（农药学专业论文）α氨基膦酸酯类手性化合物的高效液相色谱（hplc）分离与制备.pdf

贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 摘要 用高效液相色谱进行对映体的光学拆分己成为现代合成化学、生物医药学及 农药化学等领域中必不可少的工具之一。在手性化合物的直接拆分中，固定相是 实现手性分离的关键，其中，多糖类手性固定相是广泛使用的手性固定相之一。 本文从保留因子、分离因子( a ) 和分离度) 等方面考察了c h i r a l c e lo d - h 、 c h i r a l p a ka d h 、c h i r a l p a ki a 色谱柱对系列a 一氨基膦酸酯类化合物的手性分离 效果，考察了分子结构、柱温、醇类添加剂的种类及浓度等因素对手性分离的影 响。选用了一种新型键合型淀粉- - ( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 手性色谱柱 ( c h i r a l p a ki a ) ，在正相系统的高效液相色谱条件下首次拆分制备了系列a 氨基膦 酸酯类化合物。 研究结果表明，不同手性固定相对化合物具有不同的手性分离效果，即使是 相同手性固定相，和硅胶载体的连接方式不同，对化合物也呈现不同的手性分离 能力。化合物结构和流动相组成、极性调节剂的浓度、柱温等对手性分离产生重 要影响。根据实验结果，对溶质在手性固定相上的分离机理作了初步探讨。对在 c h i r a l p a ki a 柱上分离效果比较理想的1 8 个外消旋体进行了手性制备，获得3 6 个 纯的单一对映异构体。色谱法检测单一对映体光学纯度大部分大于9 8 。部分化 合物通过1 hn m r 进- - 步作了确认。培养出化合物( ) a 3 i 的单晶，用x 一衍射确认 其构型为s 型。经初步抗烟草花叶病毒活性试验，结果表明( + ) 和( ) 的对映异构体 活性差异不大。 关键词：a 一氨基膦酸酯；多糖类手性固定相；手性分离，半制备分离 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 a b s t r a c t t h ee n a n t i o m e r i cr e s o l u t i o nb yh p l ci si m p o r t a n tt oc o n t e m p o r a r ys y n t h e t i c c h e m i s t r y , m e d i c i n a la n da g r i c u l t u r a lc h e m i s t r ye t c c h i r a ls o l i dp h a s e ( c s p ) i st h e k e yf a c t o rf o rd i r e c te n a n t i o m e r i cr e s o l u t i o n p o l y s a c c h a r i d eb a s e ds t a t i o n a r yp h a s e h a sb e e ni d e n t i f i e da sv e r s a t i l ea n du s e f u lc s pf o rt h es e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r s t h r e ec s p sd e r i v e df r o mp o l y s a c c h a r i d es t a t i o n a r yp h a s e ( c l l i m l c do d h ， c h i r a l p a ka d - ha n dc h i r a l p a k w e r ec o m p a r e df o rt h ee n a n t i o s e p a r a t i o no f a a m i n o p h o s p h o n a t e d e r i v a t i v e s n ee f f e c t so fc o m p o u n ds t r u c t u r e , c o l u m n t e m p e r a t u r e ，p o l a rm o d i f i e ra n di t sc o n c e n t r a t i o no i lt h er e s o l u t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d b yc h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r ss u c ha sr e t e n t i o nf a c t o r ( 助，s e p a r a t i o nf a c t o r ( a ) a n d r e s o l u t i o n ) c h i r a l p a ki ac o l u m nw a ss e l e c t e df o rt h es e m i - p r e p a r a t i v es e p a r a t i o n o fas e r i e so fa a m i n o p h o s p h o n a t ed e r i v a t i v e sw i 廿ln o r m a lp h a s e s ，w h i c hi san e w i m m o b i l i z e dc s pb a s e do n3 , 5 一d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t eo fa m y l o s e i tw a sf o u n dt h a td i f f e r e n tc s p sd i s p l a y e dd i f f e r e n te n a n t i o s e l e c t i v i t i e s e v e nt h e s a m ec s pw a ss h o w nt od i f f e ri nt h ea b i l i t yt oc a u s ee n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o nd u et o t h ed i f f e r e n tp r e p a r a t i o nt e c h n i q u e si n v o l v e d t h ec h i r a ls e p a r a t i o ns t r o n g l yd e p e n d s o nt h es t r u c t u r eo fs o l u t e s ，t h ec o m p o s i t i o no f m o b i l ep h a s e ，o r g a n i cm o d i f i e r c o n c e n t r a t i o na n dt h ec o l u m nt e m p e r a t u r e s e m i - p r e p a r a t i v es e p a r a t i o no f18r a c e m a t e sw a se x e c u t e ds u c c e s s f u l l yo n c h i r a l p a ki ac o l u m na n d3 6p u r ee n a n t i o m e r sw e r eo b t a i n e d 硼be n a n t i o m e r i c e x c e s sv a l u e so fm o s to fp u r ee n a n t i o m e r sw o r em o r et h a n9 8 s o m ep u r eo p t i c a l i s o m e r sw e r ec o n f i r m e db y1 hn m r s i n g l ec r y s t a lo fc o m p o u n d ( - ) - a 3 - 1w a s c o n f i r m e da n ds t r u c t u r ew a sf o u n dt op o s s e s sa nsc o n f i g u r a t i o nb yx - r a yd i f f r a c t i o n 1 1 1 eb i o a c t i v i t yo fa l lc o m p o u n d sp r e p a r e dw e r et e s t e dp r e l i m i n a r i l y , t h er e s u l t s i n d i c a t e d ( + ) a n d ( 一) e n a n t i o m e r se x h i b i tl i t t l ed i f f e r e n ta n t i t o b a c c om o s a i c v i r u s ( r m v ) a c t i v i t i e s k e yw o r d s ：a a m i n o p h o s p h o n a t e ；d e r i v a t i z e da m y l o s ec s p ；c h i r a ls e p a r a t i o n ； s e m i - p r e p a r a t i v es e p a r a t i o n 2 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 英文缩写 c s p h p l c s f c s m b c t m d n a c d c t a c n 僵b 缩写词列表 英文全称 c h i r a ls o l i dp h 黜 h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y s u p e r c r i t i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h y s i m u l a t e dm o v i n gb e dc h r o m a t o g r a p h y 勋6 a c c om o s a i cv i r u s d e o x y r i b o n u e l e i ca c i d c y e l o d e x t r i n c e l l u l o s et r i a c e t a t e c e l l u l o s et r i s ( 4 - m e t h y l b e n z o a t e ) a d m p c a i n y l o s et r i s ( 3 ，5 - d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) c d m p cc e l l u l o s et r i s ( 3 ，5 - d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) t h f a h c h g c 皿a e t o h t e t r a h y d r o f u r a n a h e x a c h l o r o c y c l o h e x a n e g a sc h r o m a t o g r a p h y i s o p r o p a n o l e t h a n o l 中文名称 手性固定相 高效液相色谱 超临界流体色谱 模拟移动床色谱 烟草花叶病毒 脱氧核糖核酸 环糊精 纤维素三醋酸酯 纤维素_ - - ( 4 甲基苯甲酸酯) 淀粉2 ( 3 ，5 二甲基苯基氨 基甲酸酯) 纤维素三( 3 ，5 二甲基苯基 氨基甲酸酯) 四氢呋喃 伽六六六 气相色谱 异丙醇 乙醇 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究曾做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：翘丝蕴 日 期： 至q q 区生z 旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：趟导师签名：型! 壁：量日期：2 q q 区锄 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 前言 g 氨基膦酸酯作为天然氨基酸的含磷类似物，具有抗植物病毒( 陈茹玉，等 1 9 9 5 ；龙韫先等1 9 9 6 ；戴庆等1 9 9 7 ；李在国等1 9 9 9 ；h u a n g , e ta 1 2 0 0 1 ) 、除草 ( 陈茹玉等1 9 9 5 ；石德清等2 0 0 2 ) 、植物生长调节( 汪焱钢等2 0 0 2 ) 、抗肿瘤( w a n g , e ta 1 2 0 0 1 ；刘学军，等2 0 0 2 ) 和杀菌( m i e n ，e t a l 1 9 7 8 ；p a u l ，e ta 1 1 9 8 4 ；l t he ta 1 2 0 0 0 ) 等重要的生物活性，且具有低毒、低残留、对哺乳动物毒性低等优点。自 1 9 4 0 年c h a v a n 首先报道了氨基甲烷膦酸甘氨酸膦酸类似物，至今已有1 0 0 0 多篇 论文涉及到它的合成、分析、分离和应用的研究，其中具有光学活性的咖氨基膦 酸及其酯是研究热点。 为了寻找较高抗烟草花叶病毒活性的a 氨基膦酸酯化合物，本中心在a 氨 基膦酸及其酯的合成及生物活性方面做了很多工作，于2 0 0 2 年筛选出具有高活 性抗烟草花叶病毒的药剂“病毒星 。此外，z h a n g 等( z h a n g , e t 口，2 0 0 5 ；j i n , e ta 1 2 0 0 6 ) 以杂环胺为原料采用 b m i m p f 6 离子液体合成含氟和苯并噻唑环的g 氨基膦酸酯新化合物；h u 等( h t he ta 1 2 0 0 8 ) 采用活性拼接法，将具有较高生物 活性的酰胺基引入到a 氨基膦酸酯结构中，首次合成了含膦酸酯与酰胺基团的a 氨基膦酸酯衍生物；赵军等( 赵军等2 0 0 7 ) 采用活性基团拼接法，将苯乙基和3 ，4 ， 5 三甲氧基苯基、氟原子引入到氨基膦酸酯结构中，设计并合成系列含氟代苯乙 基和3 ，4 ，5 三甲氧基苯基的氨基膦酸酯化合物。生物活性测试结果表明这些化合 物对烟草花叶病毒均具有一定的活体治疗作用。 对于农药而言，随着立体化学的发展和对农药的构效关系研究的不断深入， 人们对光学活性产品的关注日益增加。目前，光学活性的a 一氨基膦酸酯的制备主 要是应用手性试剂导向合成法、不对称合成法、色谱分离方法。2 0 0 1 年廖本仁 等( 廖本仁等，2 0 0 1 ) 对光学活性a 氨基膦酸及其酯的各种不对称合成方法作了 综述，主要介绍了化学计量不对称合成和催化不对称合成法；2 0 0 2 年周爱玲等( 周 爱玲等，2 0 0 2 ) 报道了手性有机磷化合物液相色谱拆分的研究进展，对间接拆分和 直接拆分法，尤其是各类手性固定相法在拆分有机磷化合物中的应用作了简介， 对拆分机理作了探讨。2 0 0 3 年宋宝安等( 宋宝安等，2 0 0 3 ) 报道了新型光学活性昏 氨基膦酸及其酯的合成进展。文中对光学活性的a 氨基膦酸酯的主要制备方法手 性试剂导向合成法、不对称合成法、色谱分离方法进行了概述和总结。可以看出， 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 拆分对映体是获得光学纯化合物的主要方法之一，特别是在开发新药的初期阶 段，当需将左、右旋二个对映体在相同条件下分别进行生物活性比较时，就显得 尤为必要。 为了进一步了解此类化合物的生物活性与其绝对构型的关系，寻找具有较高 抗烟草花叶病毒活性的弘氨基膦酸酯类化合物，本论文对本中心合成的部分a 氨基膦酸酯消旋体使用高效液相色谱手性固定相法进行了拆分，获得了单一对映 体，并对其光学活性、生物活性、绝对构型等进行研究，对拆分机理进行了探讨。 4 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 第一章文献综述 1 1 引言 光学纯物质在药物、天然产物、精细化学品、高分子材料等领域有着广阔的 应用前景，发展能够获得光学纯物质的技术已成为化学工作者一个重要的研究方 向。目前获得光学纯物质的方法主要有“手性源”法、不对称合成法以及外消旋体 拆分法，而外消旋体拆分法是其中最为实用和经济的一种。在常用的外消旋体拆 分法中，色谱法由于具有经济、快速和操作方便等优点，已成为最有发展潜力的 方法之一。本章重点围绕a 氨基膦酸酯化合物手性分离的手性固定相、多糖衍生 物手性固定相的种类及外消旋体拆分制各的色谱技术这三方面进行介绍。 1 2m 氨基膦酸酯对映体h p l c 拆分的手性固定相( c s p ) h p l c 分离手性农药包括间接拆分法和直接拆分法，前者又称手性试剂衍生 化法，后者包括手性流动相添加剂法和手性固定相法，其中手性固定相法是目前 对映体拆分中发展最快的一种方法。自1 9 8 1 年p i r k l e 等研究出( r ) n ( 3 ，5 二硝基 苯甲酰基) 苯甘氨酸手性固定相以来，作为商品出售的手性固定相已有2 0 0 多种。 现在商品化的手性固定相有p i r k l e 型手性固定相、环糊精及衍生化环糊精手性固 定相、多糖类手性固定相、大环抗生素类手性固定相、蛋白质手性固定相等。 a 氨基膦酸酯对映体拆分方法中见报道的有手性固定相h p l c 法和毛细管 电泳法，其中h p l c 手性固定相法运用广泛，毛细管电泳法不能用于制备，故本 节只对h p l c 手性固定相法做一个概述。手性固定相法总的拆分机理是被拆分的 对映异构体与手性固定相形成非对映的过渡态络合物，从而表现出不同的物理化 学性质而分离。用于a 氨基膦酸酯对映体拆分见报道的主要有p i r l d e 型手性固定 相、环糊精手性固定相、多糖类手性固定相。 1 2 1p i r m e 型手性固定相 p i r l d e 型手性固定相的研究，主要贡献应归功于美国i l l i n o i s 大学的p i r l d e w h 研究组，因此称为p i r l d e 型或多种作用手性固定相，其商品以b r u s h t y p e ( 届0 型) 著称。p i r l d e 还运用非对映异构化合物作用的分子模型和对同一系列的各种外 消旋物质的研究，阐明了这类c s p 的手性识别机理，其立体识别基于三点作用 原理。这类手性固定相的特点是在手性中心附近至少含有下列一种官能：( 1 ) z - 吸电子或兀- 给电子的芳香基团：( 2 ) 能形成氢键的原子或基团；( 3 ) 形成偶极相互 5 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 作用的极性基团；( 4 ) 大体积非极性基团。 1 9 9 2 年p i r k l e 等( p i r k l e , e ta 1 1 9 9 2 ) 在系y o n - 受体型( 3 ，5 二硝基苯甲酰基) 氨 基酸衍生物和兀- 给体( 萘基) 氨基酸衍生物手性固定相上，拆分了一些仅氨基膦酸 酯的3 ，5 - 二硝基苯甲酰胺衍生物。19 9 4 年s e l i m ( s e l i m ，e ta 1 19 9 4 ) 报道用( r ) - 2 ，2 ，2 三氟1 - ( 9 葸基) 乙醇手性固定相( 现称为第一代刷型固定相) 拆分了3 ，5 二硝基苯 基m 氨基膦酯，采用的三种手性固定相手性分离系数依次为c s p 4 c s p 3 c s p 2 。 19 9 6 年g a o 等( g a o ，e ta 1 1 9 9 6 ) 报道了在p i r c l e 型手性柱上分离了一系列o ，o 二乙 基恤甲基苯基亚磺酰胺基) 芳基甲基膦酸酯，探讨了可能的手性识别机理，考 查了流速和柱温对手性分离的影响。1 9 9 7 年高如瑜等( 高如瑜等1 9 9 7 ) 在p i r l d e 型 固定相上对o 乙基o - 苯基n 异丙基硫代氨基膦酸酯系列化合物进行了有效拆 分，对其可能的手性识别机理进行了探讨。1 9 9 8 年h u a n g 等( h u a n g e ta 1 1 9 9 8 ) 报 道了在n ( 3 ，5 二硝基苯) 亮氨酸手性固定相上分离了7 个不同结构的a 一氨基膦酸 酯，考查了不同流动相对手性分离的影响，在正己触乙醇做流动相下，6 个化合 物可以达到基线分离，1 个化合物部分分离。2 0 0 0 年z a r b l 等( z a r b l ，e ta 1 2 0 0 0 ) 在 奎宁手性固定相上成功拆分了几个含3 ，5 二硝基苄氧酰胺的膦酸酯化合物，分离 因子在1 1 2 8 之间，分离度在2 0 之间，都达到了基线分离。2 0 0 1 年g 等 w a n g , e ta l2 0 0 1 ) 在p i r k l e 型手性固定相上实现了一系列o , o - - - 7 , 基a 苄氧酰胺 芳基甲基膦酸酯化合物的手性分离，考查了不同流动相和柱温对手性分离的影 响。2 0 0 1 年黄君珉等( 黄君珉等2 0 0 1 ) 在p i r l d e 型手性固定相s u m i c h i r a lo a 4 7 0 0 上 实现了一系列n 苄氧甲酰基a 氨基膦酸二苯酯的有效拆分，并且指出p i r c l e 型手 性固定相对此类化合物的分离优于衍生化环糊精手性固定相。 p i r k l e 型c s p 是目前使用量大、适用面广、对手性识别机理揭示较深的一 类重要c s p 。p i r k l e 等认为此类手性固定相拆分机理是在该类c s p 和溶质分子 之间发生以下几种作用：( i ) c s p 芳环与被分离溶质的舡电子给体、受体作用， 如固定相中存在缺电子芳香基团，被拆分的对映体化合物中有富电子芳香基团 与之匹配，从而达到拆分的目的；( 2 ) c s p 上的仲胺、羰基基团与溶质的酸性质 子、羟基、氨基之间的氢键作用；( 3 ) 偶极偶极作用；( 4 ) 大体积非极性基团靠近 c s p 手性中心而产生的空间立体效应。 1 2 2 环糊精及衍生化环糊精手性固定相 6 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 环糊精( c y e l o d e x t r i n ，简称c d ) 是由6 8 个或更多个葡萄糖单位通过a - l , 4 糖 苷键连接而成的环状化合物( 见图1 - 1 ) 。用于作手性固定相的通常为含乒8 个葡 萄糖单元的a 、) ，环糊精。环糊精分子中的羟基为其衍生化、改性提供了结构 基础，也就产生了一系列的衍生环糊精手性固定相。 m 图l l 环精精结构式 f i g 1 - 1 s t r u c t u r e so fc y c l o d e x t r i n 1 9 9 9 # - - - 2 0 0 5 年南开大学元素有机化学研究所的黄君珉、周爱玲等( 黄君珉等 2 0 0 1 ；周爱玲等2 0 0 3 ；z h o u , e ta 1 2 0 0 5 ) 致力于手性有机磷农药的拆分，先后完成 了在苯基氨基甲酸酯衍生化1 3 一环糊精键合相上对一系列n 苄氧甲酰基a 氨基膦 酸二苯酯和一系列2 ( 噻唑基) 吨氨基膦酸酯的拆分，在s ( + ) 萘乙基氨基甲酸酯衍 生化伊环糊精键合相对一系列n 苄氧甲酰基吨氨基膦酸二苯酯的拆分、在4 硝基 苯基氨基甲酸酯衍生化p 环糊精键合相上对一系列2 ( 噻唑基) a 一氨基膦酸酯的拆 分。在这些实验中，黄君珉、高如瑜等结合热力学数据，对手性分离过程热力学 行为进行了讨论。探索运用定量结构、对映体选择性保留关系方法，对对映异构 体的色谱保留和溶质分子描述参数通过因子分析和多元线性回归方法选择其中 几个参数进行相关性联立建立定量方程，从超热力学控制的角度研究了色谱和手 性识别机理。 黄君珉等认为环糊精固定相与对映体分子通常有两种识别方式，一种为内识 别，即通过环收敛作用形成包结物，另一种为外识别，即环糊精与客体分子表面 的相互作用。反相体系通常为内识别机理，而正相体系通常为外识别机理，衍生 化的环糊精手性固定相会增加识别位点，所以衍生化环糊精手性固定相不仅在反 相体系中可实现手性分离，在正相体系中亦可实现，是多模式手性固定相。 1 2 3 多糖类手性固定相 多糖是自然界大量存在的具有光学活性的聚合物，主要包括纤维素和淀粉， 他们是d - 葡萄糖以伊1 ，4 糖苷键或以口1 ，4 糖苷键相连而形成的聚合物。组成多 糖的葡萄糖单元具有手性，多糖分子本身又具有高度有序的螺旋结构，因此这类 7 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 分子具有手性识别能力。纤维素和淀粉本身都不适于直接用作手性固定相，因其 手性识别能力低，需对其进行衍生化。 19 9 4 年c a c c a m e s e 等( c a c c a m e s e ，e ta 1 19 9 4 ) 用纤维素c h i r a l c e lo d 手性柱上 分离了一系列氟化n ( 芳基) 1 氨基1 芳甲烷膦酸酯化合物，指出n 上的芳环基团 和c 上的芳环基团对手性识别起着非常重要的作用。1 9 9 8 年g r a s s e r t ( g r a s s e r t , e t a 1 1 9 9 8 ) 合成了一系列二烷基1 苯甲酰胺基2 苯基一乙烯基膦酸酯化合物，采用 了c h i r a l p a k a d 和c h i r a l c e lo d h 对化合物进行了光学纯度的检测。2 0 0 1 年 n g u y e n 等( n g u y e n , e ta 1 2 0 0 1 ) 报道了在淀粉c h i r a l p a k a d 手性柱上分离制备了二 异丙基吨( 4 羟基一3 一甲氧基5 甲基苯基) - n 3 - ( 2 ，6 二甲基吡啶) 氨基甲基膦酸酯 的手性异构体。2 0 0 3 年d u ( d l l e ta l2 0 0 3 ) 等在c h i r a l c e lo d 手性柱上对一系列仅 氨基膦酸酯进行了拆分，在正己烷：乙醇- - 9 8 ：2 的优化条件下，1 5 个昏氨基瞵酸酯 中有1 3 个在此手性固定相上被分离。2 0 0 1 - - - 2 0 0 4 年y a n g 等( y a n g , e ta 1 2 0 0 1 ；2 0 0 2 ； 2 0 0 3 ；2 0 0 4 ) 报道了o , o - = l 基a 苄氧酰胺芳基甲基膦酸酯系列化合物分别在 c h i r a l c e lo d ，c h i r a l p a ka d ，c h i r a l p a ka s ，c h i r a l c e lo ga n dc h i r a l c e lo j 手性柱上 的分离效果，讨论了化合物的结构和对手性分离的影响，探讨了可能的手性识别 机理。 对多糖类手性固定相而言，其手性拆分机理比较复杂，目前还没有比较满意 的解释，还不能预言手性拆分的情况，其手性识别实际上是对映体与手性固定相 之间所有作用综合影响的结果，很多时候是不能完全用经典的“三点作用原理” 来解释的。对同一种多糖衍生物固定相而言，因制备过程中的种种因素，如硅胶 载体的孔性结构以及表面化学性质、多糖分子量大小及分布、不同基团的引入、 涂敷溶剂等的不同而呈现不同的构象，从而表现出了不同的拆分能力。同时它们 在固态或溶液中的结构也很难准确测定，因此很难根据“三点作用”原理从分子 水平来解释它们的手性识别能力。一般认为多糖苯基氨基甲酸酯类固定相的主要 手性吸附位置则为极性的氨基甲酸酯基，光学拆分能力受控于氨基、羰基与样品 间的氢键作用，羰基与样品间的偶极偶极作用，在对映体的苯环与手性固定相 的苯环之间的肛石相互作用，以及非手性作用( 如空间效应) 等作用力。由于两个 对映体与固定相之间作用能力有差异，形成了非对映体络合物而得到分离，总的 说来，用多糖手性固定相分离化合物只能凭借经验和实验来判断，对映体拆分的 手性识别机理还有待于进行更加深入的研究。 8 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 1 3 多糖手性固定相的种类与发展 近年来，多糖衍生物手性固定相( 主要包括纤维素、直链淀粉的衍生物) 在高 效液相色谱领域得到了深入的研究，由于这类固定相对很多化合物具有较好的手 性分离效果和较高的柱容量，在手性分离和手性制各方面都得了广泛的应用。 n o v a r t i s 公司e r i cf r a n c o t t e 在复查了大约1 0 0 0 种消旋体的分离之后，在“2 0 0 4 手 性欧洲会议一他做了以下报告：大约的混合物可以用4 种分离，即9 0 c s p s纤维 素衍生物c h i r a l c e lo d 和c h i r a l c e lo j ，淀粉糖衍生物c h i r a l p a ka d 和c h i r a l p a ka s 。 所有这些c s p s 都是根据d a i c e l 化学工业公司c h i r a lt e c h n o l o g i e s 的专利制造的多 糖衍生物手性柱。本实验在查阅大量文献的基础上，也选定了在多糖类手性固定 相上进行拆分与制备，因此，本部分对多糖类固定相的发展和种类做较为详细的 介绍。 i h 1 几种重要的多糖类手性固定相 多糖是自然界大量存在的具有光学活性的聚合物，组成多糖的葡萄糖单元具 有手性，多糖分子本身又具有高度有序的螺旋结构，因此这类分子具有手性识别 能力。未经衍生的多糖分子手性识别能力有限，用合适的衍生化试剂将其糖单元 上的羟基衍生为烷基酯或苯基氨基甲酸酯后，所得到的衍生物具有较强的手性识 别能力。目前应用于对映体分离的多糖衍生物主要包括纤维素醋酸酯和苯甲酸 酯、纤维素( 淀粉) 苯基氨基甲酸酯、纤维素( 淀粉) 芳烷基氨基甲酸酯。 最早用作固定相的多糖衍生物于1 9 7 3 年由h e s s e ( h e s s e 。e ta 1 1 9 7 3 ) 合成的微 晶纤维素三醋酸酯( c t a i ) ，其结构见图1 2 。c t a 1 可以直接填入柱管制成色谱 柱，也可以涂敷在硅胶表面后再填入柱管制成色谱柱。某些对映体化合物在上述 两种色谱柱的洗脱顺序相反( i c h i d a , e ta 1 1 9 8 4 ) ，这可能是由于两种情况下，纤维 素三醋酸酯的超分子结构不同。c t a 1 可用来分离很多对映体化合物，尤其是非 极性的芳香族化合物和药物。 图l - 2 纤维素三醋酸酯的结构 f 喀1 2s t r u c t u r eo f c e l l u l o s et r i a c e t a t e 后来，人们在考察纤维素三苯甲酸酯衍生物( c t b ) 的手性识别能力时发现， 9 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 纤维素- - ( 4 甲基苯甲酸酯) ( c 喇b ) 呈现出较为广泛的手性识别能力，所拆分的 对映体包括一些药物和非芳香族化合物。不过，淀粉三苯甲酸酯衍生物的手性识 别能力明显低于相应的纤维素三苯甲酸酯( o k a m o t o ，e ta 1 1 9 8 7 ) h 扣弋 图1 - 3 纤维素三( 4 甲基苯甲酸酯) 的结构 f i g 1 - 3s t r u c t u r e so fc e l l u l o s et r i so - m e t h y l b e n z o a t e ) o k a m o t o 等人合成了一系列纤维素( 淀粉) 三苯基氨基甲酸酯衍生物( 图1 呦， 并系统地研究了它们的手性识别能力和机理( o k 锄o t o ，e ta 1 1 9 8 6 ，1 9 9 0 ，1 9 9 4 ) 。 该类衍生物的手性识别能力很大程度上取决于苯环上取代基的数量和种类 ( o k a m o t o ，e ta 1 1 9 8 4 ，1 9 8 6 ，1 9 8 7 ) 。在这一类衍生物中，纤维素和淀粉三( 3 ，5 - 二 甲基苯基氨基甲酸酯) ( c d m p c 和a d m p c ) 呈_ 现出较强的手性识别能力，相应的固 定相已被商品化，商品名分别为c h i r a l c e lo d 和c h i r a l p a ka d 。a d 的手性识别能 力与o d 相当，但由于a d m p c 和c d m p c 的空间结构不同，a d 和o d 对同一对对 映体往往呈现出相反的洗脱顺序，因此在一些对映体分离中，两者可互为补充。 图1 4 纤维素和淀粉- - - ( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 的结构 f i g 1 - 4s t m c t u r e so ft d s ( 3 ，5 - d i m e t h y l p h e n y l c , a r b a m a t e ) o fc e l l u l o s ea n da m y l o s e 纤维素和淀粉的几种芳烷基氨基甲酸酯也表现了一定的手性分离能力。 k a i d a ( k a i d a , e ta 1 1 9 9 3 ) 和o k a m o t o ( o k a m o t o ，e ta 1 1 9 9 0 ) 研究发现纤维素和淀粉 的1 苯乙基氨基甲酸酯和1 苯丙基氨基甲酸酯表现出较高的手性识别能力。纤维 素和淀粉的1 苯乙基氨基甲酸酯的手性拆分能力在很大程度上取决于芳烷基的 结构，其中淀粉三【1 苯乙基氨基甲酸酯】( 结构见图1 - 5 ) 匍j 备的固定相表现出较强 的手性识别能力，目前已经商品化( 商品名为c h i r a l p a ka s ) 。该固定相对部分对 映体的识别能力甚至强于o d 和a d 。 1 0 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 h 3 c 图1 s 淀粉= 1 1 苯乙基氨基甲酸酯1 的结构 f i g 1 - 5s t r u c t u r e so ft r i s ( 1 - p h e n y l e t h y l c a r b a m a t e ) o fa m y l o s e 1 3 2 涂敷型和键合型多糖手性固定相 2 0 0 5 年以前作为商品出售的多糖类手性固定相通常是将多糖衍生物直接涂 敷到经氨丙基修饰的大孔硅胶上。2 0 0 5 年初，大塞璐化学工业有限公司陆续商品 化了几种多糖类键合型手性固定相，其中有c h i r a l p a ki a 、c h i r a l p a ki b 等手性柱， 这些产品可以选择使用许多过去在涂敷型手性柱上不能使用的溶剂。表1 1 列出 了一些商品化的多聚糖衍生物手性柱，除微晶纤维素三乙酸酯，c h i r a l p a ki a ， c h i r a l p a km 外，其余均为涂敷在硅胶上制备的手性柱。 表1 - 1 商品化多糖衍生物手性柱 一一坠b l e 1 - 1c o m m e r c i a l c h i r a lc o l u m no fp o l y s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e 一 商品名手性固定相生产公司 把多糖衍生物涂敷于大孔的硅胶表面制成涂敷型手性固定相，是目前应用最 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 广的多糖衍生物类手性固定相的制备方法。该方法由o k a m o t o 等在1 9 8 4 年 ( o k a m o t o ，e ta 1 1 9 8 4 ) 发展起来，硅胶用作载体使得固定相的机械稳定性和柱效 得到了显著地提高，而本方法的出现大大促进了多糖衍生物手性固定相的发展。 涂敷型固定相的手性识别能力和柱效受制备过程中很多因素的影响，例如硅胶的 粒径、孔径和比表面积、涂敷溶剂的种类、涂敷方法、涂敷量等。近年来又有新 的载体被使用，研究较多的是氧化锆。涂敷型手性固定相在使用时，流动相中都 应当避免使用会使多糖衍生物溶解或溶胀的溶剂，例如四氢呋喃( t h f ) 、三氯甲 烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯等，即使是极少量的这些溶剂的使用，均会引起 涂敷型手性固定相柱流失或柱效下降，这个缺点在一定程度上限制了涂敷型多糖 手性固定相的使用，解决这个问题的途径就是制备键合型多糖衍生物手性固定 相。 键合型固定相是指将多糖衍生物通过间隔臂以化学键键合在担体表面，或使 衍生物交联成网状而固载在担体表面。这样制备的固定相可耐四氢呋喃等溶剂的 冲洗而不会造成多糖衍生物的流失，从而扩大了流动相的使用范围。发展高效率 的键合方法是目前多糖衍生物固定相研究的热点。与涂敷型固定相相比，键合型 固定相可使用的流动相范围更广，因而一些不能在涂敷型固定相上拆分的对映体 化合物有望在键合型固定相上得到拆分。 1 4 手性药物分离和制备的色谱技术 目前，在国际市场上以单一旋光异构体销售的农药仅占农药销售总额的7 左右，随着立体化学的发展和对农药的构效关系研究的不断深入，人们对光学活 性产品关注日益增加。为了得到纯的对映异构体，对手性化合物的定向合成及对 外消旋体进行手性拆分成为各国科学家研究的热点，这类研究工作具有很重要的 理论意义和实用价值。定向合成过程比较复杂，一旦工艺流程确定后，比较容易 实现工业化、规模化生产，但很多手性化合物用定向合成的方法在短的时间内很 难得到对映体过量值达到9 8 的纯化合物。特别是在开发新药的初期阶段，当需 将左、右旋二个对映体在相同条件下分别进行生物活性比较时，外消旋体拆分方 法，尤其是色谱法就成为一种最重要的分离方法，这种方法可以迅速地从消旋体 混合物中生产出高纯度的对映体，以便进行纯的光学异构的生物活性测试，得到 重要的实验数据，指导实验的进展方向。现就有关用于手性药物拆分的色谱技术 做一简要概述。 1 2 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 1 4 1 高效液相制备色谱( r i p l c ) 高效液相色谱法以其公认的直接、快速、高效、简便和适用范围广等优点而 得到迅速发展。现阶段，利用高效液相色谱法进行不对称拆分被公认为是最有效 的方法之一，而且h p l c 载液量大，可用于对映体间的制备分离。 1 9 9 6 年p a d i g l i o n i 等( p a d i g l i o n i ，e ta 1 1 9 9 6 ) 报道用麦角生物碱做手性固定相 可分离2 , 4 ，5 涕丙酸，他们采用h p l c 法在2 5 0 x 7 8 眦i d 的柱子方法制备了 2 ，4 ，5 涕丙酸，一次单独进样可制备纯对映异构体各l m g 。2 0 0 4 年c h a m p i o n 等 ( c h a m p i o n , e ta 1 2 0 0 4 ) 在c h i r a l c e lo j 柱上用己酮2 丙醇为流动相时，直接 拆分a h c h ，并且在相同的条件下，使用制备柱得到大约2 5 0m g 的a - h c h 单 一对映体；在c h 瓜a l c e lo d 制备柱上制备约2 5 0m g 反氯丹，顺氯丹和七氯。 目前，高效制备液相色谱技术已可以将小粒径( 5w n ) 的填料装填成直径至1 5 0 r a n l 的制备柱，科学家们无需重新开发制各色谱的分离技术，而直接利用在分析色 谱柱( 2 1n l l n 或4 6l l i n l 直径) 上优化的方法进行线性放大，节省了时间和费用。 1 4 2 超临界流体色谱( s r c ) 超临界流体色谱( s f c ) 是从2 0 世纪8 0 年代中期发展起来的一种拆分技术， 这种方法以是以超临界c 0 2 为流动相进行分离的一种绿色色谱分离技术，具有 高效、快速、操作条件易于变换等特点。超临界色谱法兼备g c 和h p l c 的优点， 可以使用g c 和h p l c 的各种检测器进行分析和测定，与气相色谱法和高效液相 色谱相比，超临界c 0 2 色谱的优点就是分析时间短、柱平衡快、流动相体系简 单、适用范围广。超临界c 0 2 的粘度接近于气体，密度接近于液体，过程阻力 较小，且扩散系数在液体与气体之间具有较快的传质速度，可获得尖锐的色谱峰。 它采用清洁的c 0 2 作为流动相，加入有机改性剂，可分离离子性、强极性的化 合物，且流动相价格便宜，适合于大量生产。 随着手性固定相的发展，越来越多的手性固定相应用于超临界c 0 2 色谱， 如p i r k l e 型手性固定相、环糊精手性固定相、多糖类手性固定相、大环抗生素类 手性固定相。2 0 0 3 年n o z a l 等( n o z a l ，e t a l2 0 0 3 ) 报道了超临界流体色谱对三唑醇 和三唑酮的手性分离方法，采用c h i r a l p a ka d 和s p h e r e xd i o l 手性柱，考察了 甲醇、乙醇和异丙醇做为调节剂对手性分离的影响，结果显示了甲醇和乙醇做为 调节剂对两个化合物的分离效果都较理想。2 0 0 4 年t o r i b i o 等( t o r i b i o ，e ta 1 2 0 0 4 ) 报道了用超临界流体色谱，用c h i r a l p a k a d 手性色谱柱对六个三唑类杀菌剂的手 1 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 性分离方法，此方法非常成功，所有的化合物，包括含四个对映体的化合物，都 能在1 0r a i n 内达到基线分离。 超临界流体色谱作为一种制备分离技术，已应用于食品、医药、生物及石油 等多个领域。