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s 腺苷甲硫氮酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化 摘要 s 腺苷甲硫氨酸( 简称s a m ) ，是生物体内重要的中间代谢体，具有转甲基、转硫、 转氨丙基等作用，是半胱氨酸、牛磺酸、谷光甘肽、辅酶a 等重要物质的前体。能 治疗神经紊乱、精神抑郁、关节炎等多种疾病，有着巨大的国际市场需求。 本文对s a m 产生菌进行了选育并开展发酵工艺研究，结果如下： 通过对s 腺苷甲硫氨酸生产菌s a c c h a r o m y c e sc e r e v 如i a eb 9 菌株进行分离复壮， 获得一株遗传性能较为稳定的菌株s a m - 3 9 8 ( 1 7 6 5 9 l ) ，以s a m 3 9 4 为出发菌株进行 诱变育种，最后获得比出发菌株s a m 3 9 # 产量高6 9 8 9 的诱变株y z 3 3 ，其s a m 含 量为3 0 0 1 9 l ，而紫外诱变、原生质体再生育种方法提高产量的效果不明显。通过比 较发现：紫外线氯化锂复合诱变和原生质体紫外复合诱变对s a m 生产菌的诱变效果 较好。 以高产稳定的诱变株y z 3 3 为出发菌株，通过测定生长曲线，探索蜗牛酶的 酶解浓度、时间、温度等因素对原生质体形成的影响，确定了制备原生质体的最佳 条件为：种子液培养1 6 h ，o 1 1 3 巯基乙醇预处理l o m i n ，酶解浓度2 5 ，酶解时间 1 5 0 m i n ，用0 5 m o l l 的蔗糖作为渗稳剂。 针对y z - 3 3 菌株在不改变原有培养基组成成分的基础上，对其各组成成分进行 了正交实验，找到最佳配比。得出最佳培养基配方为：蔗糖1 2 、氯化铵0 8 ，酵 母粉0 8 ，硫酸镁0 0 0 5 ，l 甲硫氨酸1 2 ，磷酸二氢钾0 4 ，磷酸氢二钾0 2 。另外， 对菌株y z 3 3 摇瓶发酵过程中的p h 值、生物量、s a m 含量、蔗糖含量、n h 4 + 等代谢 参数进行测定，为s a m 发酵工艺的建立提供了参考。 还对补料工艺做了初步的研究，确定了补料工艺与最适宜补料方式。初步补料 工艺为：l m e t ： b 料终浓度0 8 ，补料起始时间2 4 h ，蔗糖补料终浓度1 0 ，补料时 间4 8 h ；最适宜补料方式为：在2 4 h 力i 入0 6 l m e t 、3 蔗糖，在4 8 h 按0 2 b 力n l m e t ， 蔗糖在4 8 h 和7 2 h 分别按2 5 补给。在此种补料条件下s a m 的产量达到4 0 4 1 9 l 。 关键词：s 腺苷甲硫氨酸；育种；原生质体；发酵工艺；分批补料 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 a b s t r a c t s - a d e n o s y l l m e t h i o n i n e ( s - - a d e n o s y l - l - m e t h i o n i n e ，a ss a m ) ，i si m p o r t a n ti n t h e m i d d l eo fm e t a b o s cb o d y ，h a st om e t h y l ，t os u l f u r , s u c ha st oa m i n o p r o p y l , h o m o c y s t e i n ei s ，t a u r i n e ，g ug a n - p e p t i d e ，c o e n z y m e & a n do t h e ri m p o r t a n tp r e c u r s o r s u b s t a n c e s t ot r e a tl l g t v o u sd i s o r d e r s ，d e p r e s s i o n , a r t h r i t i sa n do t h e rd i s e a s e s ，h a sah u g e d e m a n do nt h ei n t e m a t i o n a lm a r k e t s a mo ft h i sp a p e rh a v ec a r r i e do u taf e r m e n t a t i o np r o c e s so fb r e e d i n ga n dr e s e a r c h r e s u l t sa r ea sf o u o w s ： t h r o u g ht h ep r o d u c t i o no fs - a d e n o s y l m e t h i o n i n e g r a i n so fs a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e b 9t o s e p a r a t er e j u v e n a t i o n , a c c e s st o ar e l a t i v e l ys t a b l eg e n e t i cs t r a i n so f s a m 3 9 # ( 1 7 6 5 9 l ) ，s a m 3 9 4 a st h es t a r t i n g t os t r a i nm u t a t i o n b r e e d i n g ， f i n a l l ys t a r t i n gs t r a i nt h a nt h es a m - 3 9 8h i g hy i e l d6 9 8 9p e r c e n to ft h em u t a t i o no f y z 一3 3 ，i t ss a mc o n t e n t3 0 0 1 9 l ，a n du v - i n d u c e d ，p r o t o p l a s t r e n e w a b l en e e d i n gm e t h o d st or a i s ep r o d u c t i o ni n e f f e c t i v e b yc o m p a r i s o nf o u n d ： u l t r a v i o l e t - l i t h i u mc h l o r i d ec o m p o u n da n dp r o t o p l a s tu v - i n d u c e dm u t a t i o no ft h es a m p r o d u c t i o no f t h em u t a g e n i ce f f e c t sb e t t e r h i g h - y i e l ds t a b i l i t yt o - t h em u t a t i o no fy z - 3 3a st h es t a r t i n gs t r a i n , t h r o u g ht h e d e t e r m i n a t i o no ft h e g r o w t hc u r v e ，a n de x p l o r ea s n a i l s p a c e o ft h ee n z y m e c o n c e n t r a t i o n , t i m e ，t e m p e r a t u r e a n do t h e rf a c t o r s0 1 1t h ef o r m a t i o no f p r o t o p l a s t s ，i d e n t i f i e dp r o t o p l a s to f t h eb e s tc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：s e e d so f t r a i n i n g1 6 h o u r s , o 1 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o lp r e t r e a t m e n t1 0r a i n , e n z y m e c o n c e n t r a t i o no f2 5 p e r c e n t ，h y d r o l y s i st i m e15 0r a i n ，w i t h 0 5m o l ls u c r o s e t h e i n f i l t r a t i o no fs t a b i l i t y y z - 3 3a g a i n s tt h es t r a i nd o e sn o tc h a n g et h eo r i g i n a lc o m p o s i t i o no ft h em e d i u mo n t h eb a s i so fi t sv a r i o u sc o m p o n e n t so fao r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t of i n dt h eb e s tr a t i o t h a t t h eb e s tm e d i u mf o rt h ef o r m u l a ：1 2p e r c e n ts u g a r , a m m o n i u mc h l o r i d eo 8 0 8 y e a s t p o w d e r , m a g n e s i u ms u l f a t e0 0 0 5 ，l m e t h i o n i n e1 2 ，0 4 p o t a s s i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e ，h y d r o g e np h o s p h a t e2p o t a s s i u m0 2p e r c e n t i na d d i t i o n , t h ey z - 3 3o nt h e f e r m e n t a t i o n p r o c e s s o fp h ，b i o m a s s ，s a mc o n t e n t ，s u g a rc o n t e n t ，n h 4 + ，a n do t h e r m e t a b o l i cp a r a m e t e r sw e r em e a s u r e df o rt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so ft h ee s t a b l i s h m e mo f s a mt op r o v i d ear e f e r e n c e a l s o ，o nt h ef e e d i n gp r o c e s sd o n eap r e l i m i n a r ys t u d yt od e t e r m i n et h ef e e d i n g p r o c e s sa n dt h em o s ta p p r o p r i a t ef e e d i n gm e t h o d s i n i t i a lf e e d i n gp r o c e s si s ：l - m e t b a t c h i i s 一腺营! 堕塾鳖壹兰堕丛塑丝蔓兰茎鳖三茎堕垡些 _ _ _ 一 f m a lc o n c e m r a t i o no fo 8p e r c e n t ，t h ef e d - s t a r tt i m e2 4 h , t h ef i n a lc o n c e n t r a t i o n o fs u c r o s e f e e d i n g10p e r c e n t 诧d t i m e4 8 h ；m o s ta p p r o p r i a t ew a y f o rt h ef e e d i n g ：2 4 ha d d i n g0 6 l m e t ，3 s u c r o s e ，i n4 8 hb yo 2p e r c e n t p l u sl - m e t ，s u c r o s ei n4 8 h a n d 7 2 hr e s p e c t i v e l y b y2 5p e r c e n tr e c h a r g e 。i ns u c hc o n d i t i o n ss a m b a t c hp r o d u c t i o n t o t a l e d4 0 4 1e f f l k e yw o r d s ：s a m ：b r e e d i n g ：p r o t o p l a s t ：f e r m e m a t i o np r o c e s s ：f e d b a t c h 1 1 1 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 乃 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究3 _ - 作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同2 1 2 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：嘴日、本 时间：弘略年歹月船日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到：中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信患网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者警嘴心鸯 导师挠祥眵 签名日期：刁眺年，月乃售签名日期：口矿年岁月j 罗日 f 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 s 腺苷甲硫氨酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化 1 前言 s 腺苷甲硫氨n ( s a d e n o s y l - l - m e t h i o n i n e ，简称s a m ) ，化学名称为5 一 ( 3 s ) - 3 氨基3 羧基丙基】甲基( s ) 枫 5 脱氧腺苷，分子式为c 1 5 h 2 2 n 6 0 5 s ，分子量为3 9 9 4 9 ， 是甲硫氨酸( m e t h i o n i n e ，m e t ) 的一种有机四价硫形式的磷酰化合物。其结构于1 9 5 1 年 被阐明( 杨静等，2 0 0 1 a ) 。作为中间代谢物，广泛存在于各种生物体内，参与诸多的 生化反应。在生物体代谢网络中，s a m 的生物合成是由s - 蝴合成酶 e c2 5 1 6 催化 甲硫氨酸( m e t ) 和a t p 反应完成，即来自于a t p 的腺苷部分攻击m e t 的硫原子，生成 高能量、活泼的有机硫化合物( 如图1 ) 。而s 州有( + ) 和( ) 两种构型( 即r ，s s a m 和 s ，s s a m ) ，其中只有( ) s a m ( 即s s s a m ) 才具有生物学活性( 项昱红等，1 9 9 9 a ) 。 h 睇豇+ 胛p 1 - 1 n h 2 “每 啪# v m g 卜k h n h _ _ 。_ - _ _ _ _ - _ - l 图ls a m 的化学合成结构 f i g 1s a m s t r u c t u r eo ft h ec h e m i c a ls y n t h e s i s 1 1s a m 的理化性质 从其化学结构可以看出，它是一种氨基酸衍生物，是l 甲硫氨酸残基通过s c 键与嘌呤核苷相连。在s a m 分子中有四个可解离基团，嘌呤环上的氨基( p i o = 3 4 ) 、 甲硫氨酸残基上的羧基( p k a = 1 8 ) 、氨基( p k a _ 7 8 ) 和硫基( p k a = 1 2 5 ) 。其中硫基具 有很强的极性，带有永久的正电荷。s a m 的等电点为7 2 4 s a m 的重要生理功能在很 大程度上在于其分子结构中含有一个活性甲基和一个高能硫原子( 余志良等，2 0 0 3 ) 。 1 1 1 物理性质 s a m 盐为白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，微溶于甲醇、乙醇，难溶于丙酮， 不溶于乙醚、丁酮( 杨静等，2 0 0 1 h ) 。 1 1 2 化学性质 s a m 及其盐具有热不稳定性，受热易分解，在碱和中性水溶液中易发生消旋、 华中农业大学2 0 0 8 属硕士毕业论文 变性；在酸性条件下相对稳定( 项昱红等，1 9 9 9 b ) 。 1 2s a m 的体内代谢 s a m 是体内重要的代谢中间体，具有转甲基、转硫、转氨丙基等作用，是半胱 氨酸、牛磺酸、谷光甘肽、辅酶a 等重要物质的前体。 谷胱甘肽 孓甲基四氢叶酸 呈 还 蔷旧四ij 泉 氢i 酶 叶 酸i 叶酸 图2s a m 的合成和代谢途径 f i g 2s a ms y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s m 上图2 所示为s 腺苷甲硫氨酸的合成和代谢途径( 孔健等，1 9 9 2 ) ： ( 1 ) 蛋氨酸和a t p 在蛋氨酸腺苷转移酶的催化下生成s a m 。( 2 ) 转甲基反应。( 3 ) s 腺苷高半胱氨酸水解酶催化s 腺苷高半胱氨酸可逆水解生成高半胱氨酸和腺苷。 ( 4 ) 胱硫醚p 合成酶催化高半胱氨酸和丝氨酸反应生成胱硫醚。( 5 ) 胱硫醚在y 胱硫 醚酶的催化下生成半胱氨酸。( 6 ) 7 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化谷氨酸和半胱氨酸 生成1 谷氨酰半胱氨酸，为合成g s h ( 谷胱甘肽) 的速率限制步骤。( 7 ) g s h 合成酶催 化y 谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸反应生成g s h 。( 8 ) 蛋氨酸合成酶在正常浓度的叶酸和 维生素b 1 2 的条件下催化高半胱氨酸重生蛋氨酸。( 9 ) 甜菜碱一高半胱氨酸甲基转移 酶在甜菜碱存在的条件下从高半胱氨酸重生蛋氨酸。( 1 0 ) s a m 脱羧酶催化s a m 羧基 的脱除，使脱羧s a m 进入聚胺合成途径。 2 s 腺苷甲硫氨酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化 1 3s a m 的生物学功能 1 3 1 转甲基作用 s a m 含有活性甲基，是体内最重要的甲基供体( 罗簧星等，2 0 0 6 a ) 。在具有特定 专一性甲基转移酶的存在下，s a m 的甲基就可以转移到硫、氮、碳、氧原子上，参 与体内物质的合成和代谢。许多含氮物质的生物合成都要从s a m 获取甲基，如肌酸、 胆碱、肾上腺素、松果素、肉碱等。当存在特定的专一性转甲基酶时，s a m 的甲基 就可以被转移。甲基转移到磷脂酰乙醇胺上则形成磷脂酰胆碱，转移到胍基乙酸上 则形成肌酸，转移到烟酰胺上则形成甲基烟酰胺等等。s a m 还参与核酸与蛋白质的 甲基化修饰。蛋白质的甲基化修饰主要指蛋白质翻译后的加工修饰，r n a 链上核糖 羟基和碱基的氨基在甲基化时都有s a m 的参与；d n a 的甲基化修饰也越来越受到关 注。d n a 的不正常甲基化能够导致染色体的不稳定，引发基因突变。d n a 甲基化的 位置改变癌症的发生有着密切的关系，转录位点不正常的甲基化影响抗肿瘤基因的 表达。去甲基后，s a m 生成s 腺苷高半胱氨酸( s a i l ) ，s a h 是转甲基化反应的竞争 性抑制剂。 1 3 2 转氨丙基作用 s a m 另一个重要功能是转氨丙基作用。尤其是在多胺的合成中具有重要作用( 王镜 岩等，2 0 0 2 ) 。s a m 经脱羧后生成5 腺苷甲基硫丙胺，将此物质中的氨丙基转移给 腐胺或亚精胺，生成相应的亚精胺和精胺，它们是真核生物中重要的多胺，5 甲基 硫腺苷是副产物。多胺具有镇痛和抗镇静的作用，并参与调节细胞的生长。而5 甲基硫腺苷能够在体内被重新用来生成甲硫氨酸。因此该反应所具有的甲硫氨酸回 补途径能够迅速的去除生成的5 甲基硫腺昔，它能抑制s a h 的水解。一般在在肝移 植和早期肝癌患者中，发现此代谢途径会被诱导强化( 杨静等，2 0 0 1 c ) 。 1 3 3转硫作用 s a m 是半胱氨酸和谷胱甘肽( g s h ) 等含硫化合物的活性前体( 罗簧星等，2 0 0 6 b ) 。 通过转硫作用，s a m 生成半胱氨酸，再经体内代谢，转变成g s h 。g s h 是体内硫储 存库和细胞主要的抗氧化物。在慢性肝病患者中，g s h 水平会下降，其部分原因是 s a m 合成减少。 3 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 1 4 s a m 的制备方法 s a m 的制备方法主要有酶促合成法、化学合成法、发酵法三种( 陈小龙，2 0 0 5 ) 。 1 4 1 酶促转化法 酶促转化法主要是利用s a m 合成酶催化底物l 甲硫氨酸( l m e t ) 和腺苷三磷酸 ( a t p ) 生成( ) 型s a m ，其中s a m 合成酶具有三磷酸酶活性，能使三磷酸分解为焦磷 酸和磷酸，其反应式如下： l m e t + a t p + h 2 0 + e - e s a m p p p i 】： e + s a m + p i + p p i e ：s a m 合成酶p i ：磷酸p p i ：焦磷酸 这种方法生产s a m 具有工艺简便，最终产物累积量高，并且分离提纯容易，反 应周期短和不容易被污染等特点。 s a m 合成酶获取的途径不断增多，方法也不断改进。但是s a m 合成酶在动植物 体内及微生物内含量少，酶活不高，且在分离纯化方面存在一定困难。例立1 4 0 0 9 酵 母干细胞只能分离纯化n 8 9 s a m 合成酶，比活力0 0 5 u m g 。所以，尽管体外酶法产 物的纯度较高，但其成本也高，大规模用此法制备s a m 还受到s a m 合成酶活力的影 响：因此这种方法一般只用于合成同位素标记的s a m 。 当前基因工程技术的发展使获得大量高活力的s a m 合成酶成为可能，因此酶促 转化法合成s a m 有着广阔的发展潜力。 1 4 2 化学合成法 化学合成法是采用s 腺苷同型半胱氨酸和甲基供体( c h 3 i ) 合成，这种方法合成的 s a m 有( + ) 型和( 一) 型两种构型，其中只有( ) 型才具有生物活性。虽然合成产物中只 含有少量( + ) - 型s a m ，但是分离提纯困难，而且s a m 分子极度不稳定，难以满足s a m 工业化生产的要求。 1 4 3 发酵法 发酵法是在培养基中添加诱导物l m e t ，通过微生物在一定条件下发酵，从而在 微生物体内大量累积( - ) - 型s a m 的生产方法，这是目前工业生产s a m 的主要途。目 前发酵s a m 的微生物主要是酵母真菌( 申丽等，2 0 0 4 ) 。 ( s c h l e n k , 1 9 6 5 ) s c h l e n kb f 从富含l m e t 的面包酵母提取s a m ，但产物含量低， 4 s 腺苷甲硫氨酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化 分离纯化困难，没法形成可行的生产工艺。( b e r n ae ta 1 ，2 0 0 2 ) s h i o z a k i 通过筛选3 0 0 多株不同的菌株，分离到一株s a c c h a r o m y c e ss a k ek 6 菌，该菌在1 0 l 发酵罐中培养7 天后的s a m 产量高达1 0 8 9 r l ，菌体生物量达至z j 5 3 9 l 。 发酵过程中决定s a m 产率高低最直接的因素为菌体内累积s a m 的能力，即与生 产菌本身有很大的关系。( s c h l e n ke ta 1 ，1 9 8 6 ) s c h l e n k 等发现c a n d i d u t i t i s ， s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 等几种普通酵母，在相对大量的l 甲硫氨酸存在条件下，酵 母细胞无论生长或不生长都可积累s a m 。 但是发酵法产率不高且生产周期长，从而限制了s a m 的广泛生产和应用。因此， 有关s a m 的大量廉价的制备工艺还有待进一步的研究。 1 5s a m 的失活机理 s 腺苷甲硫氨酸在生产和应用过程中最关键的问题是稳定性差、易发生失活反 应。这在很大程度上限制了它在临床上的应用。因此，人们对其失活机理进行了研 究。结果表明：s a m 的失活反应可按照以下3 种不同的机理进行( 薛学东，2 0 0 6 ) 。 1 5 1s a m 分子内的亲核攻击 这是最主要的失活反应，首先s a m 分子在常温条件下，由于s a m 分子中高能锍 的存在，使相连的c 原子活化，容易受到亲核进攻，硫一碳键断裂，会发生各种降 解及硫原子上的手性异构反应。即分子内的氨基上的羧基氧攻击分子内的1 ，碳原子， 生成5 甲基硫腺苷和高半胱氨酸内酯，形成分子内的环化反应，引起降解失活。 1 5 2 立体异构体消旋化导致的失活 ( s ，s ) s a m 自发消旋反应生成非生物活性的( r ，s ) 一s a m 。s a m 的消旋失活反应， 经过大量研究发现，主要有两个方面的原因：( 1 ) 酶促活性异构体能够自发消旋而 失去活性，但是消旋机理目前尚未阐明。( 2 ) s a m 分子中的锍通过自发消旋而失去手 性，这在简单的锍盐消旋动力学中已被充分阐明。 1 5 3 水解导致的失活 s a m 水解后，主要生成腺嘌呤( a d e n i n ) 和s 一戊糖甲硫氨( s p e n t o s y l m e t h i n e ) ，该 水解反应的机理比较复杂。b o r c h a r d t 对s a m 碱性水解机理进行研究时发现，s a m 5 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 及相关的锍核苷对引起糖苷键快速断裂的碱性条件极其敏感( o s m a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。糖 苷键的断裂起源于一个异常的消除反应。邻近锍中心的碳原子( 5 位置) 上质子去除， 随之消除反应发生，结果糖苷键断裂，形成4 、5 双键。b o r c h a r d t 认为，糖苷键的断 裂可作为消除反应的协同反应发生，或者通过形成能快速分解释放出醛的半缩醛中 间体发生。 1 5 4 其他因素 1 5 4 1 p h 对s a m 稳定性的影响 由于s a m 存在多个可解离基团，其稳定性受p h 的影响较大，研究结果表明：p h 在1 5 以前，裂解反应以相对高的速率进行，此后，在p h1 5 7 5 之间时，消旋反应无 明显变化；p h 为1 5 时，消旋反应是唯一进行的反应。p h 为4 5 时或更低时，水解成 腺嘌吟的反应完全停止：p h 为6 时，强烈抑制水解成腺嘌呤的反应( o t e r o ，1 9 8 9 ) 。 1 5 4 2 温、湿度对s a m 稳定性的影响 研究表明，当温度高于4 0 c 时，s a m 及其盐极易分解失活，在室温下也不稳定， 在低温下相对稳定。h o f f m a n 在用s a h 和c h 3 i 合成s a m 时发现，在1 6 时，在含水 量小于5 的体系中，消旋反应比在3 7 c 体系中要慢8 5 0 i ( c u r e i oe ta l ，1 9 7 8 ) 。 1 6s a m 的稳定性研究 由于s a m 分子的极端不稳定性，即使在常温下也易发生消旋和分解反应，这不 但对分离过程中操作温度、p h 值及操作时间提出了严格的要求，更对制备成s a m 的 稳定性盐产品提出了更高的要求，这使其具有很好商业应用价值。 1 6 1s a m 盐的合成及其稳定性 为了提高s a m 的稳定性，人们制备出许多s a m 的盐，这其中包括s a m 的盐酸盐 和硫酸盐，这两种盐在低温和干燥的条件下，发现其稳定性依然较差，只能用于一 般的生化研究。1 9 7 4 年，s a m 的对甲基苯磺酸盐研制成功，其稳定性比上述两种盐 有较大的提高，并于1 9 7 6 年进入临床试验阶段。随后又研制出其它的s a m 盐及其口 服肠溶片和注射用粉针剂。目前临床上应用的主要是s a m 的1 ，4 丁二磺酸盐，其稳 定性比s a m 的对甲基苯磺酸盐有了进一步提高。而最近报道，d e s h p m a d e 等研究出 s a m 的4 ，6 苯磺酸盐、s a m 的3 ，5 二硫酸盐及s a m 的2 ，4 ，6 三硫酸盐，其稳定 6 s 腺苷甲硫氨酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化 性即使在不断升温的的环境下也有了很大的提高( o t e r oe ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 s a m 盐稳定性的关键取决于分子中阴离子的性质，增加阴离子的立体障碍可以 提高s a m 盐的稳定性，这是因为大分子量的阴离子通过静电作用与s a m 结合，利用 其空间位阻可以限制s a m 分子中氨基酸链的自由旋转，从而使s a m 的稳定性得到提 高( c i m i n oe ta 1 ，1 9 8 4 ) 。 基于对s a m 失活机理的深入认识，人们提出了s a m 稳定化理论，在此基础上 成功研制了一系列新型多聚阴离子形式的稳定性s a m 盐，如聚乙烯磺酸硫酸盐、聚 乙烯磺酸磷酸盐、聚苯乙烯磺酸盐。按照其溶解性，可分为两大类：水溶性聚阴离 子s a m 盐和脂溶性多阴离子s a m 盐。水溶性聚阴离子s a m 盐具有高度稳定性。通过 与s a m 盐酸盐、s a m 对甲苯磺酸硫酸盐的热稳定性比较实验发现，固态聚阴离子 s a m 盐在4 5 时，能长期稳定存在，而在7 5 时的稳定性却各不相同，但它们在7 5 时的稳定性均远远高于s a m 盐酸盐和s 川对甲苯磺酸硫酸盐( m u c c i o l ie t a l ，1 9 9 2 ) 。 1 7 s a m 的药理作用 1 7 1 抑郁症 早在1 9 7 3 年的研究就己表明，s a m 具有抗抑郁效果，目前已经成功应用于临床 治疗抑郁病( m o r r i s o ne t a l ，1 9 9 6 ) 。同时，b r e s s a p f i ：做的研究表明，s a m 在抗抑郁方 面较安慰剂和三环类抗抑郁剂效果更加明显，与抗抑郁药物丙咪嗪、氯丙咪嗪等相 比，有较小的副作用。 s a m 具有抗抑郁效果的机理目前还不很明确，但大量临床研究表明，一种机理 可能是s a m 对一元胺的代谢转化具有刺激作用( g a l a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。与此报道相一致 的大白鼠试验表明，s a m 能提高脑内去肾上腺甲素和血清素的浓度；s a m 还可以提 高人类的5 羟吲哚酸的浓度。另一种机理可能是s a m 参与与磷脂的合成，提高细胞 膜的流动性，包括神经细胞的生物合成，可以调节中枢神经系统，对抗抑郁有显著 效果。 s a m 可以提高脑内5 羟色胺和5 羟吲哚乙酸的水平，对各种抑郁症，尤其是产 后抑郁症有疗效。与其它抗抑郁症相比，s a m 具有见效快、无成瘾性、无不良反应、 耐受性好等优点。l 瞄床研究中，采用h a m i l t o n 抑郁量表( h r s d ) 以及其它的抑郁量表 对给药前后迟滞抑郁、躯体症状、睡眠、自杀及体重等因子进行评分来评估该药的 7 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 抗抑郁作用( m o r r i s o ne t a l ，1 9 9 6 ) 。口服或注射给药第四天，评分值就显著下降，第 二周已较起始时下降了5 2 。s a m 疗效与中、低剂量三环类抗抑郁药相当。而与其 它抗抑郁药不同，s a m 抗抑郁作用无剂量相关性，起效快，几乎无不良反应，耐受 性好。临床中还发现，s a m 与标准抗抑郁药，如米安巴林、氯丙咪嗦、丙咪嗦、去 甲基咪嗦等联合用药比单独用药起效快。 1 7 2 肝病 s a m 在治疗肝病中的应用肝脏是s a m 合成和甲基化的主要场所，如果肝脏受 到损伤，肝病患者的s a m 合成被阻断，蛋白质和核酸的合成、聚胺和半胱氨酸的供 给都会受到限制。半胱氨酸是一种重要的肝脏保护剂谷胱甘肽的合成前体。临床研 究证明，注射和口服s a m 可以有效提高血液和肝组织中谷胱甘肽的含量，从而提高 肝脏的解毒作用，可以减轻甚至消除肝脏损伤，s a m 对胆汁淤积、酒精造成的肝 损伤包括肝硬化及其它一些肝功能紊乱都有疗效，尤其对肝硬化有较好的临床效果， 可以显著降低其死亡率( s c h l e n ka n dd a i n k o ，1 9 8 2 ) 。大量临床研究证明，s a m 对各 种原因引起的肝功能异常有良好疗效( n i t s c he ta l ，1 9 9 2 ) 。到目前为止，s a m 临床研 究包括各种原因引起的慢性肝炎、原发胆汁性肝硬化、药物性胆汁淤积、妊娠性胆 汁淤积等。给酒精性肝硬化患者使用s a m 后，肝脏中谷胱苷肽含量升高，血浆半胱 氨酸、甲硫氨酸水平下降，组织切片表明在组织水平有明显改善。s a m 也对药物性 胆汁淤积( 如雌激素、扑热息痛等) 、妊娠性胆汁淤积、慢性肝病性胆汁淤积有效， 患者血清转氨酶、总胆酸、胆汁胆固醇饱和指数恢复正常。并可缓解胆汁淤积造成 的痉痒、疲劳等症状。s a m 可使慢性铅中毒患者临床症状、生化指标明显改善。对 g i l b e r t 。s 综合症( 一种家族性胆红素代谢缺陷) 亦有一定疗效，用药者非结合胆红素及 总胆红素含量降低，尿液中d 葡萄糖二酸含量升高( v e t t e r , 1 9 8 7 ) 。 1 7 3 关节炎 约2 2 ，0 0 0 多名关节炎患者接受s a m 治疗，两周后症状就能得到改善( c u e n o de t a l ，1 9 9 5 ) 。一项双盲试验结果表明，s a m 与酮洛芬疗效相当，两者联合用药能增强 和延长酮洛芬的作用。研究还表明，1 0 0 m g 的s a m 与7 5 0 r n g 萘普生，2 0 r a g 炎痛息康， 1 5 0 m g 消炎痛，1 2 0 0 m g 布洛芬作用相当。s a m 与非类固醇类抗炎药相比，既不抑制 前列腺素合成，也不会损伤胃肠道( f a z i oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 s 腺苷甲硫氨酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化 1 7 4 纤维性肌痛、偏头痛 原发纤维性肌痛是一种慢性非关节性风湿病，症状为全身多处疼痛、僵直，通 常还伴有抑郁症、疑病症、偏执狂等。肌注s a m ( 2 0 0r a g d ) 2 1 天后，患者疼痛感位 点数量减少，根据h a m i l t o n 抑郁量表进行的评分值降f 氐( i - i o f f m a n , 1 9 8 6 ) 。另一项s a m 口服临床研究表明，患者服药后疼痛、不良清绪、躯体僵直等症状得到改善 ( f r i e d e l 19 8 9 ) 。 1 7 5 神经紊乱 多项研究表明：神经紊乱的病因在于中枢神经系统甲基基团的供应不足，同时 神经紊乱病人大脑的许多不同区域和脊髓质中发现s a m 浓度的减少。此外，神经紊 乱病病人大脑组织尸检后发现卵磷脂的浓度也减少。而在早期的神经紊乱病病人中， 用核磁共振分光镜观察到依赖与s a m 新陈代谢产生的磷脂酶浓度发生很大的变化 ( s c h l e n ka n dd a i n k o ，19 6 2 ) 。 有研究表明，血液中半胱氨酸浓度的升高，可以作为叶酸缺少、维生素b 1 2 缺少 和甲基过程消弱的一个信号，这些对神经紊乱病病人来说都是一个危险信号。此时， 通过应用s a m 或其它甲基供体( 如三甲铵乙内酯或叶酸和维生素b 1 2 ) ，能够恢复甲基 基团和使血液中半胱氨酸浓度正常化( b r e s s a ，1 9 9 4 ) 。 1 7 6 其它 给阿尔茨海默病患者静注s a m ( 2 0 0m g d ) ，连续1 5 天后，其活动、注意力、情 绪显著改善，但认知功能的改善不明显( b r o w ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。给癫疾患者静注s a m ( 2 0 0 r a g d ) 8 1 4 天后，患者情绪、警觉性、活动明显改善。目前s a m 的临床研究还涉及到 脑缺血及爱滋病并发症之类的疾病。研究还发现，血浆中同型半胱氨酸的升高是血 管疾病的危险信号，且冠状动脉疾病患者血浆腺苷蛋氨酸含量低于正常水平 ( b o r e h a r d t ，1 9 9 9 ) 。给健康志愿者口服腺苷蛋氨酸肠溶片以后，受试者血浆5 一甲基四 氢叶酸( 5 m t h f ) 水平升高，5 m t h f 能使同型半胱氨酸重新甲基化生成甲硫氨酸， 增强同型半胱氨酸的代谢，可用于预防血管疾病。 9 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 1 8s a m 的临床应用 s a m 作为既有治疗疾病药物作用，又有食品营养强化作用的天然物质，颇有应 用前景( 陶敏和干信，2 0 0 5 a ) 。早在7 0 年代末，s a m 作为临床处方药就己出现在欧洲 医药市场上。当时是用作治疗关节炎的抗炎止痛药物。国外抗炎药物品种极多，而 s a m 并未占有什么优势。8 0 年代中期，s a m 在欧洲被推荐为抗忧郁症的精神病药物 ( 景沛，1 9 9 5 ) 。1 9 9 0 年在美国通过了f d a 的随机双盲法验证。1 9 9 9 年，美国f d a 正 式批准其上市，迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过十亿美元。近年来， 国外临床己转向对肝脏疾患的治疗。s a m 在人体内是由肝脏细胞合成的，而肝脏又 是s a m 发挥其生物学作用的主要场所。在肝细胞功能有障碍时，必然会损伤到s a m 的生物合成和代谢作用，因此，s a m 应该是肝病治疗的理想药物。据报道，s a m 不 仅有利于各种急、慢性肝病的治疗，而且对实验性动物早期肝癌也有预防作用 ( m a r t i n o ve ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 s 心有着巨大的国际市场需求。据国际卫生组织有关的报道：目前，全球每年 用在治疗肝病和帕金森氏等病的s a m 大约需要4 5 0 5 0 0 吨左右。s a m 在国内的市场 也非常广阔。我国是肝炎流行的大国，而我国目前尚无一种能真正改善肝细胞代谢 的生化药物。 目前，s a m 在国内的应用主要是用于医疗用途，最常见的药品“思美泰”，其有效 成份为s a m 的稳定性盐s 腺苷l 甲硫氨酸1 ，4 - 丁烷二硫酸，为意大利b i o r e s e a r c h 公司和德国基诺药厂生产，有口服肠溶制剂和针粉剂两种( 陶敏和干信，2 0 0 5 b ) 。这 两个外资公司的产品，价格昂贵，不能普及使用，远远满足不了社会需求。而过去 数年s a m 国际市场呈现迅速增长趋势，如果s a m 的药用和医疗保健价值在中国得 到进一步认可，国s a m 市场至少是目前的1 0 0 倍。而目前国内s a m 生产尚属空 白。因此，s 州临床推广应用的关键是，首先利用物理化学、生物等各种诱变选育 手段获得稳定高产的菌株，然后在此基础上解决大量而价廉的s a m 生产工艺。上个 世纪八十年代起，我国就开始研究，但因发酵水平低、分离纯化成本过高，至今未 能实现工业化。国内开发高产价廉的s a m 生产工艺显得极为迫切。这也是提高我国 国际竞争力的重要内容，同时也可为我国创造巨大的经济利润和社会效益。 1 0 s 腺苷甲硫氨酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化 1 9s a m 产生菌的诱变育种 1 9 2 7 年，m u l l e r 发现x 射线能诱发果蝇基因突变，从此开创了诱变育种技术的先 河( s h o z o se ta 1 ，1 9 8 6 ) 。经过近一个世纪的不断发展和完善，诱变育种尤其是物理诱 变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为常用和最有效的技术之一。物理诱变 是使用辐射中的各种射线为诱变源( 包括紫外线、x 射线、丫射线、快中子、微波、超 声波、电磁波、激光和宇宙射线等) ，对生物靶进行诱变。另外还包括化学诱变( 如： n t g 、e m s ) 、分子生物学等方法。这些诱变技术设备简单、操作方便，利用这些 诱变源进行单一或复合诱变，已得到了大量的高产工业微生物菌株。 a l d b e r g 是最先发现结构类似物抗性株可以积累相应的氨基酸的，此后通过筛选 抗结构类似物突变株以获得氨基酸高产菌株的方法得到了广泛的应用( d i n - w i s ha n d t o u r i g n y ，1 9 6 6 ) 。张玉臻以分离于苹果渣的丝孢酵母s t 8 5 1 菌株为原始菌株，经u v 多 次诱变及在含乙硫氨酸( 甲硫氨酸的结构类似物) 双层平板及缺硫、限硫梯度平板上 有效筛选，获得了菌体甲硫氨酸含量能大幅度提高的抗乙硫