（农药学专业论文）原卟啉原氧化酶催化机理及其抑制动力学的研究.pdf

i n h i b i t i o nk i n e t i c so f p r o t o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e at h e s i s s u b m i t t e di np a r t i a lf u l f i l l m e n to f t h er e q u i r e m e n t f o rt h em s d e g r e ei np e s t i c i d es c i e n c e b y z h i f a n gw a n g p o s t g r a d u a t ep r o g r a m k e yl a b o r a t o r yo fp e s t i c i d ea n d c h e m i c a lb i o l o g y m i n i s t r yo fe d u c a t i o n ，c o l l e g eo fc h e m i s t r y c e n t r a lc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r ：g u a n g f uy a n g c o s u p e r v i s o r ：z h e nx i a c a d e m i ct i t l e ：p r o f e s s o r s i g n a t u r e a p p r o v e d m a y , 2 0 1 1 ，r 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：了乏芳日期：j 1 年土月卅日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅： 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：了乏芳 日期：刀年岁月7 日 导师签名： 乡 ( 秒 日期：知，f 年j 月f 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a m s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的规 定享受相关权益。回童途塞握窒卮澄后! 旦坐玺；旦= 生i 垂生筮查： 作者签名：了乏芳 日期：训1 年岁月7 1 日 、， 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 原卟啉原氧化酶( p r o t o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e ，p r o t o x p p o ，e c1 3 3 4 ) 是叶绿 素和亚铁血红素相同生物合成步骤中的最后一个酶，其广泛存在于动物、植物、真 菌和细菌中。在原卟啉原氧化酶的催化作用下，无色的原卟啉原被氧化，失掉 六个电子生成共轭的光敏性物质原卟啉。 研究表明原卟啉原氧化酶定位在叶绿体和线粒体中，对于叶绿素和亚铁血红素 的合成具有重要的作用，这就决定了它在生命体系中具有重要的意义。在人体中， 该酶的缺损会造成显性遗传疾病混合型卟啉症( v a r i e g a t e dp o r p h y r i a ，v p ) 的产 生，这种病又称杂色卟啉病，为一种常染色体显性遗传疾病。这种疾病患者的数量 和发病地域正在不断扩大，因此对该酶的研究具有重要的医学意义。在植物体内， 原卟啉原氧化酶是光依赖性除草剂的作用靶标，除草剂与底物竞争性抑制的结果会 导致绿色植物组织的干枯与白化，从而死亡。这在研发新型的抑制剂上引起了农药 学家的关注，因而对该酶的研究具有重要的农学意义，我们希望从酶水平利用分子 生物学手段，研究抑制剂与酶的作用机制，从而指导新型抑制剂的合成与研发。 基于原卟啉原氧化酶在医学和农学中的重要性，我们主要进行了以下四方面的 工作： 一、通过对多种蛋白晶体培养条件的摸索优化，对人体p p o 晶体进行培养，得 到了分辨率为1 9 a 的人体p p o 与其抑制剂三氟羧草醚( a f ) 的复合物晶体结构， 为理解人体混合型卟啉症的发病机制和p p o 催化机理的研究提供了重要的结构信 息。 二、在结构和模拟计算支持的前提下，识别了在人体p p o 活性空腔中对催化过 程有重要作用的氨基酸残基，采用d p ni 突变方法建立了基因突变体系，并对其活 性进行测定，验证了这些氨基酸残基的重要性。 三、对原卟啉原氧化酶的氧化机理进行了迸一步的研究，并且采用s t o p p e d f l o w 的方法测得了0 2 加速酶反应的速率常数，提出了p p o 新的催化氧化机制。 四、通过高通量筛选对p p o 类抑制剂的抑制动力学进行了研究，寻找出了活性 更高的化合物，在这些化合物结构的基础上，通过计算机模拟对不同官能团的影响 进行总结，对高效新型抑制剂的研发具有指导意义。 综上所述，本文从结构生物学的角度对人体原卟啉原氧化酶进行研究，所得到 的实验结果对抑制剂的分子设计和v p 卟啉症的研究具有指导作用。在此基础上结 合计算化学对原卟啉原氧化酶与底物、抑制剂、辅助因子之间的相互作用进行了研 i 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 究。本文通过对抑制剂合理的分子设计和高通量筛选，为设计高效专一、开发新型 抑制剂提供重要的理论指导和新思路。 关键词：原卟啉原氧化酶；定点突变；动力学常数；氧化机理；停流技术；抑 制剂 i i 嚣、 ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t p r o t o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e ( p p o ；e c1 3 3 4 ) c a t a l y s e s t h eo x y g e n - d e p e n d e n t a r o m a t i z a t i o no fp r o t o p o r p h y r i n o g e ni xt ot h e f u l l yc o n j u g a t e dm a c r o c y c l eo f p r o t o p o r p h y r i ni x ，w h i c hw i d e l ye x i s t si na n i m a l s ，p l a n t s ，f u n g ia n db a c t e r i a i ti st h e l a s tc o m m o ns t e po ft e t r a p y r r o l e b i o s y n t h e s i s f o r t h ef o r m a t i o no fh a e m sa n d c h l o r o p h y l l s p p ol o c a t e si nt h ec h l o r o p l a s t sa n dm i t o c h o n d r i a ，f o rt h es y n t h e s i so fc h l o r o p h y l l a n dh e m e ，p l a y sa l li m p o r t a n tr o l e ，w h i c hd e t e r m i n e st h eg r e a ts i g n i f i c a n c ei nt h el i f e s y s t e m i nh u m a n s ，t h ep p od e f e c t sc a nc a u s ea u t o s o m a ld o m i n a n td i s e a s ev a r i e g a t e d p o r p h y r i a p ) i nt h ea g r i c u l t u r a lf i e l d ，p p oi n h i b i t o r sh a v eb e e nu s e da sh e r b i c i d e sf o r m a n yy e a r s t h e ya p p e a rt ob ei d e a lh e r b i c i d e s ，b e c a u s et h e ya c tr a p i d l yw i t hl o w u s e r a t ea n dd on o th a r mm a m m a l su n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s ，a sw e l la st ob e e n v i r o n m e n t a lf r i e n d l ya n dl o wl e v e lo fr e s i s t a n c ea sc o m p e t i t i v ei n h i b i t o r s b u tb e c a u s e o fl o n gf o rf o r t yy e a r si nu s e ，n a t u r a lo e c u r r e n c eo fw e e dr e s i s t a n c et op p oi n h i b i t o r sh a s b e e nr e p o r t e ds i n c e2 0 0 4a n di th a s a p p a r e n t l yb e g u nt oe x p e n d s oi ti sn e c e s s a r yt of i n d a l t e r n a t i v ei n h i b i t o r s 、砘t 1 1m o r ep o t e n c y , e s p e c i a l l yt h a to fn o v e ls c a f f o l d st os o l v et h e a n t i r e s i s t a n c ep r o b l e ma n dl i m i t a t i o n so fc o m m e r c i a li n h i b i t o r s i nt h i s p a p e r , w eh o p e t oo b t a i naf u l l r a n g e o fi n f o r m a t i o na b o u t p r o t o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e ，a n dw em a i n l yc a r r i e do u tt h ew o r ki nt h ef o l l o w i n gf o u r a r e a s ： f i r s t l y , w ec r y s t a l l i z e d h u m a np r o t o p o r p h y r i n o g e n o x i d a s e ( h p p o ) 、丽t l lt h e i n h i b i t o ra c i f l u o r f e n ) t h r o u g hav a r i e t yo fp r o t e i n c r y s t a l s t o e x p l o r e t h e o p t i m i z a t i o n a lc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rh p p o ，w eg o tt h ec r y s t a ls t r u c t u r eo fh p p oi n c o m p l e x 、j i ，i lt h ec o f a c t o rf l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e ( f a d ) a n dt h ei n h i b i t o ra f a ta r e s o l u t i o no f1 9a 1 1 1 es t r u c t u r a la n db i o c h e m i c a la n a l y s e sr e v e a l e dt h em o l e c u l a r d e t a i l so ff a da n da fb i n d i n gt oh p p o s t r u c t u r a la n a l y s i sa n dg e lc h r o m a t o g r a p h y i n d i c a t e dt h a th p p oi sam o n o m e rr a t h e rt h a nah o m o d i m e ri nv i t r o s e c o n d l y , b e c a u s ee f f o r t st oc r y s t a l l i z et h es u b s t r a t eo rs u b s t r a t ea n a l o gw i t hh p p o f a i l e d , w ep e r f o r m e di ns i l i c od o c k i n go ft h es u b s t r a t e p r o t o p o r p h y r i n o g e ni xi n t ot h e c r y s t a ls t r u c t u r eo fh p p ot of i n dt h es i g n i f i c a n tr e s i d u e sc o n t r i b u t i n gt op p oa c t i v i t y , a n d v e r i f i e dt h ei m p o r t a n c eo ft h e s er e s i d u e s t h i r d l y , w es t u d i e dt h er o l eo fe l e c t r o na c c e p t o r0 2i nt h ee a t a l y t i c a lr e a c t i o n , a n d u s e da o p p e d f l o wm e t h o dt om e a s u r et h er a t ec o n s t a n to ft h ee n z y m er e a c t i o n w ea l s o p r o p o s e dn e wi n s i g h t sf o r t h em e c h a n i s m f o u r t h l y , w es t u d i e dt h e i n h i b i t o rk i n e t i c sb yh i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n gt od e s i g n i i i 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s t h en e wa n de f f i c i e n ti n h i b i t o rm o l e c u l e sr a t i o n a l l y i ns u m m a r y , t h i sp a p e rp r e s e n t e dt h ep e r s p e c t i v eo fs t r u c t u r a lb i o l o g yo fh p p o t h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ee n z y m ea n ds u b s t r a t e i n h i b i t o r e o f a c t o ri np r o t o p o r p h y r i n o g e n o x i d a s ew e r es t u d i e db ym u t a g e n e s i s ，k i n e t i c sa n dc o m p u t a t i o n a lm e t h o d s t h ei n h i b i t o r r e s i s t a n c ew a sa l s ob es t u d i e db yh i g h t h r o u g h p u ts c r e e n i n g a l lo ft h e s er e s u l t sw o u l d s h e dl i g h to nt h er e s e a r c ho fi n h i b i t o ro rr e g u l a t o rm o l e c u l a re x p l o i t a t i o na n dd e s i g n , a s w e l la st h ev a r i e g a t e dp o r p h y r i ar e s e a r c h 。 k e yw o r d s ：p r o t o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e ，s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，e n z y m e k i n e t i c s ，m e c h a n i s m ，s t o p p e d f l o w , i n h i b i t o r i v 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 a b s t r a c t 目录 i i 1第一章研究背景介绍 1 1 原卟啉原氧化酶概述1 1 1 1 原卟啉原氧化酶的作用及其在细胞中的定位1 1 1 2 原卟啉原氧化酶的亚基组成3 1 1 3 原卟啉原氧化酶的辅酶4 1 1 4 原卟啉原氧化酶的底物4 1 2 原卟啉原氧化酶的活性测定5 1 2 1 原卟啉原氧化酶催化的反应”5 1 2 2 原卟啉原氧化酶的活性测定原理6 1 2 3 底物原卟啉原的制备6 1 2 4 底物原卟啉原的定量7 1 2 5 原卟啉原氧化酶反应动力学8 1 2 6 原卟啉原氧化酶抑制动力学8 1 3 原卟啉原氧化酶的反应机理研究”9 1 4 原卟啉原氧化酶的晶体结构研究1 3 1 4 1 烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体结构1 3 1 4 2 粘球菌m y x o c o c c u sx a n t h u s 原卟啉原氧化酶的晶体结构”1 7 1 4 3 枯草芽孢杆菌b a c i l l u ss u b t i l i s 原卟啉原氧化酶的晶体结构”2 0 1 4 4 微小细菌e x i g u o b a c t e r i u ms p 2 5 5 1 5 原卟啉原氧化酶的晶体结构”2 2 1 4 5 人体原卟啉原氧化酶的晶体结构2 3 1 4 6 种属间原卟啉原氧化酶晶体结构的比较2 3 1 5 原卟啉原氧化酶的医学和农学研究2 7 1 5 1 原卟啉原氧化酶的医学研究2 7 1 5 - 2 原卟啉原氧化酶的农学研究”3 2 1 6 本文的研究目的和主要内容3 8 第二章人体原卟啉原氧化酶及其突变体的研究体系 2 1 人体原卟啉原氧化酶介绍4 0 2 1 1 人体原卟啉原氧化酶的基本性质”4 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 1 2 人体原卟啉原氧化酶的研究价值 2 2 人体原卟啉原氧化酶的表达和纯化” 2 2 1 实验仪器与材料 2 2 2 实验方法4 4 2 2 3 实验结果与小结4 8 2 3 人体原卟啉原氧化酶的活性测定研究4 9 2 3 1 实验仪器与试剂4 9 2 3 2 实验方法4 9 2 3 3 实验结果与小结5 0 2 4 人体原卟啉原氧化酶晶体培养5 2 2 4 1 实验仪器和材料5 2 2 4 2 实验方法5 2 2 4 3 实验结果和小结5 3 2 5 人体原卟啉原氧化酶及其突变酶的相关性质研究6 0 2 5 1 突变体系的建立6 0 2 5 2 实验结果与小结”6 4 第三章原卟啉原氧化酶氧化机理的研究 3 1 研究对象的选择7 0 3 20 2 在p p o 催化反应中的作用7 2 3 2 1 原卟啉原氧化酶催化机理的新认识7 2 3 2 2 利用荧光实时监测酶反应”7 3 3 2 3 利用s t o p p e d f l o w 测定酶反应的速率常数7 4 第四章原卟啉原氧化酶抑制动力学的研究7 8 4 1 原卟啉原氧化酶抑制剂简介7 8 4 2 原卟啉原氧化酶商品化除草剂抑制动力学研究8 l 4 2 1 实验目的8 l 4 2 2 实验方法”8 3 4 2 3 实验结果与讨论8 5 第五章全文总结 参考文献 附录 附录a 9 l 9 3 1 0 2 1 0 2人体原卟啉原氧化酶突变体测序结果比对图 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 附录b 附录c 附录d 氨基酸的结构和中英文名称及简写符号 个人简历 氨基酸密码子表 f a d 与三氟羧草醚的结构 在学期间发表的学术论文和研究成果 致谢 1 0 4 1 0 5 1 0 6 1 0 7 1 0 8 1 0 9 ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章研究背景介绍 1 1 原卟啉原氧化酶概述 1 1 1 原卟啉原氧化酶的作用及其在细胞中的定位 原卟啉原氧化酶( p r o t o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e ，p r o t o x p p o ) ( e c1 3 - 3 4 ) 在分子氧存在的条件下，催化氧化原卟啉原i x ( p r o t o p o r p h y r i n o g e ni x ) 生成原卟 啉i x ( p r o t o p o r p h y r i ni x ) ，其广泛的存在于动物、植物、细菌和真菌中。它是亚铁 血红素和叶绿素相同生物合成步骤中的最后一个共有酶【l 卅。图1 1 所示为原卟啉原 氧化酶在血红素生物合成过程中所处的位置以及到目前为止关于血红素生物合成 过程所有参与的酶的晶体结构【5 】。原卟啉原氧化酶在多数生物体内是一类膜蛋白， 基本位于细胞器的膜上。在动物与真菌中，它一般位于细胞的线粒体内；而植物体 中，存在两种同工酶，其中一种位于细胞的线粒体内，另一种位于叶绿体中【6 7 1 。 研究表明线粒体中的原卟啉原氧化酶位于线粒体内膜；而质体原卟啉原氧化酶位于 叶绿体中类囊体膜靠基质的一侧，还有- d , 部分原卟啉原氧化酶酶位于外被的内膜 中i s , 9 1 ；而在某些厌氧生物中，原卟啉原氧化酶则位于细胞质当中【。 a 黪麒 p 塑竖f 5 垒竺兰2 - b o o h ( e c 2 3 1 3 7 ) g s aa 棚o r n u t a s 9 f 箜些2 ( e c5 4 3 8 l p o r p h o b i l i n o g o n ( p b g ) g l u t a m a t e - i - s e c r a a l d e h y 糖 m 伽h 艺 o 铋。泓。乇 专 删 妒懒 一m一 咖 细 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s c h p r e - u r o p o r p h y d n o g e n t 1 由蛔x 弦惜狮y i n e u r o l p o r p h y r i n o g e ni i i ( u r o g e n ) 瑚 2 黔辫 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s o x y g e n 螂d e n ! c o p r 0 6 e no x d 箍e c c p o ) c e c1 3 ，3 3 p r | o t o p o r 曲y r i ni x ( p r o t o l 回 m 图1 1 血红素的生物合成过程( 紫色框中为原卟啉原氧化酶在此合成过程中的位置) 1 1 2 原卟啉原氧化酶的亚基组成 不同来源的原卟啉原氧化酶亚基组成是不相同的。粘球菌属m y x o c o c c u s x a n t h u s 1 l 】、枯草芽孢杆菌b a c i l l u ss u b t i l i s 1 2 1 的原卟啉原氧化酶晶体结构表明其均以 单体的形式存在，小鼠【1 3 1 ，菠菜【1 4 1 ，莱茵衣藻1 5 1 同样是以单体形式存在的；烟草原 卟啉原氧化酶晶体结构表明其以二聚体形式存在的；厌氧菌d e s u l f o v i b r i og i g a s 原 卟啉原氧化酶由三个亚基组成，亚基的大小分别为1 2 、1 8 5 、5 7 k d a 1 0 1 ，并且这三 个亚基是通过二硫键结合。 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 3 原卟啉原氧化酶的辅酶 已有研究表明，原卟啉原氧化酶属于黄素蛋白家族中的一员，以f a d 为辅酶 ( f a d - c o n t a i n i n gp r o t e i n ) ，并与其以非共价键的形式结合。通过研究表面大多数黄 素蛋白氨基酸序列在n 末端存在一段特征的氨基酸序列，其中含有一段高度保守的 g x g x x g 序列，x 代表任意氨基酸残基，而且这段序列能形成一个p q p a d p 结合 的结构，其中的甘氨酸残基与f a d 的磷酰基相互作用8 ，1 6 l ，而通过对原卟啉原氧化 酶的研究表明，在其n 末端同样存在着这样一段二核苷酸结合序列( d i n u c l e o t i d e b i n d i n gm o t i f ) 1 1 7 1 ( 如图1 2 ) 。 曩s p h _ k n d h _ d b m 翼e - p m a s d o h _ o b l s t r e p t o n y e e 一p h y t 皇h 一翻b 一 冀y x o c o e c u p h y t 匹o h _ d b n r e a p _ p h y t d o h d b 曩 稿u # o - p o r y h y t d h o h m n y x o c o c c u - 一拜n d h d b m a r a b i d o p - ib _ p h r 乞d e h _ d ) = n z a p h y t d o h d b m c - p ic 吐皿_ p h y t d b _ d b m s o y b e - 丑_ p h y t d a h d b - 媾 r c i 讧m _ p h y t t h o h = s y n q e h o c o 口e u - 一，b y t d h 一曲露 k c 一葛 0 b _ d b t 耳u 耳曩荔一m o b d b m h 让再茸曩一辩- o o b 置 r s c m 8 0 ad a m b o v l 霸_ m a o 一d i n s 置t & n _ p p o _ o b = x o - 一p p o d b = y 一p ，o _ d b m 二 c 乙 g l 瓣至 羲 蠹 量 曼 ：一 ：， ：二 l 栽i p 0 p c ? t y f 已s k 二r d v e豇1 1 , 鬈：； i 蜓j r 5 z 徽 燃毫 ：激鎏 噩嚣爱 馨； 了8 c h t r d 麓s c 辑p ：m ： 垂 直 s 妥爰； 特土c o 乞土 矗一聋p o l _ d b m d i n o c o c c 缸一p p 0 d b 薯 p t o p i o 丑i b - e t r i u 盘_ p p o _ d b m x y x o p p o _ d b n 叠- c l 工1 u - 一p p o d b 曩 冀i - o 口；三毫n _ p p 0 2 _ d b r k y c o b a c t 鱼r i u 蕾一p p o _ d b m纛 二；基：；等蠢量器：? r ；：；岂要氢羞蔓耋 戆e 曩誊蒌；y 0 8母0 e e e f ：受； t f 篮7 ，口 c v 羹 l 口l 啪：w d l e 王互 图1 2 黄素蛋白家族的氨基酸序列比对刚1 7 】， 红色方框内为不同种属原卟啉原氧化酶的序列比对图 1 1 4 原卟啉原氧化酶的底物 3 艇 e 已报道大部分不同种属来源的原卟啉原氧化酶都显示出了对原卟啉原的专 一选择性，但是部分原卟啉原氧化酶还显示出了对底物类似物如血卟啉原 ( h e m a t o p o r p h y r i n o g e ni x ) 、粪卟啉原( c o p r o t o p o r p h y r i n o g e ni ) 和尿卟啉原 ( u r o p o r p h y r i n o g e ni ) 等的催化活性。( 如表1 1 所示) 4 鞴 鼎器 ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 表1 1 不同来源原卟啉原氧化酶的底物选择性 p r o t o p o r p h ym e s o p o r p h y r i n h e m a t o p o r p hc o p r o t o p o r p h yu r o p o r p h y r i n o r i n o g e ni xo g e n i xy f i n o g e ni xf i n o g e n i g e ni 人 ( v 1 v p r o t o g e n ) 小鼠 k m = 5 6 9 m k m - - 9 0 1 t m k m - - 9 0 p m 大鼠线粒 ( v = 10 v p r o t 体 o g e n ) 、，、， 大麦 1 ， ( v = v p r o t o g e n( v i1 v p r o t( v p r o d u c tp u r i f i 既lu s e d 私ar m v , a v r i m e r c a n dp c r 【l - 册e 螯甲而盯) l 3 _ 厂，卜4 ，? o v e r l a pe x t e n s i o np c rt o e p c r ) ：t w op 僳 ( p d r 撒- n1 - 2a t r i3 一kc o m b i 脯d , m e l t e d a 槛髓l c d e x t e n d e da 矗df i z n lp c r ( 弘t m 凹s1 4 ，哆乒岩= = = = 鬻 1 4l a y e t t e 解a p c e ) ：蜘d 磷n d 州雠嚆 p c rp r o d t l ：t s 犯- d 陀l l j 越c da n - j 口a 继幻稻棼4 图2 1 3 常用的由p c r 介导的定点突变方法【8 9 9 0 l 在图2 1 0 中的，突变方法1 1 称为简单p c r ( s p c r ) 。突变p c r 后，突变位点 只能位于产物的末端。为了克服突变位点只能位于产物的末端这个缺点，研究者又 设计o v e r l a pe x t e n s i o np c r ( o e p c r ) ，方法1 2 ，此法使用了两个重叠引物，和两 个外侧引物。先进行两个独立的p c r ，产物拿来退火和延伸，产物可用两个外侧引 物p c r 扩增。重叠引物的设计是o e p c r 的关键。o e p c r 的缺点是效率偏低，其 原因在于重叠区域比较短。长引物p c r ( m e g a p r i m e rp c r ，m p c r ) 方法1 3 后来 被发展应用，弥补了o e p c r 效率偏低的缺陷。首先利用简单p c r 制造出含突变位 点的长引物，纯化以后以引物( 长引物的名称由此而来) 的身份参与第二轮p c r 。 与o e p c r 相比，m p c r 的优点还有，设计使用的引物较少，引物与模板之间的同 源互补性高。为了突破简单p c r ( s p c r ) 的限制，人们使用了环状模板，首先把 待突变的d n a 分子装入载体，用一对尾对尾引物扩增( i n v e r t e dp c r , i p c r ) 方法 1 4 ，产物转化入宿主细胞环化，扩增。这样的方法也能把突变位点引入基因的任何 位置，而后研究者还在此方法中加入一步利用限制性内切酶d p ni 消化模板，再转 化。由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经d a m 甲基化修饰的，对o p n i 敏感而被切碎( d p n i 识别序列为甲基化的5 - g a 上t c 3 ，如图2 1 4 ，在各种质粒中 几乎都会出现，而且不止一次) ，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化 而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆，整个 实验突变的成功几率大大提耐9 1 ，9 2 。在本文的操作中，主要是用改进后的1 4 这种 相对简单的突变方法来建立我们的突变体系。 6 1 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s m u t a n ts l l s n ds y n t h e s i s p e r f o r mt h e r m a _ | c y c l i n gl o ： d e t u f ed n at c m p l a t e a n 嘲a l 嘲j a 口e n i cp r i m o r s 戗眦a i n i r 嘧o e 搴i r e dm u t a i o e e 簧t e r j d 鲫di n c o r p o r a , ep r 蚋麓辨 w i 脚p f u u # r ad n ap 。i 妒嗍煳 2 功埘d l g l 喀t l o no ft e m p l a t e d 嗡e s | p a r 印1 l a lm e l h y l a l e da n c l h e m 删a m dd n a 锻m 洲 c 卜l i 。 3 讥n i o l 能- t i y ga tc 3 7 - t r a n s 锄m r n u l a 1 e d 。m 棚e c u 酶3 7 c t ag f i n t oc o m p e t e mc e i l $ f o rr i c kr e p a y i c h , 图2 1 4 “d p ni 消化”突变方法原理图和d p ni 识别位点 在整个突变操作中，根据所需要引入的突变位点进行d p ni 法突变，此方法引 物设计比较容易，操作步骤也很简单，所需要的时间少，大大减短了实验周期，而 且利用d p ni 专一性消化甲基化的野生型质粒模板，提高了突变的几率，因此我们 的突变操作主要应用此法进行。 2 5 1 3 实验仪器与材料 仪器： p c r 扩增仪：t e c h g e n e ，( t e c h n e 公司) ；台式高速冷冻离心机：h e r m l ez 3 2 3 k ，( h e r m l el a b o rt e c h n i k 公司) ；电转化仪：m i c r o p u l s e r t m ，( b i o r a d 公 司) ；凝胶成像仪：g e ld o cx r 凝胶成像仪( b i o r a d 公司) 。 材料： 菌株与酶类 b l 2 1 ( d e 3 ) s t r a i no f e c o l i ( s t r a t a g e n e ) ；t a qd n a 聚合酶p l u s ( 北京鼎国公司) ， e a s y p f u 聚合酶( 北京全式金公司) ；d p ni 限制性内切酶( 美国n e we n g l a n db i o l a b s 公司) 。 2 5 1 4 实验方法 d p ni 突变法实验步骤： p c r 加样表如下 瓠 ，屯 i i l 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 组成成分体积 模板( h t u n a n p p o ) f a s tp f u5x b u f f e r 引物p 1 ( 5 0 u m ) 引物p 2 ( 5 0 u m ) f a s t p i l l 酶 d n t p o0 m m ) m g s 0 4 ( 5 0 m m ) 水 t o t a l 0 2 i _ d 5 9 l 0 3 m 0 3 山 0 5 山 0 7 山 0 5 m 1 7 5 “l 2 5 m p c r 程序： 9 5 2 m i n _ 9 4 2 0 s 4 5 、5 0 、5 5 、6 0 2 0 s 一7 2 4 m i i l 一7 2 l d45min-hold4 c 二、d p n i 降解甲基化的模板d n a 待p c r 产物冷却后，加入l g ld p ni 酶( 1 0u n i t ) ，于3 7 。c 孵育2 h 。 三、转化 取2 9 l 经d p ni 消化的p c r 产物进行转化。 四、制备甘油管，测序 从平板上挑起单菌落，于2 x y t 培养基中，3 7 c 过夜培养，后制成甘油管，送 公司测序确认突变成功与否。 五、酶反应动力学常数测定 人体原卟啉原氧化酶以及突变体活性测定方法同第二章第三节。各个酶的米氏 常数。，最大反应速度v m 缸，催化速率忌。缸，通过测定不同底物浓度【s 】下酶反应初 速度v ，按以下公式拟合得到： 三：生上- i - , 上 一= 一- 一一 y 【嗣 匕= e 】 e 】为酶浓度。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 5 2 实验结果与小结 2 5 2 1 突变体的动力学常数分析 人体p p o 野生型与活性空腔周围氨基酸残基突变酶的动力学数据( 表2 7 ) 显 示了这些与活性空腔相互作用的氨基酸残基在一定程度上影响了酶的催化活性，与 野生型相比其活性基本上都有所降低。是什么原因引起这些突变体的活性降低呢? 我们需要从结构上进行进一步的探讨。 表2 7 人体p p o 野生型与活性空腔周围氨基酸残基突变酶的动力学常数 2 5 2 2 从结构上对突变