（农药学专业论文）尼可霉素提取工艺hplc定量分析方法及剂型初步研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文申特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 ：表或撰写逆的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 l 而使用过白材料，指导教师贮此进行7 审定。与我一同工作的同志力车研究所做鳃任 i 何贡献均己在论文中儆了明确的说明，并表示了谢意。 l 研究蝴：产鳓 帆，妒年广月埘日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文瞬规定”，静学生必须按 照学校要求提交学位论文纳印刷本扣电子版本；学校有权保存提交论文的印剥蹶和电 予舨，并提供雪录检索和阋览服务，可以采用影印。缩印或扫描等袋削手段保存汇 编学位沦文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播学位论 支的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位黼槲：泌名导黼：体谚 签名日期：伽7 年f 月留日 签名丑朔：。7 年，月；占日 淀：请将事表髓缓浆玎盘学组论文的扉页番i 习录之阔 尼可霉素提取工艺，h p l c 定量分析方法及剂型初步研究 中文摘要 尼可霉素是一种生物农药，属于核苷肽类抗生素，通过抑制真菌细胞壁骨架成 分之一几丁质的合成产生药效。尼可霉素目前通过微生物发酵手段生产，发酵工艺 中对发酵液的提取有离子交换法和减压浓缩法，本文通过对后一种工艺中浓缩温度 及发酵液p h 两种因素的优化，使得率由3 2 - - 3 5 提高到5 7 - 6 1 。尼可霉素的定 量检测一般采用微生物检定法，效率和精密度均较低，而如果采用液相色谱法检测， 尼可霉素的两种组分x ，z 在常规反相色谱条件下又不易分离。本文采用离子对反 相色谱，通过对流动相中有机系水系的比例，缓冲液p h ，缓冲液浓度，离子对试剂 的浓度等色谱条件的摸索，确定色谱条件为：流动相比例水甲醇= 9 4 6 ，缓冲液 p h 3 6 ，缓冲液浓度1 0m m ，离子对试剂浓度1 0m m ，流速l m l m i n 。在此条件下实 现了x 。z 组分色谱峰基线分离，建立了尼可霉素的离子对反相色谱的检测方法，加 快了分析时间并提高检测精密度。回归方程为：y = 1 6 6 2 7 x + 2 9 1 8 7 4 。r = o 9 9 4 5 ，其 中y 为峰面积，x 为浓度( ug m l ) 。该法在3 1 2 - - 2 5 0 u g m i 浓度范围内线性关系 良好。精密度r s d = i 9 7 ，平均回收率为9 7 ，样品的日间稳定性良好， r s d = 0 5 4 2 。本文还对尼可霉素的三种剂型的稳定性进行了研究，发现水剂的稳 定性差，无法商品化。研究了可溶性粉剂和可溶性粒剂的载体及助剂对其稳定性的 影响，筛选出合适的载体及助剂。可溶性粉和的初步配方为( ) ：原药3 0 。载体j 3 0 ，表面活性剂s 28 4 9 ，g s l8 4 9 ，光保护剂m1 0 ，抗氧化剂( 抗坏血酸) 0 0 2 ，干燥 剂5 ，防腐剂( n a c i ) 8 ，可溶性粒剂的初步配方为( ) ：原药4 0 ，载体c 23 0 ，表面 活性剂g s 33 0 。 关键词：尼可霉素提取工艺定量检测离子对反相色谱剂型 注：本课题由武汉天惠生物工程公司资助 华中农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t n i k k o m y c i n ，a sak i n do fb i o p e s t i c i d eb e l o n gt op e p t i d y ln u c l e o c i d ea n t i b i o t i c s ，i sa c o m p e t i t i v e i n h i b i t o ro fc h i t i n s y n t h e t a s en i k k o m y c i n i s p r o d u c t e db y b i o s y n t h e s i s p r o d u c tf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yi n c l u d e si o n - e x c h a n g em e t h o da n dl o w p r e s s u r ev a p o r i z em e t h o d i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，w eo p t i m i z e dt h es e c o n dt e c h n o l o g ya n d i n c r e a s e dt h ee x t r a c t i o ny i e l df r o m3 2 3 5 t o5 7 6 1 t h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n m e t h o d so fn i k k o m y c i nu s u a l l ye m p l o y e dm i c r o b i a la s s a y ( b i o a s s a y ) ，b u tt h ee f f i c i e n c y a n da c c u r a c yw a sl o w ，a n dt h et w o i n g r e d i e n t sn i k k o m y c i nx a n dzc a n tb es e p a r a t e db y c o n v e n t i o n a lr e v e r s e p h a s eh p l c w ed e v e l o p e da ni o n - p a i rh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h ym e t h o dw h i c hs h o r e n e dt h ea n a l y s i st i m ea n di n c r e a s e dt h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n w ei n v e s t i g a t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n p r o p o r t i o no ff l o wp h a s e ，p h o f b u f f e r ，c o n c e n t r a t i o no fb u f f e r ，c o n c e n t r a t i o no fi o n p a i ra g e n ta n da n dc a p a c i t yf a c t o r a n df i n a l l yr e a l i z e db a s e l i n es e p a r a t i o no fn i k k o m y c i nxa n dz t h er e g r e s s i o ne q u a t i o n w a s ：y = 1 6 6 2 7 x + 2 9 1 8 7 4 ， t h ec a l i b r a t i o nc u r v ew a sl i n e a r ( r = 0 9 9 4 5 ) w i t h i nt h er a n g eo f3 1 2 - - 2 5 0 u g m 1 t h e m e a nr e c o v e r yw a s9 7 ( n = 6 ) a n dt h ep r e c i s i o n ( r s d ) w a s1 9 7 ( n = 8 ) ，d a yt o d a yp r e c i s i o nw a so 5 4 2 w es t u d i e dt h es t a b i l i t yo ft h r e ef o r m u l a t i o n so fn i k k o m y e i n a n df o u n dt h a ts t a b i l i t yo fa q u e o u ss o l u t i o n ( a s ) w a sp o o ra n dc a l l tb e m e r c h a n d i s e d a n dw ei n v e s t i g a t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t a b i l i t ya n dk i n do fc a r r i e r s a n da d j u v a n t so fo t h e rt w of o r m u l a t i o n sw a t c r - s o l u a b l ep o w d e ra n dw a t e r - s o l u a b l e g r a n u l ea n dt h e n s c r e e n e dt h em o s tc o m p a t i b l ec a r r i e r sa n da d j u v a n t s t h er a w f o r m u l a t i o no fs p ( ) ：a c t i v ei n g r e d i e n t3 0 ，c a r r i e rj3 0 ，s u r f a c ea c t i v ea g e n ts 28 4 9 ，g s l 8 4 9 ，a n t i u va g e n tm1 0 ，a n t i o x i d a t i o na g e n to 0 2 ，d e s i c c a n t5 ，a n t i s e p t i c ( n a c l ) 8 t h e r a wf o r m u l a t i o no fs g ( ) ：a c t i v ei n g r e d i e n t4 0 ，c a r r i e rc 23 0 ，s u r f a c t a n tg s 33 0 k e y w o r d s ：n i k k o m y c i n ，e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y , q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n ，i o n p a i r r p h p l c ，f o r m u l a t i o n 2 尼可霉素提取工艺，h p l c 定量分析方法及剂型初步研究 1 前言 1 1 尼可霉素简介 1 1 1 尼可霉素 1 ，1 ，1 尼可霉素 尼可霉素( n i k k o m y c i n ) ，是一种核苷肽类抗生素，能有效抑制真菌细胞壁骨架 成分之一n 丁质的合成，有效抑制真菌、昆虫、螨虫的生长。尼可霉素发酵液中 含有由二十多种组分，其中尼可霉素z 和x 为主要的生物活性组分尼可霉素在自 然界中易降解，无残留，对哺乳动物、蜜蜂、植物等相对无毒，是一种理想的农用 抗生素。和多氧霉素( p o l y o x i n ) - - 样，具有选择毒性、抗真菌谱广、对人、动物和农 作物安全、残留低的优点。又名新多氧霉素( n e o p o l y o x i n ) 。和多氧霉素相比，缺点是 内吸性差，需使用较大剂量，优点是发酵周期短，生产菌株效价高。 图1 。尼可霉素x f i g u r e1 n i k k o m y e i nx 尼可霉素的生物合成：目前尼可霉素由微生物发酵生产。产生菌为圈卷产色链 霉菌( s t r e p t o m y c e st e n d a et v e 9 0 1 ) 。发酵培养一般采用2 甘露醇，2 黄豆粉作 为主要的碳源和氮源。温度2 7 ，发酵周期7 8 小时。发酵产量与培养基中磷酸盐 浓度，p h 及加入的前体( 尿嘧啶) 密切相关 6 4 3 。 尼可霉素的化学合成：日本研究人员利用r e f o r m a t s k y 反应，迸行立体选择性 反应，合成了尼可霉素的两个手性中心，在1 9 9 5 年和1 9 9 8 年分别用化学酶合成和 脂肪酶催化的方法完成了尼可霉素b 的全合成。但是工作着眼于模式研究，反应 条件非常苛刻，应用于工业生产有很大困难。f 6 7 】【6 8 】 理化性质：x 组分在p h 6 0 ，2 0 下与巴比妥酸生成红色化合物，与z 组分不 反应。与茚三酮，商锰酸钾呈阳性反应，与f c a 3 呈黄色反应。 7 0 2 8 1 作为真菌细胞壁几丁质合成酶的抑制剂，尼可霉素对防治动植物及人类真菌感 染性疾病有广泛的应用前景。在农用上，尼可霉素用于植物昆虫及某些真菌病害的 防治具有极大的前景。文献报道，0 0 0 5 的尼可霉素使用3 4 次抑制苹果红蜘蛛 的抑制率可达9 9 ，对巢菜修尾蚜的田间防治效果为l o o p p m 幼虫死亡率达9 2 2 7 3 华中农业大学硕士学位论文 。对植物真菌的抑制作用强，如对灰葡萄孢霉的e c 为1 1 5 u g m l ，交链孢霉为 0 5 1 0u g m l ，毛盘孢霉为0 1 5 0 4u g m l ，冻土毛霉为0 0 2 0 0 9u g m l ，稻瘟病梨形 孢霉为2 - 4 u g m lf 2 s 。尼可霉素与其它生物农药的复配性能良好。实验证明尼可霉 素与井冈霉素等复配具有明显的增效作用。对植物真菌病害，不仅可直接地在植株 上喷施，还可以通过种子处理起到良好预防效果。尼可霉素是低毒抗生素，在有效 使用范围内无药害。对大白鼠口服急性半致死剂量( l d s o ) 大于5 0 0 0 m g k g 体重。 在医用上，研究表明，利用n i k k o m y c i nz ，x 组分对哺乳动物的深部真菌感染如白 色念珠菌有较强的抑制作用，可用于治疗真菌感染性疾病 1 1 1 1 3 0 。 1 1 ，1 2 生物农药 生物农药是直接利用生物产生的活性物质或生物活体作为农药，以及人工合成的 与天然化合物结构相同的农药，它包括微生物农药 3 3 1 1 3 4 、植物源农药、转基因生 物农药和天敌生物农药等。生物农药具有以下优点：是对病虫害防治效果好，对 人畜安全无毒，不污染环境无残留；二是对病虫害特异性强，不杀伤害虫的天敌 和有益生物，能保护生态平衡：三是生产原料和有效成分属天然产物，它们回归自 然能保证可持续发展；四是可用现代生物技术手段对有益菌及其发酵工艺进行改造， 不断改进性能和提高品质；五是多种因素和成分发挥作用，害虫和病菌难以产生抗 药性。与化学农药相比唯一的缺点就是药效偏慢。目前我国化学农药的使用量已经 达到世界第一，但生物农药的使用并不广泛f 4 1 】。 绿色食品的发展成为大势所趋，而与之密切相关的绿色农药也取得了显著的进 展绿色农药已经形成了系列成熟的品种。包括植物源农药、微生物农药、新型作用 方式等有机合成农药以及他感化合物和信息素类农药：在绿色农药剂型方面也取得 了许多突破。形成了以水为基质的水乳剂、微胶囊剂等环境友好的绿色化新剂型浓药 助剂的绿色化方面，主要是微生物表面活性剂为最近发展起来的一类新型的绿色表 面活性剂，己开始在农药领域进行研究和应用【3 】【3 9 】【4 2 】。 1 1 2 国内外的研究现状 1 1 2 1 国外的研究现状 从美国专利局网站( h t t p ：帕n n 阢u s p t o o f g ) 上可以查询到关于n i k k o m y c i n 的所有专 利，可以了解到国外对n i k k o m y c i n 的研发历史。参与研发的公司或科研部门有：德 国t u b i n g e nu n i v e r s i t y ( 图宾根大学) & b a y e ra g ，c i b a g e i g yc o r p ( 汽巴嘉基公 司，瑞士) ，印度的m i l e s l a b ( 后成为一家美国公司，改名m i l e s i n c ) ，n o v a r t i s f i n a n c e c o r o u n i v e r s i t yr e s e a r c hc o r p ，m e r c k c o ，h c ，f u j i s a w ap h a r m a c e u t i c a lc o 应用从农 用转到医用，最新的专利是2 0 0 6 年发表，可见一直没有停止对其的研发。 4 星里苎鲞塑墼三苎：竺! 鉴室墨坌堑查鲨墨型型塑垄翌塞 表1 关于尼可霉素的国外专利情况统计 堡垒! ! ! 塑鲤鱼竺! 塑墅塑墅尘 专利号发表年份专利授权人 研发单位 国外曾有3 个公司提供过n i k k o m y c i nz 的标准样品：s h a m a np h a r m a c e u t i c a l ( 夏 曼制药公司) ，b a y e ra g ( 拜耳制药公司) ，c a l b i o c h e m ( 卡尔生物化学公司) 。为了避免 与多氧霉素的竞争，曾试图将尼可霉素开发成杀虫剂，但由于种种原因未能开发产 品。也因尼可霉素对人体深部真菌感染有很好的治疗作用，有几家公司试图将其开 发为抗真菌的药物 1 1 2 2 国内的研究现状 在基础研究方面，国内中科院北微所己对尼可霉素的生物合成途径进行了大量 研究【4 6 】 5 华中农业大学硕士学位论文 在生产方面，国内已有不少尼可霉素生产厂家，但由于生产菌株产素单位低、发 酵周期长，而造成成本偏高。目前国内已通过卫星搭载、高能等离子辐射等技术， 筛选出一株稳定的尼可霉素高产株，产素水平能达到1 0 0 0 0 u m l 以上，具有发酵周期 短、成本较低等优势。 国内的商品化生产由于发酵水平低的原因，只有华北制药厂生产过取名为华光霉 素的2 5 可湿性粉剂，由于效价低成本高，市场销售很不理想而中断。 本课题组已经进行过发酵工艺的研究工作，完成了实验室小试和工厂中试。本课 题在此基础上进行提取工艺的优化，液相的检测及制剂稳定性的研究工作 1 2 尼可霉素提取生产工艺 1 2 1 离子交换法 离子交换树脂早已广泛应用于一些医用抗生素的提取上，如链霉素，卡那霉素 等。农用抗生素与医用抗生素比较，对纯度的要求不高，更强调得率和成本，根据 这一特点，离子交换树脂提取法非常适用于农用抗生素的提取。 1 2 2 减压浓缩法 蒸发就是不挥发的溶质和挥发性的溶剂分离的过程，可以分为常压蒸发，减压蒸 发和加压蒸发。在减压的条件下，可以在较低的温度将发酵液中的水分蒸发出去， 实现浓缩。尼可霉素作为生物农药，具有其一般特点即对温度比较敏感。低温可保 证对于温度敏感的尼可霉素不致失活。 1 3 尼可霉素的定量分析 1 3 1 生物测定：管碟测定法 抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定实验菌的固体培养基内呈球面形扩 散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了实验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。根据 抗生素在一定浓度范围内，剂量对数与抑菌圈直径( 面积) 呈线性关系，比较标准品与 供试品两者对接种的实验菌产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 1 3 2h p l c i i p i c 与生物测定相比，优点在于精密度高，检测速度快【2 7 】。尼可霉素是极性 很强的离子型化合物，在反相柱上保留很弱，常规的反相色谱无法分析，必须用离 子对反相色谱。 6 尼可霉素提取工艺，h p l c 定量分析方法及剂型初步研究 1 3 2 1 离子对色谱( i o n p a irc h r o m a t o g r a p h y i p c ) 无机离子以及离解很强的有机离子通常可以采用离子交换色谱或离子排斥色谱 进行分离。有很多大分子或离解较弱的有机离子需要采用通常用于中性有机化合物 分离的反相( 或正相) 色谱。然而，直接采用正相或反相色谱又存在困难，因为大 多数可离解的有机化合物在正相色谱的硅胶固定相上吸附太强，致使被测物质保留 值太大、出现拖尾峰，有时甚至不能被洗脱。在反相色谱的非极性( 或弱极性) 固 定相中的保留又太小。在这种情况下，就可采用离子对色谱。离子对色谱也称离子 相互作用色谱，是在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即“离 子对试剂”，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱 柱上被保留。保留的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的 浓度。离子对色谱也可采用正相色谱的模式，即可以用硅胶柱，但不如反相色谱效 果好，多数情况下采用反相色谱模式，所以离子对色谱也常称反相离子对色谱。离 子对色谱主要用于能电离的或有离子性质的有机化合物或离子性和中性溶质的混合 物的分离【2 6 】【4 0 】【6 5 】1 6 6 儿7 1 】 1 3 2 2 离子对反相色谱方法的建立 离子对色谱中各种参数对保留值的影响有： 有机溶剂浓度的影响：有机溶剂浓度增大，k 减小【4 9 】； 缓冲液浓度：浓度增大，a 对管路为负面影响b 对r t 的影响( 无机盐浓度增 大，k 减小) c 缓冲能力的大小( 浓度增大，缓冲能力越大) 离子对试剂浓度：当离子对试剂与溶质电荷同号时，浓度增大，k 减小； 流动相p h ：在反相色谱中，随流动相p h 变化，溶质被解离的浓度越高，其保 留值越小。在反相离子对色谱中，恰好相反。比如氨基苯磺酸两性化合物为例，流 动相p h 4 5 时，k 随p h 变化不大，当p h 4 5 ，氨基以中性存在，当流动相p h 4 5 时，氨基质子化 成正电荷基团。在离子对色谱中，起保留作用的溶质离子主要是与离子对试剂电荷 反号的一部分溶质组分。p h 对保留值的影响主要通过改变溶质在流动相中与离子对 试剂电荷反号的溶质离子浓度来实现的。 在反相离子对色谱分析中，进样前对色谱柱的预平衡需要花费一定时间，且色 谱柱是否完全达到平衡会对后续分析有影响。 1 3 2 3 方法学试验 精密度试验，测试仪器的重复性和再现性。 回收率试验，回收率包括绝对回收率和相对回收率。绝对回收率考察的是经过 7 华中农业大学硕士学位论文 样品处理后能用于分析的药物的比例。因为不论是生物基质还是制剂辅料中的有效 成分，经过样品处理都有一定的损失。做为一个分析方法，绝对回收率一般要求大 于5 0 才行。它是在空白基质中定量加入有效成分，经处理后与标准品的比值。相 对回收率严格来说有两种。一种是回收试验法，一种是加样回收试验法。前者是在 空白基质中加入药品，标准曲线也是同此，这种测定用得较多，但有标准曲线重复 测定的嫌疑。第二种是在已知浓度样品中加入有效成分，来和标准曲线比，标准曲 线也是在基质中加有效成分。相对回收率主要考察准确度。准确度系指用该方法测 定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。有时也称真实度。一定的准确 度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如 含量钡9 定、杂质定量试验等。准确度应在规定的范围内建立，对于制剂一般以回收 率试验来进行验证。试验设计需考虑在规定范围内，制备3 个不同浓度的试样，各 测定3 次，即测定9 次，报告已知加入量的回收率( ) 或测定结果平均值与真实 值之差。 样品稳定性试验( 日问) ，测试样品的稳定性。 1 4 制剂的贮存稳定性 1 4 1 剂型 1 4 1 1 剂型概述 除了水溶性强的硫酸铜及挥发性大的溴甲烷类等农药可以直接施用外，绝大多 数农药品种必须经过加工成各种剂型方可使用。通过剂型加工，能够赋予农药以特 定的稳定形态，便于流通使用，以适应各种应用技术对农药分散体系的要求。另外 还可以优化生物活性、增加药剂的安全性、扩大药剂的使用方法及用途、控制原药 释放速度而延长药剂的持效期、减缓农作物病虫害对农药抗性的发生和发展。 农药制剂学是多门学科技术互相融合的产物。随着世界环保意识及社会经济可 持续发展的需要，对农药安全性规定的日益严格，进一步促进世界农药沿着安全、 高效、经济的方向发展。造成新农药筛选的成功率下降。促使新农药研发过程周期 更长、投资更大，因此，世界各国在加强农药新品种研发及现有产品技术改造的同 时，剂型研发的重要性已成为农药界和植保界的共识【9 】【5 0 】。 近年来，国际农药剂型研发趋势已朝着水性、粒状、缓释、省力化和精细化的 方向发展 8 1 1 2 9 1 1 5 1 1 , ( 1 ) 农药新剂型水性化指的是以水为基质( 不用或少用有机溶剂) 而制备的农药 剂型。传统的农药液剂，以乳油占绝大部分，而生产乳油又要使用大量有机溶剂， 这些有机溶剂又以易燃、易爆、对人畜有毒、污染环境的甲苯和二甲苯为主，在生 8 尼可霉索提取工艺，h p l c 定量分析方法及剂型初步研究 产、贮运和使用过程中都存在安全隐患。发达国家已禁止或部分禁止其在蔬菜和果 树上使用。以水为基质的制剂类型逐步取替以有机溶剂为基质的乳油，既可节约大 量的能源又可减轻对环境的污染，减少对生产者、操作者的健康危害、也具有贮运 安全、资源节约等优点。其研发相当迅速，现在已有一系列水基性新剂型，如水乳 剂( e w ) 等。然而，对于某些生物农药如尼可霉素来说，水基化却是不可行的，由于 水解造成的有效成分降解，使得水剂无法商品化。 ( 2 ) 农药剂型的粒状化。由于某些原药在水中不稳定及考虑到加工、包装贮运 和使用技术上的要求，若不能加工成水性剂型时，应该加工成乳油或其它不含水剂 型，由于乳油存在着安全性差以及对环境污染严重等因素逐渐被淘汰，加工制成在 水中易崩解和分散的粒状剂型，可以防止用水稀释时产生的粉尘飞扬问题，又具有 药剂不粘附容器、使用方便，容器用后易处理等优点。农药的粒状化剂型受到国内 外农药剂型开发人员的重视。目前所涉及到的主要剂型有水分散性粒剂( w d g ) 等。 对于生物农药，将其剂型由粉剂改为粒剂，可以减少制剂产品的表观面积，降低制 剂产品吸潮性，从而能更加有效地规避空气水分对其有效成分稳定性的影响。 ( 3 ) 农药剂型的缓释化。通常使用的农药剂型，如可湿性粉剂等，使用后有效 成分都暴露在自然空间中，对于毒性高的药剂极易引起中毒和对有益生物的杀灭， 此外由于光解、水解、生物降解或水的淋溶流失、空气挥发等原因，使农药药剂损 失率很高，药剂的田间持效期大大缩短。基于上述问题，农药市场上出现了控制释 放技术与缓释剂剂型。如微胶囊剂，利用物理化学方法将农药包裹起来实现了农药 低毒化，释放缓慢化。这种剂型具有施药次数少，持效期长的特点，大大减少农药 使用量。 ( 4 ) 农药剂型的省力化。如我国是水稻生产大国，稻田用药量很大，稻田施药 又是件辛苦的农活，迫切要求开发水面飘浮粒剂、撤滴剂、水面展膜剂、泡腾片剂 等省力化剂型。 ( 5 ) 农药新剂型的精细化。国际上已经开拓计算机技术在农药加工中的应用， 许多发达国家已将计算机技术用来协助建立经验方程、设计和筛选最佳配方，预测 产品性能及质量变化，用于农药剂型加工生产工艺参数优化控制和数据处理，缩短 新制剂开发周期，稳定和提高制剂产品质量，改善劳动条件，提高农药生产效率 2 2 1 2 3 4 3 5 9 】。 1 4 1 ，2 生物农药的剂型加工 如1 1 1 2 所述，生物农药是指用来防治农业病虫草鼠害和卫生害虫等有害生物 的生物活体及其代谢产生的生理活性物质，并可以制成商品上市流通的生物源制剂。 与化学农药相比，生物农药的剂型加工更加困难。由于生物农药对外界环境因素如 9 华中农业大学硕士学位论文 温度、湿度和光照等比较敏感，因而生物农药存在着制剂贮存稳定性差【4 7 】【4 】，田 间持效期短，作用速度慢等不足之处。解决这些问题的根本办法除了加强对生物农 药的基础性研究( 如加强生物农药作用机理的研究) 外，通过剂型加工以减少外界因 素对生物农药制剂产品的影响，延长生物农药制剂产品的贮存稳定期限，提高防治 效果已经成为生物农药技术发展的重点之一。我国在生物农药剂型加工技术方面离 发达国家还有相当大的差距。主要表现为剂型单一，缺乏高水平的剂型，制剂质量 不稳定( 贮存期短) ，助荆( 保护剂和增效剂等) 研究不够。因而生物农药的剂型加工质 量已成为新型生物农药能否开发成功的瓶颈f 5 】【6 】 7 1 f 1 8 】f 4 8 1 。 1 4 1 3 尼可霉素的剂型 目前尼可霉素剂型为可湿性粉剂和水剂，制剂贮存稳定性差，货架期短一直是 难题。尼可霉素还没有出现过可溶性粉剂和可溶性粒剂产品 6 0 6 2 6 9 1 。在尼可霉 素助剂使用上，也未见使用绿色表面活性n 1 3 的报道。 1 4 2 制剂贮存稳定性 1 4 2 1 贮存稳定性 贮存稳定性是指制剂在贮存一定时间后，其物理，化学性能变化的大小，变化 越小，贮存稳定性越好。贮存稳定性是制剂的一项重要性能指标，它直接影响到产 品的使用效果。包括固体制剂的流动性，分散性和悬浮性等物理方面的变化【1 9 】， 以及有效成分含量降低这样的化学方面的变化【5 3 】【4 5 】，原因包括原药与载体的不相 容性，温度，光照，湿度，氧化，微生物，p h 等因素引起的原药的分解等 5 4 1 例如高 温引起的有效含量降低 1 1 1 4 4 5 5 1 1 5 8 1 。 1 4 2 2 尼可霉素的不稳定性 尼可霉素在碱性条件下不稳定。高温下易于降解( 个人通讯，宋幼新) 。在2 0 。c ， p h 5 5 下8 d ，尼可霉素在水溶液中由1 0 0 降到8 0 6 3 。尼可霉素在光照下也不 稳定( 个人通讯，宋幼新) 。 1 4 3 提高活性成分的稳定性的几个途径 a 探明影响稳定性的因素，制剂的不稳定性由多种原因引起，有温度，光照， 湿度，氧化，制剂中原药的浓度，微生物的降解，p h 等如井冈霉素水剂逐渐失活，主要 由于微生物分解所致，确保产品质量稳定性在于造成不利于微生物生存的条件 3 1 1 。 对有机氮杀螨剂单甲脒水溶液的水解反应的研究表明，单甲脒水溶液的酸性越大， l o 尼可霉素提取工艺，h p l c 定量分析方法及剂型初步研究 水解速率越小【1 6 】。 b 筛选合适的载体，原药与载体的不相容性是引起有效含量降低的一个原因 c 改换对提高稳定性有助的剂型。例如，对于生物农药，将其剂型由粉剂改为 粒剂，可以减少制剂产品的表观面积，降低制剂产品吸潮性，从而能更加有效地规 避空气水分对其有效成分稳定性的影响【3 5 】。 1 4 3 1 载体 载体与农药的不相容性。当选择一载体来加工固体农药产品时，需要考虑的最重 要的性质之一，是农药和载体的相容性，当暴露在高温下，长时期储藏时，有一定 程度的内在不稳定性。也有许多农药有一定程度的水解，或有些受到催化分解或降 解的趋向 3 6 1 。 1 4 3 2 表面活性剂 中国农药用表面活性的研究始于2 0 世纪5 0 年代，2 0 世纪6 0 年代开始批量生产， 现在主要产品有：乳化剂有阴离子、非离子以及与非离子复配的表面活性剂。农乳 单体如十二烷基苯磺酸钙( 农乳5 0 0 号) 、壬基酚聚氧乙烯醚( 农乳1 0 0 号) 等。复配的 农药乳化剂如0 2 0 4 c 等，基本能满足乳油制剂要求。分散剂主要品种有木质素磺酸 盐类产品等，基本可以满足一般可湿性粉剂加工需求。渗透剂、增效剂主要品种有 氮酮、脂肪醇聚氧乙烯醚o r c ) 等1 1 2 。 表面活性剂主要起润湿、展布、粘着、渗透、移行、促进或改善配伍性作用，能 降低药液的表面张力，提高液滴在靶标表面的润湿、展布、覆盖和滞留，还可以溶 解表皮蜡质层，促进活性成分的渗入和有利吸收。用作助剂的表面活性剂主要有非 离子、阳离子和阴离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂通用性强，应用最多。 大多是基于聚氧乙烯( e 0 ) 的亲水基。阳离子表面活性剂通常使用在作物上易发生 药害，因此仅仅在少数几种除草剂中应用。阴离子表面活性剂有较好的润湿、乳化 和分散性，大多用作乳化剂、分散剂或相容剂，通常还与非离子表面活性剂一起使 用，以增强其效果。它是加工农药各种制剂( 如乳油、可溶性液剂、可湿性粉剂、 悬浮剂、水乳剂、微乳剂、悬乳剂、种衣剂、水分散粒剂和微胶囊剂等) 不可缺少 的加工助剂。 绿色表面活性剂( g r e e ns u r f a c t a n t ) 指由天然的或再生资源加工的，对人体刺激性小 的和易于生物降解的表面活性剂。为与绿色食品相适应，农药品种的发展，也应该绿色 农药( 包括绿色农药制剂和绿色农药助剂) 化，绿色农药的特点之一是：使用后在农 作物体内外、农产品以及在土壤、大气、水体中无残留，或即使有微量残留也可以在 短期内降解，生成无毒天然物质而完全融入大自然。绿色表面活性剂这类高效新型助 u 华中农业大学硕士学位论文 剂具有对水生生物毒性低、原料来源于生物源、容易生物降解、对作物无药害和与 环境相容性好等优点，可以选用的包括烷基多糖类( a p s ) 的烷基多苷( a p g ) 和n - 烷基毗咯烷酮类表面活性剂。这两类表面活性剂不像常用表面活性剂类依赖于聚氧 乙烯。它可以通过改变烷基亲油基链长来改变h l b 值，并可用增加链长来降低水 中溶解度。 1 5 课题研究的内容，意义 1 5 1 研究的主要内容 a 提取工艺优化：为降低发酵成本，提高收率，比较两种农用抗生素提取工艺的收 率，研究不同提取条件对收率的影响。 b 尼可霉素h p l c 测定方法的建立：标准曲线制作，线性范围确定，检测波长确 定。色谱柱和流动相的选择，缓冲液p h 值的确定，精密度和回收率试验等。 c 带齐u 稳定性试验：载体和助剂对制剂稳定性的影响。 1 5 2 课题研究的意义 为尼可霉素的商品化，用于农作物真菌病害防治奠定基础。 1 2 尼可霉素提取工艺，h p l c 定量分析方法及剂型初步研究 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 供试菌株 尼可霉素产生菌s t r e p t o m y c e st e n d a et v e 9 0 1 ( 武汉天惠生物工程公司提供) 生物测定指示菌m u c o r h i e m a l i s ( 武汉天惠生物工程公司提供) 2 1 2 培养基 2 1 2 1 发酵培养基( ) 生黄豆粉3 可溶淀粉3 硫酸镁0 1 酵母粉0 1 氯化钠0 3 碳酸钙0 2 硫酸亚 铁7 5 m l 1 消前p h7 0 2 1 2 2 微生物检定培养基( ) a p d a 培养基 马铃薯1 0 0 9 葡萄糖1 0 9 琼脂粉9 5 9蒸馏水1 0 0 0 m l 自然p h b 下层培养基 琼脂l o g 蒸馏水1 0 0 0 9 2 1 3 标准品 尼可霉素x ，z 组分标准品( 中国科学院微生物研究所宋幼新研究员惠赠) 2 1 4 材料，试齐4 过滤膜( o 4 5 u m ) ，广口玻璃瓶，研钵，标准筛，l o o m l 量筒，玻棒，离子 交换玻璃柱，c 1 8 反相柱( 大连e l i t e 色谱柱，2 0 0 m m 4 6 m m ，跏m ) ，0 0 l x 4 强阳性离子交换树脂( 南开大学化工厂) 。 2 5 尼可霉素可湿性粉剂及尼可霉素原药( 武汉天惠生物工程公司提供，有效 成分含量) 5 0 ) ，聚氧乙烯烷基醚( 平平加) ，十二烷基磺酸钠( s d s ) ，a p g ( 烷 基糖苷) ( 深圳长园嘉彩环境材料有限公司) ，n 烷基吡咯烷酮，m e g a ( 烷基葡萄 糖酰胺) ，萘磺酸甲醛缩合物( n n o ) ( 武汉盛达化工有限责任公司) ，可溶性淀粉， 庚烷磺酸钠( 天津科密欧化学试剂公司) ，乙酸铵，抗坏血酸，草酸，变色 硅胶，苯甲酸钠，n a c l ，木质素，绢云母粉，高岭土，白炭黑，膨润土，硅藻土， n a 2 s 0 4 ，蔗糖，乙酸、甲醇( 未注明者均为市售) 。 华中农业大学硕士学位论文 2 1 5 主要仪器 i - l h s 型水浴锅金坛市正基仪器公司； 旋转蒸发仪上海安亭仪器厂： 高效液相色谱仪b e c k m a ng o l d e n 5 0 ： 高效液相色谱仪w a t e r s7 1 7 4 ： a y 2 2 0 和b l - 2 2 0 型电子天平s h i m a d z u 公司； t d l - s - a 离心机上海安亭仪器厂； 3 0 3 - 6 型电热培养箱南通科学器材厂； 紫外灯金坛市正基仪器公司； 干燥箱上海安亭仪器厂； - i q l l 5 0 b 可控温摇床中科院武汉科学仪器厂： 全自动发酵罐容积4 0 l ，通风可调，参数在线监测。 2 2 实验方法 2 2 1 提取工艺方法 2 2 1 1 离子交换法处理发酵液 发酵液经静置沉淀或离心后取上清，采用南开产0 0 1 x 4 强阳性离子交换树脂处 理，上柱容量1 0 b v ( 柱床体积) ，上柱流速 2 b v h ，洗脱流速0 5 b v h 。根据处理 前后发酵液体积及效价求出离子交换法的收率( 按2 2 1 2 中公式计算) 。 2 2 1 2 减压浓缩法浓缩发酵液 在p h 4 0 ，室温2 5 的条件下，调节旋转蒸发仪水浴锅温度至不同温度，将发酵 液浓缩1 0 倍后，通过浓缩前后效价的比较以及浓缩时间的比较，得出不同温度下的 收率，确定最佳浓缩温度。 在室温2 5 的条件下，调节旋转蒸发仪水浴锅温度至最佳水浴温度，取4 个发 酵液样，每样5 0 0 m l ，分别将发酵液调节至不同p h ，并分别浓缩1 0 倍后，通过浓 缩前后效价的比较，得出不同温度下的收率，得到最佳发酵液p h 。 收率计算按照公式： 收率= ( 浓缩后效价浓缩后体积) ( 浓缩前效价x 浓缩前体积) 1 0 0 2 2 1 3 减压浓缩法浓缩发酵液的放大实验 按照2 2 1 2 中得到的最佳条件下，在4 0 l 罐上进行放大实验，得到放大实验的 收率。 1 4 尼可霉素提取工艺，h p l c 定量分析方法及剂型初步研究 2 2 2 定量检测方法 2 2 2 1 生物测定( 微生物检定) 采用双层平板管碟法，按照文献【3 7 】 5 6 】 5 7 所述方法进行。抗生素微生物效价测 定法操作中，上层培养基温度在加入指示菌时不能超过5 0 c ，培养基制备中马铃薯 发芽部分要除去，要防止指示菌老化【2 】【1 0 【1 4 】【1 5 1 7 】【2 4 】【2 5 】【5 2 】。在微生物检定 的抑菌圈大小与效价的换算中，借助e x c e l 软件可以方便地完成，较以前的坐标纸 描线法快速 2 1 1 。 2 2 ，2 2h p l c 分析方法的建立 a h p l c 进样 色谱柱使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的c 1 8 反相柱，离子对试 剂为庚烷磺酸钠，缓冲液为乙酸一乙酸胺体系，有机相为甲醇，流速l m l m i n ， 柱温为室温。用流动相溶解样品后，使用0 4 5 “m 的过滤膜过滤除去微粒杂 质，进样。 b 检测波长的选择 尼可霉素标样进样后查看目标峰光谱，x 组分在2 9 0 n m 处有最大吸收峰，因此选 择2 9 0 n m 为检测波长。 c 色谱条件的选择 配制不同比例流动相，不同p h 缓冲液，不同浓度缓冲液，不同浓度离子对试剂， 进样试验，以x ，z 组分两峰的分离度作为衡量标准( 当r = i 时，称为4a 分离，两 峰基本分离，r = i 5 时，称为6o 分离，r 1 5 称为完全分离1 ，得到最佳分析条件。 d 线性关系考察 配制浓度为2 5 0 , 1 2 5 ，6 2 5 ，3 1 2 ，1 5 6u l m l 的标样，用0 4 5i im 微孔滤膜过滤，按上 述色谱条件进行分析，求出回归方程。 e 精密度试验 取尼可霉素标样，连续进样8 次，求r s d ( 相对标准偏差) ，要求r s d 2 。 f 回收率试验 取己知含量的样品共6 份，分别精密加入已经定量的尼可霉素溶液进行回收率测 定，回收率= 测得量及原含量+ 加入量) 1 0 0 。 g 群品稳定性试验 取同一样品一天中不同时间测定其含量，比较不同时间尼可霉素含量的变化，计 算其相对标准偏差，确定样品的e l 问稳定性，要求r s d 、 2 。 华中农业大学硕士学位论文 2 2 3 制剂实验 2 2 3 1 热稳定性贮存实验 将样品灌充于一个5 0 m l 的广口玻璃瓶至离项部l c m ，用一个有内衬( 确保密封) 的塑料盖封瓶，拧紧瓶盖以保证封紧，将瓶置于5 4 ( 2 恒温箱中贮存1 4 d 后取出，冷 至室温供测定用4 4 。 2 2 3 2 紫外保护剂性能对比实验 将7 5 原药与u v 保护剂( 载体) 1 ：1 混合后置于紫外灯下照射2 4 h 后取出( u v 灯管功率密度8 0 w c m ，照射距离5 0 c m ) ，检测照射前后的效价。 2 2 3 3 助剂及载体筛选试验 将助剂或载体与尼可霉素原药混合后进行热贮试验。在可溶性粒剂试验中，以贮 存稳定性及崩解性( 全溶解时间) 等质量控制指标作为筛选依据。崩解性以全溶解 时间长短表示，测定方法按照2 2 3 5 进行。可溶性粒剂细度取能通过2 0 目筛( o 9 m m ) 且不能通过1 6 0 目筛( o 0 9 7 m m ) 的颗粒【6 l 】。 2 2 3 4 手工造粒 将载体与原药及助剂混匀后置于干燥箱中干燥，干燥完毕后取出研磨成粒，过筛。 2 2 3 5 崩解时间测定 向盛有9 0 m l 蒸馏水的l o o m l 量筒中于2 5 加入样品颗粒0