（农药学专业论文）阿维菌素系列手性固定相的制备及应用研究.pdf

摘要 研究和开发普适性强、柱容量高、柱性能稳定的理想手性固定相一直是色谱工作者孜孜以求 的目标。新手性固定相的开发应该包括以下步骤：新的手性选择子的选择一一固定化一一被分离 物质的筛选一一手性识别机理的研究。本论文围绕着全新的高效液相色谱手性固定相的开发，根 据上述步骤展开，完成了以下工作： 本文率先将农用抗生素引入手性固定相合成工作当中，首次将三种结构相似的农用抗生素： 阿维菌素、伊维菌素和甲氨基阿维菌素键合到硅胶表面，制备出一系列全新的高效液相色谱手性 固定相，并考察了其在不同色谱模式下对对映异构体的拆分情况，实验结果表明，阿维菌素系列 手性固定相对三唑类化合物有着较好的手性分离效果。目前这部分工作已经申请了专利保护。 经过优化后的固定相制各条件为：取干燥的阿维菌素系列化合物3 0 9 置于2 5 0 r a l 圆底三颈 烧瓶中，加入1 0 0 m l 干燥吡啶，搅拌5 m i n ，然后滴加0 5 m l ( 3 异氰酸酯基丙基) 三乙氧基硅 烷，氨气保护下7 0 * ( 2 反应1 h ，冷至室温后，加入3 0 9 经酸处理活化过的硅胶，氮气保护下于7 0 继续搅拌反应1 2 h ，过滤依次用吡啶、d m f 、甲醇、水、丙酮洗涤数次，6 0 1 2 真空干燥过夜。 称取上述手性固定相3 5 9 ，咀四氯化碳为匀浆液，以无水乙醇为顶替液，在6 0 m p a 压力f 将固定 相装入不锈钢柱( 2 5 0 m i n x 4 6 m mi d ) 中即可得到阿维菌素系列高效液相色谱手性柱。 本文的另一部分首次将圆二色检测器和基于二元检测器的解卷积方法应用于新手性固定相 合成的后期工作当中，成功解决了被分离物质筛选的难题，降低手性分离判断对色谱条件的依赖 性，减少了色谱条件优化所需要的时间，大大缩短了筛选时间。在手性固定相合成的开始阶段， 由于合成路线、方法等的选择不完全合理，会造成所制备的手性色谱柱柱效低，对手性化合物的 分离度低；而且由于被分离对象有限及色谱条件选择等方面的原因，分离对象在所制备的手性固 定相上未必可以得到很好的分离这时如果我们使用非手性检测器，由于色谱峰的重叠将会很难 判断对映体是否分离很有可能在手性固定相合成的筛选阶段就将这种手性选择子排除。使用高 效液相色谱圆二色检测器将可以在很大程度上避免这种情况的发生，即使在分离因子n 接近1 o o 的情况下，使用高效液相色谱圆二色检测器也可以很清楚的看到对映体的分离。但是这时我们还 缺少保留时间、分离因子等关键数据，使用解卷积方法可以使原本重叠的色谱峰分离，并得出诸 如保留时间、分离因子、峰面积等的准确数据，这样就可以更好的评价新手性固定相的性能，进 一步优化其合成方法及色谱分离条件。 文献报道的解卷积方法需要分步处理，然后得出解方程的所必需常数。最后解出最终结果， 步骤繁琐，实现困难。本文在参考了文献方法后。建立了全新的解卷积方法；此方法相对文献方 法更简单，并且减少了人为因素在计算过程中的干扰；率先公开了根据方法所编写了程序，实现 了对实际样本图谱处理的自动化；最后将此方法实际应用于评价已合成的阿维菌素系列手性固定 相。这种应用是一次大胆的尝试希望为这方面研究工作的进一步开展和完善提供良好的基础和 契机。 关键词：大环抗生素，阿维菌素，手性固定相，手性分离，圆二色检测器，解卷积 a b s t r a c t r e c e n t l y , i th a sb e e naf o c u so f m s e a m hi nc h i r a ls e p e r a t i o nf i e l dt ot a k em a c r o c y c l i ea n t i b i o t i c sa s c h i m ls e l e c t o r m e a n w h i l e ，m a c r o e y c l i ca n t i b i o t i c s - b a s e dc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s h a v eb e e na t t r a c t i n g m o r ea t t e n t i o ni n c r e a s l yf o ri t sb r o a da p p l i c a t i o nf i e l dw i t hh i g hl o a d a b i l i t y , r o b u s m e s sa n ds t a b i l i t ye t c a d v a n t a g e s t h i st h e s i st a k e st h el e a di ni n t r o d u c i n ga g r i c u l t u r ea n t i b i o t i c st oc s p sa n dp r e p a r e so n e s e i m so fn o v e l t yh p l cc s p sw i t hb o n d i n gt h r e er e l a t e ds t r u c t u r e sa g r i c u l t u r ea n t i b i o t i c s ( a b a m e c t i n ， i v e r m e c t i na n de m a m e c t m ) o n t os i l i c a l g e l ，a tt h es a m et i m e , t a k e s t h er e s e a r c ho ft h ec h i r a l c o m p o u n d su n d e rd i f f e r e n tc h r o m a t o g r a p h i cm o d e sa n dd i s c u s s e st h ep o s s i b l em e c h a n i s m so fc h i r a l d i s c r i m i n a t i o ns i m p l y t h ea b o v ep o r t i o nh a sb e e na p p l i e df o rp a t e n tp r o t e c t i o n t h ef o l l o w i n gi st h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n s a v e r m e c t i n s ( 3 0g ) w a sd f i e da t6 0 0 cf o r1 2hu n d e r v a c u u m ， a n dt h e nd i s s o l v e di n d r yp y n d i n e ( 1 0 0m l ) ， s t i l t e df o r5 r a i n ， 3 - i s o c y a n a t o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( 0 2m l ) w a ss l o w l ya d d e du n d e ran i t r o g e na t m o s p h e r e ，a n dt h e m i x t u r ew a sh e a t e dt o7 0 。cf o rlh 谢l l lc o n t i n u o u ss t i r r i n g + a f t e rc o o l i n gt or o o mt e m p e r a t u r e ，3 0 9 a c i d - t r e a t e da n dd r i e du l l r n o d i f i e ds d h e r i c a ls i l i c aw a sa d d e da n dt h em i x t u r ew a sh e a t e dt o7 0 。cf o r1 2 hw i t hc o n t i n u o u ss t i r r i n gu n d e ran i t r o g e na t m o s p h e r e t h em i x t u r ew a sc o o l e dt or o o mt e m p e r a t u r e , f i l t e r e d a n dt h er e s i d u ew a sw a s h e ds e v e r a lt i m e sw i t l lp y r i d i n e ，d m f , w a t e r , m e t h a n o l ，a c o t o n i t r i l e , a n da c e t o n e ，a n dt h e n “e du n d e rv a c u u ma t6 0 0 cf o r1 2h t h ea v e r m e c t i n s - m o d i f i e ds i l i c ag e l ( 3 0g ) w a sp a c k e di n t oas t a i n l e s ss t e e lh p l cc o l u m n ( 2 5 0 x 4 6m mi d 1b yt h ef l o wo fa b s o l u t ea l c o h o la t 5 o 1 0 7 p ap r e s s u r e t h i se x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec s p sm a d et h eb o r e rc h r i a ls e p a r a t i o n e f f e c t i o no f t r i a z o l e sc o m p o u n d s i t st h ef i r s tt i m et h a tb o t ht h ec i r c u l a rd i e h r o i s md e t e c t o ra n dt h ed e c o n v o l u t i o nb a s e do n d u a l - d e t e c t o ra r eu s e dt op r e p a r ea n dd e t e c tt h ec h i r a ls e p a r a t i o na b i l i t yo f n e we h i r a ls t a t i o n a r yp h r a s e b yt h e s et e c h n i q u e s ，t h es u i t a b l es a m p l ew i l lb ed i s c o v e r e dm o r ee a s i l y q u i c k l y a tt h eb e g i n n i n go f c s p sp r e p a r a t i o n , t h ec o l u m ne f f i c i e n c yw i l ln o tb eg o o da se x p e c t a t i o n ，f o rm a n yr e a s o n s ，s u c hn s ：t h e l o wc o l u m ne f f i c i e n c y , u n s u i t a b l es a m p l e sa n di n c o r r e c tc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o ne t c w i l ll e a dt ot h e l o wr e s o l u t i o na b i l i t yt oc h i r a ls a m p l e s f o rt h a tc a s e ，l o t so f t i m ew i l lb es p e n ti ns a m p l e st e s t i n g ，e v e n t h o u i g ht h e s ec h i r a ls e l e c t o i sw e r ea b a n d o n e d b u tt ot h ea p p l i c a t i o no f c i m u l a t o rd i c h r o i s md e t e c t o r , t h e s e p a r a t i o no fc h i r a ls a m p l e sw i l lb eo b v i o u sa n dw ew i l la v o i dm a n yw r o n gj u d g m e n t s b u tt h em o r e u s e f u ld a t a ，s u c ha sr e n t e n t i o nt i m ea n ds e p a r a t i o nf a c t o rc a nn o tb ed e t e r m i n e db ys i n g l ec h r o m a t o g r a m o ne i r c u l a rd i c h m i s md e t e c t o ro nu vd e t e c t o r t h em a x i m u ma n dm i n i m u mv a l u c sr e l a t e dt or e n t e n t i o n t i m e so fe n a n t i o m e mi nas a m p l e s ot h ed e c o n v o l u s t i o nb yc o m p u t e ri st h es i n g l eo fe n a n t i o m e r c o m p o u n d i tc a nb ee a s i l ys i m u l a t e da su vs i g n a l so rc ds i g n a l sb yt h em e t h o do fd e c o n v o l u t i o nb y c o m p u t e r t h eu s e f u ld a t ac a nb ec a l c u l a t e dc o r m e t l y , w h i c hm u s tb eh e l p f u li ns u b j e c t i v ea s s e s s m e n to f an e wa c c u r a c yc s pi nt h ef o l l o w i n gw o r k t h ed e t a i l e dm e t h o do fd e c o n v o l u t i o ni nd o c u m e n t sc o n t a i n st w os t e p s w h i c ha 1 et h ec a l c u l a t i o n o fg - f a c t o rt oe a c he n a n t i o m e r a tf i r s t ，a n dt h ec a l c u l a t i n gr e s u l t s ( u vs i g n a l so rc ds i g n a l s ) b a s e do n i i 中国农业大学博士学位论文 摘 要 g - f e c t o r a n dt h ef i r s ts t e ps h o u l db em a n u a lt r e a t m e n t 。a n ds e p a r a t e df r o mt h en e x ts t e p i nt h i st h e s i s ，a n b f wa r i t h m e t i ci sd c w e l o p e da n da p p l i e di nd e c o n v o l u t i o nt oc h r o m a t o g r a m m e a n w h i l e ，t h ep r o g r a m b a s e do n 山i sm e t h o di se a s i e rt h a nt h er e p o t t e do n e i tc a nc a l c u l a t ea l lt h ef a c t o r sb yi t s e l f s ot h a tl e s s a f f e c t sf o r mh u m a nf a c t o r si si n t r o d u c e di nt h ew h o l ep r o g r a ma u t o m a t i c a l l ya n di n t e l l i g e n t l y a tt h e e n do ft h i st h e s i s ，t h en e wp r o g r a mw a sa p p l i e di nd e c o n v o l u t i o nt ot h et r u ec h r o m a t o g r a m ，a n dt h e r e s u l t sa r eu s e di na s s e s s m e f f l to f t h en e ws t a t i o n a r yp h r s s e s t h i st h e s i si st h eb o l dt r yo ft h ec i r c u l a rd i c h r o i s md e t e c t o ra n dt h ed c c o n v o l u t i o nb a s e do l i d u a l - d e t e c t o rt op t a p a l ea n dd e t e c tt h ee h i r a ls e p a r a t i o na b i l i t yo f n e wc h i r a ls t a t i o n a r yp h r a s e h e r e ，w e h o p ed oc e r t a i nd e e p - g o i n gr e s e a r c hf o rt h i sd i r e c t i o ni nt h i sf i l e da n do f f e rg o o db a s e o p p o r t u n i t y c o m p a r i n gw i t l lt h et r a d i t i o n a lw o r k , i tw i l ln o to n l yr o ：h c ew o r k l o a dg r e a t l ya n di m p r o v e sw o r k e f f i c i e n c y , b u ta l s os o m ep r o b l e m sw i l l lf i x e dc h a r a c t e rc a l lb eq u a n t i t a t i v e , f i n a l l ya f f o r dm o r ea c c u r a c y r e f e r w n c ea n de v i d e n c e k e y w o r d s ：m a c r o c y c l i ca n t i b i o t i c s ，a v e r m e c t i n s ，c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p s ) ，c h i r a ls e p a r a t i o n ， c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) ，d e c o n v o l u t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：男7 ( 、澎 时间： 一f 年，月8 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：野，弘礁 时间：年月僧日 导师签名：胁毒时间：a 一石年占月，矿日 第一章绪论 1 1 手性的概念及实现手眭分离的方法 1 1 1 手性的概念 物质与其镜像不能重叠的性质称为手性( c h i r a l i t y ) 。手性是自然界的普遍现象，手性所能描 述的事物极其多样，大至星系旋臂、行星自转、大气气旋，小到矿物晶体、有机分子、安培电流、 弱相互作 l j 的宇称不守恒等等。在化学领域，两种互为镜像关系而又不能重叠的分子称为对映异 构体( e n a n t i o m e r s ) ，简称对映体。手性是目前化学领域研究的热点，2 0 0 t 年的诺贝尔化学奖就 授予了研究“手性”问题的杰出学者。 化台物的手性与空间结构有关，因为化合物分子的排列是三维的。有时候，写在纸面上看起 来相同的分子结构实际上并不相同。例如，图1 - 1 中表示乳酸分子的结构式( i ) 和( i i ) 虽然连 接在中心碳原子上的4 个基团即h ，- c o o h ，o h 和- c h 3 都一样，但它们却是不同的化合物。 它们之间的关系如同右手和左手之间的关系一样，互为对映体。它们之间的区别仅在于这四个基 团在空间具有两种并只有两种不同的排列次序，这两个分子因此具有不同的构型a o h k c o o h h 。、c h 3 ( i ) o h h o o c 、土 ，o w h 3 c 1 图卜1 乳酸的分子结构 通常认为，对于一对对映异构体来讲，除了各自的旋光方向相反、强度相等外，其他物理性 质应该相同，这也就造成了所构成的外消旋体的物理性质完全相同。但是实际情况并不完全一样， 对映异构体分子之间存在着相互作用的影响，而这种影响在稀溶液和气相的情况下可以忽略不 计，但在固态、纯溶液、浓溶液的情况下，这种影响还是比较大的。特别是在f 司态条件下，由于 晶态外消旋体分子之间亲和力的影响，造成了以下一些特殊的情况。 ( 1 ) 外消旋混合物；外消旋混合物( r a c e m i cm i x t u r e ) 又称为聚集体( c o n g l o m e r a t e ) 指两 个相反构型纯异构体晶体的混合物，在结晶过程中外消旋物的两个异构体分别各自聚结、自发地 从溶液中以纯结晶的形式析出。产生的主要原因是由于两个不同构型对映异构分子之间的亲和力 小于同构型分子之间的亲和力，结晶时只要其中一个构型的分子析出结晶，在它的上面就会有与 之相同构型的结晶增长上去，分别长成各自构型的晶体。形成等量的、两种相反构型晶体的混合 物。这种聚集体也具有不对称的习性，各自的结晶体都呈现互为镜像关系。外消旋混合物的性质 和一般混合物的性质相似，其熔点低于单一纯对映异构体，溶解度大于单一纯对映异构体 ( 2 ) 外消旋化合物：外消旋化合物( r a c e m i cc o m p o u n d ) 指两种对映异构体以等量的形式共 同存在于晶格中，形成均一的结晶。产生的主要原因是由于两个不同构型对映异构分子之间的亲 和力大于同构型分子之间的亲和力，结晶时两个不同构型对映异构分子等量析出共存于同一晶 格中。由于分子间的相互作用增强，其熔点常比纯的对映体高，有尖锐的熔点。外消旋化台物的 其他物理性质也与组成它的纯对映体的物理性质不同，其熔点处于熔点曲线的最高点，当向外消 旋化合物中加入一些纯的对映体时，会引起熔点的下降。固态的红外光谱也显示差异。 ( 3 ) 假外消旋体：假外消旋体( p s e u d or a c e m a t e ) 是外消旋化合物的一种特殊情况。在假外 消旋体中两种对映异构体以非等量的形式存在晶格中，形成的是一种固体溶液，也称为外消旋固 体溶液。产生的主要原因是由于同构型分子之间与相反构型分子之间的亲和力差别不大，结晶时 两种构型的分子以任意比例相互混杂析出。其熔点曲线是凸形或凹形的，理想的情况下是一条直 线。假外消旋体的物理性质与纯对映异构体基本相同。但在实际应用过程中，假外消旋体的情况 是比较少见的。 区分外消旋化合物、外消旋混合物和假外消旋体的常用方法有：红外光谱法( i r ) 、粉末x 射线衍射法( x r d ) 和差热分析法( d s c ) 。由于外消旋化合物是两种对映异构体以等量的形式 共同存在晶格中，因此其红外光谱、x r d 谱、d s c 谱与纯对映异构体相比都有较大的差别；而 外消旋混合物的晶格中只含有一个构型的分子，其红外光谱、x r d 谱、d s c 谱与纯对映异构体 无显著差异。特别是外消旋化合物的d s c 谱中，熔化潜热几乎是单一对映异构体的2 倍。 利用溶解度曲线和熔点也可以区分外消旋化台物、外消旋混合物和假外消旋体。当将外消旋 体和任一纯对映异构体混合时，由于外消旋混合物具有混合物的性质，混合后的熔点会升高；而 外消旋化台物混合后的熔点会降低；假外消旋体的混合熔点则没有显著变化。这是由于外消旋混 合物具有混台物的特点，而假外消旋体属于外消旋固体溶液的缘故。 在外消旋化合物、外消旋混合物和假外消旋体各自的饱和溶液中，加入任一纯对映异构体结 晶后，对外消旋混合物和假外消旋体溶液，结晶不溶解；而外消旋化合物的饱和溶液中结晶会溶 解，并产生旋光。这是由于外消旋混合物和假外消旋体的饱和溶液中，任一种纯对映体都已经处 于饱和状态，故结晶不再溶解。 1 1 2 手性药物的生理活性差异 在自然界，特别是在生物体中，手性化合物的两个对映体的存在量是不同的，有的仅是以单 一的对映体存在。例如，构成蛋白质的氨基酸都是l 氨基酸，而组成多糖和核酸的单糖则是d 单糖。许多其他天然存在的手性小分子也主要以对映体中的一种存在。这种现象，称为手性优择 ( c h i r a l p r e f e r e n c e ) 。手性优择是一种自然界的属性，但产生这种属性的确切机理、起源和过程仍 是个未解之谜，是当今科学研究的重要课题之一。很有可能，在地球的漫长演化历史中，由于某 些不对称的物理和化学因素的影响，在生产的手性有机化合物分子的两个对映体中，一个对映体 多于另一个；或是仅一个对映体存在，另一个对映体则不存在。手性优择使得作为生命活动重要 基础物质的生物大分子或其组成单元如核酸、蛋白质、酶、多糖等以及分子机器如受体、离子通 道等具有不对称的性质，以使得酶只催化特定手性底物的反应，受体仅与特定手性的小分子化合 物结合等。手性的两个对映体分子与生物大分子的选择性作用可以比较形象地用手与手套的关系 来比喻；左手能左手套，而右手与左手手套就不匹配，该现象可称为手性识别。二十世纪六十年 代在欧洲引起恐慌的“沙立度胺( t h a l i d o m i d e ) 悲剧”就是一个突出的例子。外消旋药物沙立度 胺又称“反应停”，可以用于治疗孕妇呕吐，但是它的使用却导致了上万名畸形婴儿的出生。后 来的研究才证实只有其( r ) 体才具有镇静作用，而( s ) 体则可导致胎儿畸形。表1 1 列出了 一些手性药物对映体的不同生理活性。 表i i 一些手性药物对映体的生理活性差异 在美国医药药物名称词典所列出的2 0 5 0 种药物中大约有一半药物分子中至少包含一个手 性中心，有4 0 0 多种药物以外消体或非对映异构体的形式服用，限于分离测定技术上的困难，其 中大部分对映体的疗效及对哺乳动物的毒性、体内的吸收、代谢等方面的差别远未被深入研究。 基于己发现的药物对映体生物活性的显著差别和产生的严重后果，1 9 9 2 年3 月，美国食品药物管 理局( f d a ) 作出手性药物的指导原则：一个含手性因素的化学药物，必须说明其两个对映体在 体内各自的生理活性、药理作用和代谢过程，以及考虑单一对映体的问鹿口】。 对农药而言，外消旋混合物中可能一种异构体具有良好的生物活性，而其对映体是低效或无 效的，甚至会产生药害。表1 2 列出了一些农药对映体的不同生理活性。只包含单一异构体的手 性农药具有药效高、对作物与生态环境更安全等特点，愈来愈受至1 人们的重视，已成为2 l 世纪 农药发展的重要方向。而外消旋农药，因其含有无效或低效的对映异构体，不仅会降低药效。而 且会污染环境。降低农产品质量。还可能导致药害或抗药性的产生。例如，丙烯菊酯( a l l e t h r i n ) 是第一个人工合成并投入工业化生产的拟除虫菊酯类杀虫剂品种一，它的化学结构中有3 个手性 碳，共有8 个光学异构体。研究表明，这些异构体之间杀虫活性差异甚大，其中以( + ) 反式酸 一( s ) 醇构型的活性最高，而其对映体活性最低，相差近2 0 0 倍；而且各异构体间存在着拮抗性， 使混合体中的高效体不能充分显示其活性【1 2 1 。 袁l 一2 一些手性农药对陂俸的生理活性差异 因此，提供药效高、毒副作用小的光学纯药物已成为现代药学研究的重要内容，与此相关的 对映体分离、分析研究具有重要的现实意义，也是追在眉睫，急需解决的关键问题。 1 1 3 实现手性分离的方法 自从1 8 4 8 年巴斯德( p a s t e u r ，l ) 借助显微镜首次实现了外消旋酒石酸钠铵盐对映体的分 离以来。外消旋体的拆分作为提供光学纯物质的重要途径，在生命科学、功能材料等许多领域得 到了越来越广泛的应用。但对映体之问除了使平面偏振光旋转的方向相反而外，在非手性条件下， 其它的物理、化学性质都相同，因而不能利用一般的理化方法( 如蒸馏、萃取等) 方便地得到分 离。目前实现手性分离的方法归结起来主要有：结晶法、化学拆分法、生物( 酶) 拆分法、色谱 拆分法等。 结晶法：直接结晶法是将外消旋混合物从溶液中结晶析出依据两种对映体结晶形态的差别。 从结晶物中进行手工分离。这一方法耗时费力，仅能应用于实验室研究。在晶体中，分子的空间 取向和排列是有序的、相对同定的。同种分子之间的晶问力与该分子和其对映体之间的晶间力是 不同的。播种结晶法是在外消旋混合物的热饱和溶液中加入一种纯对映体品种，将附着在播入品 种上的同种对映体析出的分步结晶分离方法。这种方法工艺简单、成本低，但应用面有限。 化学拆分法：如果外消旋分子含有活性官能团，能与某种纯手性物质( 手性试剂) 反应，形 成非对映异构体，从热力学的观点来看，可利用非对映异构体之间的物理、化学性质的差异进行 分离，而后再将衍生物还原为纯对映体，从而实现外消旋体的拆分，这就是化学拆分法。大部分 化学拆分法过程冗长，产率通常不高，对映体光学纯度也不高，适用的化合物类型不太多。 生物( 酶) 拆分法；生物拆分法主要是利用酶对光活性异构体有选择性地进行酶解作用，使 外消旋体中一种对映体酶解较快，而另种较慢，或不发生酶解，并在适当的条件下被保留而达 到分离。酶催化拆分的主要途径为主体选择性水解、酶化和转酶作用。近年来兴起的非水相酶催 化技术用于许多疏水化合物的拆分，使该技术得到了长足的发展。迄今为止，绝大多数天然氨基 酸都已成功地用酶法拆分得到了高纯度的对映体。但该法仅能适用于酶促反应体系，另外酶不稳 定、制剂的价格较高等因素也阻碍了它的应用。 总之，用化学拆分法、生物拆分法分离对映体，操作相对繁杂、速度慢、效率低，色谱技术 的发展使对映体的拆分方法进入了一个新时代。 色谱法分离对映体的方法主要有：薄层色谱( t h i n 1 a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) 、气相色谱 ( g a s c h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 、高效液相色谱( h i g h - p e r f o i m c e u q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 、 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t m p h o r e s i sc h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 、超临界流体色谱( s u p e c r i t i c a l f l u i dc h r o m a t o g r a p h y ，s f c ) 等其中高效液相色谱法具有柱容量高、不会发生被分离溶质高温 构型变化或破坏生物活性等优点，具有发展成实验室和工业规模对映体制备级分离的巨大潜力 “”。高效液相色谱直接拆分对映体包括手性固定相法( c h i r a ls t a t i o n a r y p h a s e ，c s p ) 和手性流动 相添加剂法( c h i r a lm o b i l ep h a s e ，c m p ) 。具有不对称中心的手性固定相的研制，是手性色谱发 展的前沿领域。 1 2 高效液相色谱手陛固定相法研究进展 近二十多年来，高效液相色谱的研究与应用发展速度惊人，其中手性固定相的研制更是一枝 独秀。手性固定相一般是把手性化合物键合或涂敷到载体表面( 一些手性高分子化合物颗粒可直 接用作固定相) ，对映体样品由于与固定相表面的手性分子形成非对映体络合物的结合能力有差 别而达到拆分目的。二十世纪八十年代初，p i r k l e 等人在深入研究手性色谱立体识别机理过程中， 重新阐述了三点作用分离理论：“手性识别要求手性固定相至少与对映体之一同时有三个相互作 用，且三者中至少有一个与立体化学因素有关川”】。其原理如图1 - 2 所示。手性固定相法分离测 定对映体速度快、柱效高、操作简单、适用范围广，在三点作用分离理论的指导下，已经发展成 为对映体分离最迅速的领域，也是手性色谱发展的关键和核心。已经商品化的手性固定相已超过 1 5 0 种，它们一般可归纳为以下几大类1 ”。 图卜2 色谱手性识别的“三点作用”模型 第一类是由a m s a o n g 研究小组发展起来的含有大量手性中心的大环糖肽类固定相。第2 2 类 是由o k a m a t o 等发展起来的淀粉或纤维素衍生物手性固定相，它们一般是涂敷在硅胶的表面。把 分子量相对较小的手性化合物键合到硅胶上得到的另一类手性固定相就是p i d d e 型手性固定相。 第四类是具有包合作用的环糊精手性固定相。另外还有蛋白质了、冠醚类手性固定相等。其中万 古霉索和纤维素三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 手性固定相是目前公认的拆分效果最好、应 用最广泛的手性固定相。 1 2 1 涂敷型纤维素或淀粉衍生物( c o a t e dc e | i u i o s ea n da m y i o s ed e r i v a t i v e s ) 自然界广泛存在的纤维素( c e l l u l o s e ) ，是由d ( + ) 葡萄糖单元通过b 1 ，4 - 糖苷键相连接 形成的线性高分子聚合物，相对分子质量约为4 0 0 0 0 道尔顿。其中一些葡萄糖单元之间园形成氢 键而产生了具有不对称性的单侧螺旋结构链。每个葡萄糖单元含有五个手性中心，所以接个纤维 素聚合物分子含有大量的手性活性点。从原理上讲，一对对映体与纤维素不对称结构链之间的相 互作用是有差别的，但是聚合物直接用作固定相，其网状结构导致传质困难、谱带扩展拆分效 果很差。而纤维素的衍生物是非常实用的、具有高度手性识别能力的固定相，能将大范围的外消 旋化合物分离成对映体，纤维素三苯基氨基甲酸醯的空间结构如图1 3 所示。到目前为止，已合 成的几十种纤维素衍生物，主要是通过酯化或醚化完全取代单元葡萄糖上的羟基从而引入不同的 活性基团【1 8 ”】。纤维素衍生物用作手性固定相主要有三种方法：( 1 ) 聚合物法，是将合成的纤维 素衍生物在有机溶剂中溶胀或者直接将衍生物微粒装柱。这种方法制作简单，样品负载量大，但 柱寿命短，分析速度较慢。( 2 ) 涂布法，是将纤维素衍生物溶于有机溶剂，通过蒸发溶剂法或沉 淀法将纤维素衍生物涂布在载体上。该法提高了固定相的稳定性，耐高压，有很好的手性识别能 力，是最为常用的方法。( 3 ) 键合法，是利用化学反应将纤维素衍生物连接到载体上，该法使得 此类手性固定相的稳定性大大提高，但同时也发现键合型的手性识别能力一般差于涂敷型固定 相。o k a m o t o 研究小组对纤维素一三苯甲酸酯和三苯基氨基甲酸酯及其衍生物的系统研究表明：在 苯基上取代基的类型、数日和位置对纤维素衍生物的手性分离能力有显著影响o “2 ”。纤维素酯衍 生物最重要的手性吸附位置是羰基或氨基甲酰基，手性中心附近带有羰基的溶质对殃体与纤维素 一三苯酯衍生物通过偶极- 偶极作用发生手性识别，或带有氨基的对映体通过氢键而发生手性识别 作用。有一个推电子取代基( 如烷基) 的苯酯比那些有一个吸电子取代基( 如硝基) 的苯醑表现 也芦毗、尹 出更高的手性识别能力口”。纤维素苯基氨基甲酸酯的光学拆分能力也取决于苯基上的取代基，含 有推电子取代基( 如叔丁基) 或含有吸电子取代基( 如硝基) 的衍生物比非取代的苯基氨基甲酸 酯有更高的手性识别能力。手性识别最重要的吸附位置是手性葡萄糖单元附近的氢基甲酰基，并 且这个基团的极性受苯基上取代基的影响。k i r k l a n d 将纤维素氨基甲酸酯类固定相的拆分机理归 结为：( 1 ) 氢键作用：( 2 ) 偶极一偶极相互作用：( 3 ) 一相互作用：( 4 ) 聚合物螺旋型空穴“立 体配合”作用。固定相的螺旋沟槽对溶质分子的芳环部分有较高亲和力，分离的对映体大部分至 少有一个芳环或可形成氢键的羰基口”。纤维素衍生物用作固定相的优越之处在于：纤维素对映体 纯度高，稳定性好，手性空腔适用于许多光学异构体，尤其是芳香族化合物的拆分。迄今为止纤 维素手性固定相己分离了大量有机化合物、生化样品等。 图卜3 纤维素一三苯基氪基甲酸酯的空间结构 直链淀粉( a m y l o s e ) 与纤维素一样也是由d 葡萄糖单元构成，但直链淀粉葡萄糖单元n 糖 苷键上存在一个螺线结构而致使其结构更有序【2 4 。2 ”，因此，直链淀粉衍生物的手性识别能力与纤 维素衍生物存在很大的差别。直链淀粉苯甲酸酯手性识别能力低，而三( 3 ，5 二甲基苯氨基甲酸 酯) 即c h i r a l p a ka d 对绝大部分对映体显示很高的手性能力。y a s h i m a 等把直链淀粉的3 ，5 二 甲基苯基氨基甲酸酯衍生物区域选择性键合到硅胶上作为h p l c 手位固定相，实验结果表明：6 位键合到硅胶上比2 3 位键合具有较高的手性拆分能力。可采用四氢呋哺和氯仿作流动相，克 服了涂敷型固定相在此类流动相中溶解的问题口“。c h a n k v e t a d z e 等讨论了直链淀粉的二甲基、二 氯、氯甲基苯基氨基甲酸酯固定相的分离性能，表明直链淀粉的2 甲基5 氯苯基氨基甲酸酯比相 应的二甲基和二氯衍生物手性识别能力高；在苯基的2 位引入甲基，增加键合氨基的比例，通过 分子内氢键形成一个更有序的刚性结构的聚糖类固定相，而在5 位引入氯增加自由氨基的比例， 意味着增加吸着点的数目，同时降低了手性聚合物的规则性，但引入氯降低吸着点酸度，减弱与 对映体氨基的相互作用力【2 7 】。其它糖类如木聚糖( x y l a n ) 、葡聚糖( d e x t r a n ) 、凝胶多糖( c u r d l a n ) p s 、脱乙酰壳聚糖( c h i t o s a n ) 等苯基氨基甲酸酯衍生物固定相的合成及手性拆分能力的评价 也有报道，在这些衍生物中木聚糖衍生物的识别能力比较高。纤维素低聚糖衍生物比纤维索衍生 物手性识别能力低，麦芽糖类衍生物与直链淀粉相似口“。吴树林将支链淀粉( a m y l o p e e t i n ) 与过 量的苯异氰酸酪在吡啶中反应得到的支链淀粉三( 苯基氨基甲酸酯) 溶解并涂敷在氮丙基硅胶上 【3 ”，用此手性同定相拆分了外消旋的簇合物u f e c c h c o w ( c o ) ，( c p c o o c 2 h 5 ) 。聚糖手性 固定相拆分的大量对映体包括含手性硫和磷原子的化合物、卤代烃、胺和酰胺、羧酸及衍生物等。 拆分对映体首选的固定相为c h i r a c e lo d ，其次为c h i r a c d0 3 或c h i m l p a ka d ，用这3 种固定相 可以拆分8 0 的化合物【3 2 1 。常用的流动相为正己烷和异丙醇的混合液。为了避免由多余活性中心 引起拖尾，一般在流动相中加入有机酸或碱，以增加峰形的对称性。在实验中。发现淀粉和纤维 素一三( 3 ，5 - 二甲基苯基) 氨基甲酸酯，可在乙腈一水等缓冲体系中使用删。聚糖类手性固定相具 有应用范围、样品容量高等优点；其缺点是枉效相对较低，对有些溶质显示不可逆吸附，涂敷 型固定相易流失。对流动相组成、流速等有一定要求p “。 1 2 2 p ir k i e 型手性固定相 p i r k l e 型手性固定相也称刷型或。n 作用型手性固定相，图1 _ 4 是已商品化的3 ，5 d n b 一苯 甘氨酸固定相的结构。这类固定相化学结构特点是在手性中心附近含有下列宫能团o4 】：( 1 ) 带吸 电子取代基或给电子取代基的芳香基团，在手性识别过程中能发生n n 电荷转移相互作用；( 2 ) 能形成氢键的原子或基团；( 3 ) 能发生偶极偶极作用