（农业昆虫与害虫防治专业论文）基于coⅠcoⅡ的蝇科分子系统学研究.pdf

基于c o i & c o i i 的蝇科分子系统学研究 专业：农业昆虫与害虫防治 硕士生：蒙建华 指导老师：贾凤龙 摘要 在有瓣蝇类中，蝇科占有重要地位。我们选取了线粒体基因细胞色素c 氧 化酶亚基i ( c o i ) 、i i ( c o l l ) 作为分子标记，通过克隆、测序分析蝇科中2 8 个 种的c o l 、c o i l 基因。这些蝇类主要采集于珠江三角洲地区，隶属家蝇亚科 ( m u s c i n a e ) 、螫蝇亚科( s t o m o x y i n a e ) 、点蝇亚科( a z e l i i n a e ) 、邻家蝇亚科 ( r e i n w a r d t i i n a e ) 、芒蝇亚科( a t h e r i g o n i a e ) 、圆蝇亚科( m y d a e i n a e ) 、秽蝇亚 科( c o e n o s i i n a e ) 。以丽蝇科中的大头金蝇( c h r y s o m y i am e g a c e p h a l a ) 、丝光绿 蝇( l u c i l i as e r i c a t a ) 作为外群，并采用目前常用的邻接法( n e i g h b o r - j o i n i n gn j ) 、 最大简约法( m a x i m u mp a r s i m o n ym p ) 、最大似然法( m a x i m u ml i k e l i h o o dm l ) 三种方法构建系统发生树，探讨蝇科中各分类阶元之间的系统关系。 三种方法构建的系统发生树，结果大多支持范滋德的传统亚科分类系统，但 单个c o i l 基因并不太适合用于分析亚科之间的系统关系。c o l 和c o i i 联合数据 得到最好结果，其中用m l 法对联合数据构建的系统发生树最为理想。各亚科之 间的系统关系为( ( ( ( ( 家蝇亚科、螫蝇亚科) 、点蝇亚科) 、邻家蝇亚科) 、芒蝇 亚科) 、( 圆蝇亚科、秽蝇亚科) ) 。 无论是单个基因还是两个基因联合分析，东方溜蝇( l i s p eo r i e n t a l & ) 总是 与圆蝇亚科的种类聚类在一起，证实这个类群之间亲缘关系最近，但是却不支持 将这个类群分为秽蝇亚科、圆蝇亚科两个亚科。 传统分类上，裸芒综蝇( s y n t h e s i o m y i an u d i s e t a ) 本该与腐蝇属( m u s c i n a ) 种类聚类在邻家蝇亚科中，m l 法建的系统树结果强烈支持这一点。但是单独使 用c o i 基因，甚至是联合数据( m p 法) 构建系统发生树时，裸芒综蝇总是与点 蝇豫科中的黑蝇属( o p h y r a ) 种类聚类。根据进化历史看，推测这是环境压力所 造成。笔者认为裸芒综蝇依| 露与腐蝇属种类妇类在邻家蝇亚辩更为合理。 所有结果均显示，家蝇属( m u s c a ) 种类都能聚类在一起，支持家蝇属在进 化上楚一个荦系。其中市蜷( m u s c a s o r b e n s ) 和孕幼家蝇( m u s c a 1 a r v i p a r a ) 互为姊妹群，逐畜家蝇( m u s c a c o n d u c e n s ) 和亚洲家蝇( m u s c a a s i a t i c a ) 互为 姊妹群。 关键词：分子系统学、蝇科、c o i 、c o i i i l m o l e c u l a rp h y l o g e n yo ft h ef a m i l ym u s c i d a eb a s e do n a n a l y s i so f m i t o c h o n d r i a lg e n e sc o ia n dc o i i m a j o r ：a g r i c u l t u r a li n s e c t & p e s tc o n t r o l n a m e ：m e n gj i a n h u a s u p e r v i s o r ：d r j i af e n g l o n g a b s t r a c t s p e c i e so fm u s c i d a eh a v et h ei m p o r t a n tp o s i t i o ni nc a l y p t r a t a e i np r e s e n t r e s e a r c h ，t w om i t o c h o n d r i a lg e n e s ，t h ec y t o c h r o m eo x i d a s es u b u n i ti ( c 0 1 ) a n d s u b u n i ti i ( c o i i ) w e r ec h o s e nt os e q u e n c ea n da n a l y z ef o rr e c o n s t r u c t i o no ft h e f a m i l ym u s c i d a e a t o t a lo f2 8s p e c i e so fm u s c i d a e ，w h i c hw e r ec o l l e c t e di np e a r l r i v e rd e l t a ，r e p r e s e n t i n g9g e n e r a ，7s u b f a m i l i e si n c l u d i n gm u s c i n a e ，s t o m o x y i n a e ， a z e l i i n a e ，r e i n w a r d t i i n a e ，a t h e r i g o n i a e ，m y d a e i n a e ，c o e n o s i i n a e ，w e r e s t u d i e d c h r y s o m y i am e g a c e p h a l aa n dl u c i l i as e r i c a t aw e r ec h o s e na so u t g r o u p s t os t u d yt h e p h y l o g e n yo fm u s c i d a e t h r e ep o p u l a rm e t h o d s ，n e i g h b o rj o i n i n g ( n j ) ，m a x i m u m p a r s i m o n y ( m p ) ，m a x i m u ml i k e l i h o o d ( m l ) ，w e r ec h o s e n t h er e s u l t sw e r em o s t l yc o n g r u e n tw i t hm o r p h o l o g i c a lr e s e a r c h ，h o w e v e ri t s u g g e s t e dt h a ts i n g l ec o i ig e n ei sn o tag o o dc h o i c et os t u d yt h er e l a t i o n s h i pa m o n g s u b f a m i l y c o m b i n e dd a t ab e t w e e nc o ia n dc o i ic o u l dg i v eu st h eb e s tr e s u l t ，i n w h i c ht h et o p o l o g yo ft r e eb ym lm e t h o dw a ss t r o n g l ys u p p o r t e d t h ei n f e r r e d r e l a t i o n s h i p i s ( ( ( ( ( m u s c i n a e ，s t o m o x y i n a e ) , a z e l i i n a e ) ，r e i n w a r d t i i n a e ) ， a t h e r i g o n i a e ) ，( m y d a e i n a e ，c o e n o s i i n a e ) ) as i m i l a rr e s u l tw a sg o t t e nw i t hd i f f e r e n tm e t h o d s ，w h i c hi st h a tl i s p eo r i e n t a l i s 1 i i a l w a y sc l u s t e r e dw i t hm y o s p i l al a u r aa n dm y o s p i l aa r g e n t a t a t h e yh a v es oc l o s e d r e l a t i o n s h i pt h a tc o u l d n tb ed i s t i n g u i s h e db e t w e e ns u b f a m i l i e sc o e n o s i i n a ea n d m y d a e i n a ei nt h i sp a p e r a c c o r d i n gt ot h et r a d i t i o n a lt a x o n o m yo fm u s c i d a e ，s y n t h e s i o m y i an u d i s e t a b e l o n g st os p e c i e so fs u b f a m i l yr e i n w a r d t i i n a e i ts h o u l dh a v ec l o s e dr e l a t i o n s h i p w i t hg e n e r am u s c i n ai nt h i sp a p e r ，w h i c hw a ss t r o n g l ys u p p o r t e db yr e s u r so fm l m e t h o d h o w e v e r ，i tc l u s t e r e dw i t hs p e c i e so fg e n u so p h y r a ，s u b f a m i l ya z e l i i n a e w h e nr e c o n s t r u c t e dp h y l o g e n y r e l a t i o n s h i pw i t hs i n g l ec o lg e n e ，e v e nc o m b i n e dd a t a ( m pm e t h o d ) i t i sr a t h e r p o s s i b l et h a te n v i r o n m e n t a lp r e s s m a k e st h e m h o m o g e n e o u sc o n s i d e r i n gt h eh i s t o r yo fe v o l u t i o n t h ea u t h o rt h i n k si tw o u l db e m o r er e a s o n a b l et oc l u s t e rs y n u d i s e t ai n t os u b f a m i l yr e i n w a r d t i i n a e i np r e s e n ts t u d y , a l ls p e c i e so fg e n u sm u s e aa l w a y sc l u s t e r e dt o g e t h e rv e r yw e l l i ts u g g e s t e dt h a tg e n e r am u s c ab em o n o p h y l y , m u s c as o r b e n sa n dm u s c al a r v i p a r a w e r es i s t e rg r o u p s ，m u s c ac o n d l u c e n sa n dm u s c aa s i a t i c aw e r es i s t e rg r o u p s k e y w o r d s ：m o l e c u l a rp h y l o g e n y , m u s c i d a e ，c o i ，c o i i i v 刖吾 l i n n a e u s ( 1 7 5 8 ) 在“自然系统”第十版中最早记述蝇科m u s e i d a e 种有效名称。 在该著作中，他将双翅目分为l o 属，主要依据是口器和触角的形态。在他所建 的m u s c a 属中，实际上包括了其它的有瓣蝇类c a l y p t r a t a e ，甚至包括了一些无瓣 蝇类a e a l y p t r a t a e 。1 8 0 2 年，l a t r e i l l e 以m u s c a 为模式建立了m u s e i d a e 科，包括 了当时已知的大部分有瓣蝇类。虽然l a t r e i l l e ( 1 8 1 0 ) 指定v o m i t o r i a 为m u s c a 属的 模式种，但长期以来，大多数蝇类分类学家一直沿用m u s c ad o m e s t i c al i n n a e u s 为该属的模式种，这一沿用被国际动物命名委员会所承认，因此，以m u s c a 为 模式建立的科成为了蝇科m u s c i d a e 。由于l a t r e i l l e 所指定的m u s c av i m i t o r i a 属丽 蝇科c a l l i p h o r i d a e ，该种被指定为c a l l i p h o r a 属的模式种。之后，m e i g e n , w e i d e m a n n , r o b i n e a u - d e s v o i d y , b r a u e r 及b e r g e n s t a m m 等蝇类分类学家描述了大 量的蝇科昆虫，为蝇科的分类学发展做出了重大贡献。 早期描述的蝇科昆虫中实际包括大量的丽蝇科( c a l l i p h o r i d a e ) 和麻蝇科 ( s a r c o p h a g i d a e ) 等有瓣蝇类。b r a u e r & b e r g e n s t a m m ( 1 8 8 9 ，1 8 9 1 ，1 8 9 3 ，1 8 9 4 ) 在一系 列专著中对蝇类进行了划分，将麻蝇科从m u s e i d a e 中分出，并在m u s c i d a e 中成 立了亚群c a u i p h o r a ( 相当于亚科) ，这是首次将c a l l i p h o r a 作为一个科级分类单 元。g i r s c h n e r ( 1 8 9 3 ) 对蝇形蝇类的分类系统中，第一次将c a l l i p h o r i d a e 从m u s e i d a e 中独立出来。h e n n i g ( 1 9 5 5 ) 将有瓣蝇类分为3 个科和一个总科，即粪蝇科 c o r d u l u r i d a e ( s c a t o p h a g i d a e ) 、蝇科m u s c i d a e 、花蝇科a n t h o m y i i d a e 和丽蝇总科 c a l l i p h o r o i d e a 。自此，蝇科m u s e i d a e ( 相当于现在的蝇总科m u s e o i d e a ) 家族基 本得到了纯化。 m u s e i d a e 的亚科级分类单元的划分长期以来都不统一。f o n s e c a ( 1 9 6 8 ) 将蝇科 划分为m u s c i n a e ，s t o m o x y i n a e ，p h a o n i i n a e , c o e n o s i i n a e ，l i s p i n a e 和f a n n i i n a e 范滋 德( 1 9 9 2 ) 根据前人的研究结合自己的研究结果，认为蝇科应分为f a n n i i n a e ， a c h a n t h i p t e r i n a e ，r e i n w a r d t i i n a e ，a z e l i i n a e ，m u s c i n a e ，s t o m o x y i n a e ，a n t h e r i g o n i n a e ， m y d a e i n a e c o e n o s i i n a e , p h a o n i i n a e 和e g i n i i n a e 。近些年来，有的学者主张将 f a n n i i n a e 作为一个单独的科。薛万琦等( 1 9 9 2 ) 根据形态学研究认为e g i n i i n a e 也应该为独立科。 目前分子系统学研究是昆虫学领域的一个热点( 寇静，2 0 0 & 徐庆刚，2 0 0 1 ； 王备新，2 0 0 2 ：c l a r y ，1 9 8 5 ；l e s s i n g e r ，2 0 0 0 ) 。宏观系统学对高级单元的进化研 究相对深入，而对科级以下的的单元研究仍不系统。本论文所选材料为蝇类中重 要的卫生昆虫，特别是蝇科的家蝇属m u s c a 、螫蝇属s t o m o x y s 、腐蝇属m u s c i n a 、 芒蝇属a t h e r i g o n a 等，同时以大头金蝇( c h r y s o m y i am e g a c e p h a l a ) 、丝光绿蝇 ( l u c i l i as e r i c a t a ) 作为外群。这些蝇类中很多都是法医领域、卫生系统及国家 出入境检验检疫领域中经常遇到的。 对蝇类的分子系统学研究，国内外学者更多把目光集中于那些对经济影响很 大的实蝇科( t e p h r i t i d a e ) 种群( h a l l , 2 0 0 5 ；j a m n o n g l u k ，2 0 0 3 ) ，或者是在法医学有 重要作用的部分麻蝇、丽蝇科类群。在实蝇科内，就有b a c t r o c e r a 属( j a m n o n g l u k 2 0 0 3 ) 、蜡实蝇属c e r a t f l i s 等( b a r r & m c p h e r o n ，2 0 0 6 ) 不同属已被研究，更多的果 蝇地理种群也被研究。 尽管目自u 有关蝇类系统学研究报道不少，也涉及到实蝇科、丽蝇科、粪蝇科、 食蚜蝇科，狂蝇科等( b e m a s c o n ie ta 1 ，2 0 0 0 ；s t a h l se ta 1 ，2 0 0 0 ) ，但除对实蝇科研 究较为透彻外，其余仅涉及部分种类。蝇科中除家蝇属等部分种类已被研究外， 各阶元系统关系仍不明确( b e r n a s e o n ie ta 1 ，2 0 0 0 ) ，而本论文部分研究了蝇科内各 属、种之问的进化关系，从不同分类阶元研究该科的进化关系。 1 实验材料与方法 第一章材料与方法 1 1 材料 1 1 1 标本的采集与鉴定 所有实验材料除家蝇( m u s c ad o m e s t i c a ) 、大头金蝇( c h r y s o m y i a m e g a c e p h a l a ) 、丝光绿蝇( w f 妇s e r i c a t a ) 外，其余均为研究者于2 0 0 5 2 0 0 6 年 问采集，主要采自于珠江三角洲地区，标本均由中山大学昆虫研究所梁铬球教授 鉴定。具体情况如下表： 。 表卜1 蝇科研究材料信息 亚科名 属学名采集地点采集 鉴定 时间人人 家蝇亚科 家蝇属 市蝇 2 0 0 6 9广州 蒙建华粱铬球 从s o r b e n s m u s c i n a em u s c a w i e d e m a n n 18 3 0 札洲家蝇 2 0 0 6 9珠海 蒙建华架铬球 m a s i a t i c a 3 h i n o n a g ac tk a n o , 1 9 7 j 肥喙家蝇 2 0 0 6 9珠海蒙建华桀铬球 mc r a s m r o s t r i s s t e i n 1 9 0 3 逐岱家蝇 2 0 0 6 9珠海 蒙建华粱铬球 肛c o r t d u c c n j w a l k e r 1 8 6 0 黄腹家蚝 2 0 0 6 9舟山 蒙建华 粱铬球 mv e n l r o s a w i e d e m a n r t1 8 3 0 带纹家蝇 2 0 0 6 9珠海 蒙建华梁铬球 m c o n f i s c a t e s p e i s e r , 1 9 2 4 毛瓣家蝇 2 0 0 6 9珠海 蒙建华桨铬球 m i n f e r i o r s t e i n 1 9 0 3 孕幼家蝇 2 0 0 6 9台山蒙建华粱铬球 m l a r v i p a r a p o r t s c h i n s k y , 1 9 1 0 突额家蝇 2 0 0 6 9弁山 蒙建华粱铬球 村：c d ，n 蟛叻吣埘 n o m s o n 1 8 6 9 台湾家蝇 2 0 0 6 9 珠海蒙建华粱铬球 mf o r m o s a n a m a l l o c h 1 9 2 5 芒蝇亚科 芒蝇属 东刀芒蝇 2 0 0 6 3新会 蒙建华 粱钸球 o r i e n t a l 括 a t h e r i g o n i n a e a t h e r i g o n a s e h i n e r , 1 8 6 8 黑j 弪芒蝇 2 0 0 6 3新会蒙建华粱镣球 n i g r i t i b i e l l a f a ne t “i l l 9 8 2 圆蝇亚科妙蝇属 净妙蝇 2 0 0 6 9二j ，i 山 埘委彳粱铬球 v l a u r a m y d a e i n a e m y o s p i l a s t e i n 1 9 l8 1 银颓妙蝇 2 0 0 6 9新会 蒙建华裟锵球 j l 扎a r g e n t a t a ( w a l k e r i8 5 7 ) 邻家蝇亚科 腐蝇属 耽腐蝇 2 0 0 6 4广州蒙硅华 粱铬球 m t ts t a b u l a n s l 艮m 唧m i i 嘲 m u s c i n a r f a l l e n 1 8 2 3 ) 肖腐蝇 2 0 0 6 3深圳贾风尼 柒铬球 & i n 黜h i i l l s ( f a l l e n 1 8 2 3 ) 综蝇属 裸芒综蝇 2 0 0 6 1 2广州 蒙建华粱铬球 s y n t h g s i o m y i a s v n u d i s e t a v a nd e rw u l v 1 8 8 3 ) 点蝇亚科 黑蝇属 蚶蚪黑蝇 2 0 0 6 3 深圳贸风尼粱铬球 0 s p i n i g e r a a z e l i i n a e o p h y r a s t e i n1 9 1 0 斑踱黑蝇 2 0 0 6 3 广州 蒙建华粱铬球 0 c h a l c o g a s t e r ( w i e d e m a n n t 8 2 4 ) 秽蝇亚科 溜蝇属 东力曲蝇 2 0 0 6 1 2广州蒙建华裟锵球 c o e n o s i i n a el i s p e lo r i e n l a l s w i e d e m a n n 1 8 3 0 翠蝇属 紫翠蝇 2 0 0 6 9三沾山谢委彳粱铬球 mg a v i s a 家蝇亚科 n e o m v i a 、i k e e l 8 5 9 黑斑带蝇 2 0 0 6 9珠渐蒙建华 粱铬球 m u s c i n a e m l a u r a i w i e d e m a n n + 1 8 3 0 ) 赫翠蝇 2 0 0 6 3深圳赞风佗 粱 矗球 ：l i m o r e n s i s 【r o b i n e a u - d e s v o i d y 1 8 3 0 绿额翠蝇 2 0 0 6 9珠海 蒙建华粱铬球 mc o e r u l e i 仔o r 3 ( m a e q u a n 1 8 5 1 1 螫蝇亚科 螫蝇属 溉螫蝇 2 0 0 6 4 高明蒙建华柴铬球 工e a l c i t r a n s s t o m o x y i n a e s t o m o x l l , s ( l i n n a e u s i7 5 8 ) 南整蝇 2 0 0 6 9珠海蒙建华 粱铬球 ss “i e n s r o n d a n i 1 8 7 3 印度螯蝇 2 0 0 6 9珠海 蒙建华梁铬球 si n d i e u s p i c a r d 1 9 0 8 表1 - 2 从n c b i 下载的序列 曼堂! ! ! ：三! ! 旦! ! 竖! ! ! ! ! 翌! ! ! i ! i 垒! 磐型曼呈! 学名属名c o l 登陆号c o i l 登陆号 4 1 1 2 仪器及试剂 主要仪器： e p p e n d o r f m i n i s p i n 离心机 m j p t c 2 0 0 p c r 仪 d y y - 6 b 型电泳仪 美国p o l a r o i d 公司f o t o d y n e 凝胶成像系统等 主要试剂： 基因组提取试剂盒t a k a r au n i v e r s a lg e n o m i cd n ae x t r a c t i o nk i t v e r 3 0 ( 大连宝生物) 、胶回收纯化试剂盒b i o s p i ng e le x t r a c t i o nk i t ( 杭州 博日) 、p m d l 8 - tv e c t o r 载体( 大连宝生物) 、l b 液体培养基、l b 固体培 养基、氨苄青霉素等。 1 2 方法 1 2 1 实验方法 1 2 1 1 基因组d n a 的提取( 参考t a k a r au n i v e r s a lg e n o m i cd n ae x t r a c t i o nk i t v e r 3 0 说明书) 1 ) 取材用镊子解剖单个苍蝇，取胸部肌肉至1 5 m l e p p e n d o r f 管中。 2 ) 破碎用眼科剪将肌肉剪碎，加入液氮，用烧熔的枪头快速研磨，再 加入3 5 0 p ls o l u t i o na 和o 9 p l 的r n a s ea 1 后用枪头快速研磨成匀浆。 3 ) 裂解 加入3 5 0 p l 的s o l u t i o na 冲洗枪头上的匀浆，振荡混匀后，6 5 水浴3 小时，其问适当振荡。 4 ) 加入4 0 0 p l 的s o l u t i o nb ，振荡混匀。 5 ) 加入1l n l 的4 预冷的s o l u t i o nc ，充分混匀后，1 2 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n 6 ) 弃上层有机相，再加入l m l 的4 c 预冷的s o h t i o nc ，充分混匀后， 1 2 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n 7 ) 弃上层有机相，将水相( 无色下层) 转移至置于c o l l e c t i o nt u b e 上的 f i l t e rc u p 中，1 2 ，0 0 0 r p m 离心l m i n 8 ) 弃f i k e rc u p 在滤液中加入4 0 0 p 1 的d bb u f f e r , 混匀。 9 ) 将s p i nc o l u m n 置于c o l l e c t i o nt u b e 上，将混匀后溶液转移至s p i n c o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃滤液。 1 0 ) 将5 0 0 p 1 的r i n s ea j n a 至s p i nc o l u m n 中1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0s e c ，弃滤 液。 11 ) 将7 0 0 1 a l 的r i n s eb 加入至s p i nc o l u m n 中1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0s e c ，弃 滤液。 1 2 ) 重复步骤l l 。 1 3 ) 将s p i nc o l u m n 至于灭菌后的1 5 m le p p e n d o r f 管中，往s p i nc o l u m n 膜中央处加入5 0 2 0 0 h 1 的灭菌水或e l u t i o nb u f f e r , 室温静置5 m i n 1 4 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离心lm i n ，即得基因组d n a ，2 0 ( 2 保存。 1 2 1 2p c r 扩增 在0 2 m lp c re p p e n d o r f 管中加入如下各反应的物质。 4 0l a i p c r 反应体系：4l a lp c r b u f f e r ( 含m 9 2 + ) 3 2 1 a l d n t pm i x 2 “i p r i m e r1 ( 5 p m 扯1 ) 2l a lp r i m e r2 ( 5 0 m i _ a ) o 4 1 a lt a q 酶 2u l基因组模板 2 6 4 1 a l d d w 1 ) p c r 扩增c o l ：其中引物参考s i | i l o n ( 1 9 9 4 ) 和b e r n a s c o n i ( 2 0 0 0 ) 等人。 p r i m e r1t 、：j 一1 4 6 0 ： t a c a a t c 飞翅c g c c t a a a c t t c a g c c p r i m e r2t l 2 - n 3 0 1 4 ： t c c a t t g c a c t a a t c t g c c a t a 订a 编辑p c r 仪反应程序，程序如下： 预变性：9 4 0 c6 m i n 变性：9 4 0 c5 0 s 6 退火：4 5 0 c5 0 s = 二 延伸： 7 2 0 c2 m i n 循环国2 次 4 0 c 保温 2 ) p c r 扩增c o i l ：其中引物参考s i m o n ( 1 9 9 4 ) 和h a r t ( 2 0 0 5 ) ) 等 p r i m e r1 t l 2 j - 3 0 4 5 ： ga = 兀 a g t g c a a t g ga = r 1 1 ：a a g c p r i m e r2 t k n 一3 7 6 8 ： a c t t g c t t t c a g t c a r c t aa t g 编辑p c r 仪反应程序，程序如下 预变性： 9 4 0 c5 m i n 变性： 9 4 0 c4 0 s 退火：4 9 0 c4 0 s 延伸： 7 2 0 cl m i n 循环_ _ 3 2 次 4 0 c 保温 1 2 1 3 纯化p c r 产物( 参照b i o s p i ng e le x t r a c t i o nk i t 说明书) p c r 产物用杭州博日公司的b i o s p i ng e le x t r a c t i o nk i t 回收。在l x t a e 电泳 缓冲液中用1 的琼脂糖凝胶电泳，在暗室中切胶至1 5 m le p p e n d o r f 管中，具 体操作如下步骤。 1 1 按l ：3 的比例( 凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数) 加入e x t r a i o nb u f f e r 例如：l o o m s 凝胶应加入3 0 0 p 1e x t r a c t i o nb u f f e r 2 15 5 c 水浴，不时振荡直到凝胶融化。 3 1 按i ：i 比例( 凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数) 加入异丙醇，混匀。 4 ) 将混合液转移到s p i nc o l u m n 内，于6 , 0 0 0 r p m 离心l m i n , 弃接液管内液 体。 5 ) 向s p i nc o l u m n 内加5 0 0 p 1e x t r a c t i o nb u f f e r , 于1 2 ，0 0 0 r p m 离心4 5 s ，弃接 液管内液体。 6 ) 向s p i nc o l u m n 内加6 5 0 9 lw a s hb u f f e r , 于1 2 ，0 0 0 r p m 离心4 5 s ，弃接液管 内液体。 7 ) 重复6 步骤。 8 ) 再次1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 m i n ，然后将s p i nc o l u m n 转移至灭菌后的1 5 m l e p p e n d o r f 管中。 9 ) 向s p i nc o l u m n 内加5 0 肚le l u t i o nb u f f e r , 室温下静置5 m i n 1 0 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 r a i n , 即得回收产物。 1 2 i 4e c o i ld h 5 c t 感受态细胞的制备 1 ) 取一试管，加入2 m l 的l b 液体培养基，再加入5 p l 菌液，3 7 。c 振荡培 养过夜。 2 ) 将试管中菌液转接到2 0 m l 的l b 液体培养基中振荡培养约2 l l 使 o d 6 0 0 o 4 0 5 3 ) 取菌液1 0 m l 冰浴3 0 m i n 4 ) 1 0 0 0 0r p m 离心1 m i n , 弃上清。 5 ) 加入o 2 m l 冰冷的c a c h 悬浮菌体，冰浴1 5 r a i n 6 ) 1 0 0 0 0r m p 离心1 m i n ，弃上清，再用0 2 m l c a c l 2 悬浮，冰浴5 m i r b 即得 感受态细胞，4 c 短期内保存。 1 2 1 5 纯化后的p c r 产物与p m d l 8 一tv e c t o r 连接 在0 2 m l 的微量离心管中，将纯化后p c r 产物与t a l ( a r a 公司p m d l 8 t v e c t o r 载体连接，反应体系如下： 1 ) c o l ： 1 5 1 x lc o l 回收片段 o 5 1 a l p m d i8 - tv e c t o r 2l a l d d w 4 斗l l i g a t i o nm i x 1 6 反应2 h 2 ) c o i l ： 1 0 1 a l 0 5 u l c o i i 回收片段 p m d l 8 - tv e c t o r 2 5 u l 4n l 1 6 反应l b d d w l i g a t i o nm i x 1 2 1 6 转化 1 ) 取8p 1 连接产物加入制备好的1 0 0 p 1 感受态细胞中。 2 ) 冰浴3 0 m i n 3 ) 4 2 热激9 0 s ，再冰浴5 m i r l 4 ) 加入8 9 0 9 l 液体l b 培养基，封口3 7 活化培养l l l 5 ) 1 0 0 0 0r m p 离心i m i n , 吸去9 0 0 p 1 上清液。 6 ) 悬浮剩余的液体，然后将菌液涂在加有氨苄的固体l b 培养基平板上， 3 7 1 2 培养过夜。 1 2 1 7 菌落筛选 1 ) 向每个1 5 m le p p e n d o f f 管中各加8 0 0 1 _ 1 1 含有a m p + 的液体l b 培养基。 2 ) 用灭菌后的牙签挑取单个茵落，在对应标记的1 5 m le p p e n d o r f 管中搅拌 后，弃牙签。 3 ) 盖紧e p p e n d o f f 管盖后，封口，置3 t c 培养振荡培养约8 - 1 0 h 4 菌液p c r 检测 2 0g l p c r 反应体系：2 l lp c rb u f f e r ( 含m 9 2 + ) 1 6 u ld n t pm i x 1u lp r i m e r1 ( 5 p m n ) l p l p r i m e r2 ( 5 m p 1 ) 0 2 1 1 1t a q 酶 1 “l菌液 1 3 2 u ld d w 反应程序如前述p c r 扩增。 5 ) 琼脂糖凝胶电泳分析p c r 产物，将有目的片段所对应的那管菌液送至 l n v i t r o g e n 公司测序，测序引物为m 1 3 通用引物，测序仪为a b i3 7 3 0 9 p r j s m t m 自动测序仪。 1 2 2 数据处理 所测序列先用c o n t i g e x p r e s s 软件进行序列拼接，然后利用b i o e d i t 软件寻找 上下游引物，剪切多余序列。将各序列在n c b i 中进行b l a s t 搜索( a l t s c h u le ta 1 ， 1 9 9 0 ；z h a n g & m a d d e n , 1 9 9 7 ) ，以检验同源序列，同时在m e o a 3 1 软件中采用无 脊椎动物线粒体遗传密码，将编码序列翻译为蛋白质，看序列中间是否出现终止 密码子，以此来验证数据的可靠性( k u m a re la 1 ，2 0 0 4 ) 。采用c l u s t a l x l 8 3 软件对 序列进行比对，各参数均为默认值，以n e x u s 格式输出。通过观察比对结果，利 用b i o e d i t 软件对序列适当人工校正。 为了检验各基因的碱基替代饱和性，分别对整个密码子，第一位密码子，第 二位密码子，第三位密码子进行了未校正的p 距离计算和g a m m a 校正的k 2 p 距 离计算，并以此在e x c e l 表格中做散点图分析。系统发育分析均采用 p a u p * 4 0 b 1 0 ( s w o f f o r d ，2 0 0 2 ) 和m e g a 3 1 ( k u m a re ta 1 ，2 0 0 4 ) 软件进行。 1 2 2 1 邻接法n 分析系统发育 利用p _ a u p + 4 0 b 1 0 ( s w o f f o r d ，2 0 0 2 ) 软件，采用g a m m a 校正的k 2 p 距离模型， 启发式( h e u r i s t i c ) 搜索策略，t b r ( t r e eb i s e c t i o nr e e o n n e c t i o n ) 枝长交换，1 0 0 次随 机序列加入，其余采用默认值，以邻接法( n j ) 重建系统发育关系。采用 b o o t s t r a p ( 1 0 0 0 次重复) 方法评估所建系统关系的可靠性。 1 2 2 2 最大简约法( m p ) 分析系统发育 采用启发式( h e u r i s t i c ) 搜索策略，t b r ( t r e eb i s e c t i o nr e e o n n e c t i o n ) 枝长交换， 1 0 0 次随机序列加入，其余采用默认值，以最大简约法( m p ) 重建系统发育关系。 采用b o o t s t r a p ( 1 0 0 0 次重复) 方法评估所建系统关系的可靠性。 l ，2 2 3 最大似然法( m l ) 分析系统发育 首先利用m o d e l t e s t 3 7 对不同的核苷酸替代模型进行评价，选择最佳模型及 运行参数，然后利用p a u p * 4 0 b 1 0 ( s w o f f o r d ，2 0 0 2 ) 软件重建系统发育关系，采用 b o o t s t r a p ( 1 0 0 次重复) 方法评估所建系统关系的可靠性。 1 0 第二章基于线粒体c o i 基因对蝇科分子系统学的 研究 1 材料与方法( 如上章所述) 2 结果 2 1p c r 扩增蝇科线粒体c o i 基因 利用所提取蝇类基因组作为模板扩增c o i 基因，均能获得大约1 6 0 0 b p 的扩 增片段。如图2 - 1 所示。 图2 - ip c r 扩增蝇科c o l 基因 m a r k e r ：d l 2 0 0 0 ；2 ：黑胫兰蝇，3 ：斑踱黑蝇，4 ：蓝翠蝇，5 ；东 方芒蝇6 ：阴性对照，7 ：阳性对照。 f i g2 - 1a m p l i f i e dc o ! g e n eo f m m c i d a eb yp c r m a r k e r ：d l 2 0 0 0 ；l a n e2 ：a t h e r i g o n i n a en i g r i t i b i e l l a ；3 ：o p h y r a c h a l c o g a s t e r , 4 ：n e o m y i at i m o r e n s i s ；5 ：a t h e n h g o n i n a eo r