（动物营养与饲料科学专业论文）nisin基因在乳酸乳球菌中的表达及其发酵条件的研究.pdf

j 妒 ， 舻 d i s s e r t a t i o nf o rt h e d e g r e eo f m a s t e r e x p r e s s i o no fn i s i ng e n ei nl a c t o c o c c u sl a c t i sa n dr e s e a r c ho ni t s o p t i m a t a t i o n f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s s u b m i t t e dt o t h eg r a d u a t es c h o o lo fz h e j i a n gu n i v e r s i t y 3 3舢5m 3 17 舢1舢y 目录 英文缩写词1 中英文摘要。2 第一章文献综述5 ln i s i n 的发展史。5 2n i s i n 的分子生物学研究现状。6 3n i s i n 生物学功能及其作用机理9 4n i s i n 生产工艺的研究现状 5n i s i n 的应用 6 本研究目的和意义1 8 第二章n i s i n 基因的亚克隆 1 试验材料1 9 2 试验方法 3 试验结果与分析2 2 第三章n i s i n 基因在乳酸乳球菌中的表达2 4 1 试验材料。 2 试验方法 3 试验结果与分析 3 1n i s i n 效价测定及计算2 7 3 2e c o l im c l 0 6 1 阳性菌的筛选与鉴定2 7 3 3n i s i n 基因在乳酸乳球菌中的表达2 8 3 4重组乳酸乳球菌l 1 a c t i sn i p 发酵上清液抑菌活性检测2 9 3 5表达产物n i s i n 的纯化2 9 第四章l l a c t i sn i p 发酵条件的研究3 1 1 试验材料。3 1 2 试验方法。3 l 3 试验结果与分析。3 2 3 11 a c t i sn i p 发酵动力学研究3 2 3 2碳源对l 1 a c t i sn i p 发酵产n i s i n 的影响3 3 3 3 氮源对l 1 a c t i sn i p 发酵产n i s i n 的影响3 4 3 4 磷源对l 1 a c t i sn i p 发酵产n i s i n 的影响3 5 3 5微量元素对l 1 a c t i sn i p 发酵产n i s i n 的影响3 7 3 6 p h 对l 1 a c t i sn i p 发酵产n i s i n 的影响3 8 3 7 培养温度对l 1 a c t i sn i p 发酵产n i s i n 的影响3 8 3 8 表面活性剂对l 1 a c t i sn i p 发酵产n i s i n 的影响一3 8 小结与创新点4 2 参考文献。4 3 致谢 l i 一 一 n 0 英文缩写词 英文缩写词 中文摘要 中文摘要 乳链菌肽( n i s i n ) 是某些乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ，l 1 a c t i s ) 产生的羊毛硫 氨酸类细菌素，对芽孢、多种革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用，对人体安全无毒，在 食品、医药、畜牧业中有较好的应用前景。目前，n i s i n 的生产菌株大都是通过天然菌 株的筛选或诱变获得，其活力的提高和功能的改造受到一定的限制。因此，本研究在 克隆n i s a 的基础上，利用d n a 重组技术获得产n i s i n 的重组乳酸乳球菌工程菌株，并 优化了其发酵条件。主要研究结果如下： ( 1 ) 以含有n i s i n 前体基因( n i s a ) 的重组克隆载体p u c m t l n i 为模板( 本实验室 保存) ，设计一对分别含有n c o i 、x b a i 的表达引物，对n i s i n 基因进行亚克隆，构建重 组克隆载体p u c m t n i s 。序列测定表明，亚克隆得到的n i s i n 基因序列与原基因一致。 ( 2 ) p u c m t n i s 经n c oi 和x b ai 双酶切，与经相同酶切的乳酸乳球菌表达载体 p n z 8 0 连接，转化e c o l im c l 0 6 1 感受态细胞，经双酶切和p c r 鉴定，筛选获得含重 组质粒的阳性菌。提取重组质粒电击转化入乳酸乳球菌l 1 a c t i sl z ( n i s a 缺失株) ，筛 选得到含重组质粒p n z 8 0 n i s 的基因工程菌一l l a c t i sn i p 。抑菌试验表明，l 1 a c t i sn i p 发酵上清液对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌、李斯特杆菌等( g + 菌) 及嗜水气假单孢菌( g - 菌) 都有明显的抑菌效果。 ( 3 ) l 1 a c t i s n i p 的发酵条件优化结果表明，产n i s i n 的最佳发酵氮源、碳源和磷源分 别是酵母粉、麦芽糖和磷酸氢二钾，添加量分别是1 5 、1 5 和3 ；发酵最适初始 p h 为6 5 ，最适培养温度是2 8 ，发酵时间为1 4 h ，在上述优化条件下，l 1 a c t i sn i p 发酵上清液中目的蛋白的抗菌活力( n i s i n 效价) 达到最高值5 0 4 0 i u m l ，比非优化条 件下的效价提高了4 0 4 。 以上结果为提高n i s i n 产量和降低n i s i n 生产成本提供基础，也为进一步深入研究 n i s i n 的结构与功能及扩大n i s i n 的商业应用提供了一定的材料和理论基础。 关键词：乳链菌肽；克隆；表达；乳酸乳球菌；抑菌效价；发酵条件 2 一 英文摘要 a b s t r a c t n i s i ni sal a n t i b i o t i c - t y p eb a c t e r i o c i np r o d u c e db yc e r t a i ns t r a i n so f l a c t o c o c c u sl a c t i s i tc a ni n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fm o s tg r a m - p o s i t i v e ( b a c t e r i aa n ds p o r eg e r m i n a t i o n , a n di ti ss a f ef o rh u m a na ss a l t n i s i ni su s e di nw i d e r a n g eo ff o o dp r o d u c t sa n di th a sg o o d p r o s p e c ti na p p l i c a t i o ni nm e d i c i n ea n ds t o c k b r e e d i n g n o w a d a y sa l lt h en i s i n - p r o d u c i n g l a t t i ca c i db a c t e r i aw e r en a t u r a ls t r a i n si s o l a t e df r o mn a t u r a lo rt h e i rm u t a t i o n s a n di ti s d i f f i c u l tt oi n c r e a s et h e s t r a i n s p r o d u c t i o nl e v e la n di m p r o v et h ep r o p e r t yo fn i s i n t h e r e f o r eg e n e t i ce n g i n e e r i n gn i s i n - p r o d u c i n gs t r a i nw a sc o n s t r u c t e dw i t hr e c o m b i n a n t d n a t e c h n i q u e sa n dt h ek i n e t i c so fg e n e t i ee n g i n e e r i n gs t r a i nf e r m e n t a t i o nw a sa l s os t u d i e d t oo p t i m i z ei t sc u l t u r ec o n d i t i o n sw i t ha i mt or e d u c ec o s ta n di m p r o v ey i e l do fn i s i ni nt h i s r e s e a r c h t h em a i nr e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t os u b c l o n en i s a ，p r i m e r s5 p l na n d3 p i nw h i c hc o n t a i nn c oia n dx b air e s t r i c t i o n e n z y m es i t e s ，r e s p e c t i v e l yw e r ed e s i g n e d ，a n dn i s ad n af r a g m e n tw a so b t a i n e db yp c r u s i n gr e c o m b i n a n tp l a s m i dp u c m t l n i ；s e q u e n c i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo f n i s aw a st h es a m ea s n i s i ng e n e ( 2 ) p u c m t n i sf r a g m e n tw a st h e nl i g a t e di n t on c oia n dx b ais i t e so fp n z 8 0 t h e l i g a t i o nm i x t u r ew a st r a n s f o r m e di n t oe c o l im c l 0 6 1f o rt h ei n i t i a lc l o n i n g s e l e c t i n go f t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp n z 8 0 n i sw a sa n a l y z e d b yr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n dp c r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp n z 8 0 n i sw a st r a n s f o r m e di n t ol 1 a c t i sl zb ye l e t r o p h o r o u s ， a n dt h er e c o m b i n a n ts t r a i nw a ss e l e c t e da n dn a m e dl 1 a c t i sn i p t h en i s i na c t i v i t i e so f 。 s u p e m a t a n t sw e r ed e t e r m i n e db ya g a rw e l ld i f f u s i o nm e t h o d ( a w d ) t h er e s u i t sr e v e a l e d t h a tt h ef e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n to ft h eg e n e t i cs t r a i nc a l lr e s i s tt h et e s t e dg r a m p o s i t i v e b a c t e r i a , s u c h 嬲：s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，m i c r o c o c c u sl u t u e s , b a c i l l u ss u b t i l i s ，l i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s ，a n do n et e s t e dg r a m n e g a t i v eb a c t e r i u m ：a e r o m o n u sh y d r o p h i l a ( 3 ) t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fl 1 a c t i s n i pw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h eo p t i m a ln i t r o g e ns o u r c e ，c a r b o ns o u r c ea n dp h o s p h o r u ss o u r c ea r e1 5 y e a s t ，1 5 3 一 英文摘要 m a l t o s ea n d3 k 2 h p o , ，r e s p e c t i v e l y l 1 a c t i s n i ps h o w e dh i 曲a c t i v i t yw h e nc u l t u r e da t 2 8 c ，p h 6 5 t h ea c t i v i t yo fn i s i nr e a c h e d5 0 4 0 i u m lw h e nt h es t r a i nw a sc u l t u r e du n d e r t h eo p t i m a t e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s k e yw o r d s ：n i s i n ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n ；l a c t o c o c c u sl a c t i s ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ； f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 第一章文献综述 第一章文献综述 乳链菌肽( n i s i n ) ，又称乳酸链球菌素、尼生素等，是由乳酸乳球菌某些菌株生长 过程中产生的次级代谢产物。n i s i n 对芽孢和多种革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用，对 人体安全无毒，是一种高效、无毒的天然食品防腐剂，已广泛用于乳制品、高蛋白饮 料、罐装食品的防腐保鲜；在医药方面已用于口腔保健、胃溃疡治疗及艾滋病治疗等 领域，它有广阔的市场价值和经济价值，n i s i n 是迄今为止研究最彻底的一种细菌素， 随着分子生物学的广泛应用，对n i s i n 的研究也更加深入。 1n i s i n 的发展史 早在1 9 2 8 年，r o g e r s 和w h i t t i e r 就发现乳酸链球菌的代谢产物能够抑制部分革兰 氏阳性菌的生长。1 9 3 3 年w i t e h e a d 提出这种抑制物的本质是一种多肽。1 9 4 4 年m a t - t i c k 和h i r s c h 从乳酸链球菌发酵液中制备了这种多肽物质，并指出它们是由血清学n 群中 的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质，命名为n i n h i b i t o r ys u b s t a n c e 即n 群抑菌 物质( ni n h i b i t o r ys u b s t a n c e ) ，简称为n i s i n 。1 9 5 1 年，h i r s h 等人首先将n i s i n 用于食 品防腐，成功地控制了肉毒梭菌引起的埃氏奶酪的膨胀腐败。从此引起了人们对n i s i n 的关注，有关研究也广泛开展起来。到1 9 5 3 年首次在英国进行商业化生产，其商品名 称为n i s a p i n 。1 9 6 8 年f a o w h o 添加剂联合委员会对n i s i n 的安全性进行了认定， 并在法律上规定可作为食品添加剂使用。这是第一个且是目前唯一用于食品工业的乳 酸菌素。1 9 8 3 年，n i s i n 被美国食品和药物管理局批准使用。1 9 9 0 年3 月2 9 日，n i s i n 被列人我国国标g b 2 7 6 0 8 6 的1 9 9 0 年增补品种中。1 9 9 4 年中科院微生物所和浙江银 象制药合作，自行研究和开发了突变菌株并投入生产。迄今为止，n i s i n 已在全世界约 6 0 多个国家和地区被批准用作食品防腐剂。 19 6 4 年t a m e r 建议使用1r u ( r e a d i n gu 1 1 i t ) 表示每微克纯乳酸链球菌素制各物中存 在活性的量。1 9 7 0 年世界卫生组织微生物标准委员会制订乳酸链球菌素的国际标准计 量单位为，并规定1 r u - - 4 0 i u 。在实际研究中还有一些单位采用a u 等( i l u - - 1 0 0 a 1 7 ) 。 5 第一章文献综述 2n i s i n 的分子生物学研究现状 2 1n i s i n 的分子结构 n i s i n 分子式为c 1 4 3 h 2 2 5 n 4 2 0 3 7 s 7 ，相对分子质量为3 5 1 0 d a ，由3 4 个氨基酸残基 组成，活性分子常呈二聚体或四聚体，分子量分别为7 k d a 和1 4 k d a 。n i s i n 属于典型 的羊毛硫抗生素，在转译水平上，n i s i n 前体分子含5 7 个氨基酸，其中n 端2 3 个残 基位于引导区，3 4 个残基在结构区。其分子结构的最大特点是含有较多的修饰性氨基 酸，在成熟n i s i n 分子的3 4 个氨基酸中有1 3 个是翻译后加工修饰形成的。 n i s i n 属于双亲性阳离子多肽，成熟的分子由2 个结构域组成：n 端结构域( 3 1 9 位残基) 含有a 、b 、c 三个环，n 末端残基为异亮氨酸( i l e ) ，c 端结构域( 2 2 2 8 位氨基酸) 含有d 和e 两个相互缠绕的环，末端残基为赖氨酸( l y s ) ，这两个结构域 都具有疏水面和亲水面的双亲结构，且两端的顶端区域有一定的弯曲性( v a nk r a a i j 等，1 9 9 9 ；v a nd e n 等，1 9 9 6 ) 。 n i s i n 天然状态下主要有两种分子形式，即n i s i na 和n i s i nz ，二者的区别是n i s i n z 第2 7 位氨基酸残基为a s p 而n i s i n a 为h i s ，它是由于其结构基因上的第1 4 8 位脱氧 核苷酸不同是造成的。此突变对肽链的理化特性及生物学功能影响很小，n i s i nz 比n i s i n a 略微容易在琼脂中扩散。一般而言，相同浓度下，n i s i nz 的溶解度和抑菌能力比n i s i n a 强( d ev o s 等，1 9 9 3 ) 。 2 2n i s i n 基因的遗传学研究 n i s i n 基因的定位曾有两种理论，一种认为它与质粒连锁，另一种则认为在染色体 上。目前比较认同的是后一种观点。k o z a k ( 1 9 4 7 ) 研究产n i s i n 菌株的突变现象时，推 测n i s i n 基因可能位于质粒上。进一步研究发现n i s i n 的产生与一个1 7 5 m d a 的质粒有 关。k 2 l l e t t a ( 1 9 9 1 ) 从乳酸链球菌6 f 3 的质粒中成功克隆到了编码n i s i n 的结构基因。通 过对质粒消除和接合转移实验也证实n i s i n 基因位于质粒上，并认为n i s i n 产生基因 ( n i p + ) 、蔗糖发酵基因( s u d ) 、n i s i n 抗性基因( n i s ) 是紧密连锁的( m c k a y 等，1 9 8 4 ) 。 d o n k e r s l o o t 等( 19 9 0 ) 发现产n i s i n 的乳酸链球菌k 1 的染色体缺失可导致n i p + 、s u e + 、 n i s 和n 5 ( 羧乙基) 鸟氨酸酶基因的缺失，并根据杂交结果提出n i s i n 结构基因与染 色体上的一个可接合转移的转座子有关，后来相继有许多研究证实了这一点，即n i s i n 生物合成基因位于染色体上的可接合转移的转座子上，且发现n i s i n 基因座是不稳定 的。 6 第一章文献综述 2 2 1n i s i n 的结构基因 n i s i n 基因簇位于染色体的一个大的接合型转座子上的一段1 4k b 区域内( r a u e h 等，1 9 9 2 ) 。参与n i s i n 生物合成和发挥免疫抗性所需的全部基因，即基因 i l i s 舰b t c i p r j 口e g 的组合，称前n i s i n 基因。n i s i n 基因簇中有些基因序列已经测定， 基因簇中除了n i s a z 属于n i s i n 编码基因外，其余几个分别参与n i s i n 的翻译后修饰 ( n i s b c ) 、转运( i l i s t ) 和胞外蛋白水解反应( n i s p ) ，以及参与对n i s i n 的免疫反应( n i s i 和r t i s f e g ) 及其生物合成调控( n i s r 和n i s k ) 。如图1 所示。 f i r写甲 卜豳圆豳匦枷畸匝汩墨窗卜汰灏溺 运黎鬣降n i s i n 基因簇( 1 4 k b ) n i s an i s b n i s tn i s cn i s in i s p n i s r n i s kn i s fn i s en i s g 5 79 9 36 0 04 1 42 4 56 8 22 2 8 4 4 62 2 52 4 12 1 4a a 图1n i s i n 基因簇序列及其启动子定位 p ，启动子；i r , 不依赖于p 的终止子反向重复序列 f i g 1 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h eo r g a n i z a t i o no ft h en i s i ng e n ec l u s t e r ，l o c a t i o n o ft h eh i s i np r o m o t e r s pd e n o t e sam a p p e dp r o m o t e r , a n di rd e n o t e sa l le x t e n s i v ei n v e r t e d r e p e a ts e q u e n c et h a tc o u l da c t 鹊f lr h o - i n d e p e n d e n tt e r m i n a t o r n i s a 是前n i s i n 的实际编码区域，尽管间隔序列有些不同，但前n i s i n 的实际编码 区域都是相同的。试验也证实从不同的乳明串菌中各自分离得到的n i s a 基因极少有差 异。根据d e v o s 等( 1 9 9 1 ) 的建议，这些基因均定名为n i s a ，即前n i s i n 的结构基因。 n i s a 结构基因首先在核糖体中合成含5 7 个氨基酸残基的原始初链，它们是成熟分子 中修饰氨基酸残基的前身，称为前n i s i n ( p r e n i s i n ) 。前n i s i n 在细胞膜上进行翻译后加 工和修饰，经过脱氢和形成硫醚环等形成n i s i n 前体( p r c c u s o rn i s i n ) ，其中前2 3 个氨 基酸残基组成n 端先导序列，分泌到细胞外后经蛋白酶切除，剩余3 4 个残基的c 端 区域，即为成熟的n i s i n 分子。 2 2 2n i s i n 基因的启动子序列 n i s i n 合成基因为多顺反子操作子，1 1 个基因序列分别由3 个启动子控制其转录，即 n i s a 、n i s r 和n i s f 启动子，分别起始转录n i s a z b t c i p 、n i s r k 和n i s f e g 多顺反子。 眦1 a c t i sn z 9 7 0 0 中得到了n i s a 的启动子序列，其存在于接合转座子t n 5 2 7 6 上 ( k u i p e r s 等，1 9 9 3 ) 。在n i s a 和n i s b 之间具有大的反向重复序列，它起转录终点信号的 作用，负责有限的通读，n i s b 的表达也依赖于n i s a 启动子( k u i p e r s 等，1 9 9 5 ) 。n i s b 的 下游基因( i l i s t c i p ) 并没有发现明显的启动子序列，目前认为这些基因的表达也受控 7 第一章文献综述 于n i s a 启动子( k u i p e r s 等，1 9 9 5 ) ，但仍没有发现表征所有这些基因共同转录的大的转 录产物。 n i s f 和n i s a 启动子有很大的同源性，- - 3 5 区极为相似，以c t g 起始，且3 5 区和一 l o 区中间间隔2 0 b p ，符合乳酸菌可调控启动子共同特征，实验已经证实它们均为可诱 导调控的启动子，可被n i s i n 诱导且与n i s i n 浓度在一定范围内成正比；而且启动二者转 录都需要完整的n i s r k 基因的参与。n i s i n 可以通过n i s 懈组分调控体系调节n i s a 和 n i s f e g 启动子的转录起始。而n i s f 启动子强度l l n i s a 强度要小( 杨之龙等，2 0 0 2 ) 。因此， 我们通常选用n i s a 来构建载体。n i s r 与前两者有很大不同，在菌体内通常为组成型表达， 难于调控。 n i s a z 是n i s i n 的结构基因，所编码的乳链菌肽前体( p r e n i s i n ) e h 5 7 个氨基酸组成， 其中n 一端2 3 个残基为信号肤区；信号肽在细胞表面被信号肽酶水解去除后，释放成熟 的有活性的n i s i n 。由于乳链菌肽诱导系统( n i c e ) 的诱导物和宿主菌都是食品级的，方 便、经济、安全且诱导效率在1 0 0 0 倍以上( 张振中等，2 0 0 2 ) 。因此，基于n i s a 构建的表 达载体一直以来都是研究的热点，并于1 9 9 6 年开始用于目的基因的表达研究，目前国 内外已有大量报道。 2 2 3n i s i n 翻译后修饰 n i s i n 是一种转录后修饰多肽片段，含有脱水碱基及环状硫醚键。n i s b 和n i s c 基因 编码的蛋白共同参与n i s i n 的翻译后修饰( k u i p e r s 等，1 9 9 5 ) 。其中n i s b 通常编码8 2 5 个氨 基酸，是1 0 0 5 k d 的蛋白质，位于前n i s i n 基因的第2 个阅读框架，其编码的n i s b 蛋白分 子c 末端附近有一个由1 4 个氨基酸残基组成的跨膜螺旋区和具有双重性质的q 螺旋， 可推断该蛋白是一个缺失了n 端前导序列的膜结合蛋白，参与前n i s i n 分子的修饰作用。 同时也发现了另外两种由于移码突变而产生的不同大小的n i s b 基因。n i s c 蛋白含有4 1 4 个氨基酸残基，分子量4 7 3k d ，与n i s b 一样在乳酸菌素成熟过程中起作用，它们都结 合于膜上，参与脱氢和硫醚环的形成。k o p o n e n 等( 2 0 0 2 ) 分别在缺失n i s b 和n i s c 的菌 株表达了带h i s 标记的n i s i n 前体基因，分析发现n i s b 缺乏株中前体蛋白完全没有经过修 饰，而n i s c 缺失株所表达的n i s i n 前体具有脱氢氨基酸残基却没有形成羊毛硫氨酸环， 据此推测n i s b 具有脱水功能而n i s c 催化脱水残基与半胱氨酸形成硫醚键。 第一章文献综述 2 2 4 n i s i n 胞外转运 分子量为6 9 k d a 的蛋白n i s t ，它属分泌型蛋白，与a b c 输出蛋白有强烈同源性， 其c 端含有w a l k e r 特征序列，n 。端具有一段疏水的跨膜结构域，用于膜上定位，参 与修饰后n i s i n 前体的胞外转移( 陈秀珠等，2 0 0 2 ；b l i g h t & h o l l a n d ，1 9 9 0 ) 。有研究表明， 2 分子n i s c 和2 分子n i s t 是修饰、转运复合物的组成部分( s i e g e r s 等，1 9 9 6 ) 。r a 等 ( 1 9 9 6 ) 试验也证实，破坏n i s t 基因将导致n i s i n 前体的细胞内积累。然而也有研究 指出( k u i p e r s 等，1 9 9 3 ) ，在多肽与信号肽结合在一起的前提下，n i s t 可以在n i s b 、n i s c 不表达的情况下，单独转运未经修饰的及部分修饰的前体肽至胞外，这为今后表达具 有稳定活性的多肽开辟了新的途径。 3n i s i n 生物学功能及其作用机理 3 1n i s i n 理化性质 n i s i n 的溶解度依赖于溶液的p h ，随p h 的下降其溶解度显著增加，它在p h 2 5 时 溶解度为1 2 ，p h 5 0 时大约下降为4 ，在中性和碱性条件下几乎不溶。n i s i n 的最 佳溶剂为0 0 2 m o l l 的盐酸。n i s i n 的稳定性也与溶液的p h 有关。p h 2 0 的n i s i n 溶液 经11 5 6 c 、1 2 1 高压灭菌仍具有活性，p h 5 0 时灭菌后丧失4 0 活性，p h 7 0 时即 使在室温( 2 5 c ) 保存一天活力损失达2 5 ，p h8 0 时，在室温保存2 4h 其活力损 失9 9 以上，经p h l l ，6 3 处理3 0 m i n ，活性全部丧失( h a n s e n 等，1 9 9 1 ) 。n i s i n 可 被人体中的胰凝乳蛋白酶降解，因而n i s i n 不会在体内残留或造成体内致病菌的抗药 性。对n i s i n 的毒性与生物学研究表明它对人体是安全的，其半致死量与食盐相近。而 且n i s i n 和治疗抗生素间无任何交叉性的互相抵消作用。 3 2n i s i n 生物学功能 n i s i n 能有效地抑杀许多g + 菌，如乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) 、分支杆菌 ( m y c o b a c t e r i u m ) 、微球菌( m i c r o c o c c u s ) 、葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s ) 、肠球菌 ( e n t e r o c o c c u s ) 、片球菌( p e d i o c o c c u s ) 、明串珠菌( l e u c o n o s t o c ) 、李斯特氏菌( l i s t e r i a ) 和链球菌( s t r e p t o c o c c u s ) 等；对芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 和梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u m ) 细胞及芽孢的萌发也有抑制作用。通常n i s i n 对g 菌没有抑制作用，但一些细胞膜干 扰剂( e d t a 、柠檬酸盐、磷酸钠和六偏磷酸钠) 或者亚致死伤害因素( 加热、冷冻、 9 第一章文献综述 高压、超高压u h p 和脉冲电场p e f ) 会改变g 一菌外膜对n i s i n 的通透性，使g 一细菌 对n i s i n 敏感，此外，n i s i n 和一些天然成分及其他防腐剂联合使用时具有增益效应， 可以改善其抗菌谱、增强其抗菌效果。 3 3n i s i n 作用机理 n i s i n 的杀菌功能与n i s i n 中的五种稀有氨基酸和其本身的阳离子去污性质有关 ( j a c k 等，1 9 9 5 ) 。n i s i n 的抑菌作用机理尚未完全清楚，但可以明确的是n i s i n 作用的 主要靶位点为细胞膜，并通过在细胞膜上形成孔道产生抑菌作用。孔道形成使维持生 命必需的离子梯度、p m f ( 跨膜电势、p h 梯度) 耗散，p m f 的耗散会中止一系列能 量依赖反应从而导致细胞死亡。n i s i n 可通过两种方式形成孔道，一种是n i s i n 在微摩 尔级浓度下形成无靶目标( 即无l i p i di i ) 介导的孔道；另一种是n i s i n 在纳摩尔级浓 度下通过活细菌细胞膜上的l i p i di i ( 细菌萜醇一焦磷酸一n 乙酰胞壁酸一五肽一n 乙 酰葡萄糖胺，u n d e c a p r e n y l - - p y r o p h o s p h o r y l - - m u r n a e - - ( p e n t a p e p t i d e ) - - g l c n a c ) 的 介导形成孔道，同时n i s i n 与l i p i di i 的结合抑制肽聚糖的生物合成。 3 3 1n i s i n 与膜模型的相互作用 通过运用膜系统模型的研究表明，n i s i n 通过结合、插入、孔道形成等步骤在膜上 形成孔道复合物。 n i s i n 与膜相互作用时，n i s i n 通过其c 端与磷脂头部之间的静电引力与脂质双层 膜紧密结合( b r e u k i n k 等，1 9 9 7 ) ，定位于脂质头部区域后，其疏水侧面插入脂质双分子 层的外层。此外疏水作用力起着次要作用( j a s t i m i 等，1 9 9 9 ) ，并受到磷脂种类的制约( 本 质上受静电引力的影响) 。在脂质单分子层中，n i s i n 对带负电荷的磷脂的亲和性高于 两性离子磷脂。b r e u k i n k 等人( 1 9 9 7 ) 用由不同比率带负电荷的磷脂酰甘油( p g ) 和 两性离子磷脂酰胆碱( p c ) 构成的脂囊研究表明：当p g 含量超过4 0 时，k + 外泄剧 烈增加，表明n i s i n 有效地结合需要大量的带负电荷的磷脂。n i s i n 与带负电荷的膜( 由 2 5 p g 组成) 之间的静电引力可提供n i s i n 结合所需总能的6 0 ( b r e u k i n k 等，2 0 0 0 ) 。 b r e u k i n k 等( 1 9 9 7 ) 运用n i s i n 变异体所做的研究表明，n i s i n 的分子结构也影响 n i s i n 与膜的结合。v a l 3 2 被g l u 代替后可显著减少n i s i n 与膜结合对带负电荷的磷脂的 依赖性；v a l 3 2 被l y s 代替后n i s i n 对膜的结合能力提高；在c 端增加更多的正电荷对 n i s i n 的抗菌活性仅有较小的影响。n 端变化仅轻微地影响n i s i n 与膜的结合能力；n 端第一个硫醚环开环，可使n i s i n 的活性丧失，而几乎不影响n i s i n 与膜的结合能力。 1 0 第一章文献综述 这些结果表明c 端对n i s i n 与膜结合起着重要作用，是与脂质相互作用的最初结合位 点。b r e u k i n k 等( 1 9 9 8 ) 研究发现n 端的色氨酸残基位于最深的插入位点，而c 端 的色氨酸残基靠近膜的表面，同时也发现n i s i n 稳定地定位在膜上并与膜表面平行的。 这些结果表明n i s i n 的n 端是最初插入膜脂相的部分，n i s i n 并没有穿透脂质双分子层， 而是结合在脂质的头部区域并平行于脂质双分子层平面。 ( 1 ) 无靶目标孔道形成的模型 关于n i s i n 形成无靶目标的孔道机制已提议出几种模型。最初提出桶板( b a r r e l s t a v e ) 模型，后来被改良为楔入( w e d g e ) 模型。两种模型的不同在于r a i s i n 分子插 入目标细胞质膜的模式。 根据桶板模型，插入的n i s i n 的疏水侧面与膜的脂质疏水核心相互作用，n i s i n 亲 水侧面朝向孔道内腔，n i s i n 单体聚集导致亲水孔道的形成。孔道的大小与稳定性取决 于参与孔道形成的n i s i n 分子数目。根据楔入模型，n i s i n 分子与膜结合后，引起脂质 双分子层的局部移位进而形成孔道的。由于n i s i n 分子的双亲性的特性，n i s i n 分子不 但通过静电引力与磷脂头部基团相互作用，而且其疏水侧面可插入脂质双分子层的外 层结构中。几个n i s i n 分子跨过膜形成孔道，此时n i s i n 分子仍然结合在膜表面，并相 对于脂质头基团的位置不变。因此与桶板模型相反，楔入模型认为n i s i n 分子不与脂质 双分子层膜的疏水核心相接触。但两种模型都认为n i s i n 分子的亲水侧面朝向孔道内 腔。 无靶目标的孔道形成模型解释了n i s i n 对纯粹脂质双分子层的作用行为，在这些模 型中要取得良好的效果，需要高浓度的n i s i n ( 微摩尔级) 。 ( 2 ) n i s i n 与l i p i di i 的相互作用 b r 6 t 等研究发现由于n i s i n 运用l i p i di i 作为孔道形成的锚定部位而造成了用活细 菌做实验时，n i s i n 的m i c 降低了2 3 个级数的现象。l i p i di i 是细胞壁前体物质，它 由一个肽聚糖头部和一个脂尾部构成，通过细菌萜醇结合在细胞膜上。肽聚糖头部即 是n 乙酰胞壁酸一五肽一n 乙酰葡萄糖胺，是细胞壁的基本构成成分；脂尾部即是焦 磷酸一细菌萜醇，作为载体把肽聚糖部分从细胞质转移到胞外区域。 n i s i n 运用l i p i di i 作为靶目标介导孔道形成，同时阻止l i p i di i 参与肽聚糖的生物 合成，从而抑制细菌细胞壁的生物合成( l i n n e t t 等，1 9 7 3 ) 。通过l i p i di i 介导，n i s i n 形 第一章文献综述 成的孔道寿命从m s 提高到几秒，n i s i n 的m i c 从微摩尔级降到纳摩尔级范围，可见n i s i n 的活性显著增加。 l i p i di i 的脂质部分并不足以启动孔道的形成，n 乙酰胞壁酸对n i s i n 的作用有重要 影响。b r e u k i n k 等( 1 9 9 9 ) 根据对n i s i n 敏感的甲烷杆菌( m e t h a n o b a c t e r i u m ) 和真细菌 ( e u b a c t e r i a ) 的l i p i di i 的糖链结构的相似性，推测m u r n a c 糖链骨架是n i s i n 的识别 位点。但如果仅有糖链作为识别位点就意味着整个细胞壁将成为n i s i n 的接受器，因此 焦磷酸盐( p y r o p h o s p h a t e ) 和或者细菌萜醇( u n d e c a p r e n y l ) 也参与n i s i n 与l i p i di i 的 相互作用( b r e u k i n k 等，1 9 9 9 ) 。 l i p i di i 作为n i s i n 结合细菌细胞膜的锚定部位，可降低n i s i n 插入膜中所需能量。 b r e u k i n k 等( 1 9 9 9 ) 研究表明l i p i di i 的浓度在0 0 0 1