（农药学专业论文）精喹禾灵多克隆抗体的制备及其应用研究.pdf

贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 、 摘要 免疫学检测技术是农药残留及其代谢衍生物和其它小分子的重要分析方法。本论文开展 了精喹禾灵免疫学检测技术和仪器分析的研究，主要内容包括精喹禾灵半抗原的设计，人工 抗原的合成，多克隆抗体制备和相应的e l i s a 检测方法的建立，同时还对水和土壤中精喹 禾灵的农药残留进行了检测。 - 1 为了得到新型特异性抗体，以精喹禾灵水解产物精喹禾灵酸为半抗原，通过质谱、 核磁共振和红外分析，成功合成了半抗原精喹禾灵酸。半抗原与载体蛋白进行偶联，分别合 成了免疫原( 混合酸酐法( m a r ) ) 和包被原( 活泼酯法( e d c 或称碳二亚胺法) ) ，紫外全 扫描证实成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原。并计算人工抗原的偶联比分别为 h a p t e n - b s a 是2 9 2 3 ，h a p t e n - o v a 是7 8 7 。 2 用h a p t e n - b s a 作为免疫原免疫3 只新西兰大白兔( m 4 7 3 6 、m 4 7 4 0 和m 4 7 4 3 ) ，获 得了抗精喹禾灵的特异性抗体，所得到的效价分别为1 8 0 0 0 0 、1 1 2 8 0 0 0 0 、1 8 0 0 0 0 0 。因为 m 4 7 4 3 的效价最高，因此选用效价为1 8 0 0 ，0 0 0 的血清m 4 7 4 3 进行实验；经方阵点滴和间 接非竞争e l i s a 确定了血清m 4 7 4 3 的工作浓度，m 4 7 4 3 兔子抗血清的e l i s a 的最适工作 浓度：包被原稀释度为1 5 ，0 0 0 ( h a p t e n - o v a , 2 0 5p e , m l ) ，血清稀释度为1 2 0 0 ，0 0 0 ，此工作 浓度用于e l i s a 方法。通过研究包被介质、有机溶剂种类与含量、缓冲液离子强度等对抗 原抗体反应的亲和力和分析灵敏度的影响，优化了e l i s a 分析条件。在优化的工作条件下， 用m 4 7 4 3 血清建立的i c e l i s a ，所得的抑制率曲线方程为1 = 3 1 7 9 3 l o g c + 9 6 3 1 4 ，r - - 0 9 9 4 ， 对精喹禾灵的抑制中浓度( i c 5 0 ) 为0 0 3 4 9 5 “e , m l ，最低检测浓度为0 0 0 1 9 2 峪i n l ，检测 范围为o 0 0 2 - 0 5i l p , m l 。在交叉反应实验中，与其结构相似的物质没有交叉反应。 3 对水和土壤的精喹禾灵残留进行分析，采用气相色谱法( g c - n p d ) 测定，精喹禾 灵的保留时间在1 4 2 3 5 m i n ，方法的线性范围为0 0 4 - 1m g l ，线性方程为y = 4 0 2 2 3 x + 0 1 4 4 3 ， 线性相关系数r 为0 9 9 9 5 ，最低检出限为0 0 0 3m g k g ，符合残留分析要求。 在水样和土壤中分别添加0 - 1p g m l 的精喹禾灵，经i c - e l i s a ( m 4 7 4 3 ) 和气相色谱 ( g c ) 分析检测，水样中精喹禾灵的添加回收率为分别为8 9 0 2 1 0 8 8 8 和9 0 9 1 1 5 0 ，土 样样中精喹禾灵的添加回收率为分别为7 8 9 5 1 1 2 7 5 和8 4 0 1 0 4 5 。两种方法的添加回收 率均大于7 8 9 ，而且分析结果的相关性好，水样和土壤中添加回收率的e l i s a 和g c 的 相关性方程：水样中r 2 = 0 9 9 7 7 ，y = 0 9 1 9 7 x + 0 0 2 1 8 ；土壤中r 2 = 0 9 9 3 6 ，y r _ 1 1 3 9 5 x 0 0 0 9 。 以上结果表明，制各的精喹禾灵抗体适用于对水样和土壤中精喹禾灵农药残留进行快速 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 检测，其结果与用仪器分析( g c - n p d ) 所得的检测结果具有较好的相关性，具有良好的实 用性。 关键词：精喹禾灵；半抗原；合成；多克隆抗体：e l i s a ：g c - n p d ；水；土壤 2 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 a b s t r a c t i m m a n o a s s a yi s a l l i m p o r t a n tt o o lf o ra n a l y s i sa n dd e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u ea n di t s m e t a b l i t a ld e r i v a t i v e sa n do t h e rs m e l lm o l e c u l e s i nt h i sw o r k , w oh a v ed e v e l o p e di m m u n l o l g i c a l a n di n s t r u m e n t a la s s a y sf o rq n i z a l o f o p - p - e t h y l ，ah a p t e nw a sd e s i g n e df o rq u i z a l o f o p - p - e t h y l , a n d t h e ni tw a sc o n j u g a t e dw i t hd i f f e r e n tc a l t i a p r o t e i n st os y n t h e s i z et h ei m m u n o g e n sa n dc o a t i n g a n t i g e n i nd i f f e r e n t w a y s ，c i - e l i s a w o r oe s t a b l i s h e dw i t hc o r r e s p o n d i n gp o l y c i n n a l a n t i b o d i e s w h a t sm o r e ，w od e t e r m i n e dq u i z a f o l o p - p - e t h y lp e s t i c i d er e s i d u e si nw a t e ra n ds o i l 1 t op r o d u c ean o v e lt y p eo fi m m u n o g e ns u s c e p t i n l et or a i s ea n f i b o d i e s ，o nt h ea l k a l i n e c o n d i t i o n , q u i z a l o f o p - p - e t h y lw a sc o n v e r t e di n t oq u i z a l o f o pa c i dw h i c hw a su s e da sh a p t e na n d w a sa n a l y z e db ym s ，1 hn m ra n d li tw a sc o n j u g a t e dt ob o v i n es e r u ma l b u m i n s a ) b y a c t i v ee s t e rm e t h o d ( a e m ) a n do v a l b u m i n ( o v a ) b ym i x e da n h y d r i d er e a c t i o n ( m a r ) ， r e s p e c t i v e l y t h eu vs p e c t r as h o w e dt h a tt h e s ec o n j u g a t e sw e r eo b t a i n e ds u c c e s s f u l l y , a n dt h e c o u p l i n gr a t i oo f h a t p e n - b s a i s2 9 2 3a n dt h ec o u p ! i n gr a t i oo f h a t p e n - o v ai s7 8 7 2 t h es p e c i a lp o l y c l o u a la n t i b o d i e sa g a i n s tq n i z a l o f o p - p - e t h y lw f f l ”g e n e r a t e db y i m m u n i z i n g3n e w z e a l a n dw h i t er a b b i t sw i t ht h eh a p t e n - p r o t e i nc o n j u g a t e ( i - l a p t e n - b s a ) t i t e r s o f 3r a b b i t sa r em 4 7 3 6 ( 1 ：8 0 ，0 0 0 ) ，m 4 7 4 0 ( 1 ：1 2 8 ，0 0 0 ) ，m 4 7 4 3 ( 1 ：8 0 0 ，o o o ) t h et i t e ro f m 4 7 4 3 w a sm u c hh i g h e rt h a nt h o s eo fo t h e r s ，s oi tw a su s e di nt h ee x p e r i m e n t t h et w od i m e n s i o n a l t i t r a t i o no f t h ea n t i s e l - am 4 7 4 3a 罢衄h a p t e n - o v aa n dt h ee l i s am e t h o dr e v e a l e dt h a lt h eb e s t w o r kc o n c e n t r a t i o ni st h a tt h ed i l u t i o no fm 4 7 4 3a n t i s e f m nw a s1 2 0 0 ，0 0 0a g a i n s t2 0 5p g m l h a p t e n - o v a , t h i sc o m b i n a t i o n sw u s e dt op e r f o r mt h ef o l l o w i n ge l i s am e t h o d t h ee f f e c to f v a r i o u sf a v o r s ，s u c ha sc o a t i n gm e d i u m ，t h et y p ea n dc o n c c n w a t i o no fo r g a n i cs o l v a n t s ，i o n i c s u e n g t l l ，w h i c hm a yi n f l u e n c et h ea f f l i n i t yb e t w e e na n t i b o d i e sa n dc o a t i n ga n t i g e na n dt h e s e n s i t i v i t yo f t h ea s s a yw e 亿s t u d i e dt oo p t i m i z e 砒i a i y d c a lc o n d i t i o n so f e l i s a w i t ho p t i m i z e d c o m b i n a t i o n , w ou s e dt h ea n t i s e r u mm 4 7 4 3t oe s t a b l i s hi c - e l i s am e t h o d , as t a n d a r dc u r v ef o r q u i z a l o f o p - p - e t h y lw a so b t a i n e db yp l o t t i n gi n h i b i t i o nr a t ev o r s u sl o g c ( c i st h ec o n c c n u a t i o no f q u i z a l o f o p - p - e t h y l ) t h ei n h i b i t i o nr a t ec u r v ee q u a t i o ni si = 3 1 7 9 3 l o g c + 9 6 3 1 4 ，r = 0 9 9 4 t h e a s s a ys h o w e dt h a tt h ei c 5 0f o rq u i z a l o f o p - p - e t h y lw a s0 0 3 4 9 5p g m la n dt h el o w e s td e t e c t i o n l i m i tw a s0 0 0 1 9 2 增m l ，t h ew o r k i n gr a n g ew a s s i g n e dt oc o n c e n t r a t i o n s0 0 0 2 - 0 5p g m lf o r q u i z a l o f o p - p - e t h y l f u r t h e r m o r e ，o t h e rs t n l c t o r a u yc l o s e l yr e l a t e dc o m p o u n d st e s t e d d i dn o t 3 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 c r o s s - r e a c ti nt h i sa s s a y 3 t h eg cm e t h o d ( w i t hn p d ) w a si n t r o d u c e do f d e t e r m i n i n gq u i z a f o l o p - p - e t h y lp e s t i c i d e r e s i d u e si nw a t e ra n ds o i l t h er ti s1 4 2 3 5r a i n ，a n dt h em e t h o dp r o v i d e sal i n e a rr e s p o n s e b ：t 、v e e n0 0 4 - 1 m g k g , t h el i n e a re q u a t i o ni sy = 4 0 2 2 3 x + o 1 4 4 3 ac o r r e l a t i o nc o e t h c i c i e n to f 0 9 9 9 5 ，a n dal i m i to f d e t e c t i o na t0 0 0 3m g 【g t h em e t h o dw a si nl i n ew i t hr e q u e s to f p e s t i c i d e r e s i d u ed e t e r m i n a t i o n f c r t h e r m o r e ，w a t e rw e r ef o r t i f i e dw i t hq u l z a l o f o p - p - e t h y la td i f f e r e n tl e v e l sr a n g i n gf r o m0 t olp 咖la n da n a l y z e db ye l i s aa n dg c - n p d ，r e c o v e r i e so fq u i z a l o f o p - p - e t h y lf r o mw a t e r s a m p l e sw e r e8 8 1 0 5 9 a n d9 0 9 - 11 5 ，o a n df r o ms o i ls a m p l e sw e r o7 8 9 5 - 1 1 2 7 5 a n d 8 4 0 - 1 0 4 5 ，r e s p e c t i v e l y , a l lo f t h e m r e c o v e r i e so f t h e s et w om e t h o d sw e r em o r et h a n7 8 9 a n dt h ec o r r e l a t i o no ft h er e s u l t sb e t w e e ne l l s aa n dg ci sg o o d , t h ec o r r e l a t i o ne q u a t i o n sa r e y 卸9 1 9 7 x + 0 0 2 1 8 ( r 2 = 0 9 9 7 7 ) o fw a t e rs a m p l e sa n dy = i 1 3 9 5 x - 0 0 0 9 噼= o 9 9 3 6 ) o fs o i l s a m p l e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea n t i b o d i e sf o r q u l z a l o f o p - p - e t h y l c o u l db e u s e df o r q u l z a l o f o p - p - e t h y lr e s i d u e sf a s ta n a l y s i si nw a t e ra n ds o i l ，a n dt h ec o r r e l a t i o no ft h er e s u l t so f e l i s aa n dg c - n p da r eg o o d i ts h o w sag o o dp r a c t i c a lf u n c t i o n k e yw o r d s ：q u i z a l o f o p - p - e t h y ；h a p t e n ；s y n t h e s i s ；p o y c l o n a la n t i b 0 l y , e l i s a , g c - n p d ； w a t e r ；s o l l 4 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 月舌 精喹禾灵( q u i z a f o t o p - p - - e t h y l ) 是八十年代开发的苯氧基羧酸类除草剂，gs a k a t a 等首 次报道其外消旋体的除草活性，日本日产化学工业公司开发生产精喹禾灵除草剂。 精喹禾灵除草剂具有选择性和内吸传导作用。是一种茎叶处理除草剂，在酸性和中性介 质中稳定碱性介质中易水解，结构式如下： 其商品名有精禾草克、n c - 3 0 2 d + 、t a r b as u p e r 等。与其它的苯氧丙酸类除草剂一样。 精喹禾灵用于芽后防治大豆、棉花、油菜等作物中一年生单子叶杂草。精喹禾灵除草剂被杂 草叶片吸收后- 能迅速通过植物术质和韧皮部分上下传导到整个植株，积累在分生组织，抑 制其细胞脂肪酸合成，抑制a c e t y lc o ac a r b o x y l a s e ，破坏分生组织生长，使杂草坏死。 根据w h o ( 1 1 1 ) 和e p a ( i ) ，精喹禾灵是有毒化学物质，已被欧盟国家蔡止使用，但 在我国和其它一些国家却是一种广泛生产和使用的除草剂，其农药残留对水、食 品和环境存在危害许多国家都对其制定相应的残留限量。因此加强对其残留的 检测可以严格控制该药的使用以及我国出口的农产品或食品的农药残留进行有效 的控制，一方面可以避免造成严重的环境污染与危害；另一方面，可以防止在进 出口中造成不必要的经济损失。 目前，国内外对精喹禾灵的残留分析方法主要有液相色谱分析法和气相色谱分析法( 苏 少明等，2 0 0 4 ；刘绍仁等，1 9 9 8 ；李跃斌等，1 9 9 7 ；h a j | l o v j t , j e ta l ，1 9 8 8 ) ，但这些传统方法样 品处理需净化，浓缩等步骤，分析过程相当繁琐，同时又需要昂贵的仪器和熟练的操作人员， 远远满足不了现场大量样品检测和监测分析工作的要求。因此很有必要探索一种快速、简便、 准确、廉价、灵敏和安全的检测方法。 农药残留免疫分析0 a ) 方法是2 0 世纪6 0 年代末发展起来用于农药残留检测的一项新 技术具有简便、快速和特异性强等优点，近年来，备受重视。农药残留免疫分析技术主要 有放射免疫分析( r i a ) 、荧光免疫分析( f i a ) 、酶免疫分析( e i a ) 、固相免疫传感器及免疫 亲合色谱0 a c ) 等。最早建立的农药i a 采用的技术多是r i a 。由于其需要使用特定的设各 及存在放射性防护和污染等问题。r i a 的应用受到较大限制并逐渐为随后发展起来的酶免疫 分析( e n z y m ei m m t m o a s s a y , e i a ) 所替代。目前，e i a 在农药领域中的应用最为广泛，尤以 酶联免疫吸附分析( e l i s a ) 发展最快，因其具有快速、简便、灵敏、廉价、特异性好、安 5 批 i ) 叱 z_o-c n 沙取 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 全和同时检测多个样品等优点，特别适用大批量样品检测等优点而成为与仪器分析方法并驾 齐驱的重要方法之一，己被分析化学界广泛接受( 刘乾开等，1 9 9 9 ；苏允兰等，2 0 0 0 ；彭顺金 等，1 9 9 5 ；王一茹等，1 9 9 6 a , 1 9 9 6 b ) 。全球农药使用量越来越大，在给环境带来严重污染的同 时，也使得需要检测得样品不断增加用常规检测手段有很多不便之处，开发和应用e l i s a 就显得很有必要。至今。国内外已经相继开发出4 0 余种农药的酶免疫分析的试剂盒。包括有 机磷类、氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、有机氯类、三嗪类、拟除虫菊类及酰胺类等。 目前，有关芳基羧酸类除草剂e i a 分析的研究，国外对2 d 及同系物的报道在上个世 纪8 0 年代颇多，这是基于这类除草剂早年在欧美等国使用较普遍的原因。但对精喹禾灵的 e l i s a 测定分析研究却迄今未见报道。糖喹禾灵除草剂己被欧盟国家禁止使用，但在我国 却是一种广泛生产和使用的除草剂，不仅涉及环境污染的监测，还与作物药害预防有关， 而且精喹禾灵是这一类除草剂的典型。因此研究这种药剂的e i a 分析方法，不仅对于芳基 羧酸类化合物的免疫反应研究有学术价值而且对于研制和应用e i a 方法，预防环境污染 和作物药害也有重要意义。 本研究对精喹禾灵进行结构修饰。合成了精喹禾灵酸作为半抗原，采用液质联用仪 o 讧s ) 、核磁共振仪( h - n m r ) 和红外光谱( m ) 进行结构鉴定。选择混合酸酐法和碳二亚 胺( ) c ) 法合成的半抗原分别与载体蛋白偶联制各人工抗原，免疫兔子获得了特异性强的 精喹禾灵多克隆抗体，建立了对精喹禾灵具高度特异性的免疫分析方法，同时还对水和土壤 中精喹禾灵的农药残留进行了检测。 6 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 一综述 人类在创造物质文明以满足发展需要的同时，因生态环境的破坏或失衡而限制了发展。 因此保护人类的生存环境，实施可持续发展战略已经成为社会“和平与发展”永恒主题的主 要内容。目前日益严重的环境污染已成为威胁人类自身存在的隐患，农药的大量施用是当前 环境污染的一大因素，特别是农药的高毒和慢性毒性，以及残留物对内分泌系统的干扰等， 格外引起人们的关注在研究环境和生态系统的保护和治理中。农药残留分析是一项必不可 少须的手段和方法。常规的残留分析技术( 气相色谱( g c ) 、液相色谱( l c ) 、质谱( m s ) 及 其联用技术等) 已难以胜任大批量样品检测，特别是现场快速检测的任务。因此具有快速、 简便、灵敏、准确、廉价并能适应现场检测特点的免疫分析技术( l a ) 尤其是是酶免疫分 析( e i a ) 便闯入了农药残留快速分析的行列。 免疫检测技术是国际上许多权威机构如世界粮农组织( r a o ) 及美国化学学会推荐的 优先发展的分析技术之一( v a n d e l a n n ，m ，e ta 1 ，1 9 9 1 ；c o n a w a y ，f e ，n 口l ，1 9 9 1 ) 。1 9 6 7 年 c e n t e n o 等首次将放射免疫分析( r i a ) 用于d d t 和马拉硫磷的检测，它的报道，标志着免 疫学检测技术正式应用于环境化学中。其后很长一段时间在农药分析中所用的免疫学技术为 r n ；l a n g o n e 等于1 9 7 5 年第一次成功地将e i a 用于狄氏剂残留量的测定，检测极限达5 0 p g m l ，但由于当时各方面条件的限制，这些技术在实验室或实际领域中的研究应用未引起 充分注意：直到1 9 8 0 年h a m m o c k 等才正式提出免疫化学技术在农药分析中具有极大的应 用潜力，并开始着手这方面的研究，农药残留免疫化学分析技术的发展才进入了一个崭新的 阶段。e i a 目前已被农药分析家们普遍应用。八十年代中期以来，国外对e i a 在农药分析 中的研究颇多，且逐渐由多抗转向单抗，以获得可以大量生产、性质稳定、重现性好的抗原 特异性单一的抗体( v 姐e j o ，p ，e t 以，1 9 8 2 ) 。经过几十年的发展，免疫学检测技术已经广 泛应用于医学、诊断学、农业、生物、食品检验等各个领域。本章简述了农药残留造成的环 境、生态及食品安全问题的主要危害，并针对引起危害的农药小分子有毒有害物质的免疫学 检测技术的基本原理、主要技术环节，国内外免疫分析技术新进展进行论述。并对此技术在 其他方面的应用进行展望。 1 1 农药的残留毒性 1 1 1 农药残留 人类在有害生物的防治上施用了大量的化学农药，这些化学农药中有残留期长、影响非 靶标生物的农药，如最早使用的砷制剂及后来的有机氯类杀虫剂等。虽大部分这类杀虫剂早 7 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 已禁用。但由于这些农药环境中的持久性，在环境样品中仍能够检测到这些农药的残留。由 于害虫抗药性等问题。在过去的几十年内，出现了许多新的农药。但其中大多数农药尚缺乏 其对环境、人和动物影响的研究。就很快进入市场，给环境带来隐患。 环境中的残留农药会随着空气的运转、水的传送和生物的携带等作用，会从一个地区迁 移到另一个地区，使农药的污染全球化，地球的每一个角落、每一种生物体内都能够发现农 药的存在。 1 1 2 农药残留的副作用 由于某些农药的持久性，施药后在环境中长期存在，持续作用于环境中的生物，引起 多种副作用。 1 1 2 1 农药残留对野生生物的影响 田问用药降低有害生物对作物危害的同时，也杀伤了大量天敌和有益生物，影响农田生 态系统。如杀草丹和丁草胺等几种水稻田常用除草剂在规定的用药剂量下。会造成蛾蚪和田 螺的死亡( 严叔平等，1 9 9 0 ) ，锐劲特用作种衣剂，野生鸟类取食锐劲特包衣的种子后发生死 亡( m a r k , m ，e t a l ，1 9 9 9 ) 等。土壤中残留的农药也会随降水和淋水的作用，最终污染水源。 水的污染对水生生物的影响极大由于永生生物一直生活在水中。几乎整个生活史中都接触 农药，即使水中的农药浓度很低也会影响到水生生物的生命活动。现在的一些高活性的农药 对水生生物也一样存在高毒杀活性。部分除虫菊酷类杀虫剂在几十p p b 的水平上就可以杀伤 鱼虾( 新编农药手册，1 9 9 1 ) 。 。 1 1 2 2 农药残留对后茬作物的影响 土壤中的农药残留，可能会影响到下茬作物的生长。一些选择性较低的高活性除草剂可 能会对当茬或后茬作物有一定的影响( 范文海等，1 9 9 3 ) 。草甘磷用于龙眼除草时，常造成对 龙眼的药害，特别是磺隆类除草剂如绿磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆等在生产中经常造成对当茬 和后茬作物的药害( 范文海等，1 9 9 3 ) 。 1 1 2 3 农药残留对人、畜的影响 农药残留对哺乳动物和人的影响是人们最关心的。农药对哺乳动物和人的毒性可分为急 性毒性和慢性毒性。急性毒性会造成肌肉、唾液分泌以及瞳孔收缩，严重的会造成呼吸困难 或导致疾病发作而死亡。但采取相应及时的措施，一般来说。急性毒性对人体造成的危害不 大。慢性毒性，如有机磷类农药的慢性神经毒性为多发性神经病，表现为中枢神经和周围神 经的退化，慢性毒性较急性毒性更难以确定。此外。农药对动物体内分泌系统的于扰也是慢 性毒性的一种表现。研究发现。内分泌紊乱剂在很低的剂量下就能诱发内分泌的紊乱。传统 b 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 认为只有脂溶性的在生物体内富集的化台物才能影响到内分泌系统j 在鱼类的研究中发现水 溶性的化合物如莠去津及其它除草剂也可以影响到动物的内分泌系统( s t e v e n , g ，e ta ， 1 9 9 7 ) 。佛罗内达大学野生动物内分泌学家t h n o t h yg r o s s 研究表明：水溶性农药虽不在生物 体富集，但水生生物一直持续的接触农药而影响到内分泌系统。在农药的临床免疫毒性研究 中发现，部分农药对人体存在直接免疫毒性、过敏反应、自身性免疫反应等( 邬红梅等， 1 9 9 7 ) 。 1 2 农药残留检测技术发展概况 农药是农业生产上用来防治病、虫、草害的有毒化学物质。农药由于具有高效、速效、 方便、适应性广、经济效益显著等特点而被广泛应用于植物病虫害防治、采后保鲜等生产过 程。农药为有毒化学品，长期大量使用后，在得到经济效益的同时也产生广泛的副作用。近 些年来由于害虫抗药性的增加，使用农药的次数和浓度不断增加，滥用以及乱用高毒、高 残留农药的现象屡禁不止，或不按照规范的允许限量使用农药，导致有害物质对生态环境造 成严重污染与危害，导致我国农畜产品农药残留超标现象严重，各种中毒事件屡见报端。一 方面，农药对人类的影响已经成为严重的社会问题，另一方面，出口的农产品也因为残留超 标而影响出口，给我国农产品的出口因此遭受壁垒，带来经济损失外，也影响贸易工作的正 常开展。近年来，残留问题受到世界各国的关注，农药残留的分析方法得到了快速的发展。 1 2 1 农药残留检测的样品前处理技术 化学农药的大量使用所造成的环境毒理问题，已引起人们的高度重视。加强对农药残留 量的检测和环境毒理研究。对于合理开发和正确使用化学农药，保护生态环境，保障人类健 康，避免和减少不必要的农业损失等具有重要理论和实践意义。近年来，气相色谱质谱联 用( c , c - m s ) 、液相色谱一质谱联用( l c - m s ) 、超临界流体色谱( s a c ) 、毛细管电泳色谱( c e ) 和酶联免疫吸附( e l i s a ) 等分析技术在农药残留分析中得到了广泛的应用，并成为当前主 要的农药残留分析技术。现代检测技术对样品的前处理提出了更高的要求，同样也推动了样 品前处理技术的发展。 农药残留量测定之前的样品前处理主要包括萃取和净化等步骤，样品前处理不仅要求 尽可能完全提取其中的待测组分，还要求尽可能除去与目标物同时存在的杂质以减少对检 测结果的干扰，避免对色谱柱和检测器的污染。过去常用的提取净化方法有索氏提取 ( s o x h l e t ) 、组织捣碎、振荡提取、水蒸气蒸馏同步萃取( s i ) e ) 、液液分配( l l e ) 、柱层析 ( f l o r i s i l 硅胶，硅藻土及氧化铝柱层析) 等技术，尽管这些技术不需要昂贵的设备和特殊仪 器，但却是整个分析过程中最费时、费力、最容易引起误差的环节。大量有机溶剂的使用 9 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 也造成了对环境的污染。1 9 9 0 年以来，固相萃取( s 0 1 i d p h a s e e x t r a c t i o n , s p e ) 、固相微萃取 ( s o l i dp h a s em i c r o - e x w a c t i o n , s p m e ) 、超临界流体萃取( s u p e rc r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n , s f e ) 、 微波辅助萃取( m i c r o w a v ea s s i s t e de x u a c t i o n , m a c ) 、凝胶渗透色谱( g e lp e n e t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y , g p c ) 和免疫亲和色谱o m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , 【a c ) 等技术得到 了不断改进和应用为农药残留量分析的样品提取净化提供了有效选择。下面简要综述近年 来在农药残留量分析中样品提取净化等前处理技术的研究进展。 1 2 1 1 液液分离技术( l i q u i d - l i q u i dp a r t i t i o n , u 两 l l p 是用一种与萃取液不相混溶而能将待测物萃取于其中，使其与其它杂质分离的一种 技术。其操作程序是：先将待测样品溶于正己烷或石油醚，然后加入亲水性有机溶剂( 如乙 腈、硫酸二甲酯、二甲基亚砜等) 进行反萃取，使脂肪等杂质留在正己烷层内，而待测成分 进入亲水性有机溶剂中，加氯化钠或硫酸钠降低其溶解度，即可使待测成分净化。对于含脂 肪较多的样品采用l l p 与柱层析相结合的方法进行净化。但l l p 不适合极性较大的氨基甲 酸酷类农药的分析。 。 1 2 1 2 固相萃取法( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n , s p e ) s p e 是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱分离原理。使液体样品通过吸附剂，保 留其中某些成分再选用适当溶剂冲去杂质。然后用少量有机溶剂迅速洗脱待测成分。从而 达到快速分离、净化与浓缩的目的。固相萃取技术的核心是填料，填料的种类很多，吸附型 的有硅胶、硅藻土、氧化铝和活性炭等。化学键合的硅胶正相的有氨基、腈基、二醇基等， 反相的有腈基、环己基、苯基、c - 、c 2 、c 6 、c s 、c 1 2 等，离子交换的有季胺、氨基、 二氨基、苯磺酸基、羧基( 朱霏红，2 0 0 0 ) 。对杂质很多、成分复杂的生物检材，采用固相萃 取作为分离纯化的前处理，同时富集主要成分，而后结合气相色谱和液相色谱法分析检测的 报导越来越多，有取代传统液液萃取的趋势。对于气相色谱来说，固相萃取法起到保护色 谱柱的作用而对于液相色谱来说，固相萃取法可保护液相色谱柱不受颗粒或强滞留基体组 成的污染。该方法与常规的液液萃取及一般的柱层析相比，节省大量的溶剂，减少杂质的 引入。对操作者安全，重现性好以及避免产生液液分配中的乳化现象。拟除虫菊酯类农 药的固相萃取法所用的吸附剂多为氟罗里硅土。其次为正相的硅胶吸附柱。氟罗里硅土柱对 亲酯性化合物有特别的吸附作用，适合于油性杂质的分离，用低极性的溶剂洗脱氟罗里硅土 柱，对菊酯类农药的回收率很高。 l 工1 3 固相微萃取法渤m p h a s e m i c t e - e x t r a c t i o n 。s p m e ) 微型固相提取法是固相提取法中的新成员，1 9 8 9 年由加拿大的b e l a r 和p a w l i s z y n 首先 1 0 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 提出，将细石英纤维( 1 7 0p m ) 上涂布一层固定相( 吸附剂) ，将纤维插入水溶液样品内，水 中分析物被分配到固定相上，取出纤维插入气相色谱仪进行分析。微型固相提取法的机制是 吸附和热解吸，取样，提取、浓缩、进样是一个步骤，全过程无需溶剂，是分析方法上的巨 大突破。进样不用溶剂。改善了色谱分离效率纤维可以重复多次使用经济有效。固相萃 取技术主要用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离和富集。微型固相萃取的选择性， 灵敏度可以通过改变石英纤维表面固定液的类型、厚度、p n 值、基质种类、样品加热或冷 却处理因素来实现。目前商业化的s p m e 纤维涂层主要有碳酸范本树脂 ( c o r b o x e n - p t r ) 聚二甲基硅氧烷- 二乙烯苯( p d m s - d v s ) ，聚丙烯酸酯o p a ) ，聚二甲基硅 氧烷( p d m s ) 等，其极性也由强变弱。s p m e 主要与g s - m s 联用用来分析环境、医药、 食品和动植物样品中挥发和半挥发农药残留量。 l 工1 4 微波萃取法( m i c r o - a m p f i t u d ee x t r a c t i o n , m a e ) 微波萃取是利用极性分子可以迅速吸收微波能量来加热一些具有极性的溶剂如甲醇、乙 醇、水等。微波能是一种非离子辐射，有机分子中的离子受到微波辐射，产生位移和偶极矩， 分子排列成行，迅速恢复到无序状态，这种反复进行的分子运动，样品迅速加热。微波穿透 力强，能够渗入基体内部辐射迅速传遍整个样品，而不使表面过热。达到萃取目标化合物， 分离杂质目的。与传统的振荡提取法比较，微波萃取具有高效、安全、快速、试剂用量小和 易于自动控制等优点( l o p e z , ll 。e t 以，2 0 0 1 ) 。利用微波萃取除虫菊醋，选用正己烷作为溶 剂，约2 0 0 秒获得了提取的物质，提取的效率较高( 郝金玉等，2 0 0 1 ) 。 1 2 1 5 超临界流体萃取法( s u p e rc r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n , 舾曰( b u s h w a y , i t g ，e t 础，1 9 8 8 ； 1 9 9 1 ) 利用超临界流体密度大、黏度低、扩散系数高并兼有气体的渗透性和液体的分配作用的 性质，将样品中的待测物质溶解并从基质中分离出来，流出液中的c 0 2 在常压下挥发，待 测物经过溶剂吸收后可以直接应用与检测，同时完成萃取和分离两个步骤，不仅减少了操作 程序，也缩短了操作时间。对菊酯类农药使用超临界流体萃取更是成功的。超临界流体与传 统的液液萃取相比，还具有速度快、效率高、应用范围广、可选择性强、无毒和费用小等 特点。超临界流体可以通过调节淋洗液的极性来提高萃取的选择性，以萃取不同物理化学性 质的农药残留。对菊酯类农药使用超临界流体萃取更是成功的。邱月明用超i | 缶界流体萃取大 米、小米和玉米中的二氯苯醚菊酯。氯氰菊酯。溴氰菊酯氰戊菊酯等四种除虫菊酯残留量， 回收率和精确度均很高，并且整个分析时间都很短( 邱月明，1 9 9 4 ) 。l e h o t a v 等利用甲醇调 节c 0 2 淋洗剂的极性从蔬菜和水果中提取除虫菊酯，使得回收率大大提高。 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 1 2 1 6 凝胶渗透色谱( g e lp e n e t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , g p o 凝胶渗透色谱技术是根据溶质( 被分离物质) 分子量的不同，通过具有分子筛性质的固 定相( 凝胶) ，使物质达到分离。凝胶渗透色谱法最初主要用来分离蛋白质，但是随着适用 于非水溶性分离的凝胶类型的增加，凝胶渗透技术应用农药残留量狰化得以发展。1 9 7 1 年 s t a l l i n g 等将凝胶渗透色谱作为一种快速净化技术应用于农药残留分析中脂肪类食物样品与 农药分离，并使该技术初步自动化，随后凝胶净化技术受到广泛重视，成为农药残留分析中 一种主要净化手段。并不断得到改进和发展。用于农药残留分析的凝胶必须可以使用有机溶 剂，而且凝胶孔径要小。目前用于农药分析中的凝胶种类主要有多孔交联葡萄糖凝胶 ( s e p h a d e x l h - 2 0 ) 和交联聚苯乙烯凝胶( b i o - b e a d s s - x ) ，可以根据被测农药以及需要分离的 杂质分子量选择不同孔径的凝胶。所选用的洗脱剂应对农药有良好的溶解度。并且对凝胶有 一定的溶胀能力。s e p h a d e x l h - 2 0 采用乙醇作为溶剂效果较好，b i o - b c a d s s - x 使用l ：l 的乙 酸乙酯和环己烷。l ：l 的二氯甲烷和环己烷做洗脱剂。凝胶色谱技术与吸附柱等净化技术相 比，具有净化容量大、可以重复使用、使用范围广、使用自动化装置后净化时间缩短、简便、 准确等其特点，其优点是可明显减少溶剂的使用量和分析时间。凝胶色谱净化技术应用于含 有脂肪样品中有机磷、有机氯、氨基甲酸酯以及拟除虫菊酯类农药等农药的净化。王兆基等 利用g p c 提取蔬菜中6 种菊酯类农药回收率为8 6 5 - 9 9 7 ，检测限为0 0 4m g j k g ( 王兆基 等1 9 9 8 ) 。 l 上1 7 免疫亲和色谱技术( i m m u n o - a 仿n l t yc o l u m n 。i a c ) 免疫亲和色谱技术是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法，是基于免疫反 应的基本原理，利用色谱的差速迁移理论实现样品分离的一种分离净化方法。分析时把抗 体固定在适宜的担体上，样品中待测组分利用与吸附剂上抗体发生抗原抗体结合反应而被 保留到柱上，再用适当溶剂洗脱下来达到净化和富集目的。它的特点是具有高度选择性， 该技术的关键是选择适合的担体、抗体和淋洗缓冲液。此方法近年来已经开始应用于生物农 药、真菌毒素和兽药残留分析的样品前处理。 1 2 1 8 加速溶剂提取法( a c c e r l a t e ds o l v