（作物遗传育种专业论文）盐芥相关耐盐基因的克隆、序列分析与遗传转化.pdf

盐芥相关耐盐基因的克隆、序列分析 与遗传转化 摘要 土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性问题。土壤盐渍化严重影响着农业的产 量，尤其是使灌溉农业作物减产。同时盐分过高还可使土壤盐渍化，限制土壤的利 用。在盐渍化土壤中，n a + 是抑制植物生长的主要因素。对大多数植物来说，n a + 是植物离子特异性损害的最主要原因。所以，克隆和分析与n a + 转运相关的基因， 将有助于更好地研究植物的耐盐机理。 对植物耐盐机制的研究，虽在众多非盐生植物中开展，但进展较慢，原因在于 缺少盐生植物的基因分析。而最近的研究发现，盐生植物一盐芥是研究植物耐盐机 制最合适的植物。盐芥与拟南芥的遗传特性、生活特性相似，同样具有植株矮小、 生长周期短、自花授粉、种子多、基因组小、易于转化的特点。盐芥是很有前景的 植物耐盐模式系统。本试验以盐芥为研究材料，对其耐盐相关的基因t h n h x l 和 t h h k t l 进行研究，结果如下： 1 根据拟南芥的序列设计引物，通过r t - p c r 及r a c e 的方法从盐生植物盐芥中 克隆出一个假定的n a + i - i + 逆向转运蛋白基因t h n h x l 。该e d n a 全长2 0 4 5 b p ，开放读 码框长度为1 6 3 8 b p ，编码一个5 4 5 个氨基酸的多肽。序列分析表明：该序列与拟南芥 的n a + h + 逆向转运蛋白基因具有很高的同源性。结构分析表明t h n h x l 基因与 a t n h x l 基因具有类似的外显子和内含子构成。系统发育分析表明该蛋白与液泡型的 n a + h + 逆向转运蛋白的亲缘关系较近，与质膜型的n a + i - i + 逆向转运蛋白亲缘关系较 远。 2 采用常规分子克隆技术，利用p g e m - t 载体，成功地将t h n h x i 基因构建到 选择标记基因可去除的植物表达载体p x 6 g f p 中，并通过冻融法将该重组质粒成 功地导入根癌农杆菌菌株l b a 4 4 0 4 中。通过叶片共培养法转化烟草，在卡那霉素 l o o m g m 的m s 固体培养基上已筛选出具有选抗性的转化苗。 3 以盐芥为材料，依据拟南芥a t h k t l 基因的序列设计引物，扩增出盐芥中 t h h k t l 基因的部分序列。然后使用r a c e 方法，从盐芥中克隆到t h h k t l 基因e d n a 序列。该序列全长1 8 1 t o p ，推测编码区长度为1 5 0 3 b p ，编码5 0 0 个氨基酸，等电点为 8 8 2 。其编码序列和氨基酸序列与拟南芥a t h k t i 基因的相应序列相似性分别为8 2 8 和7 7 3 。 关键词：盐芥，r a c e ，n a + n + 逆$ 1 转运蛋白，t h n h x l ，t h h k t l i v c l o n i n g ，s e q u e n c ea n a l y s i s a n dt i e n e t i c t r a n s f o r m a t i o no ft h es a l t t o l e r a n tr e l a t e d g e n e sf r o mt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a a b s t r a c t s a l i n i t ys o i li saw o r l d w i d ep r o b l e mt h r e a t e n i n gc r o pp r o d u c t i o n s a l ts 订c s si st h e m a j o rf a c t o rt h a tl i m i t sa n dd e c r e a s e st h eo u t p u to fc r o p si nm a n yp a r t so ft h ew o r l d , p a r t i c u l a r l yf o rt h ei r r i g a t e dl a n d h i 【g hs a l i n i t yo fs o i lc a u s e ss a l i n aa n dl i m i t ss o i l u t i l i z a t i o n n a + i ns a l t n i t ys o i li st h em a j o rf a c t o ro f i n h i b i t i n gp l a n tg r o w t h b u tf o rm o s t p l a n t s ，n di st h ep r i m a r yc a u s eo fi o n - s p e c i f i cd a m a g e t h e r e f o r e , c l o n ea n da n a l y s i s n d - t r a n s p o r tr e l a t e dg e n e sa r ev a l u a b l et os t u d ys a l t - t o l e r a n tm e c h a n i s m m a n y , t o om a n y , s p i e sh a v e b e e nu s e dt oe x e m i n es a l i n i t yr e s p o n s ep h y s i o l o g y , b u tt h ef l a m e sa s s o c i a t e dw i t hg e n e t i co rm o l e c u l a rg e n e t i cs t u d i e si ns a l i n i t ys t r e s s r e s e a r c ha r ef e w t h er e c e n td i s c o v e r yo ft h eh a l o p h y t i cp l a n ts p e c i e s ，t h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l a ，w h i c hi sn a t i v et ot h es e a s h o r es a l i n es o i l s ，m e e t sa l lt h ec r i t e r i af o rb e i n ga g e n e t i cm o d e ls y s t e m t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l aw h i c hi sar e l a t i v eo ft h ea r a b i d o p s i sh a s s m a l ls i z e ，s h o r tl i f ec y c l e ，s e l f - p o l l i n a t i o n , a n dh i g hs e e dn u m b e r , a n df a v o r a b l eg e n e t i c t r a i t ss u c ha ss e l f - f e r t i l i z a t i o n , as m a l lg e n o m e ，e f f i e i e n tt r a n s f o r m a t i o n , a n dm u t a g e n e s i s s o t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ab e c o m e st h ep r o s p e c t i v es a l i n i t yt o l e r a n c em o d e l t h em a j o r p u r p o s eo fo u t e x p e r i m e n ti su s i n gt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l aa st h er e s e a r c hm a t e r i a l ， s t u d y i n gt h ef u n c t i o no f t h es a l tr e l a t e dg e n eo ft h n h x la n dt h h k t l 1 ae d n af i - a g m e n tw a sa m p l i f i e df r o mt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l au s i n gp r i m e r s d e s i g n e db a s e do nt h ea r a b i d o p s i st h a l i a n aa t n h x lg e n es e q u e n c ei nr t - p c r 5 一a n d 3 - r a c em e t h o d sw e r et h e nu s e dt oo b t a i naf d ll e n g t he d n a t h ee d n as e q u e n c e w a s2 0 4 5 b pi nl e n g t hi n c l u d i n ga no p e nr e a df l a m eo f1 6 3 8 b p ，e n c o d i n gap r e d i c t e d p o l y p e p t i d eo f5 4 5a m i n oa c i d s t h ed e t a i l e ds e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eg e n e s h a r e dt h eh i g h e s th o m o l o g o u sw i t ha t n h x l t h u s ，t h ee d n ae n c o d e sap u t a t i v e n a + i - i * a n t i p o r t e r ( 唧a x o i na d d i t i o n , t h eg e n es t r u c t u r eo ft h n h x lb a s e do ni n t r o n a n de x o na n a l y s i sh a dh i g hs i m i l a r i t yt o t h a to f4 吐刀忧，1 1 坞p h y l o g e n e t i ea n a l y s i so f v a r i o u sn a + i ra n t i p o r t e r si n d i c a t e dt h a tt h n i - i x li sg r o u p e dw i t ht o n o p l a s tn a + i - i + a n t i p o r t e r s ，a n dd i s t i n g u i s h e df r o mp l a s m am e m b r a n en d i - ra n t i p o f t e r s 2 b a s i n go nr o u t i n em o l e c u l a rc l o n i n gt e c h n i q u e sa n du s i n gt h ep g e m - tv e c t o r , t h e c o d i n gr e g i o no ft h n h x w a si n s e r t e d i n t ot h es e l e c t a b l em a r k e r - r e m o v a b l e e x p r e s s i o nv e c t o rp x 6 g f p t h er e c o m b i n a n tv e c t o rw a si n t r o d u c e di n t oa g r o b a c t e r i u m v t u m e f a c i e n al b a 4 4 0 4 w i t hf r e e z e - t h a wm e t h o d t o b a c c ow a f tt r a n s f e r r e db y1 e a fd i s k , i r a n s f o t m a n t so f t o b a c c ot h a ts c r e w e db yk a u a m y e i nm e d i u mw e r l ，o b t a i n e d 3 u s i n gt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l aa st h er e s e a r c hm a t e r i a l ，ae d n af r a g m e n tw a s a m p l i f i e df r o mt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l au s i n gp r i m o sd e s i g n e db a s e do nt h ea r a b i d o p m s t h a l i a n aa t h k t lg o n es e q u e n c ei nr t - p c r r a c em e t h o d sw 铘t h e nu s e dt oo b t a i na f u l ll e n g t he d n a t h ee d n as e q u e n c ew a s1 8 1 t o pi nl e n g t hi n c l u d i n ga l lo p e nr e a d f r a m eo f1 5 0 3 b p , e n c o d i n gap r e d i c t e dp o l y p e p t i d eo f5 0 0a m i n oa c i d s a n dp ii s 8 8 2 t h ed e t a i l e ds e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eg e n es h a r e dt h e8 2 8 s i m i l a r i t y w i t h a t h k t l k e yw o r d s ：t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ，r a c e , n a + h + m t i p o r t e r , t h n - x 1 ，t h h k t l v i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：力一7 年多月刁e t 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师签名： h i 时间：加7 年月纠日 时间： 2 。；：7 年石月2 护 2 引言 综上所述，植物对盐胁迫的适应非常复杂，提高作物的耐盐性仍然面临着极大的 挑战。在盐渍化土壤中，n a + 是抑制植物生长的主要因素。所以，克隆和分析与n a + 转运相关的基因，将有助于更好地研究植物的耐盐机理。n a + 逆向转运蛋白与植物 耐逆密切相关，过量表达质膜型和液泡型n 棚+ 逆向运转体基因均能显著提高植物的 耐盐性。n a + i - i + 逆向转运蛋白基因在植物耐盐基因工程的应用中己经显示出良好前 景。 到目前为止，植物耐盐性的研究大多是借助于非盐生植物进行的，虽然有少数几 种盐生植物已广泛用于生理及分子生物学的研究，但这些植物中没有一种符合作为遗 传模式材料的要求。最近研究发现，一种盐生植物一盐芥与拟南芥的遗传特性、生 活特性相似，均具有植株矮小，自花传粉，种子多，生长周期短，基因组小，易于转 化的特点【l 】，可以作为耐盐研究的模式植物。 本试验以耐盐模式植物盐芥为试验材料，根据拟南芥基因组序列的信息，克隆盐 芥中的相关基因，比较拟南芥和盐芥耐盐性差异的分子机制。从盐芥中克隆n a + a - ： 逆向转运蛋白基因有利于了解甜土植物和盐生植物的n a r 逆向转运蛋白基因在结 构与功能上的差异，以及进一步深入研究该类基因的耐盐作用机理奠定基础。进行盐 芥t h h k t l 基因的克隆，为进一步研究盐芥孤冠k 死基因功能、分子机理等奠定基础。 3 盐芥t h n h x l 基因的克隆与表达载体的构建以及遗传转化 3 1 材料与方法 3 1 1 试验材料 3 1 1 1 植物材料 盐芥( t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ) 种子来源于美国a b r c ( t h e a r a b i d o p s i sb i o l o g i c a l 瑚o l 耽ec e n t e r ) ，在温室中培养，温度保持在2 5 左右。 3 1 1 2 质粒及菌种 大肠杆菌( e s c h e r i a c h i ac o l d ：d h 5t l 菌株；农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ： l b a 4 4 0 4 ) 质粒：p x 6 - g f p ：质粒载体：p g e mte a s y ( p r o m e g a 公司) 。 3 1 1 3 酶及化学试剂 反转录酶，t a x i 酶，1 4 - d n a 连接酶，w i g 和x g a l 及克隆载体p g e m te a s y 购自p r o n l e g a 公司；引物由上海生工和上海赛百盛生物技术( s b s ) 有限公司合成；胶回 收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；r n a 提取试剂盒( 离心柱型) 购白天为公 司：r n a 提取试剂、质粒提取试剂盒购h v i t r o g e n 公司。 3 1 1 4 主要仪器设备 m jp c r 仪、t c 9 6 t i - i ( a ) p c r 扩增仪、t h e r m o 超速冷冻离心机、d y y - 8 c 型 电泳仪、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温培养箱、恒温干燥箱、低温冰箱、超低温 冰箱、超净工作台、高压灭菌锅、s p - - 2 1 0 2 u v 型微量紫外分光光度计、l q p b - 4 颗粒测定仪( 制冰机) 等。 3 1 1 5 培养基 l b ( 大肠杆菌) 培养基：胰蛋白胨 1 0g l 酵母浸膏 5 9 l n a c l 1 0 9 l 琼脂 1 5g l ( 液体培养基不加) m s 培养基：( m u r a a s h i g et a n ds k o o ge1 9 6 2 ) b 2 9 1 3 1 1 6 溶液配制 氨苄青霉素( a m p ) 液( ( 5 0 m g m l ) ：5 0 r a g a m p 溶于l m l 蒸馏水中，- 2 0 1 2 保存。 利福平( r i d ( 5 0 m g , m l ) , 0 1 5 9r i f 溶于3 m l o p 醇中，- 2 0 。c 保存。 x - 删- 用二甲基甲酞胺溶解配成2 0 m g m l 的贮存液，于一2 0 避光保存。 i p t g ：8 m l 的无菌去离子水中溶解2 9i p t g 后用蒸馏水定容至1 0 m l ，过滤除 菌，分装小份于一2 0 保存。 d e p c 水：在1 0 0 0 m l 的去离子水中加入l m ld e p c ，密封混匀，3 7 。c 放置过夜， 高压灭菌4 5 r a i n 。 5 0 x t a e ：t r i s2 4 2 9 ，冰醋酸5 7 1m l ，0 5me d t a ( p h 8 0 ) 1 0 0 m l ，加水定容至1 1 4 升。 3 1 1 7 引物合成： 参考已发表的拟南芥逆向转运蛋白基因a t n h x l 基因的e d n a 核苷酸序列，设 计盐芥n a + m + 逆向转运蛋白基因部分e d n a 克隆引物如下： x 1 ：5 - g t g ct g c a a c c gg t c tgta 3 ： x 2 ：5 - 3 g c c 舶陌玎t t t g c r r r c t g c t c - 3 。 r a c e 扩增中使用的特异引物如下： g s p i ：5 一c t c a c t g c g a c t g a t g t t c c t g g g c - 3 ： g s p 2 ：5 g c a a g t t g t ca = 几- r g g t g g g c t g g t c 3 。 5 端巢式p c r q l 物为： g 2 a ：5 - t i c c t g g g t g t c a c t c a c - 3 ；3 端由于r a c e 效果较好，没有设计巢式 p c r 引物。 根据已克隆的盐芥t h n h x l 基因的e d n a 序列设计盐芥n a + a - i + 逆向转运蛋白基因 基因组d n a 克隆引物如下： 咖1 1 - 5 ：5 - g g c g c g c c t a t a t c t g g g a g g g c a a c a c g - 3 ： 1 m n l l 3 ：5 g c g g c c g c g g a t a a m a c a c a a g a c g c a c a a - 3 。 盐芥n a + r i + 逆向转运蛋白基因编码区e d n a 克隆引物如下： 1 h n l a - 5 ：5 - c r c g a g t 戌l 蛆t c t g g g a g ( g c a a c a c g - 3 ： 1 m n l b 3 ：5 a c t a g t g g a t a 戌m a c a c a a g a c g c a c a a 3 。 脓杆菌检测引物： x l g 3 b ：c c g c a a g a a a c g a c a a a g t ，该引物与1 n l b 3 配成一对引物。 3 2 2 试验方法 3 2 2 1 植物材料处理 将盐芥种子播种于花卉土中，1 个半月后以取叶片，用于d n a 和r n a 的提取。 3 2 2 2 基本分子生物学实验技术 3 2 2 2 i 盐芥d n a 的提取 c t a b 法 1 ) 将2 c t a bb u f f e r6 5 预热3 0 r a i n ： 2 ) 取l o o m g 盐芥叶片放于1 5 m l 离心管中，在液氮中研磨成粉末( 越细越好) ； 3 ) 加入6 0 0 r a l 预热好的2 x c t a bb u f f e r ，震荡，6 5 保温3 0 m i n ； 4 ) 加入等体积的氯仿异戊醇，轻缓颠倒混匀； 5 ) 室温下1 3 0 0 0 r r a i n 离, d 5 m m ； 6 ) 将上清液转入新的离心管，加入等体积的异戊醇，轻缓混匀，室温放置1 5 r a i n 7 ) 1 3 0 0 0 r m i n 离, t , l o m i n 沉淀d n a ； 8 ) 弃上清液，倒置离心管于干净的吸水纸上5 m i m 9 ) 加j 1 0 0 1 t l t eb u f f e r 溶解d n a ； l o ) 向溶解的d n a 中加入5 0 p , l 7 5 mn i - h o a c ，轻缓混匀，然后再加入1 5 0 “l 异 戊醇，轻缓混匀，室温放置5 m i n ； 1 1 ) 1 3 0 0 0 r m i n 离, 凸q o m i n 1 2 ) 弃上清液，倒置离心管于干净的吸水纸上5 m i r a 1 3 ) 加入l m l 7 0 乙醇，松动沉淀，震荡； 1 4 ) 1 3 0 0 0 f ，如_ i n 离心8 m i n ； 1 5 ) 小心倒掉乙醇，倒置离心管1 0 m i n ； 1 6 ) 加5 0 p l h 2 0 溶解，用分光光度法测a 2 6 0 及a 2 8 0 以确定浓度，于- 2 0 ( 2 贮保 存。 植物基因组d n a 提取试剂盒 1 ) 取植物新鲜组织1 0 0 m g ，加入液氮充分研磨。 2 ) 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有7 0 0 i j t l6 5 。c 预热缓冲液g p i 的离心管 中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在6 5 水浴2 0 分钟，水浴过程中颠倒离心管以 混合样品数次。 3 ) 加入7 0 0 p l 氯仿，充分混匀，1 3 0 0 0 r p m 离心5 分钟。 4 ) 小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入7 0 0 j l 缓冲液 g p 2 ，充分混匀。 5 ) 将混匀的液体转入吸附柱c b 3 中，1 3 0 0 0 离心3 0 秒，弃掉费液。 6 ) 向吸附柱c b 3 中加入5 0 0 肛l 去蛋白液g d ，1 3 0 0 0 离心3 0 秒，弃掉费液。 7 ) 向吸附柱c b 3 中加入7 0 0 “l 去漂洗液p w ，1 3 0 0 0 离心3 0 秒，弃掉费液。 8 ) 向吸附柱c b 3 中加入5 0 0 1 a l 去漂洗液p w ，1 3 0 0 0 离心3 0 秒，弃掉费液。 9 ) 将吸附柱c b 3 放回费液收集管中，1 3 0 0 0 离心2 分钟。将吸附柱c b 3 置于 室温或5 0 数分钟，以彻底凉干吸附柱中的漂洗液。 1 0 ) 将吸附柱c b 3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 5 0 - 1 0 0 1 a l 经6 5 7 0 水浴预热的洗脱缓冲液t e ，室温放置2 5 分钟，1 2 0 0 0 离心3 0 秒。 1 1 ) 离心得到的溶液再加入吸附柱c b 3 中，室温放置2 分钟，1 2 0 0 0 离心2 分钟。 用分光光度法测a 2 6 0 及a 2 8 0 以确定浓度，于- 2 0 贮存。 3 2 2 2 2 盐芥r n a 的提取 p l a n tr n ar c a g e n t 试剂法 1 ) 取组织0 1 9 ，加入少许液氮研磨成粉末； 2 ) 加入o 5 m l 冰冷的( 4 ) p l a n t r n a r e a g e n t ，抽打匀浆( 使样品完全悬浮) ； 1 6 3 ) 室温放置5 m i n ； 4 ) 室温1 2 0 0 0 9 ，2 m i n ，取上清至新的1 5 e p 管中； 5 ) 加0 1 m l i s m n a c l ，轻拍混匀； 6 ) 加入3 0 0 t t l 氯仿，颠倒混匀( 2 0 - 3 0 次) ； 7 ) 4 0 离心1 2 0 0 0 9 1 0 分钟，取上清至新e p 管； 8 ) 加等体积的异丙醇混匀，室温静置l o 分钟； 9 ) 4 0 离心1 2 0 0 0 9 1 0 分钟，弃上清，留沉淀； 1 0 ) 加入l m l 7 5 乙醇，温和震荡悬浮沉淀； 1 1 ) 室温1 2 0 0 0 91 分钟( 弃上清) ； 1 2 ) 加1 0 - 3 0 t t l r n a s e - f r e ew a t e r ( 用# p e t 助溶) ；如果有浑浊，室温1 2 0 0 0 91 分钟，取上清液，用分光光度法测a 2 6 0 及a 2 8 0 以确定浓度- 7 0 c 保存。 t r i z o l 法 1 ) 取组织0 1 9 ，加入少许液氮研磨成粉末； 2 ) 加入l m l t r i z o l ，抽打匀浆； 3 ) 冰浴5 m i n ，使其充分裂解； 4 ) 4 0 离, c , , 1 2 0 0 0 r r a i n1 0 m i n ，取上清至新e p 管； 5 ) 加a 2 0 0 t t l 氯仿，震荡混匀，冰浴5 m i n ； 6 ) 4 0 离, 1 * 1 2 0 0 0 r r a i n1 5 r a i n ，取上清至新e p 管； 7 ) 加5 0 0 t t l 异丙醇震荡混匀，冰浴5 m i n ； 8 ) 4 c 离, t , 1 2 0 0 0 r r a i n1 0 r a i n ，弃上清，留沉淀； 9 ) 加入l m l 7 5 乙醇，温和震荡悬浮沉淀； 1 0 ) 4 0 离, l , 8 0 0 0 r m i n5 m i n ，弃上清； 1 1 ) 室温晾干； 1 2 ) 加5 0 t t l r n a s e - f i - e e w a t e r 溶解，用分光光度法狈g a 2 6 0 及a 2 8 0 以确定浓度- 7 0 保存。 植物总r n a 提取试剂盒( 离心柱型) 1 ) 匀浆处理： 5 0 - 1 0 0 m g 植物时片在液氮中迅速研磨成粉末，加入4 5 0 i j t l r l ，混匀后室温放置 5 m i n ： 2 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心2 5 m i n ，取上清进行以下操作； 3 ) 缓慢加入上清0 5 倍体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 c r 3 中，1 2 0 0 0 r p m 离, t j , 3 0 - 6 0 s e c ，弃掉收集管中的废液： 4 ) 向吸附柱c r 3 中加, _ ) k 7 0 0 t t l 去蛋白液r w l ，1 2 0 0 0 r p m 离，t j , 3 0 6 0 s ，弃废液； 5 ) 向吸附柱c 9 3 q 日* h 入5 0 0 t t l 去漂洗液r w ，1 2 0 0 0 r p m 离一1 j , 3 0 6 0 s ，弃废液： 1 7 6 ) 重复步骤5 ； 7 ) 1 2 0 0 0 r p m 离, d 2 m i n ，去除残余液体； 8 ) 将吸附柱c r 3 转入一个新离心管中，加入5 0 - 1 0 0 p , l r n a s e - f i t 冶水，室温放置 2 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离, t ) 2 m i m 9 ) 洗脱样品7 0 c 保存。 3 2 2 2 3 反转录 1 ) 冰上操作： 1 - 5 烬 总r n a l p l o l i g o ( d t ) 补r n 勰e - 疳。e 水到l l l j l 2 ) 7 0 l o m i n ； 3 ) 再加入4 t t l 5 x b u f f e r 2 p l d n t p 2 1 t ld t t ( 1 0 0 m m ) 4 ) 混匀，加入l p l 反转录酶，再混匀； 5 ) 4 2 保温l h 一1 5 h ； 6 ) 7 0 1 5 m i n 终止反应。 3 2 2 2 4p c r 扩增 反应体系： 0 8 1 t ld n a ( 1 0 2 5 0 n g ) 2 i l l l o x b u f f e r 1 2 p lm g e l 2 ( 2 5 m m ) 2 肛l 心订t ( 2 r a m ) l 肛lp i ( i o p m ) l p lv 2 ( 1 0 p m ) 0 2 肛lt a qd n ap o l y m e r a s e d d h 2 0 补足2 0 1 t l 体系； p c r 反应程序： 9 4 5 m i n ； 9 4 ，3 0 s - - 5 5 c ，5 0 s 一7 2 c ，3 0 s - - 3 5 循环； 7 2 1 0 m i n ； 4 f o r e v e r 。 3 2 2 2 5 用c a c l 2 制备大肠杆菌感受态细胞 1 ) 挑取大肠杆菌单菌落，接种于2 0 m ll b 培养基中，3 7 c 摇菌过夜； 2 ) 吸取2 0 0 p l 菌液，接种于5 0 m ll b 培养基中摇茵2 h 左右，经常观察菌液 的生长状，至o d 约为0 3 左右； 3 ) 将菌液倒入一个1 0 m l 的无菌离心管中，置于冰上冷却1 0 m i n ； 4 ) 4 c ，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ； 5 ) 倒出培养液，将管倒置l m i n 加入3 m l 冰预冷的o 1 m 的c a c l 2 轻轻地重悬 菌体，冰上放置3 0 r a i n ； 6 ) 4 c ，4 0 0 0 r p m 离心l o m i n ； 7 ) 小心倒掉上清，加入6 0 0 p l 冰预冷的o 1 m 的c a c l 2 ，轻轻的重悬； 8 ) 用1 s m l 的无菌e p 管分装成2 0 0 l l u 管，加入l 4 体积的无菌甘油，液氮冷 萃，放入- - 7 0 ，保存备用。 3 2 2 2 6 大肠杆菌转化及蓝白斑筛选方法 1 ) 取一管感受态细胞分别加入上次实验的所有连接产物( 1 0 p l ) 。轻轻混匀， 冰上放置3 0 m i n ； 2 ) 4 2 热激9 0 8 ； 3 ) 迅速冰上放置3 5 m i n ， 4 ) 在上述各管中加入8 0 0 p l l b 培养液混匀；3 7 ( 21 0 0 r p m 摇菌1 h ，使已转化 的细胞繁殖1 - 2 代，并表达抗性蛋白； 5 ) a 0 0 0 r p m 离心3 m i n ，使细胞沉于管底，吸掉8 0 0 1 a l 上清夜，用剩余培养液 将细胞悬浮；加入4 此i p t g ( 2 0 0 m g m 1 ) 和1 6 p l ) ( - g a l ( 5 0 m g m l ) ，混匀后用三角 推棒均匀的铺在含有抗生素的平板上，吹千多余液体； 6 ) 3 7 倒置平板培养1 2 1 9 h 。取出培养板4 1 2 放置数小时，使蓝色在这一期间 充分显色。 3 2 2 2 7 转化子的进一步扩增和鉴定 首先在一个灭过菌的新平板培养基上再涂布一次i p t g 和x - g a l ( 以便除去其 中的假阳性菌落) 。从已筛选出的蓝斑和白斑培养皿中挑取1 5 个白斑并作好标记， 用牙签挑菌落在新培养基上划平板。同时用2 个蓝斑划平板，以作对照。3 7 c 倒置 平板培养1 2 1 9 h 。第二天用牙签挑菌落。需要靠t 7 ，s p 6 这一对引物，利用菌落 p c r 来进行检测，因为t 7 ，s p 6 这一对引物的结合位点是在t 载体上，因此利用 它来做p c r 我们就可以防止假阳性的质粒产生。p c r 扩增1 5 管，琼脂糖凝胶电泳 后，经凝胶成像系统检测，标记只有带目的基因才能出现亮条带。 p c r 检测反应体系： 0 8 p l d n a ( 1 0 2 5 0 n g ) 2 肛l 1 0 x b u f f e r 1 2 1 t lm g c h ( 2 5 r a m ) 1 9 2 ) t l 仆r i p ( 2 r a m ) l t t lt 7 ( 1 0 p m ) i p l s p 6 ( 1 0 p m ) 0 2 t t l t a qd n ap o l y m e r a s e d d h 2 0 补足2 0 t t l 体系； p c r 检测反应程序： 9 4 5 m i r a 9 4 ，3 0 s - - 5 0 ，5 0 s - 7 2 ，3 0 s - - 3 5 循环； 7 2 1 0 r a i n ； 4 cf o r e v e r 。 3 2 2 2 8p c r 产物的分离纯化 采用上海华舜生物工程有限公司生产的d n a 凝胶回收试剂盒纯化，具体操作 步骤如下( 室温离心9 0 0 0 9 ) ： 1 ) 在紫外灯下，切下含d n a 的琼脂糖块，使它尽可能的小。放入1 5 m l 离心 管中。尽可能多地去掉不含d n a 的琼脂糖，这样对提高质量、简化操作均有好处。 2 ) 按每1 0 0 m g 琼脂糖加入3 0 0 t t l s l 液的比例加入s 1 液，置5 0 c 水浴1 0 m i n ， 琼脂糖块完全溶化，每2 m i n 颠倒混匀一次。 3 ) 将溶化后的a g a r o s e 液移入吸附柱，离心3 0 s 。倒掉收集管中的液体，再将 吸附柱放入收集管。 4 ) 在吸附柱中加入5 0 0 t t l w l 液，离心1 5 s 。倒掉收集管中的液体，将吸附柱 放入收集管。 如果室温低于2 0 ，离心前先静置l m i n 。 5 ) 在吸附柱中加入5 0 0 t t l w l 液，静置l m i n 后，离心1 5 s 。倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入收集管。 6 ) 离心l m i n 。 此步骤绝对不可以省略或者调整。 7 ) 将吸附柱放入一个干净的1 5 m l 离心管中，在吸附膜中央加入3 0 t t l t i 液， 静置l m i n 后，离心l m i n 。将1 5 m l 离心管( d n a ) 贮存于2 0 。 3 2 2 2 9t a 克隆回收片段与t 一载体的连接 3 t t lp c r 回收产物 l t t lp g e m - te a s y 载体 l t t lt 4 d n a 连接酶 5 t t l b u f f e r d d h 2 0 补足1 0 ) t l 体系4 过夜； 3 2 2 2 1 0r a c e 引物合成： s m a i u ：5 l a a g c a g t ( 托玎a t c f a c g c a g a ( 玎a c g c g g g - 3 ： 3 - c d s ：5 - a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t a c ( t ) 3 0 vn _ 3 ( n = a ，c ，g ，o rt ； v = a ，g ，o rc ) ； 5 - c d s ：5 钢2 5 v n o = a ，c ，g ，o r t ；v = g ，o rc ) ； u p m l ： 5 l ( 玎aa t a c g a c t c a c t a t a g g g c a a g c a g t g g t a t c a a c g k ：a g 协g t - 3 ： u p m s ：5 l c t a a t a c g a c t c a c t a t a g g g c 3 t ： n u p * * 5 _ a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g l - 3 。 第一条链的合成： 1 ) 分别在0 2 m l 的r n a s e - f r e e 离心管中加入以下物质： y - r a c e - r e a d yc d n at - r a c e r e a d yc d n a l - 3p l r n a 样品l _ 3 此r n a 样品 lp l 5 - c d s 弓i 物1t t l y - c d s 引物 1t t ls m a r t 引物 2 ) 在每个离心管加r n 船e - 鲰水至5 9 t l ； 3 ) 混匀，短暂离心； 4 ) 7 0 保温2 m i n ； 5 ) 冰浴2 m i n ： 6 ) 短暂离心； 7 ) 将以下试剂分别加入离心管中： 2t t l5 xf i r s t - s t r a n db u f f e r 1 肛l d t r ( 2 0 r e l y 0 lh l d n 耶m i x ( 1 0 r a m ) lp lb dp o w e r s c r i p tr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 1 0 1 a lt o t a lv o l u m e 8 ) 用枪头轻轻混匀； 9 ) 短暂离心； 1 0 ) 4 2 保温1 5h ； 11 ) 加入1 0 0 t t l t r i c i n e - e d t ab u f f e r 稀释第一条链； 1 2 ) 7 2 7 m i n 终止反应； 1 3 ) 将样品放在2 0 保存。 t - r a c e ： 2 1 反应体系： t - r a c e - r e a d yc d n a 2 5t t l 5t t l1 0 x p c r b u f f e r lp ld n r p m i x 1p l g s p 2 ( 1 0p l 田1 | l 5 p lu p m ( 1 0 x ) 0 5 1 o u l t a qd n a p o l y m e r a s e 补水至5 0 i _ t l ，混匀 反应程序： 5c y c l e s ： 9