（农药学专业论文）稻谷蔬菜水果中吡虫啉残留量检测方法研究.pdf

些堕查些查兰堡主兰垡丝苎； 摘要 如今农药的残留问题已成为全世界关注的焦点。很多发达国家已建 立了关于食品中农药残留的安全限量和检测方法，而目前我国的相关标准 还不健全，如对作物中吡虫啉的检测还没有规定的检测方法标准。本论文 即在建立一个简便快捷、具有高灵敏度和准确度，并体现现代科技水平的 吡虫啉残留检测的国家标准，供全国进行农药残留安全检测工作使用。 吡虫啉是德国拜尔公司( b a y e r a g ) 开发生产的一种杀虫剂。中文通用名： 吡虫啉；英文通用名：i m i d a c l o p r i d 。广泛应用于各种作物上，其杀虫谱较广。 经实验筛选，最后确定的三种样品的前处理方法分别为： 稻谷样品：乙腈提取，s p e 柱净化，减压蒸干，h p l c 检测：白菜样品：二 氯甲烷提取，提取液经无水硫酸钠脱水，过s p e 柱净化，减压蒸干，h p l c 检测：苹果样品：甲醇提取，向提取液中加入氯化钠水溶液及石油醚，振 荡后静置分层，保留水相，再用二氯甲烷分三次反萃水相，二氯甲烷萃取 液经无水硫酸钠脱水，减压浓缩至近干，h p l c 检测。 通过对色谱柱、流动相、检测器及检测波长考察确定色谱条件如下： 色谱柱h p z o r b a x x d b c l 8 柱 流动相水( o 2 乙酸水) ：乙腈8 0 ：2 0 检测波长2 7 0 n m 经以上方法检测样品的回收率均在8 5 以上，最低检出限为 0 0 0 5 u g m l ，使用本方法进行前处理得到的色谱图均有较好的净化效果。 本课题建立的方法最低检出限o 0 0 5 u g m l ，变异系数平均值为1 o l ，回 收率均高于8 5 ，t 值小于致信度9 5 的t 值。利用此方法检测三种样品中 的吡虫啉均得到较满意的结果。 综上所述，本实验确定的检测方法基本达到作为国家标准的方法要求。 关键词：吡虫啉； 液相色谱法：残留；检测；标准 前言 第一部分前言 一、吡虫啉的性质及作用特点 毗虫啉是德国拜尔公司( b a y e r a g ) 开发生产的一种杀虫剂。中文通用名： 吡虫啉；英文通用名：i m i d a c l o p r i d ；中文商品名：康福多：英文商品名：a d i m i r e c o n f i d e rg a a c h on t n 一3 3 8 9 3 。化学名称为1 ( 6 氯3 吡啶基甲基) - n 一硝基 亚咪唑烷2 一基胺，结构式如下： c 吡虫啉是新开发研制的一种硝基亚甲基类内吸性杀虫剂新品种，广泛用 于各种作物上，包括水稻，棉花、玉米、高粱、果树和蔬菜等大多数农作物。 其杀虫谱较广，包括同翅目、缨翅目、鞘翅目、双翅目以及部分鳞翅目害虫 等，尤其对刺吸性害虫具有内吸性和高残效。如：黑尾叶蝉、稻褐飞虱等，也 可有效预防各类粉虱、木虱、玉米金针虫等。 吡虫啉作用于烟碱乙酰胆碱受体，干扰昆虫神经系统的刺激传导、引起 神经通路的阻塞，此阻塞造成重要的神经传导物质乙酰胆碱的积累，从而导 致昆虫麻痹，并最终死亡。 毗虫啉具有以下特点： ( 1 ) 高效：单位面积用药量较低，般为每公顷几十克的水平，低于现有的 常规杀虫剂。 ( 2 ) 持效期常：可常达数周，施药一次可使一些作物在整个生长季节免受害 虫侵害。 ( 3 ) 对抗性害虫有效：由于其作用机制与现在的大多数杀虫剂不同，因此对 现有的杀虫剂产生抗性的害虫对吡虫啉敏感。 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 4 ) 安全性好：吡虫啉对脯乳动物毒性较低，无致畸致癌致突变作用。对 鸟类较安全，用于种子处理时对鸟有趋避作用；对有益动物如蚯蚓和蜘蛛较 安全：叶面旌用，特别是在花期，对蜜蜂高毒，但用于种子处理时对蜜蜂无 毒：对地下水较安全。 ( 5 ) 吡虫啉具有胃毒和触杀作用，无论是害虫取食或触杀都有效。 ( 6 ) 具有内吸活性适用于土壤和种子处理及颗粒施用 按我国农药毒性分析标准，吡虫啉属低毒杀虫剂。吡虫啉口服l d 5 0 ：大 鼠 1 2 6 0 m g k g ；雄小鼠 1 4 7 m g k g ；雌小鼠 1 2 6 m g k g 。经皮l d s o ：大鼠 1 0 0 0 m g k g 。原药对兔眼睛有轻微的刺激性，对皮肤无刺激。对大鼠蓄积性 试验，其蓄积系数k 5 ，为轻度蓄积性农药。 吡虫啉无三致性。致突变试验：a m e s 试验和微核试验均为阴性表明无 致突变性。 吡虫啉对鱼的毒性很低( l c s o 一2 4 h 分别为5 0 4 m g ，l 和1 8 8 m g 1 ) ，但对 虾极为敏感( l c 5 0 一4 8 h 仅为0 0 0 3 4 m g 1 ) ，属高毒农药。吡虫啉对家蚕和蜜 蜂均有较高的毒性，它对蜜蜂的触杀毒性l d s o 为7 6 5 m g l ，具有较高的胃杀 和触杀毒性。 吡虫啉的物理性质为：纯品为无色晶体，有微弱气味，熔点1 4 3 8 1 3 6 - 8 ，蒸汽压2 1 0 。9 h p a ( 2 0 * c ) 。溶解度( 2 0 c ) ：水o 5 1g l 、二氯甲烷5 0 1 0 0 9 ，l 、 异丙醇1 - 2 9 1 、甲苯o 5 - 1 o g a 、正己烷 9 8 ) 化学名称为1 ( 6 氯一3 一吡啶基甲基) - n 一硝基亚咪唑烷2 一基胺 稻米、蔬菜及水果样品市场随机购买。 ( 二) 主要试剂 甲醇分析纯沈阳化学试剂厂 盐酸分析纯沈阳化学试剂厂 二氯甲烷分析纯沈阳化学试剂厂 氯化钠分析纯沈阳化学试剂厂 乙酸乙酯分析纯沈阳化学试剂厂 石油醚分析纯沈阳化学试齐厂 去离子水实验室自制 乙腈色谱纯天津康科得科技有限公司 ( - - ) 仪器设备 安捷伦l1 0 0 型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司 c l s 固相萃取柱 s p e - p a k c a r t r i d g e s5 0 0 m g 3 m l 沃特斯公司 s a t o r i u st 6 0 2 电子分析天平( 万分之一精度) 德国制造 z k 高速自控组织捣碎机江苏省盐城市龙岗医疗器械厂 s h z d ( m ) 型循环水式多用真空泵河南巩义英峪予华仪器厂 日立r e 一5 1 数据控制旋转蒸发仪 k q 一3 0 0 d e 型医用数控超声波清洗器江苏省盐城市龙冈科学仪器厂 m i l l i - q 去离子水系统 m i l l i p o r e 公司 三、色谱条件 色谱柱h p z o r b a x x d b c l 8 柱 检测器u v 检测器 检测波长2 7 0 r i m 流动相水( o 2 乙酸水) ：乙腈8 0 ：2 0 柱温 2 5 流速 2 m l m i n 进样量2 u l 四、样品前处理 ( 一) 稻谷样品 提取 准确称取大米( 粉碎后过6 号筛) 样品4 o g ，分三次加入1 5 m l 乙腈超声 提取，每次5 m i n 。 净化 将提取液沉降后过c 1 8 固相萃取柱，用2 m l 乙腈预淋；样品用8 m l 乙 腈溶解后过柱，保留穿透液。 浓缩 将穿透液减压蒸干后用色谱纯乙腈定溶到1 m l 。0 4 5 u m 滤膜过滤，待 高效液相色谱检测。 检测 a g l i e n t1 1 0 0 型高效液相色谱( u v 检测器) 配h pz o r b a xc l s 色谱柱， 外标法检测。 ( 二) 白菜样品 提取 将白菜样品去泥，按4 分法取样后匀浆，准确称取匀浆后的白菜样品 4 o g ，加入1 0 m o l l 盐酸l m l ，用1 5 m l 二氯甲烷超声提取5 r a i n ，并重复2 次。 沈阳农业大学硕士学位论文 j 争化 提取液经无水硫酸钠脱水，在5 04 c 左右的条件下减压浓缩至近干，过 0 5 9 填料的c 1 8 固相萃取柱净化：用5 m l 甲醇预淋s p e c 1 8 柱；样品用2 2 2 m l 石油醚和乙酸乙酯混合液( 3 0 ：7 0 v ：v ) 分三次转入柱内穿透液弃去，再 用8 m l 石油醚和乙酸乙酯混合液( 8 5 ：1 5v ：v 】洗脱。 浓缩 收集洗脱液，减压蒸干，用色谱纯乙腈定容到l m l ，0 4 5 u r n 滤膜过滤， 待高效液相色谱检测。 检测 a g l i e n t110 0 型高效液相色谱( u v 检测器) 配h pz o r b a xc 1 8 色谱柱， 外标法检测。 ( 三) 苹果样品 提取 将苹果样品按4 分法取样后匀浆，称取匀浆后的苹果样品4 o g ，用1 5 m l 甲醇超声提5 m i n ，并重复2 次。 净化 将提取液浓缩至近干，向提取液中加入5 氯化钠水溶液及石油醚各 5 m l ，振荡后静置分层，保留水相，再用1 5 m l 二氯甲烷分三次反萃水相， 二氯甲烷萃取液经无水硫酸钠脱水。 浓缩 脱水后的液体减压浓缩至近干，用色谱纯乙腈定容到l m l ，o 4 5 u m 滤 膜过滤，待高效液相色谱检测。 检测 a g l i e n t1 10 0 型高效液相色谱( u v 检测器) 配h pz o r b a xc 1 8 色谱柱， 外标法检测。 五、色谱定性与定量分析 _ 买粒 ( 一) 定性分析 色谱定性分析即把样品的色谱图与标准品的色谱图进行对比，根据保留 时间t r 判断流出的色谱图是否含有待测化合物。 ( 二) 定量分析 本实验采用外标法( 标准曲线法) 进行定量计算。 ( 1 ) 毗虫啉标准溶液的配制 储备液的配制 精确称取1 0 m g 吡虫啉纯品溶于少量乙腈中，以l o o m l 容量瓶定容至刻 度，即得1 0 0 1 j g m l 标准样品储备液。 工作液的配制 取1 0 0 9 9 m l 标准溶液l m l 用乙腈定容至l o m l 得到1 0 9 g m l 标准工作 溶液 取1 0 肛g m l 标准溶液l m l 用乙腈定容至l o m l 得到1 p g m l 标准工作溶 液 取l p g m l 标准溶液l m l 用乙腈定容至l o m l 得到o 1 i _ t g m l 标准工作 溶液 当以上各标准溶液不用时，放置于4 c 冰箱避光保存。 ( 2 ) 标准曲线绘制 将配好的毗虫啉标准样品在选定的色谱条件下进样，然后作出响应信号 与样品含量之间的关系曲线，即标准曲线。由标准曲线可得出方法的线性范 围及相关系数。据此对待测样品进行定量分析。 六、方法的可靠性分析 ( 一) 灵敏度 灵敏度是衡量仪器的最低检出限，即在所设定的分析条件下仪器所能检 出样品的最低含量的指标。当响应信号与噪音的比值不小于3 时，该信号可 以被检测。 沈阳农业大学硕士学位论文 f - - ) 准确度 t 检验 其计算公式为：t - = l a ”2 ( ix z - x1 ) s 式中n 为检测次数，x 为检测平均值，x ：为真值，s 为标准差。将t - 检验 中计算出的值与实际值k 进行比较。色谱分析要求可信度为9 5 ( t 。= t o0 5 ) ， 查表得，当检测次数是5 时，t o0 5 为2 7 8 。当计算t 值小于2 7 8 时，符合准 确度要求。 加标回收 加标回收率是衡量准确度的另一个指标。这种方法是在样品中加入一定 量的毗虫啉标准品，然后按照所确定的样品前处理及检测方法进行检测，得 到吡虫啉的含量，将得到的吡虫啉含量与实际加入量相比，得到的数值即为 回收率。回收率越接近1 0 0 ，方法的准确度越高。 ( 三) 系统适用性 根据色谱峰的分散度、精密度、分离度、理论塔板数等指标评价系统适 用性。 ( 1 ) 色谱峰分散度 色谱峰分散程度用标准偏差。值衡量，其值为o 6 0 6 5 h 。处对应的t 与 t r 的差值。由于此结果不易计算，因此常用w 4 代替，其中w 为色谱峰宽。 标准偏差越小，曲线中部升高的越高，两侧下降越侠，分散程度就越小，色 谱峰形越好，有利于定量分折：反之，则对定量分折不利。 ( 2 ) 精密度 精密度是指同一组检测结果中，多次平行检测之间的符合程度，以多次 检测的平均结果作为标准，是衡量检测结果重复性的指标。精密度离，表示 各次检测结果的密集程度高或离散程度小，即重现性好。在精确的检测中， 精密度用标准偏差和相对标准偏差表示。其值越小，精密度越好。 标准偏差s 的计算公式为： 2 实验 压豆 ( n 1 ) 式中s 标准偏差 x i 单次分析数值 x 样品分析结果的平均值 相对标准偏差r s d 的计算公式为 r s d = 1 0 0 s o x 一 ( 3 ) 分离度 r = 2 ( t r u - t r i ) ( w l - w 2 1 其物理意义为相邻两峰顶距是相邻两峰底宽的几倍。 当r 1 5 时，两峰完全分离：当r 0 8 时，两峰为基线分离，是两峰能 分开的最基本要求。 ( 4 ) 理论塔板数 理论塔板数为色谱理论的一个重要参数，理论塔板数表示色谱柱分离柱 效的高低。 理论塔板数n = ( t r o ) 2 其中t r 为样品的保留时间，o 为色谱峰的标准差。 鎏堕垒些查兰塑主兰垡笙塞 第三部分结果与讨论 一、色谱条件的选择 色谱是一种现代分离分析方法。任何两种不同的物质，只要它们存在物 理、化学或生物性质上的差异及在不同组分上分配系数的差异，便可以在色 谱过程中得到分离、分析或检测。 ( 一) 固定相的选择 液相色谱是以液体为流动相，以广义的固相为固定相而进行分离的。通 常均将固定相添于柱子中，即以色谱柱的形式进行工作。因此色谱柱是进行 分离的主要场所。入们通常将色谱柱比喻为色谱仪的心脏，这是很恰当的。 发生在色谱柱中的分离过程，受热力学因素和动力学因素的控制。为了 得到满意的分离效果，首先必须考虑固定相的性质及其与溶质相互作用的强 弱，这主要体现在色谱柱填料的设计、合成及选择上。为使分离的谱带展宽 尽可能小，就需要对柱子进行优化设计并将填料填充成性能优良的柱子。 高效液相色谱柱按其分离模式来分，大致可分为：正相、反相、离子交换、 疏水作用、体积排阻、亲和及手性等类型的色谱柱。 按色谱模式分的各类型色谱柱分离原理及适用对象见表1 表1 各类型色谱柱分类 坠! 丝! 垒! ! ! ! 堡墅壁鳇! ! 堡坠! 垫坚! 里罂坦墅 色谱拄 类型 分离原理适用对象 结果与讨论 根据待测物吡虫啉的化学结构式可以判断该物质为极性较强的化合物， 应采用反相色谱柱进行检测。 反相色谱柱有不同的配基，包括c 6 、c 8 ，c 1 8 等。对于反相键合相色谱， 烷基碳链的长度和键合量是影响固定相样品容量、组分保留值、柱效及分离 选择性等色谱性能的主要因素。一般来说，当键合量一定时，烷基碳链越长， 则碳含量成正比例增加，样品容量增加，组分保留值也增加，同时固定相稳 定性也越好，这是c 1 8 柱( 即o d s 柱) 比其他碳链烷基键合相应用更普遍的 重要原因；而当烷基碳链长一定时，表面键合量越大，则样品容量增加，组 分保留值增加，柱效也提高。 沈阳农业大学硕士学位论文 择。 本实验通过对c 6 、c 8c 1 8 反相色谱柱的考察确定c 1 8 为固定相的最佳选 i 1 i 尺 l _ 、 图1 0 0 5 u g m l 吡虫啉标准样品在c 1 8 柱上的保留 f i g l0 0 5 u g ，m li m i d i c l o p r i ds t a n d a r ds a m p l ei nc l sc o l u m n ( 二) 流动相的选择 流动相的选择需要满足下列条件：所选择的流动相要能够完成对被分离 物的充分分离，即待测组分能够与其他杂质峰分开：在选定的流动相条件下 峰型良好：整个分离过程应尽量在1 0 分钟内完成。 在考察流动相的选择是否合适时引入了一个参数，这就是容量因子k ( 也叫分配比) ，它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。它是 指在一定的温度及压力下，组分在两相间分配达平衡时分配在固定相和流动 相中的质量比。k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量 大。容量因子与分辨率有关。在h p l c 中一般将k 控制在2 5 之间，在这 个范围内分辨率随k 的增加而增加。当k 超过5 时，k 的增加将使色谱时间 大大延长而分辨率增加有限。因此，容量因子k 在5 左右时最佳。 在反相色谱中，常用极性溶剂及其混合溶剂作流动相。溶剂的极性越低， 其洗脱能力越强，溶剂强度越高；相反，溶剂极性越强，则洗脱能力越小， 溶剂强度越弱。 结果与讨论 水是反相色谱最弱的溶剂；也是使用最广泛的流动相。为了获得各种不 同强度的洗脱，通常采用水与有机溶剂混合，例如：水一乙腈，水一甲醇， 水一四氢呋喃等。当水与化学性质相似的有机溶剂混合时，( 如甲醇和水都 是质子的接受体) ，只改变流动性，不改变流动相的选择性，即仅组分保留 值发生变化而组分洗脱顺序不变；当水与化学极性相差较大的有机溶剂混合 时( 如水与乙腈、四氢呋喃) ，则不仅组分保留值改变，组分的洗脱顺序也 发生变化。 1 流动相种类的选择 根据吡虫啉的极性选用乙腈一水作流动相，则可通过调整流动相的配 比，将保留时间控制在7 分钟左右。 2 流动相配比的选择 吡虫啉的保留时间受流动相配比的影响很大，增加流动相中乙腈的含量， 保留时间相应缩短：反之乙腈的含量降低保留时间也相应延长。调整流动相 中水( 0 2 乙酸水) 乙腈的比例分别为3 ：1 和4 ：1 时o 1 m o l l 标准样晶检 测所得色谱图 me 图2 水( o 2 乙酸水) 一乙腈的比例为3 ：1 f i g2t h er a t i oo f w a t e r - a c e t o n i t r i l ei s3 ：1 圳= 沈阳农业大学硕士学位论文 图3 水( o 2 乙酸水) 一乙腈的比例为4 ：1 f i g3t h er a t i oo f w a t e r - a c e t o n i t r i l ei s4 ：1 当流动相水和乙腈的体积比为3 ：1 时，吡虫啉的保留时间为5 1 8 8 r a i n ； 当流动相水和乙腈的体积比为4 ：l 时，吡虫啉的保留时间为7 9 7 3 r a i n 。当待 测物的保留时间太短时，易与溶剂及样品中的其他杂质峰发生干扰。实验证 明当调整流动相水和乙腈的体积比为4 ：l ，即吡虫啉的保留时间为7 9 7 3 m i n 时，三种样品中其他干扰物质与毗虫啉标准样品分离的较好。 ( 三) 检测器的选择 液相色谱检测器按其性质或应用范围可以分为总体性能检测器( b g l k p r o p e r t yd e t e c t o r ) 和溶质性能检测器( s o l u t ep r o p e r t yd e t e c t o r ) 两大类。 总体性能检测器 响应值取决于流出物( 包括样品和流动相) 某些物理性质总的变化的检测器。 包括：示差折光率检测器、介电常数检测器、电导检测器等。 检测方法：采用差示测量法，即将含有被测物质的流动相与不含被测物的流 动相的同一物理性质进行比较测量。 优点：应用范围广 缺点：流动相本身有响应，因此易受温度变化、流量波动以及流动相组成等 因素的影响 。入 望墨兰塑笙 溶质性能检测器 响应值取决于流动相中溶质的物理变化或化学特性的检测器。 包括：紫外一可见检测器、荧光检测器、化学发光检测器、安培检测器、手 性检测器等。 检测方法：溶质性检测器选择性的测量溶质有别于流动相的某一物理或化学 特性。 优点：仅对被测物质有较大的选择性，而对流动相响应值很小，故检测灵敏 度高。 缺点：与总体性能检测器相比，检测范围受到限制 理想的检测器应具有以下特点： ( 1 ) 灵敏度高，以便能作痕量分析 ( 2 ) 对所有样品都能响应 ( 3 ) 不受温度和流动相流速变化的影响 ( 4 ) 线性范围宽 ( 5 ) 噪音低、漂移小 ( 6 ) 死体积小 ( 7 ) 对样品无破坏 ( 8 ) 。稳定可靠，重现性好 ( 9 ) 价格便宜 根据毗虫啉的化学结构为含有吡啶环的化合物，具有紫外吸收，而紫外 一可见检测器符合灵敏度高、不受流速变化、重现行好、价格便宜等特性， 是液相色谱最常用的检测器。 ( 四) 检测波长的选择 下图为d a d 检测器扫描得到的o 0 5 u g m l 吡虫啉标准液吸收波长的三维 图谱。其中x 轴表示时间，y 轴表示波长( 2 0 0 4 0 0 n m ) ，z 轴表示响应值。 图中所示三个色谱峰，其中保留时间在1 m i n 左右的为溶剂峰：另两个保留 鲨里堡兰竺查兰堡主兰堡垒兰 时间在7 7 r a i n 左右，为吡虫啉色谱峰，在这两个峰中，峰高较高，吸收值较 大的在2 7 0 r i m 附近。为确保获得较大的灵敏度选2 7 0 a m 为最佳检测波长。 图40 0 5 u g m l 毗虫啉标准品2 0 0 - - 4 0 0 n m 扫描光谱 f i g4t h es c a ns p e c t r u mo f 0 0 5 u g m li m i d i c l o p r i ds t a n d a r db e t w e e n2 0 0 4 0 0 n m 综合以上分析，实验选定的色谱条件总结如下： 色谱柱h p z o r b a xx d bc 1 8 柱 流动相水( 0 2 乙酸水) ：乙腈 配比8 0 ：2 0 检测器u v 检测器 检测波长2 7 0 n m 流速 2 m l m i n 柱温 2 5 进样量2 u l 二、样品前处理方法的优化 ( 一) 提取 样品的提取是作残留分析工作的第一个关键性的实验步骤，提取率的高 低将直接影响回收率。对于提取方法、提取溶剂种类及提取剂用量的考察是 本环节的三个关键点所在。 1 提取方法 常用的提取方法有以下几种： 震荡法 结果与讨论 组织捣碎法 超声波提取法 组织捣碎+ 超声波法 经典的索氏提取法 震荡法是在样品切碎后加入适当溶剂，在震荡器中震荡提取0 5 1 h ，过 滤出溶剂后，再用溶剂洗涤滤渣一次或数次，合并提取液后进行浓缩净化。 震荡法所需要的时间长，并需要重复提取2 3 次。 索氏提取法是经典的提取方法，这种方法需要使用特定的索氏提取器， 效果好，但是耗时过长，一般需要8 1 2 h 。目前已作为一种经典的提取方法 来衡量其他方法的提取率。 超声波法及组织捣碎法也是在食品药物残留分析中常用的提取方法，这 两种方法操作简便、提取率高，并可联合应用。 采用不同的提取方法对稻米、白菜及苹果样品添加的o 0 5 u g m l 毗虫啉 进行处理，其回收率见表2 表2 不同提取方法对三种样品中的吡虫噼提取回收率比较 t a b l e 2r e c o v e r yo fi m i d i c l o p r i df r o mt h r e ed i f f e r e n ts a m p l e sb yd i f f e r e n te x t r a c t i n g m e t h o d 沈阳农业大学硕士学位论文 由表2 的比较可知，组织捣碎法与超声波法联用的方法对于蔬菜及水果 样品中残留农药的提取最为有效。这种方法首先要将样品适当切碎，然后放 入组织捣碎机中快速进一步捣碎1 2 m i n 。然后将粉碎的组织转移到烧杯中， 加入适量提取剂，超声震荡5 m i n ，重复3 次，利用高频率的超声波使残留 药物完全释放出来，从而达到提取的目的。这种方法提取简便快速( 几分钟) ， 较之公认提取效率高的索氏提取法而言，所需时间大大缩短索氏提取( 8 - - 1 2 h ) 而在回收率上无显著性差别。实验证明，用超声波震荡法提取后的白 菜和苹果样品再用索氏提取器提取回收率不足l ；稻米类样品，不宜采用 组织捣碎的方法提取，由上表比较结果可知，超声波震荡提取法同样对稻米 样品有好的提取效果。故对于稻米样品只需粉碎过筛后采用超声波提取法。 2 提取溶剂的选择 对于提取剂的要求是尽可能选择溶解残留危害物质及其代谢产物，而不 溶解或少溶解食品中成分及杂质干扰物的溶剂作为提取剂。因此，必须综合 考虑样品的性质，尤其是色素含量的多少、被检测药物的极性、溶解性以及 提取剂的沸点、毒性等方面的问题。而考虑的重点首先应该是被测物吡虫啉 在提取液中的溶解度，根据“相似相溶”原理，选择极性相似的提取溶剂。 表3 毗虫啉在不同溶剂中的溶解度表( 2 0 ) t a b l e 3t h es o l u b i l i t yo fi m i d i c l o p r i di nd i f f e r e n ts o l v e n t ( 2 0 1 以 3 i 结粜与讨论 二氯甲烷的最高，但二氯甲烷为一极性较小的溶剂，对于样品中非极性杂质 的干扰排除能力差；而甲醇和乙腈为极性较强的溶剂，虽对吡虫啉的提取率 不及二氯甲烷但对非极性干扰物的排除能力较二氯甲烷强。 根据三种样品中所含主要成分极性的不同，选择不同的溶液作为提取溶 剂。人米样品含有的杂质较少，故所采用的净化步骤也比较简单，考虑到s p e 柱净化时采用乙腑作为上样液净化，为了不引入其他干扰，采用乙腈作为提 取剂；白菜样品中舍有的杂质相对较多，二氯甲烷对于吡虫啉样品有特殊的 亲和性，对样品的提取率较高，故采用二氯甲烷作为白菜样品的提取剂。而 引入的杂质在过s p e 柱时，用淋洗液除去；苹果样品含有的果胶等大分子成 分较多不易采用过柱的方式净化，故采用液液萃取的方式提纯，因为二 氯甲烷对样品的溶解度大，本实验选择样品经甲醇提取后用石油醚除杂，二 氯甲烷反萃水相的方式净化。对待测物吡虫啉达到最大的回收。经以上分析 本实验所选的提取剂见表4 表4 不同样品的提取溶剂 f i 9 4 t h ee x t r a c t i n gs o l v e n t o f d i f f e r e n ts a m p l e 经实验证实三种提取剂对三种样品中吡虫啉的提取均能得到较好的回收。 3 提取剂用量的选择 提取剂用量少，提取不完全，回收率低；用量过多，又会使浓缩时间延 长。所以其用量以能浸没样品，使之与样品充分接触为宜。通过实验，确定 在粉碎后的样品量为5 9 时，n t - 1 5 m l 提取剂，超声波震荡提取5 r a i n ，重 复提取3 次。 ( 二) 净化 1 不同样品前处理方法的确定 壅堕堡些查竺塑兰竺堡塞 一 a 稻谷样品 大米中主要成分为淀粉，粗蛋白和粗纤维含量均小到1 0 ，脂肪的含量 不足2 。可将样品沉阡过夜( 将淀粉沉淀) 后过s p e 柱净化。过柱时用乙腈 溶解后直接上柱，并用乙腈洗脱即可。 b 白菜样品 白菜样品与大米相比成分相对复杂，首要问题是考虑除去白菜样品中的 色素及水分。加入无水硫酸钠除去样品中的水分。白菜样品中含有的色素较 多，由于毗虫啉为种极件较高的农药，与之相对比所含的色素为极性较低 的物质，所以在过s p e 柱时先用极性较低的溶液石油醚和乙酸乙酯混合液 ( 3 0 ：7 0v ：v ) 淋洗除去色素和一些极性较低的杂质，再用极性较高的溶液石油 醚和乙酸乙酯混合液( 8 5 ：1 5 v ：v ) 洗脱待测物。 c 苹果样品 苹果样品除含有水分和色素外，还含有果胶、纤维素及多糖等大分子成 分，过s p e 柱易造成柱体的阻塞，影响除杂的目的。故采用萃取的方法净化， 先用石油醚和水萃取除去苹果中的色素和极性较低的杂质再用二氯甲烷反 萃水相提纯待测物。 用上述三种方法提纯三种不同的样品，在选定的色谱条件下检测毗虫啉 的回收率均大于8 5 。 2 残圈分析常用的净化方法有固相萃取法和液液革取法 a 圉相萃取法 固相萃取就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品 的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和 富集目标化合物的目的。 s p e 克服了液液萃取( l l e ) 及- - 般柱层析的缺点，与( l l e ) 相比， 可节省时间和溶剂约9 0 减少杂质的引入，对操作者较为安全，重现性好， 可避免l l e 中乳化现象的产生：s p e 的另一优点是容易实现预处理的自动 堑墨兰塑堡 化，国外已推出商品化的自动固相萃取装置a s p e c ( a u t o m a t e ds o l i d - p h a s e e x t r a c t i o nc l e a n u p ) ，将其与h p l c 在线结合可实现许多农药残留的全自动分 析。 固相革取的模式及原理 固相萃取实际上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相 同，可分为正相( 吸附剂极性大于洗脱液极性) ，反相( 吸附液极性小于洗 脱液极性) ，离子交换和吸附。 s p e p a kc l g 方法的建立 一般可滔于有机溶剂的样品根据极性的不同可采用不同类型的s p e 柱填料 及与之相对应的洗脱剂。具体情况见表5 表5 不同样品的s p e 分离模式 f i 9 5d i f f e r e n ts p es e p a r a t i o nm o d eo f d i f f e r e n ts a m p l e 样品类型和极性分离模式柱填料洗脱剂 可溶于有机极性 n p c 氰基、二醇基、己烷、氯优 溶剂样品氨基、氨基脓二氯甲烷、 氨基甲醇、丙酮 中等极性 l s c 硅藻土、硅胶、己烷、氯仿、 硅酸镁、氧化二氯甲烷、 非极性 r p c 铝 三萎、乙酸 c 1 8 、c 8 键合己烷、二氯 悯0 0 0 相、环己烷、 甲烷、丙酮、 氰基、苯基键乙腈、甲醇、 合相 水 本实验欲检测的毗虫啉样品为极性较强的化合物，与之相对应的提取溶 剂r 卜的其它杂质即为极性较弱的化台物，根据上表所提供的信息及样品基体 丝堕查些查兰堡主兰些笙苎 的性质稻谷和白菜样品中的吡虫啉农药的净化采用f l o r i s i l 固相萃取柱。 a 稻谷样品 a 活化吸附剂 在萃取样品之前要用适当的溶剂淋洗固相萃取小柱，以使吸附剂保持湿 润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。 本实验采用乙腈淋洗活化柱体。 b 上样溶剂种类的确定 稻谷样品中含有的杂质较少，将大部分淀粉沉淀下来，提取液浓缩到近 干时，用有机溶剂溶解样品，溶解液分三次转移过s p e 柱，收集穿透液即可 将上样液中含有的极性较低的杂质保留在s p e 柱上，得到纯净的待测液，达 到净化的目的。 比较稻谷样品添加o 0 5 u g m l 毗虫啉，分别采用二氯甲烷、丙酮、乙腈 分别作为上样液溶解样品后转移过s p e 柱，收集穿透液后减压浓缩，l m l 乙腈定容，0 4 5 u m 微空滤膜过滤，液相色谱检测得到的回收率如图5 ： 1 0 0 8 0 i 褥6 0 1 娶 ；国4 0 2 0 0 二氯甲烷 乙腈丙酮 提取溶剂 图5 分别采用二氯甲烷、丙酮、乙腈作上样液的回收率图 f i 9 5t h er e c o v e r yr a t i oo f d i f f e r e n td i s s o l u t i o nd i e h l o r o m e t h a n ea c e t o n ea c e t o n i t r i l e 丙酮作为上样液，极性较低，对待测物的回收不好：二氯甲烷对吡虫 啉样品有很好的溶解度，当用二氯甲烷作为上样液经固相萃取柱净化，收集 堑墨皇堕堡 穿透液回收率较高。但由于二氯甲烷的极性较低，对于稻谷样品中所含有的 极性较低的杂质的净化效果不好：乙腈的极性较高，作为上样液经过固相萃 取柱净化，将样品中极性较低的杂质吸附在柱体上，而待测物毗虫啉则穿透 柱体，保留在穿透液中达到净化的目的。用乙腈和二氯甲烷分别作为上样溶 剂，按所确定的方法同步操作，所得色谱图如下 图6 用乙腈作上样溶剂 f i 9 6a c e t o n i t r i l ea st h ed i s s o l u t i o n 。l 图7 = 氯甲烷作上样溶剂 f i 9 7d i c h l o r o m e t h a n ea st h ed i s s o l u t i o n 从上两图可见，乙腈作为上样溶剂的色谱图杂峰较少，待测物吡虫啉的 色谱峰可与杂质峰达到基线分离；二氯甲烷作为上样溶剂的色谱峰杂质较 多，待测物吡虫啉的色谱峰未与杂质峰达到基线分离，干扰目标化合物的检 测。故选用乙腈作为上样溶剂。 c 上样溶剂体积的确定 分别取2 m l ，4 m l ，6 m l ，8 m l ，l o m l 乙腈溶解浓缩至近干的待测样 品，收集穿透液后减压浓缩，经l m l 乙腈定容，o 4 5 u r n 微孔滤膜过滤，液 相色谱检测所得回收率如下： 一 八 一 沈阳农业大学硕七学位论文 斟1 0 0 g 曰8 0 6 0 4 0 2 0 o 2468 1 0 体积m 1 图8 不同体积乙腈作为上样溶剂所得回收率图： f i 9 8r e c o v e r yr a t i oo fa c e t o n i t r i l ea sd i s s o l u t i o nw i t hd i f f e r e n tv o l u m e 由图8 可见，采用8 m l 乙腈溶解待测样品时，样品可得到最大的回收 率，增加乙腈的量回收率不再增加。 b 白菜撰品 a 活化吸附剂 采用甲醇预淋后再用水淋洗活化柱体。 b 上样溶剂的确定 待测样品被上样液溶解后，吡虫啉农药及样品中的一些杂质均被保留在 s p e 柱上。此时。需要上样溶液的极性较低，以免将吡虫啉农药带出，发生 穿透现象。调整石油醚和乙酸乙酯的比例分别为4 0 ：6 0 ( v ：v ) ，3 5 ：6 5 ，3 0 ：7 0 作为上样溶剂，当石油醚和乙酸乙酯的比例为3 0 ：7 0 时，在淋洗液中未检出 待分析组分，即没有发生穿漏现象，从而确定该混合比例不影响分析物的保 留。 结果与讨论 n 0 1 s , s 2 7 0 r 目0 1 ( e c u 嘲d l 图9 石油醚和乙酸乙酯的比例为3 0 ：7 0 时色谱图 f i 9 9t h eh p l cc h a r tw h e nt h er a t i oo fp e t r d e u me t h e ra n de t h y la c e t a t e i s8 5 ：1 5 c 洗脱液的确定 洗脱液的作用是将保留在s p e 柱上的吡虫啉农药洗脱下来。因为毗虫啉 的极性较强，这就要求洗脱液的强度增加。调整石油醚和乙酸乙酯的比例分 别为7 5 ：2 5 ( v ：v ) ，8 0 ：2 0 ，8 5 ：1 5 作为洗脱液，o 0 5 u g m l 吡虫啉标准添加液 相色谱检测所得色谱图如图1 0 p a d lei 中口口* 舯0 伽 1 4 q e q - 、 一，：k 五 图1 0 石油醚和乙酸乙醋的比例为7 5 ：2 5 ( v ：v ) 洗脱色谱匿 f i g l 0t h eh p l c c h a r tw h e nt h er a t i oo fp e t r d e u me t h e ra n de t h y la c e t a t ei s 7 5 ：2 5 沈阳农业大学硕七学位论文 图1 1 石油醚和乙酸乙酯的比例为8 0 ：2 0 ( v ：v ) 洗脱色谱圈： f i g l lt h eh p l cc h a r tw h e nt h er a t i oo f p e t r d e u me t h e ra n de t h y la c e t a t ei s 8 0 ：2 0 一” 图1 2 石油醚和乙酸乙酯的比例为8 5 ：1 5 ( v ：v ) 洗脱时色谱图 f i g l 2t h eh p l cc h a r tw h e nt h er a t i oo fp e t r d e u me t h e ra n de t h y la c e t a t e i s8 5 ：1 5 由以上三图可见，当调整石油醚和乙酸乙酯的比例为8 5 ：1 5 ( v ：v ) 洗 脱时所得色谱图的回收率最高( 色谱峰的峰面积最大) 。 d 洗脱剂体积的确定 分别取2 m l ，4 m l ，6 m l ，8 m l ，1 0 m l 石油醚和乙酸乙酯的比例为8 5 ：1 5 ( v ：v ) 洗脱o 0 5 u g m l 标准添加的待测样品，收集洗脱液后减压浓缩，l m l 乙腈定容，0 4 5 u m 微孔滤膜过滤，色谱检测所得回收率如图1 3 ： 3 9 结果与讨论 螫1 0 0 冒8 0 6 0 4 0 2 0 o 24 6 8 1 0 体积m l 图1 3 不同体积洗脱液洗脱o 0 5 u g m l 特铡样品回收率 f i g l 3t h er e c o v e r yr a t i oo f0 0 5 u g m ls a m o l ee l u t e db yd i f f e r e n tv o l u m e b 液一液萃取 c 苹果样品 液一液萃取常用于样品中被测物质与基质的分离，在两种不相溶液体或 相之间通过分配对样品进行分离而达到被测物质纯化和消除干扰物质的目 的。 苹果样品除含有水分和色素外，还含有果胶、纤维素及多糖等大分子成 分，过s p e 柱易造成柱体的阻塞，影响除杂的目的，故采用液一液萃取的方法 净化。先用石油醚和水萃取除去苹果中的色素和极性较低的杂质，再用二氯甲 烷反萃水相提纯待测物。 二氯甲烷萃取液体积的确定 萃取剂用量少，萃取不完全，影响回收率；萃取剂的用量过大，又会 造成溶液的浪费。分别取萃取荆9 m l 、1 5 m l 、2 1 m l 分三次反萃水相，所得 回收率如图1 4 ： 沈阳农业大学硕士学位论文 萃取剂体积 图1 4 不同体积萃取剂萃取0 0 5 u g j m l 待测样品的回收率 f i g l 4t h er e c o v e r yr a t i oo f0 0 5 u g m ls a m o i ee z t r a c t i o nb yd i f f e r e n tv o l u m e 由图1 4 可见，萃取剂的体积为9 m l 时，回收率较低；当萃取剂的体积 增加到1 5 m l 时，回收率不再随着萃取剂体积的增加而增加。 ( 三) 浓缩 经过上述处理的溶液中，溶液中匪虫琳韵干扰物质已基本除净，但此时 吡虫啉的浓度较低，而且各次操作后的溶液体积不同，因此，在进行检测前， 需要浓缩定容。很多研究结果指出，浓缩过程中待测物最容易损失。这就要 求浓缩过程中，要注意减少残留药物损失，并要求浓缩速度不能太慢。常用 的浓缩方法如下： ( 1 ) 自然挥干将样品液置于干燥通风背阴处，让溶剂自然挥发浓缩。适用于 沸点低的溶剂及耐氧化而不耐热的样品。 ( 2 ) 氮气吹干用氮气吹扫样品液，加速溶剂的挥发，同时氮气可保护样品不 被氧化。适用于耐氧化性差的样品。 ( 3 ) 减压蒸千将样品液置于水浴上加热，并在液面上抽真空减压，加速溶剂 挥发。适于沸点高的溶剂及耐热的样品。 ( 4 ) 旋转蒸发器将样品液装入旋转蒸发器的圆底烧瓶，置于水浴上加热，同 时在液面上抽真空减压，并连续旋转圆底烧瓶以扩大蒸发面，如此可大大加 4 竺墨兰堕丝 速溶剂的蒸发，是一种效率较高的浓缩方法。 ( 5 ) 冷冻干燥须在专用的冷冻干燥器上进行的。原理是将样品液冷冻，同时 抽真空减压，使溶剂升华除去，达到浓缩的目的。该法适用于具有生物活性 样品的浓缩。 自然挥干需要时问较长，易造成样品的污染；氮气吹干适用于易被氧化 的样品，而本实验的检测对象吡虫啉不易被氧化：冷冻干燥法使用于生物活 性样品的浓缩。旋转蒸发器与减压蒸干都是省时高效的方法，但旋转蒸发器 需要对样品多次转移，故本实验首选减压蒸干为浓缩的首选方法。 三、吡虫啉标准品保留时间稳定性分析 保留时间是确定色谱峰位置的标志，也是定性分析的依据，与待测物组 成成分密切相关。在一定的色谱条件下，任何物质都有一定的出峰位置即保 留时间。本实验分别考察2 0 0 3 年1 2 月，2 0 0 4 年5 月，2 0 0 5 年2 月吡虫啉 ( 0 0 5 u g m l ) 的保留时间，以判断该物质的稳定性。 t m h i n 州 哪 l 图1 52 0 0 3 年1 2 月吡虫啉标准样品0 0 5 u g m l 色谱图 f i g1 5t h eh p l cc h a r t o fi m i d i e l o p r i di nd e c e m b e r2 0 0 3 沈阳农业大学硕士学位论文 一m 图1 62 0 0 4 年5 月o 0 5 u g m l 毗虫啉标准样品色谱图 f i g1 6t h eh p l cc h a r t o fi m i d i c l o p r i di nm a y2 0 0 4 _ n 枷 ； f尺 l jl 图1 72 0 0 5 年2 月0 0 5 u g m l 吡虫啉标准样品色谱图 f i g1 7t h eh p l cc h a r to fi m i d i c l o p r i di nf e b e r a r y2 0 0 5 四、色谱定性定量分析 ( 一) 定性分析 下列分别为毗虫啉标准样品o 0 5 u g m l ，稻谷、白菜及苹果样品空白及 o 0 0 5 u g m l 标准添加样品的色谱图。根据保留时间对照进行定性分析。 结果与讨论 t 一 图1 8 吡虫啉标准样品0 0 5 u g m l f i g1 8t h eh p l cc h a r t o fi m i d i c l o p r i d0 0 5 u g m l 圈1 9 稻谷样品空白色谱圈 f i g1 9t h eh p l cc h a r t o fp a d d yb l a n k n e s s ，7 。二2 = = 三= 2 2 2 2