现本论文与以前的论文所得出的结论存 在一些相似之处，但对与x e n o r h a b d u s 属来说，原有的1 6 sr d n a 部分序列构建 系统发育树的方法并不是很完善，还存在一些缺陷，尤其是近两年来新种的陆续 被描述，特别是2 0 0 6 年，x e n o r h a b d u s 属又有1 1 个新种被描述，以前我们基于 1 6 sr d n a 部分序列所进行的x e n o r h a b d u s 属的初步分类的结果并不是太准确， 现在我们以1 6 sr d n a 全序列与g e n b a n k 中现有的昆虫病原线虫共生菌同源序 列进行比对分析并构建系统发育树，得到的结果与数据比1 6 sr d n a 部分序列得 到的数据要精确，结果也要更完全。该研究对我国线虫共生菌资源的保护，对共 生菌的起源、系统进化以及线虫与共生菌两者的协同进化等基础研究也有重要的 意义。 4 彭小明中山大学硕士论文 第2 章昆虫病原线虫共生菌的分子分类的理论基 础 2 1 引言 昆虫病原线虫s t e i n e r n e m a 和h e t e r o r h a b d i t i s 是目前国际上使用最多的新型 生物线虫杀虫剂( 廖美德梁世中，2 0 0 1 ) 。它们具有很强的杀虫毒力，因为其体 内分别共生有x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 两类共生菌。共生菌与线虫的共生关 系可以概括为：x e n o r h a b d u s - q s t e i n e r n e m a 共生，p h o t o r h a b d u s 与h e t e r o r h a b d i t i s 共生，且一种共生菌能与多种线虫共生，但一种线虫只能携带一种共生菌，共生 菌存在于线虫的肠道内，线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内，并将共生菌释放到 昆虫的血腔中；线虫保护共生菌不受寄主免疫反应的影响；共生菌在昆虫血腔内 繁殖，产生毒素和抑菌物质，导致昆虫患败血症，而在4 8 小时内死亡；共生菌 能分解营养物质，提供线虫繁殖发育所需的营养；同时共生菌产生的抗菌素，能 抑制其它杂菌的侵染，为线虫的生长、发育和繁殖提供理想的环境( b o e m a r ee t a ，1 9 9 6 ) 。图1 - 1 为两类共生菌的共生线虫生活史示意图( f r e n c h - c o n s t a n te ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。 图卜1 两类共生菌的共生线虫生活史 f i g 3 一ll i f ec y c l e so f b a c t e r i u m - n e m a t o d e ss y m b i o s e s 彭小明中山大学硕士论文 斯氏线虫和异小杆线虫的生活史及携带共生菌的形式明显不同，斯氏线虫在 寄主体内第一代是雌雄异体，其共生菌x e n o r h a b d u s 存在于线虫肠道内的一个特 殊囊状结构内( v e s i c k s ) ；异小杆线虫在寄主体内第一代是雌雄同体，其共生菌 p h o t o r h a b d u s 则直接存在于线虫肠道内( b i r de la 1 ，1 9 8 8 ；p o i n a r ，1 9 9 0 ) 。 昆虫病原线虫对害虫有很强的致病力，其中起关键性作用的是共生菌( 蒲蛰 龙，1 9 9 4 ) 。近几年，共生菌外毒素蛋白的发现，为人类提供了新的杀虫蛋白和 基因；共生菌分泌产生的多种抗菌素，有很强的抑菌活性。这一切使得共生菌的 研究越来越为人们所重视。人们对共生菌的认识也远远超出了原有水平“细 菌与线虫的共生关系”；现在许多学者已认识到：昆虫病原线虫共生菌是一种亟 待开发的、既能杀虫又能防病的生物资源。了解昆虫病原线虫及共生菌的一些特 性是进行分类研究的基础。 2 2 昆虫病原线虫共生菌的特性 昆虫病原线虫共生菌是共生于昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s e p n s ) 肠道内的一类细菌，革兰氏染色阴性，属肠杆菌科( a k h u r s t ，1 9 8 3 a b ： a g u i l l e r a e t a l ，1 9 9 3 ) ，但它们是一类特殊的肠杆菌科细菌，因为这些细菌呈硝 酸还原酶阴性。共生菌与肠杆菌科中亲缘关系最近的p r o t e u s 的区别如表2 1 。 x e n o r h a b d u s 为过氧化氢酶阴性；p h o t o r h a b d u s 为过氧化氢酶阳性，而且能 产生荧光物质。在人的伤口处曾分离到p h o t o r h a b d u s ，但是经权威医院的临床观 察，发现从伤口处分离到的p h o t o r h a b d u s 在正常条件下对人没有致病性( f a r m e r e ta 1 ，1 9 8 9 ；c o l e t ) i c o l oe ta l ，1 9 8 9 ；g e r r a r d ，2 0 0 3 ) ；而且通过d n a - d n a 杂 交实验表明这些菌株明显不同于其它与昆虫病原线虫共生的p h o t o r h a b d u s 属细 菌( a k h u r s t ，1 9 9 6 ) 。 6 彭小明中山大学硕士论文 表2 - 1 区别x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 与肠杆菌科中亲缘关系最近的p r o t e u s 属的特性 t a b l e2 - 1c h a r a c t e r i s t i c sd i f f e r e n t i a t i n gx e n o r h a b d u sa n dp h o t o r h a b d u s , f r o mt h e n e a r e s tg e n u s , p r o t e u s ，w i t h i nt h ee n t e r o b a c t e r i a e e a e + ：阳性；一：阴性；d ：部分阳性 + ：p o s i t i v e ；一：n e g a t i v e ；d ：p a r t i a lp o s i t i v e 2 2 1 共生菌的生理生化特性 2 2 1 1x n o r h a b d u s 属的特征 x e n o r h a b d u s 的细胞是不产孢子的杆状细胞( o 3 2 2 - 1 0 i lm ) ，革兰氏染色 阴性，兼性厌氧，具有呼吸和发酵两种代谢类型。最适宜的生长温度通常是2 8 左右，有些品系在4 0 1 2 生长。葡萄糖产酸，其他的碳水化合物很少能发酵的。 过氧化氢酶阴性，硝酸盐不能被降解为亚硝酸盐。许多区分肠杆菌科的试验对 x e n o r h a b d u s 这个属都是阴性的。生长的稳定期会出现不同程度的型变( b o e m a r e & a k h u r s t ，1 9 8 8 ) 。初生型细胞是可动的，因为具有周身的鞭毛，而且可以在 0 6 1 2 的琼脂上聚集( g i v a u d a ne a ，1 9 9 5 ) ，在卵黄培养基上可检测到卵磷 脂酶阳性，在稳定期的培养液中产生原生质的晶体包涵体( b o e m a r ee ta 1 ， 1 9 8 3 a ) 。某些品系的次生型细胞也是可动的。次生型细胞不吸收色素( a l d a u r s t ， 1 9 8 0 ) ，不产抗生素、蛋白包涵体，缺乏初生型细胞的其他一些特征。脂酶活性 用吐温一2 0 检测，大多数品系能水解吐温- 4 0 、6 0 、8 0 和8 5 ，次生型细胞分解脂 7 彭小明中山大学硕士论文 类的反应比初生型细胞强。大多数品系具有脱氧核糖核酸酶、蛋白酶活性。 x e n o r h a b d u s 属内各种生理生化特性的差异见表2 ，2 ( a k h u r s t ，1 9 8 6 a b ： b o e m a r e & a k h u r s t ，1 9 8 8 ；f i s c h e r - l es a u xe ta 1 ，1 9 9 8 ，1 9 9 9 a ；g i v a u d a ne ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。 2 2 1 2 p h o t o r h a b d u s 属的特征 p h o t o r h a b d u s 细胞是不产孢子的杆状细胞( o 5 2 x 1 1 0 p m ) ，革兰氏染色阴 性，周身具鞭毛，能运动。兼性厌氧，具有呼吸和发酵两种代谢类型。适宜生长 温度是2 8 ，有些品系能在3 7 3 8 生长。所有的品系都是过氧化氢酶阳性，不 降解硝酸赫，缺乏肠杆菌科所具有的许多特征。p h o t o r h a b d u s 能水解凝胶，大部 分品系具有对羊和马血清的溶血作用，一些品系在2 5 下还能使羊血清产生不 规则的环状溶血作用。p h o t o r h a b d u s 的细菌全部对吐温2 0 具有溶脂作用，许多 对吐温，4 0 ，6 0 ，8 0 和8 5 有溶脂作用。葡萄糖产酸不产气。果糖，d 甘露糖， 麦芽糖，核糖和n 乙酰基葡萄糖也能产酸。甘油发酵反应微弱。延胡索酸盐、 葡萄糖胺、l 谷氨酸盐、l 一苹果酸盐、l 脯氨酸、琥珀酸盐和l 酪氨酸作为主要 的碳源和能源被吸收。皿培养时会出现自发的型变，产生次生型细胞。自然环境 中分离到的初生型细胞是野生型的，大部分细胞( 5 0 - - 8 0 ) 在生长稳定期能够 合成原生质体包涵体，能发荧光，黑暗中能看到多种波长光线混和而成白光。不 同品系的发光亮度不同，一些菌落所发的荧光只能在使用光度计或者闪烁计数计 时才能被观察到。在1 5 0 种已报道的p h o t o r h a b d u s 各菌落中仅有一种是不发荧 光的( a k h u r s t & b o e m a r e ，1 9 8 6 ) 。初生型细胞发光强度是次生型细胞的1 0 0 倍 以上。初生型细胞在营养培养基上产粉红、红色、橙色、黄色或绿色色素，尤其 是在胰蛋白酶大豆培养基和卵黄培养基等富集培养基上。次生型细胞产色素少， 颜色不同。次生型细胞的主要特征表现在不吸收m a c c o n k e y 培养基上的中性红， 并能产生抗生素。 p h o t o r h a b d u s 属内各种生理生化特性的差异见表2 3 ( p o i n a r ，1 9 7 6 ：g r e n i e r p ，a 1 ，1 9 9 6 a b ；g e r r i t s e n e t a ，1 9 9 2 ；a k h u r s te t a l ，1 9 9 6 ；f a r m e re t a ，1 9 8 9 ) 。 8 彭小明中山大学硕士论文 表2 - 2x e n o r h a b u d u s 属内各种的生理生化特征 t a b l e2 - 2c h a r a c t e r sd i s c r i m i n a t i n g x e n o r h a b d u ss p p 袖x n e m a t o p h i l a x b o v i e n i i x p o n a r i ix ，b e d d i n g i ix j a p o n i c a 寄主线虫 s t e i n e r r n e m a 最f e t i a e , 最g l a s e r i u n i d e n t i f i e d e a r p o e a p s a e s i n t e r m e d i u ms c u b a n u m& e m e m e m a & a f f l n e ,s p p 最i t r a u s s e i 生长最高温度 3 53 24 03 9 ( ) 对鳞翅目昆虫的 + + 一+ 病原性 运动性d dd + 色素 一 黄色棕色浅棕色 s i m o n s 柠檬 + 酸盐 水解七叶苷 一一d+ 苯丙氨酸脱氨酶d 一 一】 一 色氨酸脱氨酶 一+ 一 - 吸收 溴麝香草酚蓝 + 一 + ( n b t a 培养基) 中性 红 + 0 i a e c o n k e y 培养基) 产酸性 肌醇-d 一一 核糖 一十一+ 水杨苷 一一 + 二氨基丁烷 一 + 一一 可否利用 l - 组氨酸 一+ + + 肌醇-d 一一 核酸 一 + 一+ l 一酪氨酸 一 + 一+ 磷酸酯酶 - 一 一 + 卵磷脂酶d dd ( 卵黄琼脂) 脂肪酶d + -t ( t w e e n 一8 0 ) 最k u s b i d a i 3 5 d 微黄棕色 d + ，阳性； + 】，7 6 - - 8 9 阳性；d ，2 6 - - 7 5 阳性； - ，1 1 - - 2 5 阳性；一，阴性；- ，弱反 应 + ：9 0 - 1 0 0 o f s t r a i n sa r cp o s i t i v e ；【+ 】：7 6 - 8 9 * 0a r ep o s i t i v e ；d ：2 6 - 7 5 a r cp o s i t i v e ； - l ：l l 一2 5 a l ep o s i t i v e ；- ：0 - 1 0 a ”p o s i t i v e ；w ：w e a kr e a c t i o n 9 彭小明中山大学硕士论文2 0 0 7 表2 3p h o t o r h a b d u s 属内各种的生理生化特征 t a b l e2 - 3c h a r a c t e r sd i s c r i m i n a t i n gp h o t o r h a b d u ss p p + ，阳性； + ，7 6 - - 8 9 阳性；d ，2 6 - - 7 5 障l 性； 一 ，i i 一2 5 阳性；一，阴性；w ，弱反应 + ：9 0 - 1 0 0 o f s t r a i n sa r ep o s i t i v e ； + 】：7 6 - 8 9 a r ep o s i t i v e ；d ：2 6 7 5 a r ep o s i t i v e ；h ：u - 2 5 a r e p o s i t i v e ；：o - 1 0 a r ep o s i t i v e ；w ：w e a kr e a c t i o n 1 0 彭小明中山大学硕士论文 2 2 3 共生菌的寄主专一性 共生菌与线虫问存在某种程度的专一性。在自然条件下，一种线虫只能与一 种共生菌共生( a k h u s t1 9 8 2 ，1 9 8 3 a ：a k h u r s t1 9 9 0 ) 。然而一种共生菌可与几种线 虫共生，例如共生菌xb o v i e n i i 可与s f e l t i a e 、si a u s s e i 、sa f f i n i s 、si n t e r m e d i a 等几种线虫共生。所有斯氏线虫均与x e n o r h a b d u s 共生；所有异小杆线虫均与 p h o t o r h a b d u s 共生。共生茵与线虫的共生关系如表2 4 所示。 表2 - 4 昆虫病原线虫共生菌种类及其相关寄主线虫 t a b l e2 - 4s y m b i o t i cr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nb a c t e r i as p e c i e sa n de p n s b a c t e ! r i as p e c i e s xn e m a t o p h i l a x j a p o n i c a zb o v i e n i i z p o i n a r i i xm a u l e o n i i xd o u c e t i a e 丑g r i f f i n i a e xm i r a n i e n m s _ = i ：= k o z o d o i i xr o m a n i i s t e i n e r n e m ac a r p o c a p s a e 最k u s h i d a i & f e l t i a e r - b i b i o n i s ) & k r a u s s e i s c 睁n i s 最i n t e r m e d i a 最c u b a n u m s g t a s e r i s t e i n e r n e m as p n c 5 1 3 s t e i n e r n e m as p s t e i n e r n e m as p s t e i n e r n e m as p & d i a p r e p e s i 最h e r m a p h r o d i t u m s t e i n e r n e m a t i d a e a r e n a r i u m sp u e r t o r i c e n s e 彭小明中山大学硕士论文2 0 0 7 x 加d i c a zh o r n 拥i c k i i xc a b a n i l l a s i i x k o p p e n h o e f e r i pl u m i n e s c e n ss u b s pl u m i n e s c e n s pl u m i n e s c e n ss u b s pa k h u r s t i i pl u m i n e s c e n ss u b s pl a u m o n d i i pt e m p e r a t a a b b a s i 曼k a r i i & a r i o b r a v e 矗s c a r a b a e i t l , b a c t e r i o p h o r ag r o u pb r e t o n h i n d i c a hb a c t e r i o p h o r a g r o u ph p 8 8 h m e g i d i s 线虫与共生菌专一性表现在两个方面：共生菌对线虫基本营养的提供和侵染 期线虫携带共生菌的能力。在共生菌对线虫基本营养方面只体现出一定程度的专 一性。在斯氏线虫和异小杆线虫中，没有一种线虫可以与自身共生的共生菌以外 的所有共生菌一起进行单菌培养( a k h u r s t1 9 8 3 a ) 。虽然sf e l t i a e 可以同5 种其 它斯氏线虫的共生菌成功地进行单体培养，但是该线虫不能在只有p h o t o r h a b d u s 的培养基中生长：另外，对于某些种类的线虫而言，其所需的最佳营养也不是由 它的天然共生菌提供的。例如在富脂的培养基上，sg l a s e r i i 与咒b o v i e n i i 培养 时，比与xn e m a t o p h i l u s 及自身的共生菌培养时繁殖速度更快( d u n p h ye ta 1 1 9 8 8 ) 。目前，关于共生菌为其共生线虫提供的基本营养种类尚不清楚；但有一 点是可以肯定的，在无菌环境下，线虫不能生长或繁殖量很低。侵染期线虫对其 肠道内共生菌的携带、保持具有高度的专一性。尽管某些斯氏线虫能与非昆虫病 原线虫共生菌的细菌在体外繁殖，但线虫并不将这些细菌留在肠道内，而且对其 它斯氏线虫共生菌的保持力也是十分有限的( a k h u r s t1 9 8 3 a ) 。由此可见线虫有 很强的选择其天然共生菌的能力，它只将天然共生菌保留在肠道内。这一专一性 在sc a r p o c a s a e x n e m a t o p h i l a 之间体现得尤为明显，在sc a r p o c a p s a e 侵染期 线虫体内不存在其它任何线虫的共生菌( d u n p h ye la 1 ，1 9 8 8 ) 。 2 2 4 共生菌的型变 彭小明中山大学硕士论文 型变( p h a s ev a r i a t i o n ) 是共生菌的一个重要特性。同种共生菌的不同变型代 谢途径的不同及型变对线虫产量和质量的影响，使得共生菌的型变成为近年来的 研究热点。昆虫病原线虫共生菌的型变最初被描述为两型现象，即根据其在琼脂 培养基上产生两种形态的菌落，及它们吸收染料能力的不同，定为初生型和次生 型( a k h u r s t1 9 8 0 ) 。型变对于许多细菌而言，是一个常见的特征，如沙门氏菌 ( s a l m o n e l l as p p ) 、奈瑟氏菌( n e i s s e r i as p p ) 已发现此特征( s i l v e r m a n1 9 8 3 ) 。 细菌的型变是一个可逆的转变过程，通常发生在主要抗原如鞭毛蛋白的变化上， 此类抗原能使细菌免受寄主防御反应、避开噬菌体的侵染( r o b e r t s o ne t 口f ， 1 9 9 4 ) 。而昆虫病原线虫共生菌的型变，不同于上述一般细菌，它的型变与免受 寄主防御反应及噬菌体的侵染无关( a k u r s t1 9 9 2 ，1 9 9 4 ) 。 关于共生菌的型变，过去曾有人认为是污染的结果，但通过两型共生菌d n a 图谱分析证明，两型菌具有1 0 0 的同源性( a k h u r s te ta 。1 9 9 4 ) ，因此初生型 和次生型菌是相同的菌株，只是在培养过程中表现出不同的菌落形态特征和生理 生化特征而己。对于x e n o r h a b d u s 而言，这种型变是可逆的，即初生型菌可以转 变为次生型菌，次生型菌在一定条件下也可转变为初生型菌( a k h u r s te ta 1 ， 1 9 9 2 ) ；而对于p h o t o r h a b