（农药学专业论文）毛细管亲和整体色谱柱的制备及应用.pdf

浙坚三些奎堂堡主兰焦笙苎 一 论文摘要 相对于常规高效液相色谱，毛细管高效液相色谱具有以下优点：样品需要量和 流动相消耗量大大减少；流量大大降低，方便了与一些如质谱等浓度型检测器的联 用。同时在毛细管液相色谱中采用整体柱的形式：可以避免复杂的装填过程和塞子 的制作；并且此整体柱具有良好的通透性，本实验中可以在毛细管电泳仪具备的压 力下实现快速分离。 论文第二章分别以二元交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 和三元交联剂 三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) 为交联剂，以甲基丙烯酸缩水甘油酯 ( g m a ) 为单体制各了毛细管整体柱。接着对其表面进行化学修饰，分别制得了 含有1 1 个碳原子间隔臂以及不含间隔臂的，键合了蛋白a 的毛细管亲和整体柱。 并对所制备的整体柱进行了形貌和孔径分布的表征。 第三章考察了基于二元交联剂( e d m a ) 的毛细管亲和整体柱在人免疫球蛋白 ， g ( i g g ) 的分离分析中的性能和应用。f 比较了有无间隔臂固定相对非特异吸附性 l 能的影响，发现不含间隔臂的毛细管亲和整体柱没有对b s a 的非特异吸附；故用 不含间隔臂的亲和整体柱来测定人血浆中人免疫球蛋白g ( h i g g ) 。得到了 h i g g 的峰高与标准溶液的浓度间有很好的线性关系，其相关系数为0 9 9 8 7 ；测定 、 了人血浆中h i g g 的含量。在快速分析实验中，一次运行可在0 7 分钟内完成。 第四章考察了基于三元交联剂( t r i m ) 的毛细管亲和整体柱的性能和应用。 结果表明，在不含间隔臂的整体柱上同样没有检测到b s a 的非特异吸附；考察了 铡：定a a t 浆中h i g g 的重现性；测定了h i g g 的峰高与标准溶液的浓度间的标准曲 浙江工业大学硕士学位论文 线及人血浆中h i g g 的其含量并且通过测定峰高与洗脱压力的关系，验证了用于 快速分离分析的可行性。 i ， 第五章比较了基于e d m a 和t r i m 的毛细管亲和整体柱的重现性和压力流速 曲线，得出了基于三元交联剂( t r i m ) 的整体柱具有更高的机械强度的结论。通 过电子扫描电镜图和孔径分布图，以及对聚合机理的探讨，对两种整体柱的性能差 异作出了一定的解释。 关键词：毛细 谱，毛细管亲和擎体柱，交联剂，蛋白a ，h 1 9 9 一 v v 、， 秒 管 一塑坚三些奎堂堡主兰垡笙塞 a b s t r a c t c a p i l l a r yc o l u m n so f f e rs o m ed i s t i n c t a d v a n t a g e so v e rs t a n d a r dh p l c - e o l u m n 8 ， s u c ha sc o n s i d e r a b l yr e d u c e ds a m p l es i z e s ，l o w e rs o l v e n tc o n s u m p t i o n a n dl o w 。v o l u m e f l o wr a t e s w h i c he n h a n c et h ed e t e c t i o np e r f o r m a n c e w h e n u s i n gc o n c e n t r a t i o n s e n s i t i v e d e t e c t i o nd e v i c e s ，s u c ha sm a s ss p e c t r o m e t e r so rf l a m e b a s e dd e t e c t o r s t h em o n o l i t h i c c a p i l l a r yc o l u m n c a n p r o v i d et h ea d v a n t a g e so fg o o dh y d r o d y n a m i c c h a r a c t e r i s t i c ，l o w f l o wr e s i s t a n c ef o rt h eb i o m a c r o m o l e c u l e sa sw e l la sc a l la v o i dt h ec u m b e r s o m ea n d e x p e n s i v ep r o c e d u r e o ft h ep r e p a r a t i o na n dp a c k i n go fb e a d s a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o nac a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i si n s t r u m e n t ，u s i n g i t s p r e s s u r es y s t e m a st h ed r i v i n gf o r c e r e a c t i v em o n o l i t h i c c a p i l l a r y c o l u m nb a s e do nm a c r o p o r o u s p o l y ( g l y c i d y l m e t h a c r y l a t e c o e t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ) a n dm a c r o p o r o u sp o l y ( g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e c o - t d m e t h y l o l p r o p a n et r i m e t h a c r y l a t e ) h a d b e e n p r e p a r e db y ”i n - s i t u ” c o p o l y m e r i z a t i o no f t h em o n o m e r si nt h ep r e s e n c eo f p o r o g e n i cd i l u e n t s ，r e s p e c t i v e l y p r o t e i naw e r ei m m o b i l i z e do nb o t ht w om o n o l i t h sw i mas p a c e ra r l no rd i r e c t l y t h e s e c o l u m n sw e r ec h a r a c t e r i z e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n dm e r c u r y i n t r u s i o np o r o s i m e t r y t h ee d m ab a s e d c a p i l l a r ym o n o l i t h i cc o l u m n sw e r ea p p l i e df o ra n a l y s i ss t a n d a r d h u m a ni m m u n o g l o b u l i ng ( h i g g ) a n dh u m a ns e r u m t h en o n - s p e c i f i ca d s o r p t i o no f t h em e d i ah a db e e ns t u d i e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e d i u mw i t h o u ts p a c ea r r n g a v ev e r yl o wn o n s p e c i f i ca d s o r p t i o no f b s a t h ea f f i n i t yc o l u m nw i t h o u t s p a c e ra r m w a su s e dt od e t e r m i n et h eh i g gi nh u m a ns e r u m t h ec o r r e l a t i v ec o e f f i c i e n to ft h e c a l i b r a t i o nc u l w er e a c h e do 9 9 8 7 t h et o t a lt i m eo f r a p i da n a l y s i sw a s l e s st h a n0 7m i n 3 _ 。 ，。i 。娥：皤k j 虢i 乩毹 t t 浙江! 些查兰堡主堂堡堕塞 t h ec 。n s 啪p t i o n 。fe l u e n t b u f f e ra n ds a m p l ew a sm u c h1 0 wt h a nb yc 。吖。m i o n a l h p l c t h et r i mb a s e dc a p i l l a r ym o n o l i t h i cc o l u m n sw e r ea l s oa p p l i e df o ra n a l y s i s s t a l l d a r dh i g ga n dh u m a ns e r u n q n o n s p e c i f i ca d s o r p t i o n w a sa l s on o to b s e r v e do nt h e t r i mb a s e da f f i n i t yc o l u m nw i t h o u ts p a c e ra r m ，a sp r o v e d w i t hb s aa sat e s tp r o t 。1 n t h ea f f i n i t yc o l u m np r e p a r e dw i t h o u ts p a c e ra r mw a st h e na p p l i e dt o d e t e r m i n et h e h i 乜gc o n c e n t r a t i o ni nh u m a ns e r u m t h ec o r r e l a t i v ec o e f f i c i e n to f t h ec a l i b r a t i o nc u r v e r e a c h e do 9 9 4 2 f u r t h e r m o r e ，t h ea m o u n t o fa d s o r b e dh i g gw a su n a f f e c t e db y t h ef l o w r a t eo ft h el o a d i n gb u f f e r ，w h i c hm a k e s t h i sm e t h o ds u i t a b l ef o rf a s td e t e r m i n a t i o no f b i o p o l y m e r s i nm i c r ol i t e rs a m p l e s t h em e c h a n i c a ls t a b i l i t yo fb o t ht h ee d m a b a s e da n dt r i mb a s e dm o n o l i t h i c c a p i l l a r yc o l u m n sw a sc o m p a r e db yt e s t i n gt h er e p r o d u c i b i l i t ya n dt h el i n e a r i t yo f t h e f l o wv e l o c i t yv s t h ea p p l i e dp r e s s u r eo ft h ec o l u m np e r f o r m a n c e t h ec o l u m np r e p a r e d w i t hg m aa n dt r i mp r o v e dt ob em e c h a n i c a l l ym o r es t a b l et h a nt h eo n ep r e p a r e d w i t hg m aa n de d m a ，w h i c hc o u l db ee x p l n n e db yt h ed i f f e r e n c eo ft h ep o r o u s p r o p e r t i e s a n d p o l y m e r i z a t i o n m e c h a n i s mb e t w e e nt h et r i ma n de d m ab a s e d m o n o 】j t h s k e y w o r d s ：c a p i l l a r yl i q u i da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，m o n o l i t h i cc a p i l l a r yc o l u m n ， p r o t e i na ，h u m a n i m m u n o g l o b u l i n g 4 疆，黼：# 辐矗箍一h 、。 ，。 塑坚三些查兰堡主堂垡笙兰一 第一章文献综述 生物大分子的分离分析是目前色谱研究领域的一大热点，高效亲和液相色谱 ( h i g hp e r f o r m a n c ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , h p a c ) 是生物大分子纯化分离中最有效 的分离模式之一。整体材料( m o n o l i t h i cm a t e r i a l s ) 的帝1 备是近年来发展起来的一种 新型色谱填料合成技术，它是通过在空管柱中加入单体、引发剂、致孔剂以及交 联剂的混合溶液原位( i n s i t u ) 聚合制得的大孔聚合物介质。由于整体柱具有制备 过程简单、重复性好、易于改性、柱压低以及传质速度快等优点，因而在生物大 分子的快速分离分析中发挥着越来越为重要的作用。本章主要对亲和色谱和整体 柱的发展进行了综述。 1 1 亲和色谱概述 1 1 1 引言 随着生物工程和生命科学的发展，对分析和分离科学提出了重大挑战，即要求 获得高活性、高纯度的生物大分子。而以往基于生物大分子的理化性质进行分离 的手段却普遍存在工艺繁琐、活性回收率低、纯化效果不理想的问题。为解决此 矛盾人们不断研究和开发新的分离、分析方法，其中高效亲和液相色谱( h i g h p e r f o r m a n c ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , h p a c ) 是一种较为理想和有效的色谱分离方法 【l 3 】。h p a c 是基于样品与配体问的特异性相互作用而实现分离的一种色谱方法。 它具有特异性强，选择性好，纯化倍数高等优点，非常适合于从复杂体系中一步 分离提纯某种组分。并且分离与富集可一步完成，特别适合痕量组分的分离分析。 h p a c 以键合在载体上的配基为固定相，以平衡液和洗脱液为流动相，经吸附、洗 脱达到分离、纯化目标分子的目的。但h p a c 也存在一些缺点：如柱子专一性强， 只能用于一种或一类物质的分离，成本高，有时易产生不可逆吸附，分离的动力 学过程慢，柱子寿命较短，对制备技术要求高等【4 】。自从o h s o n 等人【5 】在1 9 7 8 塑、江王些盔堂堡主堂焦堡苎 一 年发表了第一篇使用高效亲和液相色谱( h p a c ) 分离a d h 、l d h 的同工酶和人 血清白蛋白的论文后，h p a c 受到了人们的广泛关注。但由于研究者为了满足特 殊要求，需要自己合成柱子，使用起来十分不方便。随着预激活填料基质的商品 化，h p a c 得到了长足地发展。预激活填料基质只需要简单地同配体偶联即可制得 - f i n 的亲和色谱填料，简化了柱子的制备过程，目前市场上出售的预激活填料包 括带有环氧基( e p o x i d e ) ，n 一羟基丁二酰亚胺( n h y d r o x y s u c c i n a m i d e ) ，叠氮盐 ( d i a z o n i u ms a l t ) 等活性官能团的基质。另外针对某一类蛋白质分离的填料如 c o n a 和p r o t e i na 等也已有商品出售。随着柱制备技术的不断提高，亲和色谱已 成为生物大分子纯化分离中的最有效的工具之一。 1 1 2 亲和配体 由于亲和分离是基于组分与固定化配体间的特异性相互作用，故h p a c 的核心 问题是寻找适宜的配基，以适应不同目标样品的分离之需。h p a c 的配基可以分为 两大类，即生物特异性配基和基团特异性配基。在亲和色谱发展的初始阶段，通 用型配体如活性染料、外源凝集素等使用较多，这类配体被称为基团特异性配体。 随后又发展出许多特异性更强的配体如酶或底物、单克隆抗体或抗原、细胞给予 体或受体等，这类配体被称之为特异性配体。 1 1 2 1 通用型配体 通用型配体对某一类含有特定基团的物质都具有识别作用，其靶目标主要不是 对着分离物的构型或序列，而是对着分子上的官能团。 活性染料是最早使用的一类通用型配体，它们在绝大多数酶的纯化中都能使 用，其中尤以c i b a e r o n b l u e f 3 g a 应用最为广泛。除f 3 g a 蓝染料外，p r o c l o n h e 3 b 等其它染料也用得较为广泛。三嗪染料的主要纯化对象为激酶、糖酵解酶、脱氢 酶、d n a 、r n a 合成酶以及多种血浆蛋白。 外源凝集素是一类非常有用的亲和配体，其中应用最广泛的是伴刀豆球蛋白 2 塑坚王些盔兰堡主兰垡垒奎一 ( c o n c a i l o v a i i na ，简称c o na ) ，它的分子能和末端含有n d 一吡哺葡糖的糖蛋白 和糖酯相结合。用含单糖的洗脱剂可使二者形成的复合物解离，解离下来的糖蛋 白构型不会发生改变，是分离纯化糖蛋白的理想配体，除c o na 外，扁豆植物外 源凝集素、麦胚外源凝集素也可用于各种类型糖蛋白的分离。 蛋白a 是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中提取的一种蛋白，它对多种免疫球蛋 白及其亚类有较高的结合能力。这种结合大部分都发生在免疫球蛋白分子的f c 区， 有时也发生在尾部。蛋白a 由五个子单元组成，其中每个子单元都有一个f c 受体 区，然而当将其固载到亲和介质上后，这五个f c 受体区有三个变成非活性的，只 剩下两个可与免疫球蛋白分子作用【6 。由于蛋白a 与免疫球蛋白的亚类的作用强 弱各不相同，因此如果条件选择适当，蛋白a 可选择性地与l g g 的不同亚类分别 结合，并通过适当的方法将这些亚类逐个洗脱下来。 蛋白g 是从链球菌中提取的表面蛋白，它也能与i g g 的f c 区结合。与蛋白a 相比，它能与更多种类单克隆抗体和多克隆抗体结合，而且结合更牢固。它与i g g 结合的亲和常数比蛋白a 与相应的i g g 结合的亲和常数高1 2 个数量级 7 。由于 蛋白a 和蛋白g 与免疫球蛋白分子的f c 区有特异性相互作用，因此它们还可以 被用于抗体的定向固载( o r i e n t e di m m o b i l i z a t i o no fa n t i b o d y ) 。抗体的定向固载是 指通过抗体分子的f c 区与载体连接，而使它的两个抗原结合区暴露在外，从而最 大限度的提高抗体对抗原的结合效率8 1 3 1 。首先将蛋白a 或蛋白g 共价键合到 载体上，然后用固载化的蛋白a 或蛋白g 吸附抗体，这样抗体的两个抗原结合区 就会暴露在外，为了防止使用时抗体流失，可以在蛋白a 或蛋白g 一抗体的复合分 子中加入交联剂( 如戊二醛) 交联从而使抗体共价键合在蛋白a 或蛋白g 上。 p o r a t h 等人1 1 4 1 首先将金属螯合配体用于亲和分离，金属螯合配体是利用过渡 金属离子如f e 2 + ，n p ，c u 2 + 和z n 2 + 等与含有n ，s 和o 等原子的有机官能团如亚 氨基二乙酸等以配位键连接，制得的金属螯合物，这些金属螫合物与蛋白表面组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基，以及色氨酸的吲哚基之间存在很强的特异性相 互作用。p o r a t h 将这种亲和分离方法称作固载化金属亲和色谱( i m m o b i l i z e dm e t a l 塑望兰些奎堂堡主堂焦鲨壅 a f f i n i t yc h r o m a t 。g r a p h y , i m a c ) 。这种亲和色谱存在的最大问题在于配体在洗脱过 程中的流失会污染产物。 1 1 2 2 特异性配体 在亲和分离中，原则上特异性相互作用越强，非特异性吸附就越小，所获得的 目标产物的纯度就越高，因此选用特异性配体能获得最佳的分离效果。然而由于 特异性配体制备十分困难，专一性强，价格昂贵，且易变性失活，而使它们的应 用受到限制。特异性配体的突出优点在于它的高选择性，它甚至能从几十亿个不 同形状、大小、性质的分子中识别出对其有特异性相互作用的分子，这种高度专 一性的亲和作用是其它配体所无法比拟的。常用的特异性配体包括酶及其底物或 抑制剂，抗原或抗体，a v i d i n 和b i o t i n ，核苷酸和核酸，受体，维他命以及激素等。 每种酶都有其特定的底物或抑制剂，它们总是相辅相成，不可分离。因此如果 要纯化酶，就可以选用其抑制剂或底物作为亲和配体。反之若要纯化抑制剂，则 可以选择其相应的酶作为配体。 随着生物工程、基因治疗和免疫技术的发展，对抗体、抗原分离纯化的要求也 越来越迫切。无论单克隆抗体还是多克隆抗体都越来越广泛地被用作亲和色谱的 特异性配体。它的特点是特异性相互作用强，不受周围其它物质的干扰。特别是 近些年来在分离特异性受体和抗体分型中所使用的外源性抗遗传型抗体也已在亲 和色谱中获得了应用。此外一些自身免疫疾病患者所产生的抗体可被用于分离纯 化自抗原。反过来这类纯化的自抗原又能进一步在改性状态下产生抗体，它们对 自抗原具有良好的反应性，这在医学上非常有用。自抗体( a u o t o a n t i b o d y ) 是在动 植物体内天然存在的抗体，当有疾病发生时，它们会发生变化，因此可把它们作 为临床疾病发生的指示。有时它们也被用于研究相应抗原的结构和功能。在免疫 亲和色谱中，它们被用于纯化和分离细胞受体，尤其是膜细胞受体。因为许多疾 病的发生都与自身抗体和相应抗原之间的特异性相互作用密切相关，因此近年来 对它们的研究变得越来越为重要。乙酰化胆碱、胰岛素、促甲状腺素、b 一肾上腺 4 塑望兰些奎堂堡主堂垡丝奎 一 素、催乳激素等受体的自抗体都是目前作为亲和配体固载化的目标和研究对象。 表1 1 中列出了一些重要的自抗体和相应的抗原以及它们的变化可能引起的疾 病，这些抗体都是免疫亲和色谱极为重要的配体。 t a b l e1 ia u t o a n t i b o d i e sa n dt h e i rr e a c t i v ea n t i g e n s a v i d i n 对b i o t i n 具有天然的亲和性，它有四个子单元，每个子单元都能分别与 b i o t i n 结合。在理想状态下a v i d i n 与b i o t i n 的结合力超过了1 0 。5m o l l 1 5 。这么 高强度的结合意味着这种复合物能经受住h p a c 的强烈冲洗条件而不发生解离。 ，一* 、n 繇： m ： 浙江王些查堂堡主堂垡笙苎 一一一 这使得a v i d i n 成为高效免疫亲和色谱的一种理想涂渍物。在抗体连接到这种配体 涂层上之前，要对相应的b i o t i n 进行改性，目前已有几种衍生化的b i o t i n 商品， 这为制备亲和介质提供了很大的方便。但这种配体与抗体之间的连接一般较难控 制，二者之阳j 的连接经常是随机的，有时会影响抗体的活性。当选用酰肼衍生化 的b i o t i n 时，它会选择性地连接到抗体分子的糖蛋白部分，从而实现抗体分子的 定向固载 8 】。 此外，链霉菌抗生素蛋白( s t r e p t a v i d i n ) 也已在免疫亲和色谱中得到应用。 s t r e t ) t a v i d i n 是从细菌链霉菌素蛋白中产生的一种纯的抗生素蛋白，能表现出所有 抗生素蛋白的性质，而且它对组织抽提液的非特异性相互作用很小，是一种很好 的特异性配体。 随着生命科学和基因工程的迅速发展，对于核酸、基因、寡核苷酸和聚核苷酸 及其相关的特异性蛋白、酶的研究越来越深入，对它们分离纯化的要求也越来越 高，亲和色谱正在这方面发挥着越来越大的作用。当将有确定序列的寡核苷酸键 合到载体上后，就可以实现其互补寡核苷酸的分离，这种亲和分离往往需要采用 温度梯度洗脱技术加以实现。 由于受体与相应的酶、蛋白质或底物之间存在着非常高的特异性相互作用，而 且这种相互作用是可逆的，因此受体也可被用作特异性的亲和配体。 动物体内存在的痕量维他命、激素等物质具有特异性传递功能，它们与相应蛋 白质的结合会对这些物质的吸附、传递、转换等过程起重要的作用【1 6 】。与它们特 异性结合的蛋白浓度都很低。如与b 1 2 牢固结合的蛋白每1 0 0 0 升人血浆中只有约 1 0 0m g 。然而它们对互补的维他命或激素却有很高的亲和力。采用经典的纯化程 序无法获得如此低浓度的物质，只有免疫亲和色谱是一条有效的途径。对于激素 的分离可采用与其相应的抗体、传递蛋白、外源凝集素等作为亲和配体。 1 1 3 配体的固载 亲和介质的活化或化学改性是配体固载的第一步，也是最关键的一步。活化后 6 一一一。1 _ v h 。h h - j 。_ 一 - *a 自i j 。 ， 浙江工业大学硕士学位论文 的活性官能团越多，接上的亲和配体就越多，分离效果就越好。因此选用合适的 活化方法非常重要。 1 1 3 1 溴化氰法 溴化氰法是制备亲和介质最早使用的方法。由于该法简单、方便、有效、易得， 因此直到现在仍在广泛使用。国外大部分商品化的予激活填料都是采用这种方法 制备的。它是利用载体上的邻位羟基与溴化氰在碱性条件下反应生成高活性的氰 酸酯，然后再与蛋白的氨基在温和的条件下反应，即可将蛋白固载在载体上。但 由于c n b r 是极强的致癌性剧毒物质，操作时要格外小心。 1 1 3 2 环氧法 环氧法毒性小，试剂易于获得，反应速度快，活化效率高，因此也是制备亲和 介质的一种常用方法。这种方法一般利用含双环氧的化合物或环氧溴丙烷、环氧 氯丙烷作为活化试剂与配体上的氨基或巯基偶联，即可制得相应的亲和介质。 1 1 3 3 碳二亚胺法 碳二亚胺法是利用配体的羧基进行反应，因此反应可在弱酸条件下进行，这对 于固载在碱性条件下易变性的蛋白特别有利。 1 1 3 4 羰基二咪唑法 含毗咯、咪唑环的n 一酰基( r c o ) 衍生物可与配体的羟基、氨基及羧基反应， 由于该反应迅速、安全、高效，且不会产生其它副反应，因此正逐渐受到人们的 关注。 1 1 3 5 高碘酸盐氧化法 高碘酸盐氧化法操作简单。氧化过程所用的n a l 0 4 的浓度一般为0 0 1 0 5m 0 1 1 塑鲨三些盔堂堡主堂垡丝墨 反应通常在弱碱( p h 8 0 8 5 ) 条件下进行。还原反应一股采用新鲜配置的1 的硼 氢化钠溶液。这种方法的缺点在于反应中的不溶性盐和其它物质会堵塞介质中的 一部分孔，从而使i l 隙率降低。由于抗体分子的f c 区有多糖残基，用n a l 0 4 氧1 七 抗体分子的糖基化区，然后与经过活化的载体反应，也同样可以实现抗体分子的 定向固载f 8 1 。 1 1 3 6 三嗪活化法 三嗪活化法是一种较新的方法，一般使用均三氯三嗪或二氯三嗪为活化试剂。 它既能与含羟基也能与含氨基的介质反应。这种方法键合量高、操作简单，是一 种很有前途的方法。 表1 - 2 列出了制备亲和介质时一些常用的活化试剂及可反应的官能团。 t a b l e1 2l i s to f v a r i o u sa c t i v a t i o nm e t h o d s 1 1 6 d i m c t h o x y h e x a n e c l i a m i n e 2 4 d i s u l f o n i c w 0 0 6 w a r d sk c h ：一c h - - 8 c h = c h ： 一n h 2 婶 o ，n 0 2 n h 2 - o h r 一冷8 r o n h 2 一 - o c h 3 o 刺h 2 ，- o hs 0 2 c 1 - n h 2 ，c o o h n + 刊卜 09 8 1 0 59 79 7 6 生物降解：( 5 ) 能功能化，可直接或通过间隔臂与配位体连接。在实际应用时， 还应考虑基质的孔隙率和基质骨架对配体微环境的影响。 h p a c 中最早使用的基质是以琼脂糖为代表的多糖类软胶。多糖结构疏松， 分子排阻极限可达4 0 m u ，它不易吸附敏感生物大分子也不使其变性，且p h 适用 范围比较广，亲和容量高，价格比较便宜。这类基质不足之处是质软，不耐压， 在较低的p h 范围内易降解 1 9 ，2 0 】。为了克服这些缺点，人们通过多糖交联方法 获得了半刚性凝胶：交联琼脂糖。常见的有s e p h a r o s e c l4 b ，6 b 等。目前，多糖 9 9 7 8 8 5 船 g 叫 2坛 枷 们 瑚 舶 啪 浙江上业大学硕士学位论文 类凝胶仍是应用最广的h p a c 基质。控制孔径的多孔玻璃是h p a c 中一类独特的 基质。它不溶解，几乎不受洗脱液、压力、流速、p h 和离子强度变化的影响，但 非特异性吸附较强。a f e y a n 等发展的灌流色谱基质是一种较为理想的生物大分子 色谱填料但由于价格昂贵而限制了其广泛应用 2 1 ，2 2 】。膜色谱结合了膜分离技术与 柱色谱的优点，溶质在膜色谱中以对流传质为主，因而特别适合于生物大分子的 分离分析 2 3 ，2 4 1 。8 0 年代末出现的刚性有机聚合物整体色谱填料具有合成过程简 单，柱压低，传质速度快等优点，并且有良好的化学稳定性，p h 适用范围广，与 生物大分子有良好的生物相容性，在蛋白质的分离纯化过程中能保持样品的生物 活性。尽管耐压性和柱效率不如硅胶，但它们的亲水性减少了对蛋白质的非特异 性吸附。 塑坚三些盔兰堡主堂篁笙墨 一。 1 2 整体柱技术进展 1 2 1 引言 近年来，生命科学、环境科学得到了迅猛发展，尤其是生物大分子的分离分析， 对色谱分析提出了更高的要求，其核心问题是色谱柱填料的发展。常规的商品化 球形填料有其不可克服的局限性：较慢的扩散传质和较大的球间隙。尽管有一些 新的填料如无孔球形基质 2 5 ，2 6 、灌流色谱基质 2 1 ，2 7 蔓3 了解决此问题而设计，但 是还是不能从本质上克服。近几年来，一种新颖的固定相形式：整体柱( m o n o l i t h i c c o l u m n ) ，因为它相对于常规填充柱有着制备简单和在生物大分子分离分析上的良 好性能和高柱效等优点，而得到了极大的关注。有关整体柱制各技术的进展可见 相关综述性论文 2 8 - 3 0 。 整体柱，又称连续床( c o n t i n u o u sb e d ) 或连续棒( c o n t i n u o u sr o d ) 。其早期发 展可以追溯到6 0 年代后期，k u b i n 等 3 l 】使用聚( 2 羟乙基甲基丙烯酸脂) 基质代 替多糖凝胶，在低压下，以体积排阻模式分离蛋白质。但是这种连续的聚合物溶 胀性很大，渗透性很差，难以实际应用。7 0 年代初r o s s 等 3 2 ，3 3 1 制备了具有通孔 的聚氨酯泡沫，用作气相色谱和液相色谱的固定相。尽管这类固定相具有良好的 通透性，但是在有些溶剂中易于溶胀和软化，未能得到实际应用。在8 0 年代末期， 发展出了压制的编织材料基质【3 4 】，纤维素薄片【3 5 、大孔聚合物膜盘【3 6 】、经压 缩的聚丙烯酰胺凝胶【3 7 等整体柱形式的分离介质。其中h j e r t 6 n 及其同事 3 7 ，3 8 于2 0 世纪8 0 年代末发展出了被称为“连续床”的经压缩的软凝胶基质，是整体 柱在色谱分离上的一个里程碑。通过在空管柱中加入单体、引发剂及致孔剂的混 合溶液“原位”( i n s i t u ) 聚合后制得聚丙烯酰胺凝胶，再将其高压压入一空色谱 柱制得软基质“连续床”色谱柱，成功地用于蛋白质及多肽的分离。但是这种填 料仅在溶胀情况下才存在大孔结构，所以不能用于流动相极性变化太大的分离过 程，应用受到一定的限制。f r 6 c h e t 等a 3 9 随后进一步发展了这项技术，在空管 e i * i 盎，；戳，、l t ，? ：琏i l 塑望三些盔堂堡主堂垡笙! l 一 柱中c c 原位”聚合制得一种全新的刚性聚合物整体柱，鉴于其具有优异的通透性、 高空间利用率、制备简单等优点，得到了广泛的应用。1 9 9 6 年后，f i e l d s 等人和 m i n a k u c h i 等人分别发展出基于硅胶的整体柱 4 0 ，4 1 】，使这项技术得到更全面的 发展。另外，在毛细管中采用整体柱的形式可以避免复杂的装填过程和塞子的制 作，进一步推动了整体柱的发展。目前，已有整体色谱柱实现了商品化【4 2 4 5 】。 1 2 2 整体柱的制备 整体材料已被用于制备高效液相色谱柱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 、毛细管电色谱柱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 及毛细管液相色谱柱( c a p i l l a r yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，c l c ) ，对于整体柱的研究和 应用是当前色谱研究的一大热点。根据所制备的整体材料的不同，整体柱可被分 为有机聚合物整体柱、无机硅胶整体柱和颗粒固定化型整体柱。 1 2 2 1 有机聚合物整体柱的制备 整体柱在高效液相色谱、毛细管电色谱及毛细管液相色谱中的制备有不同之 处。 1 2 2 1 1 有机聚合物高效液相色谱整体柱的制备 有机聚合物整体柱的制备方法继承于大孔离子交换树脂、球型聚合物色谱填料 4 6 】。将单体、交联剂、致孔剂和引发剂的混合溶液加入空管柱中通过热引发或光 引发聚合。反应完全后用有机溶剂除去致孔剂及其它可溶性化合物，即可得到大 孔聚合物整体柱，然后通过对其进行化学改性以满足各种色谱模式的要求。 根据所用单体的不同，有机聚合物整体柱可分为以下几种。 1 2 2 1 1 1 基于聚苯乙烯的整体柱 聚苯乙烯整体柱的制备一般选用苯乙烯或氯甲基苯乙烯为单体，二乙烯基苯为 1 4 塑兰三些盔堂堡主兰垡堡塞 一 一 交联剂，甲苯和十二醇为致孔剂。由于聚苯乙烯表面具有较强的疏水性，因此可 直接用于小分子、肽以及生物大分子的反相色谱分离 4 7 - 4 9 。聚苯乙烯是强疏水 性材料，为了保证蛋白质在分离过程中的构象稳定需要对其表面进行改性。然而 苯乙烯表面无活性官能团，改性困难。氯甲基苯乙烯与二乙烯苯的共聚物不仅具 有聚苯乙烯的机械强度和化学稳定性，而且含有氯甲基活性官能团易于改性。另 外，通过调节氯甲基苯乙烯的比例，可以改变配体的键合密度。f r c h e t 等人 5 0 】 对聚氯甲基苯乙烯整体柱进行两步修饰，得到了表面亲水性很强的整体柱。首先 用乙二胺与氯甲基反应，然后再与y g l u c o n o l a c t o n e 反应，从而使聚氯甲基苯乙烯 表面的亲水性大大增强。将聚氯甲基苯乙烯整体柱与乙二胺反应后，再与氯乙酸 或溴乙酸反应即可得到弱阳离子交换柱【5 l 】。为了获得较大的比表面，x i e 等人 5 2 ，5 3 】使用了高的二乙烯基苯比例制得了比表面达4 0 0 m 2 儋的整体柱，且依然具有 较好的通透性。 1 2 2 1 1 2 基于聚丙烯酸酯的整体柱 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a c o e d m a ) 是应用最为广泛的聚丙烯酸酯类 整体柱。由于它具有环氧活性官能团易于改性，因此可被用于制各多种色谱填料。 s v e c 等人 5 4 ，5 5 用二乙胺与聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱反应制得弱阴离子交 换柱。用e t h y l e n e d i a m i n e 反应后再与i d a 反应，或者直接嫁接i d a 可制得弱阳离 子交换柱【5 6 ，5 7 】。v i k l u n d 5 8 用聚2 一丙烯酰胺，2 一甲基丙磺酸 ( p o l y ( 2 - a c r y l a m i d o 一2 - m e t h y l 一1 - p r o p a n e s u l f o n i ca c i d ) ) 在经过水解的聚甲基丙烯酸 缩水甘油酯整体柱上接枝，得到了强阳离子交换柱。 尽管分析型聚合物整体柱的制备技术已经比较成熟，但合成制备型的整体柱还 存在很多问题a 由于合成整体柱时一般采用热引发的引发剂，同时聚合反应是一 个放热反应，所以当柱管的直径超过一定范围时，径向存在的温度梯度会导致所 合成的聚合物孔结构不均匀。因此采用这种方法合成的整体柱的直径最大不能超 过2 5m m 。p e t e r s 等人 5 9 通过逐步加入单体混合液降低聚合速度以消除由于聚合 塑望三些查堂堡主堂垡堡壅 一 放热而导致温度升高的影响。他们采用这种方法制备了孔结构均匀的规格为2 0 0 5 0m mi d 的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱。p o d g o m i k 等人 6 0 设计合成了环 柱状的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱，将其用于径向色谱。 1 2 2 1 1 3 基于聚丙烯酰胺的整体柱 丙烯酰胺是一个亲水性很强的单体，通常在水相中聚合制备凝胶，用于凝胶电 泳。h j e r t 6 n 【6 1 制得含有异丙基的丙烯酰胺凝胶用于疏水色谱分离蛋白质。x i e 6 2 用丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯共聚合成了聚丙烯酰胺。甲基丙烯酸丁酯疏水整体 柱，并成功地用于蛋白质的分离。这种聚合物的疏水性可通过改变反应液中甲基 丙烯酸丁酯的含量加以控制。 1 2 2 1 1 4 分子印迹整体柱 聚合物整体柱的制备技术也可以被用于制备分子印迹( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) 材料 6 3 。分子印迹是合成对烙印分子具有预定分子识别能力的一种方法。所谓分 子印迹型材料，就是以待分离的手性化合物中的一种绝对构型为印迹分子( 也称模 扳) 、制备对该手性分子有选择性识别功能的高分子聚合物一分子印迹聚合物作为色 谱的固定相。其印迹过程 6 4 】如下：( 1 ) 使印迹分子和功能单体间产生互补相互作 用( 非共价作用、共价作用、金属配位作用) 形成复合物； ( 2 ) 在交联剂的存在下， 在模板一单体复合物周围产生聚合反应，形成高分子聚合物； ( 3 ) 用溶剂将印迹分 子洗脱出去，得到分子印迹聚合物。m a t s u i 6 5 首先选用甲基丙烯酸或2 。三氟甲基 丙烯酸为功能单体，e d m a 为交联剂首先合成了分子印迹整体聚合物，并用于结 构异构体的分离。 1 2 2 1 i 5 基于开环反应有机聚合物整体柱 尽管上述基于自由基聚合整体柱具有众多优点，但是也存在两个问题 6 6 ：一， 大多功能单体处在组成整体柱的微球的内部，其功能基团无法在色谱分离过程发 1 6 塑望王、业奎堂堡主堂垡笙壅 挥作用。二，极性基团在微球内部会导致整体柱溶胀效应加重，影响其机械强度。 最近，m r b u c h r n e i s e r 等人【6 7 发展了一种基于开环聚合机理的整体柱( r o m p ) ， 其最大的优点是在整体聚合时可以用包括手性选择体在内的很多功能单体。 1 2 2 1 2 有机聚合物电色谱整体柱和毛细管液相色谱整体柱的制备 在毛细管中，按固定相的形式不同，可以分为三类：开管柱( o p e n t u b u l a r ) 、 填充柱( p a c k e d c o l u m n ) 和整体柱( m o n o l i t h i cc a p i l l a r y ) 。毛细管整体柱是在毛细 管中通过原位聚合的方法合成多孔聚合物，并以此多