（农业昆虫与害虫防治专业论文）2种蜜蜂和4种胡蜂溶血肽基因克隆与表达研究.pdf

中文摘要蜂毒溶血肽( m e l i t t i n ) 是意大利蜜蜂蜂毒的最主要成分，约占蜂毒于重的4 0 5 0 。它具有很强的生物学活性，可引起红细胞裂解、脂质体释放标记离子以及肥大细胞释放组胺，同时它对细胞膜也具有很强的表面活性，其透过卵磷脂膜和混合脂膜的速度为任何表面活性剂所不及。因而，它是目前医药、生物：【程及农业上家畜疾病的治疗和植物保护方面研究的重要原料。首先本研究分别从中华蜜蜂、意大利蜜蜂工蜂和雌性亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂毒腺中抽提总r n a ，通过r t - p c r 方法扩增得到2 种蜜蜂和4种胡蜂蜂毒前溶血肽原的e d n a , 再将扩增产物克隆到p g e i v l 辔te a s yv e c t o r 上。测序结果表明：扩增得到的片段长度均为2 1 3b p ，系蜂毒前溶血肽原编码区的c d n a ，共编码7 0 个氨基酸，包括由2 1 个氨基酸组成的信号肽和4 9 个氨基酸组成的溶血肽原，溶血肽位于其，c o o f i 端( 第4 4 7 0 残基) 。经序列比较，2 种蜜蜂和4 种胡蜂蜂毒前溶血肽原之间的氨基酸序列同源性都超过9 2 。中华蜜蜂、意大利蜜蜂和亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂各自与东方蜜蜂印度亚种蜂毒前溶血肽原氨基酸序列的同源性分别为9 7 2 、1 0 0 、9 3 、1 0 0 、9 7 2 、9 7 2 。结果表明，蜂毒前溶血肽原一级结构序列具很高的保守性，尽管胡蜂和蜜蜂属于膜翅目不同的总科，但它们的前溶血肽原基因却非常相似。以前胡蜂总科被认为不存在溶血肽基因，本研究首次揭示了胡蜂总科存在与蜜蜂相似的溶血肽基因。本文报道的中华蜜蜂、亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂和大胡蜂的前溶血肽原基因都已作为新的基因序列在g e n b a n k 登录，分别为：a p sc e r a n 口c e r a n ap r e p r o m e l i h i nm r n a ( 登录号a f 4 8 7 9 0 7 ) 、p o l i s t e sh e b r a e u sp r e p r o m e l i t t i nm r n a ( 登录号a f 4 8 7 9 0 9 ) 、v e s p u l am a c u l i f r o n sp r e p r o m e l i t t i nm r n a ( 登录号a f 4 8 7 9 1 1 ) 、v e s p av e l u t i n an i g r i t h o r a xp r e p r o m e l i t t i nm r n a ( 登录号a f 4 8 7 9 0 8 ) 、v e s p am a g n i l i c ap r e p r o m e l i t t i nm r n a ( 登录号a f 4 8 7 9 1 0 ) 。利用g s t 基因融合表达系统构建了中华蜜蜂、亚非马蜂溶血肽基因的大肠杆菌诱导表达载体p g e x a c c m 和p g e x p h m ，并在菌株b l 2 1 中进行了商效表达。二者的表达产物经w e s t e r nb l o t t i n g 检测均具有很强的免疫活性，与预期目的蛋白分子量大小一致，三抗夹心e l i s a 检测结果也表明表达产物具有明显的免疫学活性。表达条件的优化实验表明p g e x p h m 和p g e x - a c c m 在i p t g 诱导下都能够在大肠杆菌b l 2 1 中稳定高效表达融合蛋白，两者的诱导表达对o d 6 0 0 、i p i g 浓度、温度以及诱导时间都有一定的选择性。在各自最佳条件而o d c m o 为1 o 时，g s t - a c c m 表达量可以达到细菌总蛋白的1 2 7 1 4 1 ，g s t - p h m 表达量可以达到细菌总蛋白的1 1 7 。溶血肽诱导家兔血小板的聚集实验也初步表明，本研究表达产物经酶解回收后得到的溶血肽蛋白是具有一定活力的，但具体活性仍有待进一步的研究。同时，分别构建了中华蜜蜂和亚非马蜂溶血肽基因与谷胱甘肽基因融合的重组杆状病毒b a c m i d g s t a c c m 和b a c m i d 。g s t p h m ，在粉纹夜蛾细胞系t n ，5 8 1 - 4 中进行了成功的表达。s d s p a g e 分析表明，感染b a c m i d g s t a c c m和b a c m i d - g s t p h mt n 细胞的表达产物均在分子量约为3 4 k d 处出现特异性条带，二者的表达量分别占t h 细胞总蛋白的7 3 和3 2 。w e s t e r nb l o t t i n g 和三抗夹心e l i s a 检测同时证明二者的表达产物都具有良好的免疫活性。感染b a c m i d - g s t a c e m 和b a c i n i d - g s l 阿h m 的 i n 细胞与感染阴性对照b a c m i d 的t n细胞状态相比，其感染症状没有明显区别，说明表达产物融合蛋白对细胞是没有明显的毒性。溶血肽诱导家兔血小板的聚集实验也初步表明，本研究表达产物经酶解回收后得到的溶血肽蛋白是具有一定活力的，但相比之下，弧非马蜂溶血肽蛋白诱导家兔血小板的聚集活力相对较低，这与两者一级结构不同是不是有关，有待研究。此外，我们还将中华蜜蜂和亚非马蜂溶血肽基因与增强型荧光( g f p d 基因融合在杆状病毒一昆虫细胞表达系统中进行了表达，二者的表达量分别占t n 细胞总蛋白的3 1 和2 6 。w e s t e r nb l o t t i n g 显示表达产物对h i s - t a g 回m o n o c l o n a la n t i b o d y 和兔抗溶血肽( 与卵清蛋白交联的总蛋白) 多克隆抗体都具有良好的免疫活性，在约3 4 6 k d 处均有一明显的条带，与预期目的蛋白的分子量大小一致。感染b a c m i d - g f p t a c c m 和b a c m i d g f p t p h m 的t n 细胞与感染阴性对照b a c m i d的t n 细胞状态相比，其感染症状并没有明显区别，说明表达产物一融合蛋白g f p l a c c m 和g f p t p h m 对细胞也不具明显的毒性。同时我们也分别构建了中华蜜蜂、距非马蜂和额斑黄胡蜂前溶虹肽原基因与增强型荧光( g f p d 基因和h i st a g + t e vr e c o g n i t i o ns i t e 融合的重组杆状病毒，分别在粉纹夜蛾细胞系t n 一5 8 1 4 中进行了表达。e l i s a 检测表明三者的胞内表达产物都具有良好的免疫活性，而胞外表达产物则均显阴性，说明各蜂前溶血l l i肽原基因的连有h i st a g 或e g f p 的前溶血肽原蛋白没有穿膜，表达产物也不能分泌出细胞外。前溶血肽原基因的信号肽有待于用非融合的载体进一步研究。关键词：中华蜜蜂；意大利蜜蜂：亚非马蜂；额斑黄胡蜂：墨胸胡蜂：大胡蜂；前溶血肽原：溶血肽；克隆：表达；大肠杆菌表达系统；杆状病毒昆虫细胞表达系统；本论文部分研究内容受国家自然科学基金( n o 302710 08 )项目资助致谢本论文是在两位导师一程家安教授和张传溪教授的悉心指导下完成的，从本论文的选题、试验设计及论文写作等每一个环节都倾注着导师的心血。两位导师以其渊博的学识、严谨务实的治学态度、正直宽厚的为人风范和对科学事业孜孜以求、无私奉献的精神将使我终生受益。值此论文完成之际，谨向两位导师表示深深的谢意和崇高的敬意!在学习和研究期间，得到了浙江大学应用昆虫学研究所全体老师和同学们的热心支持和帮助，正是由于他们的关心和帮助使得本研究得以顺利完成。感谢昆虫所何俊华教授、胡萃教授、刘树生教授、陈学新教授、叶恭银教授、施祖华教授、徐志宏教授、陈盛禄教授、莫建初教授、祝增荣研究员、唐启义研究员、蒋明星副教授、娄永根副教授、马云副教授、余虹副教授、刘银全老师、姚洪渭老师、张子钰实验师、芮开宁老师的支持和帮助；感谢动科院苏松坤老师、鲁兴萌教授，生物技术研究所陈正贤老师、吴建祥老师，植物病理学科宋风鸣教授给予的指导和帮助；感谢浙一医院核科学的徐勤老师、杨以理老师给予的无私帮助；感谢王六彩小姐给予的各种帮助。感谢二年来和我朝夕相处的张素方博士，感谢她在实验过程中给予的启发和帮助；感谢已毕业的武家才硕士在我刚进实验室时在基因克隆等方面给予的耐心指导和帮助；感谢刘艳荷博士后、王芳博士在实验过程中给予的无私帮助：感谢已毕业的沈立荣博士、赵伟春博士给予的热心帮助；此外，还得到了李江红、徐海君、马秀翠、黄新发、高国辉、郭忠建、王敦、安世恒、顾奇伟、林建国、杨章女、姜永厚、张小斌、吴立成、杜孟浩、朱光辉、孙冠英、白素芬、白耀宇、杨天赐、张时妙、徐晓国、腾立等同学的大力支持和协助。感谢中科院吴祥甫研究员赠送粉蛾夜蛾细胞系t n 5 8 1 4 。在此谨向所有在这五年来在学习和生活上关心和帮助过我的老师们和同学们表示深深的谢意!在求学的二十年中，我的父母和家人在各方面都给予了我一如既往的关心和照顾，正是他们的理解、鼓励和支持使我得以顺利求学至今，值此论文完成之际，对他们表示深深的感谢，并对在我学习期间去世的外婆、奶奶表示深深的怀念!最后，谨向参加本论文评阅和答辩会的全体专家致以最诚挚的谢意!施婉君2 0 0 2 年5 月于浙江大学华家池校区第一部分文献综述及本研究的目的和意义浙江大学博士学位论文第一章蜜蜂蜂毒的研究进展在众多的蜜蜂产品中，蜂毒是最具有开发价值的产品之一。从二十世纪七十年代开始，国外学者就己对意大利蜜蜂( a p i sm e l l i f e r a ) 蜂毒进行了一系列研究，包括蜂毒活性成分的分析、分离纯化及作用机理等等。七十年代以后，随着分子生物学技术的发展，又克隆了一系列蜂毒功能基因，并同时在医学、药学、生物工程及农业等领域展开广泛的研究。而我国虽作为世界第一养蜂大国，但在蜂毒研究上却大大落后于欧美国家，尤其是对于中华蜜蜂( a p i sc e r r r n c lc e t a n a ) 的分子生物学方面上的研究基本处于空白。我国每年仅风湿病、类风湿病的发病率就在3 左右，全国约有此类患者4 0 0 0 多万人( 余林生，1 9 9 5 ) ，开发利用蜂毒资源，不仅可以增加养蜂者的收入，促进养蜂业稳定发展，而且会创造更大的社会效益和经济效益。1 蜂毒的来源蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和昌4 腺分泌的透明毒液，蜂蜇时由尾部蜇针排出，是蜜蜂用于防卫敌害的武器。蜇针也叫蜇刺，是由失去产卵功能的产卵器特化而成的，它与毒腺、副腺及毒囊一起组成了蜜蜂的毒器( 图1 1 ) ( v i s s e h e re ta l 1 9 9 6 ；m u l f m g e r e t a l ，1 9 9 2 ) 。平时蜇针一般藏予第7 腹节摺入的刺囊内，当敌害临近需要时，工蜂会伸出蜇针，刺入敌体，毒囊里的毒液马上经蜇针注入敌体，而蜜蜂蜇针上的倒刺导致毒器被拉脱，离体的蜇针还会借助毒囊肌肉的伸缩，使蜇针继续前进，毒囊继续放毒，直到蜇针被顶住，毒液放尽为止( 叶振生等，2 0 0 1 ) 。蜂毒腺分泌毒液在羽化前即开始，但刚出房的工蜂毒液非常少。毒囊中的毒液随着目龄增长而积累，1 5 日龄工蜂的毒囊内贮存的毒液达o 3 毫克，随后毒腺细胞丌始退化，2 0 日龄后毒腺完全停止分泌毒液。蜜蜂工蜂毒囊内贮存毒液的多少，与蜜蜂的日龄、饲料、采毒的季节、采毒的次数以及蜜蜂的品种有很大关系( 余林生，1 9 9 5 、。塑坚查兰堕l 兰些堡墨图1 i 蜜蜂毒器( m u l f l n g e re f a l ，1 9 9 2 ；v i s s c h e r e l a l ，1 9 9 6 )f i g 1 1h o n e y b e es t i n ga p p a r a t u s ( m u l f i n g e re la l ，1 9 9 2 ；v i s s c h e r “a l ，1 9 9 6 )初期采集蜂毒的方式是利用单个蜜蜂蜇刺的方法；5 0 年代开始使用乙醚麻醉法取毒；6 0 年代以后，国内开始采用电刺激取毒的方法，它也是目前生产蜂毒的最好方法，其基本原理就是利用电刺激蜜蜂，使之产生蜇刺行为，将毒液排出体外，然后再收集提取。电取蜂毒器的式样很多，有巢门取毒、笼子取毒、副盖取毒三种。其中以副盖取毒形式采的蜂毒质量最好。一般每群排毒蜜蜂为1 5 0 0 只左右，每次约7 分钟，每群每次可收干蜂毒约达0 1 9 ，排在玻璃板上的毒液在空气中很快形成固体晶点，用不锈钢刀片将它刮下，即为蜂毒粗品( 陈盛禄等，2 0 0 1o2 蜂毒的理化特性蜜蜂蜂毒是一种味苦而具有芳香气味的微黄色透明液体，比重为1 1 3 1 3 ，呈酸性，p h 为5 0 5 5 ，对人的鼻粘膜、眼角膜和1 ：3 腔粘膜具有强烈的刺激性，在常温下会很快挥发干燥成占原液重量3 0 - - 4 0 的土黄色固体。挥发物中至少有1 2 种以上可用气相分析鉴定的成分，其中包括以乙酸异戊酯为主的报警激素。i bf 蜂毒在采集和精制过程中极易散失，通常在述及蜂毒的化学成分时，难以做到浙江大学博士学位论文全面、准确( 葛春华等，1 9 9 5 ) 。蜂毒极易溶于水、甘油和酸，不溶于酒精。蜂毒溶液不稳定，容易染菌和变质，鲜蜂毒只能保存几天；加热至1 0 0 c 经1 5 分钟组分被破坏，至1 5 0 毒性完全丧失。蜂毒易被消化酶和氧化物所破坏，在胃肠消化酶的作用下，很快就会失去活性，这是因为蜂毒中主要生物活性成分为肽类物质，易被蛋白酶所分解，氧化剂如k m n 0 3 、c 1 2 、b r 2 等能迅速破坏它。醇可降低其活性；碱与蜂毒有强烈的中和作用；酪酸、苯酚及某些防腐剂，以及生物碱沉淀剂，也能和蜂毒发生作用。干燥蜂毒稳定性强，加热至1 0 0 c ，经1 0天仍不失其生物活性，冰冻有利保存其活性，在严密封闭和干燥的条件下，能保持其作用达数年之久( 宋心仿等，2 0 0 0 ；杜桃柱，1 9 9 8 ) 。3 蜂毒的成分蜜蜂蜂毒的成分十分复杂，至今还未完全搞清。国内外研究结果表明，蜂毒中水分占8 0 8 8 ，干物质中蛋白质占7 5 ，主要活性物质有多肽类、酶类、生物胺等，其主要成分见表1 1 ( 骆尚骅，2 0 0 1 ；h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。各种化学成分在蜂毒中所占的比例不同，其生物活性也不尽相同，本文就其中6 种主要成分作一简单的介绍。表1 1 意大利蜜蜂蜂毒主要成分( 肖锡红，1 9 9 1 ；骆尚骅，2 0 0 1 ；缪晓青等，2 0 0 0 ；孙欣等；1 9 9 0 ；h a r te la 1 ，2 0 0 0 )t a b l e1 - 1m a i nc o n s t i t u t e sa n db i o c h e m i c a lp r o p e r i e so fv e n o mo f am e l l i f e r a ( x i a os h ，1 9 9 1酶类磷脂酶a 2 ( p h o s p h o l i p a s e a 2 )l o 1 21 4 5 5 51 2 9磷脂酶b ( l y s o p h o s p h o l i p a s eb 、1 02 2透明质酸酶( h y a l u y o u i d a s e )1 5 2 04 03 4 9酸性磷酸单脂酶( a c i d1 05 5p h o s p h o m o n o e s t e r a s e )a 一葡萄糖苷酶( a g l u c o s i d a s e ) 0 61 7 0一一4浙江大学博士学位论文表1 1 意大利蜜蜂蜂毒主要成分( 肖锡红，1 9 9 1 ；骆尚骅，2 0 0 1 ；缪晓青等，2 0 0 0 ；孙欣等；1 9 9 0 ；h a ne t a l ，2 0 0 0 ) ( 续)t a b l e1 1m a i nc o n s t i t u t e sa n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fv e n o mo f a m e l l i f e r a ( x i a os h ，1 9 9 1 ；l o us h ，2 0 0 1 ；l i a o x q e l a l ，2 0 0 0 ；s u n s e t a l ，1 9 9 0 ；h a r te t a l ，2 0 0 0 ) ( c o n t i n u e d )多肽类生物胺氨基酸溶血肽( m e l i t t i n l明肽( a p a m i n l镇静肽( s e c a p i n )肥大细胞脱粒肽( m c dp e p t i d e 、阿度拉平( a d o l a p i n )托肽平f r e r t i a p i n )普卡平( p r o c a m i n e )心脏肽( c a r d i o p e p )蛋白酶抑制剂伊m t e mi n h i b i t o r )小肽( 少于5 个氨基酸1组胺f f x i s t a m i n e )多巴胺( d o p a m i n e )去甲肾上腺素o 妯”p i n e p h r i n e )乙酰胆碱a ( c e t y l c h o l i n e )亮氨酸色氨酸脯氨酸谷氨酸精氨酸天冬氨酸组氨酸款氨酸未知4 0 5 00 51 0o 11 ，40 6 0 8o 31 3 - 1 5o 6 1 60 1 3 - 1 00 1 加70 3 0 30 0 4 80 0 4 30 3 3 5o 0 5 30 0 2 70 0 5 50 0 2 02 8 52 0 3 52 72 5 9 21 1 0 9 21 40 61 9 470 60 1 50 1 50 1 52 71 82 52 21 0 32 16l l6 5一一5塑坚查兰堡主兰堡笙兰表1 1 意大利蜜蜂蜂毒主要成分( 肖锡红，1 9 9 1 ；骆尚骅，2 0 0 1 ；缪晓青等，2 0 0 0 ；孙欣等；1 9 9 0 ；h a ne t 以，2 0 0 0 ) ( 续)t a b l e1 1m a i nc o n s t i t u t e sa n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fv e n o mo f a m e u i f e r a ( x i a os h ，1 9 9 1 ；l o us h 。2 0 0 1 ；l _ i a ox q e ta 1 ，2 0 0 0 ；s u ns e ta 1 ，1 9 9 0 ；h a r te ta l ，2 0 0 0 ) ( c o n t i n u e d )3 1 溶血肽( 详见第三章)蜂毒溶血肽，具有2 7 个氨基酸，属于蜂毒蛋白质多肽类，是意大利蜜蜂蜂毒的最主要成分，约占蜂毒干重的4 0 5 0 ；为编码蜂毒前溶血肽原蛋白的m r n a翻译后经后加工的终产物，分子量为2 8 5k d a ，强碱性，具两亲性和热稳定性，溶于水，在水中形成二种形式：在低浓度、低离子强度下形成单体的自由结构；在高浓度、高离子强度下则形成四聚体。它具有很强的生物学活性，可引起红细胞裂解，脂质体释放标记离子以及肥大细胞释放组胺尤其是对细胞膜具有很强的表面活性，其透过卵磷月旨膜和混合脂膜的速度为任何表面活性剂所不及，这一性质使其受到生物膜研究工作者的高度重视，现已成为一种模型肽，已被广泛用于膜作用机制、钙调蛋白作用机理等方面的研究( 周淑平等，1 9 8 6 ；s c h m i d t ，1 9 8 2 ；房柱等，1 9 8 8 ) 。1 9 8 3 年，v l a s a k 等利用意大利蜜蜂( a p i sm e l l i f e r a ) 蜂王毒腺总r n a 反转录成c d n a ，然后将合成的双链c d n a 克隆到p b r 3 2 2 载体中，构建c d n a 文库，用探针筛选出带有大于2 0 0 b p 插入片段的阳性克隆，然后再将它们亚克隆到p u c 8载体中，再经酶切鉴定从中筛选出2 个阳性克隆，对其中含有最大插入片段的p u m l 3 4 进行测序，结果显示该插入序列为蜂毒前溶血肽原蛋白的核苷酸序列，该e d n a 所编码的成熟肽蜂毒溶血肽原蛋白为4 9 个氨基酸残基。蜂毒溶血肽原蛋白实质上是蜂毒溶血肽的天然融合蛋白，它在蜜蜂毒腺细胞中合成后经二肽蛋白酶水解成蜂毒溶血肽。王关林等( 2 0 0 0 ) 从蜜蜂毒腺中提取总r n a ，通过r t - p c r 方法扩增得到了蜂毒溶血肽原的c d n a ，再进一步通过定点诱变，在溶血肽的序列前引入了羟胺裂解位点，构建了与b 一半乳糖苷酶部分序列相融合的溶血肽诱变表达载体，并在大浙江人学博i + 学位论史肠杆菌中表达了诱变蛋白，但表达量不高，并且建立诱变蛋白后纯化及活力问题至令未见报道。v n l a z a r e v 等( 2 0 0 1 ) 利用溶血肽跟e g f p 结合在细胞中进行了融合表达，发现溶血肽可以抑制细胞培养中m y c o p l a s m ah o m i n i s 支原体的生长，起到细胞培养中所加的抗生素d o x y c y c l i n e 的效果。3 2 磷脂酶a 21 9 5 4 年n e u m a n n 和h a b e r m a n n 首次鉴定出蜂毒中存在磷脂酶a 2 ，它属于胞外分泌，其分子量为1 4 5k d a ，单一多肽链，由1 2 8 个氨基酸残基组成，其中含8 个半胱氨酸，由4 个二硫键相连，c 末端为酪氨酸，n 未端为异亮氨酸( 见图1 2 ) 。2 0 0 2 年沈立荣等利用r t - p c r 技术得到磷酸脂酶a 2 的编码区序列。它是一种糖蛋白，碳水化合物共价结合于肽链的1 3 位天冬酰氨上。糖链组分为岩藻糖、半乳糖、甘露糖、葡糖胺，是发挥生物活性主要部分。蜂毒中的磷脂酶a 2 至少有2种同工类型：a 型和b 型，它们在糖链结构上存在明显差异。a 型糖基化程度较高，分子量约为2 8 6 2k d a 。b 型糖基化程度很低或没有，占蜂毒磷脂酶a 2 的极少部分，分子量约为1 7 5 4k d a ( p r e n n e r c ，1 9 9 2 ：余金良等，1 9 9 9 ) 。图1 2s h i p l i n i 等( 1 9 7 4 ) 报道的意大利蜜蜂磷脂酶a 2 氮基酸序列黑线为二硫键f i g 1 2a m i n oa c i ds e q u e n c e o f p h o s p h o l i p a s e a 2 f r o m a p i s m e l l i f e r a ( s h i p l i n ie t a l ，1 9 7 4 )t h ed a r kl i n ei n d i c a t et h ep o s i t i o no f d i s u l f i d eb r i d g e s瞵脂酶a 2 是一种水解天然酯类的催化酶，具有极强的溶血活性。酶分子带i ?电，等电点为1 0 5 ，在干燥冰冻下稳定，可在室温、黑暗卜- 保存数年而仍有活性浙江大学博士学位论文( o w e ne la 1 ，1 9 9 0 ) 。磷脂酶a 2 是蜂毒中主要的过敏原，其糖链上天冬酰胺连接n 一乙酰葡糖胺的一1 ，3 岩藻糖的糖基化作用是抗原的决定因子。磷脂酶a 2 裂解磷脂酰化合物中的第二酯键，产生溶血卵磷脂作用于红细胞膜会导致溶胞现象，使红血球破裂、红细胞溶解，产生溶血效应。生物膜溶解后，蜂毒的其它组分便可进入到膜内发生作用。不过，磷脂酶a 2 不直接作用于细胞壁脂类，而是靠蜂毒溶血肽的协同作用，或与底物复合后，依靠底物接近细胞使之溶解，产生溶血现象。在磷脂酶a 2 的催化反应中，c a 2 - 先与酶结合，使酶的空间构象发生改变，然后再与卵磷脂结合，释放出脂肪酸和溶血卵磷脂( 余金良等，1 9 9 9 ；李英华等，2 0 0 1 ) 。目前，纯化的磷脂酶a 2 已成为研究脂代谢、磷脂结构、生物膜、酶非均相催化反应机制、磷脂酶结构和代谢及脂蛋白关系的重要工具酶，为研究遗传信息、基因诊疗、蜂疗等带来极佳广阔的开发前景。3 3 透明质酸酶1 9 2 8 年d u r a n 发现透明质酸酶，称之为扩散因予。1 9 4 0 年c h a i n 和d u t h i e将其命名为透明质酸酶( h y a l u r o n i a a s e ) 。透明质酸酶为蜜蜂蜂毒中的主要过敏原之一，分子量为4 5k d a ，p i 为4 巧，占蜂毒干重的2 一3 ，其主要功能是水解透明质酸( h y a l u m n i ca c i d ) ，全蜂毒透明质酸酶的活性在2 0 u m g 左右( m u l l e rp ta 1 ，1 9 9 0 ；h a b e r m a n n ，1 9 7 2 ) ，催化透明质酸和硫酸软骨素( c h o n d r o t i ns u l f a t e ) 及动物结缔组织粘多糖聚合物长链中n 乙酰葡萄糖胺( g i c n a c ) 与d 葡糖酸酸( g l c a ) 间b 一1 ，4 糖苷键水解，产生4 糖产物g i c a g i c n a c - g i c a - g l c n a c 的一种透明质酸氨基己糖苷酶( h y a l u r o n o g l u c o s a m i n i d a s e ) ( h a u s l e y , 2 0 0 0 ；沈立荣，2 0 0 2 ) 。蜂毒混合物中的透明质酸酶相对来说不很稳定，但纯化后的透明质酸酶却是异常的稳定，它可在p h3 1 2 范围中重复地透析和冷冻，维持其活性的最高温度为5 6 c ( a l l a l o u f e t a l ，1 9 7 5 ) 。透明质酸酶的分子结构中无自由s h 基团，作为蜂毒中的扩散因子，对其它蜂毒成分发挥生物活性起协同作用，为蜂毒进入动物组织及蜂毒的扩散、渗透起到了打开通道的作用。随着静电取蜂毒技术的应用，1 9 8 4 年k e m e n y 等利用离子交换层析与兔抗蜂毒透明质酸酶、磷脂酶a 2 血清亲和层析相结合的方法，从意大利蜜蜂的粗蜂毒中分离得到透明质酸酶，p a g e 电泳在4 1 k d 处得一条带，免疫结果证明确实为分离纯化后的透明质酸酶。1 9 9 1 年j a c o b s o n 等测出意大利蜜蜂透明质酸酶氨基酸序8浙江大学博：e 学位论文列n 端的3 0 个氨基酸残基：1 9 9 3 年g m a c h l 和k r e i l 从c d n a 文库中筛选得到蜜蜂透明质酸酶基因的编码区序列，并在大肠杆菌上进行了表达，获得重组融合蛋白，活性测定表明，纯化后的表达产物活性相当于天然纯透明质酸酶的8 0 ：1 9 9 8年s o l d a t o v a 和m u u e 在杆状病毒昆虫细胞中对意大利蜜蜂透明质酸酶进行了表达，发现其表达产物活性高于在大肠杆菌的表达；2 0 0 0 年h a u s l e y 对意大利蜜蜂的透明质酸酶晶体结构进行了详细研究，2 0 0 1 年s h e nl i r o n g 等利用r t - p c r 技术得到中华蜜蜂透明质酸酶基因编码区。到目前为止透明质酸酶是糖苷酶5 6 家族中唯一已知分子结构的一种透明质酸酶。虽然蜜蜂蜇人后，透明质酸酶作为一种扩散因子，能导致受害者伤口部位的结缔组织分解，增加组织坏死程度，促进蜂毒其它成分的扩散，引起受害者过敏，甚至超敏性休克，但此特性又可使其在临床上作为一种药物扩散剂，促使皮下注射或局部积聚的渗出液、血液等的扩散和吸收，也有消除水肿和血肿的作用，因此，透明质酸酶也是一种生物学研究的工具酶，在心血管疾病、肿瘤等治疗方面很有研究应用前景。3 4 明肽1 9 6 5 年h a b e r m a n n 和r e i z 第一次分离得到蜂毒的第二个主要多肽一明肽( a p a m i n ) 。1 9 6 7 年h a u x 等确定其一级结构，由1 8 个氨基酸残基组成，两个二硫键位置为c y s l , - c y s l l 、c y s 3 - - c y s l 5 ( h a b c r m a n n ，1 9 7 2 ) 。1 9 7 3 年s p o e r r i 等证明其为一种神经毒肽，结构见图1 3 。1 9 7 5 年v a nr i e t s c h o t e n 等利用固相方法合成蜂毒明肽，合成的明肽无论在化学特征还是在毒理方面都跟天然蜂毒明肽一致。1 9 9 5 年g m a c h l 和k r e i l l 根据已知蜂毒明肽的氨基酸序列，利用原位杂交法从意大利蜜蜂毒腺e d n a 文库中筛选得到明肽基因的编码区序列，并发现其跟肥大细胞脱粒肽基因核苷酸序列的同源性竟达8 0 ；基因定位发现，明肽5 ，端核苷酸序列中含有肥大细胞脱粒肽的一段内含子，推测蜂毒中明肽与肥大细胞脱粒肽的表达可能同时受这两个基因的协同控制。蜂毒明肽作为一种神经毒素，它可透过血脑屏障，直接作用于中枢神经系统，可使小鼠对各种刺激敏感，缩短巴比妥引起的睡眠时间。大剂量蜂毒明肽可使动物死于呼吸肌麻痹；未死小鼠呈现举尾、后肢躁动等兴奋状态：它还能增加下丘脑的去甲肾上腺素、多巴胺和5 - 羟色胺含量等等，在临床上具有潜在的应用价值浙江大学博l 学位论文( 陈惠芳，1 9 9 1 ；黎遵列，2 0 0 0 ) 。a p a m m -silb 心c y 。缸”c ，一印”地巾”虹t 虹a 1 3 l ”c y 诅k a 研舡p 丫坩州”c a n ii，。sg c d - p e p tid eii1 5i = s c y 1 i e 伽j gs ih n o c - a i h 一私一g 扫一一一坤- r gs e e a p i ns ；一：；iii y r i l t - x l e - a 甜- v a l p r o p r a - a 罐- c y p r o p r o 一6 1 r - s e p l y s p h t - 工l e 一 ，n 一 r l 一yl r 一v r l 呻r 口一v 1图l 3 意大利蜜蜂明肽、肥大细胞脱粒肽和镇静肽的氨基酸序列( v l a s a kre ta 1 1 9 8 4 ；g m a c h lme t a l ，1 9 9 5 )f i g 】3a m i n oa c i ds e q u e n c eo fa p a m i n e ，m c dp e p f i d ea n ds e c a p i n ef r o m a p i sm e l l i f e r a ( v l a s a kre ta 1 ，1 9 8 4 ；g m a c h lme ta 1 ，1 9 9 5 )3 5 镇静肽镇静肽( s e c a p i n ) 约占整个蜂毒干重的l ，呈强碱性，由2 5 个氨基酸组成，分子量为2 7 5k d a ( h a b e r m a n n ，1 9 7 2 ) 。1 9 8 4 年v l a s a k 和k r e i l 利用3 2 p 标记的c d n a探针从意大利蜜蜂蜂王毒腺的c d n a 文库中筛选得到镇静肽前体的编码区序列，共7 7 个氨基酸残基，其中前3 2 个氨基酸残基为信号肽，一个二硫键位置为c y s 9 一c y s 2 0 ( 见图1 3 ) 。在镇静肽的毒性实验中，当静脉注射入4 0 m g k g 时，小鼠才出现轻微的镇静，直到注射入8 0 m g k g 时实验小鼠才出现1 5 分钟的安静，但紧接着伴随的是小鼠出现竖毛和低温症状( g a u l d i ejp t d l 1 9 7 6 ) 。浙江大学博士学位论义3 6 肥大细胞脱粒肽肥大细胞脱粒肽( m a s sc e l l 姆a n u l a t i n g p e p t i d e0 rm c dp e p t i d e ) ，呈碱性，由2 2 个氨基酸残基组成，占整个蜂毒干重的2 3 ，其分子中含2 个精氨酸、5个赖氨酸、5 个疏水性氨基酸，其羧基末端为天冬酰胺，两个二硫键位置为c y s 3 c y s l 5 、c y s 5 c y s l 9 ( 见图1 3 ) ( a n t h o n y , 1 9 7 7 ：s c h m i d t ，1 9 8 2 ；张景艳，1 9 9 5 ) 。1 9 9 5 年，g m a c h l 和k r e i l 克隆得到意大利蜜蜂肥大细胞脱粒肽基因的编码区序列，其分子量为2 5 9 3k d a 。纯化后的肥大细胞脱粒肽具有完整的a 螺旋结构，立体结构大致呈球形，分子表面分布有8 个正电荷，等电点为1 2 。其立体结构是其生物活性所必需的；当两个二硫键被打开或被羧甲基化时，肥大细胞脱粒肽的生物活性丧失；置换其分子中的两个精氨酸残基也能明显影响其活性：改变其分子中5个赖氨酸残基组成的e - 氨基基团，也能使其活性丧失( 张景艳，1 9 9 5 ) 。实验证明，肥大细胞脱粒肽能有效地对抗实验性佐剂诱导的大鼠关节炎f 类似于人的风湿性关节炎) 的发生，而且在病变发生后，还能明显地减少原发性和继发性的组织损伤饵a d j i p e 仃o ukle ta 1 ，1 9 8 8 ) ，肥大细胞脱粒肽的这种抗炎活性比同剂量的氢化可的松、新安替根、保泰松或水杨酸钠强2 - - 1 0 0 倍。目前，尚不清楚肥大细胞脱粒肽的抗炎机理，但实验都表明该肽是通过多种途径发挥其抗炎效应的，与此相反的是，小剂量的肥大细胞脱粒肽又能促进肥大细胞脱颗粒，释放组胺等活性物质，肥大细胞脱落颗粒是一种复杂的多步骤过程，其具体细节还未被完全阐明。一般认为，它起始于抗原与抗体的结合，引起肥大细胞膜上两个j g e分子发生桥联反应，导致i g e 受体发生聚合，然后触发一系列反应，即随着磷脂酶c 的活化，c a 2 + 发生移动，蛋白质磷酸化，再引起磷酸脂酶a 2 活化，最后形成溶血卵磷脂，促使肥大细胞内颗粒与细胞膜融合，释放出内容物( 张景艳，1 9 9 5 ) 。同样，肥大细胞脱粒肽引起组胺释放的准确机理也未搞清。但不管机理如何，就肥大细胞脱粒肽来说，其在高浓度时有较强的抗炎效应，而在低浓度时又具有致炎效果，这本身就足己引起人们的兴趣。目前最关键的是要加紧对其进行毒理学的详细研究，以便使其能早日应用于临床。浙江大学博t 学位论文4 蜂毒的药理作用4 1 对神经系统的作用蜂毒有箭毒样及神经节阻断剂样作用。浓度为1 ：1 0 0 0 的蜂毒可使膈肌神经肌肉先收缩后松驰，表明它能阻滞冲动由神经传至肌肉。此外，蜂毒也可使中枢神经系统突触内兴奋传导障碍，并具有中枢性n 胆碱受体阻滞剂的特点，可以预防动物因烟碱引起的活动增加和惊厥发作。蜂毒溶血肽除有神经节阻断作用外，尚能抑制小鼠自由活动和探求活动，改变大脑皮层和上行网状激活系统的传导功能。蜂毒明肽，可透过姐脑屏障，直接作用于中枢神经系统，可使小鼠对各种刺激敏感，缩短巴比妥引起的睡眼时间。大剂量蜂毒明肽可使动物死于呼吸肌麻痹，未死小鼠呈现举尾、后肢躁动等兴奋状态。阿度拉平则对脑前列腺素合成酶的抑制作用约为消炎痛的7 0 倍，但阿片受体拮抗剂纳洛酮能部分解除它对小鼠的镇痛作用( 张波，2 0 0 1 ；丁志贤，2 0 0 1 ) 。4 2 对心血管系统的作用蜂毒有明显的降压作用，无论是肾上腺再生性高血压大鼠、或盐性高血压或肾血管性高血压大鼠，均可产生明显的降压效果。黄申等报道大鼠静注蜂毒0 1 m g 1 0 0 9 体重，可引起大鼠颈动脉血压明显的急性降压作用。蜂毒中的磷脂酶a 2 对多种麻醉动物有迅速而明显的降压作用。苯海拉明和西米替丁等h i 、h 2 。受体拮抗剂可显著减弱磷脂酶a 2 的降压作用，荧光法测定显示磷酯脂a 2 能明显增加血浆组胺浓度、说明其降压作用主要是通过释放组胺、改变外周阻力而实现、提示合用组胺h 1 、h 2 受体阻断剂有可能预防临床上出现的血压下降现象( 丁志贤，2 0 0 ) 。蜂毒心肽或蜂毒明肽对离体心脏出现的心律失常均有恢复作用，其作用与异丙肾上腺素相似，但作用比它持久。最近研究表明蜂毒心肽和蜂毒明肽对出血性或内毒素性休克的动物有效，它能改善减弱了的心功能，并能预防全身性心血管衰竭。全蜂毒的降压作用主要与磷脂酶a 2 有关，但蜂毒的不同组分对心血管系统、血压的作用仍存在着差异( 黎遵列等，2 0 0 0 ) 。4 3 抗凝和溶血作用蜂毒在体内外均有抗凝血作用，它能显著延长钙凝时间、血浆凝血酶原对问浙江大学博t 2 学位论文和部分的凝血激酶时间。同时蜂毒具有极强的溶血作用，它能引起红细胞内胶体大量渗出，红细胞内渗压降低而导致破裂。溶血肽和磷胎酶a 2 是蜂毒中的溶血成分，前者比后者溶血作用更强( 陈惠芳，1 9 9 1 ) 。4 4 对消化系统的作用蜂毒可以对抗肾上腺素和去甲肾上腺素对离体肠管的抑制作用，能兴奋离体肠管及子宫平滑肌。蜂毒中的磷脂酶a 2 有直接兴奋平滑肌的作用。蜂毒制剂不能增加消化液的量，但可减少食物引起的胃液分泌，使活动减弱，可用于胃分泌功能亢进的息者( 卫应等，2 0 0 0 ) 。4 5 抗炎作用蜂毒对甲醛、角叉菜胶或巴豆油等所致大鼠关节肿胀都有明显抑制作用，刘若庸等报道蜂毒0 8 7 5 m g k g ( 相当于临床剂量5 倍1 对甲醛所致大鼠亚急性关节炎有明显抑制作用，连续用药1 4 天后组织学检查对心、肺、肝、肾、脾、脑及生殖腺等重要器官无不良影响。肥大细胞脱粒肽、蜂毒明肽、蜂毒肽和抗炎止痛肽是抗炎主要成分( 张波，2 0 0 1 ) 。4 6 抗肿瘤作用蜂毒对多种动植物( 如小麦、天竺葵等) 肿瘤有一定抑制作用。它能抑制小鼠肉瘤组织中三磷酸腺苷的合成。蜂毒肽和磷脂酶a 2 能使细胞微粒体膜溶解，从而抑制细胞呼吸，抑制肿瘤组织的生长( 陈惠芳，1 9 9 1 ) 。4 7 抗菌作用蜂毒对革兰氏阳性及阴性细菌都有抗菌作用，尤以链球菌和痢疾杆菌最为敏感。它还能增强磺胺药和青霉素的抗菌作用。蜂毒还有抗辐射作用，它可延长受x 线或f 线照射动物的生存率。蜂毒溶血肽可能是蜂毒中抗辐射的有效成分f 卫应等2 0 0 0 ) 。4 8 免疫抑制作用蜂毒所治疗的疾病中8 0 属于免疫性疾病。2 0 0 0 年王秋波等从免疫学角度，浙江大学博士学位论文探讨了蜂针蜇刺前对机体的免疫功能影响及蜂针疗法对免疫系统的调节作用。发现蜂疗后机体血浆及诱导单个核细胞b m c ) 产生的m - 2 含量明显增高，血浆几4含量明显降低，诱生p b m c 产生的i l 4 无明显变化，同时，血浆中的i g g 、i g a 、i g m 、c 3 的量在蜂疗前后无明显变化，因而蜂毒对机体免疫系统有直接作用，蜂毒通过增强t h i ( 辅助性t 细胞) 细胞功能，对机体细胞免疫功能起正向调节作用。5 蜂疗的起源蜂毒的利用和研究有着很长的历史。远在古埃及时代，人们就已注意到蜂蜇有治病的功效。一千七百年前，古罗医学家g a l e n 就记述了蜂毒可作止痛等多种用途。1 8 8 8 年维也纳医生f t e r t s c h在维也纳医学周刊上发表了一篇论文，进述了他用蜂蜇治愈了1 7 3 个风湿病人的事饲。1 9 1 2 年奥地利医生1 lt e r t s e h 也发表了用蜂毒治疗风湿热的注文，在6 6 6 例病人中有5 4 4 人痊愈，9 9 人有效。视。近十年来，随着分子生物学的发展，从此蜂蜇疗法在西方普遍受到人们的重推动了蜂毒组份结构与功能的研究，为蜂毒在医学和生物学上的应用开辟了广阔的前景。目前美国、前苏联、英国、德国、俄罗斯、新西兰、保加利亚、罗马尼亚等国家在蜂毒的应用和研究方面处于世界领先地位，并且由美国蜂疗协会设立的蜂疗网站( h t t p ：w w w h o n e y b e e t h e r a p y e o m ) ，还专门向全球介绍蜂疗技术、蜂疗产品，普及蜂疗知识( 余林生，1 9 9 5 ) 。在我国蜂毒治疗风湿病，始于徐铉( 9 1 6 - 9 9 1 ) 稽神录。利用黄蜂的尾针作药灸治疗疮疡，始于方以智( 1 6 1 1 1 6 7 1 ) 物理小识卷五。1 9 1 3 年，直隶实业杂志( 第2 0 期) 刊登“蜂毒医病”文章，是我国近代蜂毒治病的先声。1 9 3 0 年养蜂月报( 1 ( 4 ) ：3 5 - 3 6 ) 刊登“蜂毒医病沈君具呈社局医院考验”文章，是我国现代蜂毒临床试验的嚆矢。1 9 4 1 年，陕西蜂业( 1 ( 6 ) ：1 4 2 ) 刊登“蜂蜇能治愈皮肤病”。1 9 4 8 年，宋伯台在中国养蜂杂志2 7 ( 6 ) ) 上发表“我试用蜂蜇医治关节炎的报告”。1 9 5 7 年，房柱在中国养蜂( ( 1 2 ) ：1 3 1 5 ) j c 发表“蜂毒疗法概述”。1 9 5 8年高等教育出版社池版了山西医学院第二附属医院编：蜂毒疗法的应用和经验介绍一书。此后，这种具有中国医学传统的蜂针疗法逐渐传播到世界各国。1 9 5 9年，山西医学院第二附属医院和北京协和医院制成蜂毒罗卡因针剂。1 9 6 0 年6 月，在北京第四制药厂召开“王浆、蜂毒学术交流会”，生产蜂毒注射液。1 9 8 0 年，浙江大学博士学位论文王本祥在药学通报( 1 5 ( 5 ) ) 上发表“蜂毒的药理及临床应用”。1 9 8 8 年陈伟编著出版了蜂刺疗法一书。1 9 8 1 年，我国第一个蜂疗研究室成立，不久改为连云港蜂疗医院。1 9 8 5 1 9 9 0 年，中国养蜂学会先后四次召开蜂疗专业学术讨论会。1 9 8 6 - 1 9 9 1 年，蜂疗专业委员会举办蜂针和蜂疗培训班8 期。1 9 9 1 年1 1 月，在济南召开国际蜂疗保健和蜂针疗法学术讨论会。1 9 9 2 年1 2 月，在沈阳召开中华预防医学会养生保健学分会蜂疗保健学组成立大会。至目前，全国已有2 2 个省、市、自治区先后成立了蜂疗医院、研究所和诊所，开展锋针疗法和蜂疗保健的应用和实验研究( 王华夫，1 9 9 6 ；肖廷1 刍, 2 0 0 1 ) 。6 蜂毒的制剂1 8 9 7 年捷克斯洛伐克拉格大学兰格教授发表了有关蜂毒的化学和药理学研究报告。1 9 1 5 年他又报道了临床应用蜂毒生理盐水溶液治疗小儿风湿病获效，自此，各种蜂毒制剂先后在许多国家出现，包括德国的a p i e o s a n 、a p i s a r t h r o n 和f o r a p i