（动物营养与饲料科学专业论文）奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究.pdf

奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究 摘要 本文对酶荧光法检测奶牛乳中p 一羟丁酸的适宜反应条件、乳样前处理方 法、准确度和精确度等进行了系统研究，并对乳中与血中b 一羟丁酸浓度进行了 相关性研究。 试验一通过三个方面的试验测试，系统研究了酶荧光法的适宜反应条件。 试验反应体系由底物p 一羟丁酸与工作试剂( 由p 一羟丁酸脱氢酶溶液、n a d + 溶液 和t r i s h c l 缓冲液组成) 构成，进行了如下三方面测定：( 1 ) 将反应体系在 3 7 水浴中保温5 、l o 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、5 0 、6 0 分钟，测定各反应 时间的相对荧光强度。结果表明3 7 。c 水浴保温1 0 分钟时，产物的相对荧光强 度比保温5 分钟时提高了4 8 ，保温1 0 分钟以后各个时间点产物相对荧光强 度变化范围较小，说明1 0 分钟为适宜的反应时间。( 2 ) 反应体系先经过3 7 。c 水浴反应1 0 分钟，然后1 0 0 。c 沸水浴中放置1 5 分钟终止酶促反应，分别测定0 、 2 、5 、1 0 、1 5 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 分钟时的相对荧光强度。结果表明不终止 反应时，0 2 5 m m o l l 标准液的产物相对荧光强度变异系数为l _ 4 9 ，而1 5 m m o l l 标准液的产物相对荧光强度的变异系数达到2 8 6 l ，结果重现性很差。 当终止酶促反应后，两种浓度标准溶液的产物相对荧光强度均比较稳定，变异 系数在2 以内，重现性较好，因此通过沸水浴1 5 分钟使0 一羟丁酸脱氢酶失活 终止酶促反应，可以提高检测结果的准确性。( 3 ) 设定工作试剂中d 一羟丁酸脱 氢酶剂量分别为2 、3 、4 国际单位( u ) m l ，经过3 7 。c 反应l o 分钟和1 5 分钟 沸水浴终止反应后，测定反应体系的相对荧光强度。结果发现三组产物相对荧 光强度之问有极显著差异( p 乙酰乙酸+ 还原型辅酶i p h8 5 9 一羟丁酸脱氢酶可催化b 一羟丁酸与氧化型辅酶i ( n a d + ) 反应，生成乙酰 乙酸和还原型辅酶i ( n a d h ) ，后者在3 4 0 r i m 波长下有吸收峰，吸光度变化与体 系中b 一羟丁酸浓度成比例关系。n a d h 是一种强荧光物质，其最大激发波长和发 射波长分别为3 6 0 n m 和4 6 0 r i m ( p b e r g v e l d ，1 9 7 0 ) 。j r u z i c k a ( 1 9 7 5 ) 根据 n a d h 的这一特性建立了n a d h 的荧光测定法( 刘昆元等，1 9 9 2 ) 。刘昆元等( 1 9 9 2 ) 的研究表明n a d h 在p h 为8 1 1 的碱性介质中，荧光法比紫外吸收法的灵敏度 提高3 0 0 0 倍，测定浓度可达l o “m 。 2 1 材料与方法 2 1 1 仪器与试剂 0 濑舶。垂建i * 蕊l 量取0 8 4 m 1 3 6 5 h c l ，于1 0 0 m l 蒸馏水中定容，摇匀备 用。 瞩l 啤l 蓐互臻囊鞲l 称取t r i s 3 0 2 8 5 9 ，于2 5 0 m l 容量瓶中定容，摇匀， 然后加入0 i m o i l h c i 用酸度计调节p h 至8 5 ，常温保存。 麟 薅i i i 萋骥潮囊谬称取0 1 6 5 9 9n a d 氧化型辅酶i ( r o c h e ， 9 8 ) ，于 2 5 m l 容量瓶中定容，摇匀，4 。c 保存。 簿羟季骥蠛氡醺将2 5 国际单位( u ) p 一羟丁酸脱氢酶溶于5 0 0 p i 蒸馏 水中，再分别稀释成2 、3 、4 u m 1 的酶溶液，于4 c 保存备用。 蘸藏獭舔蛹称取0 6 3 0 0 9p 一羟丁酸钠( s i g m a ，纯度9 9 o ) ， 溶解后于1 0 0 m l 容量瓶中定容混匀，作为标准贮存液( 1 0 m m o l l ) 。使用时再根 据需要稀释成0 2 5 、1 0 、1 5 、2 5 、4 0m m o l l 的标准溶液。 茁篱麟麟壤獭嚣美国p e r k i ne l m e r 公司 醭凌遴 瘩浴锯 浙江大学硕士学位论文 2 1 2 试验设计与方法 荧残黧灌祭绺 激发波长3 4 0 h m ，发射波长4 6 5 n m ，狭缝5 o h m ，反应时间3 0 秒。 适孽囊庳琏闯 将1 0 0 p lb 一羟丁酸钠标准溶液( o 2 5 m m o l l ) ，3 u m l p 一羟丁酸脱氢酶溶液、 i 0 o m m o l ln a d + 溶液与t r i s h c l ( p h = 8 5 ) 缓冲液混合，于3 7 。c 水浴保温反 应5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、5 0 、6 0 分钟，然后测定不同反应时间的 相对荧光强度。 酶键囊藤徽缝羹 取l o o g l p 一羟丁酸钠标准溶液( o 2 5 和1 5r r a n o l l ) ，按上述相同操作加 入其它反应试剂，3 7 c 水浴保温1 0 分钟进行反应，然后于1 0 0 。c 沸水浴中放黄 l j 分钟终止酶促反应，分别测定0 、2 、5 、1 0 、1 5 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 分钟 时的相对荧光强度。 适宜凌应薛魏整 取l o o 斗1 p 一羟丁酸钠标准溶液( 3 , m o l l ) ，分别加入浓度为2 、3 、4 u m l p 一 羟丁酸脱氢酶溶液，按上述操作程序加入其它反应试剂，于3 7 。c 水浴保温1 0 分钟进行反应，1 0 0 4 c 沸水浴中放置1 5 分钟终止反应后，测定样品相对荧光强 度。 2 1 3 数据处理与统计 所有数据用e x c e l 软件进行数据处理，用s a s 软件( 6 1 2f o rw i n d o w s ) 中 的平衡试验设计方差分析过程( a n o v a ) 进行统计，均值的多重比较采用d u n c a n 法进行。 赵占宇奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 2 2 试验结果 2 | 2 1 适宜反应时间 酶促反应时间对样品荧光强度的影响见图4 。3 7 。c 水浴保温1 0 分钟时，产 物的相对荧光强度比保温5 分钟时的相对荧光强度提高了4 8 ( p o 0 1 ) ， 反应1 0 分钟以后各时间点的相对荧光强度变化较小，平均变化幅度为0 5 ， 表明1 0 分钟反应已经足够，可作为适宜的反应时自j 。 趟 蝮 鬟 糕 靛 罂 051 01 52 02 53 03 54 04 55 05 56 0 反应时间( m i n ) 图4 酶促反应时间与样品相对荧光强度的关系( n = 2 0 ) f i g u r e 4 ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n r e a c t i o nt i m ea n dr e l a t i v ef l u o r e s c e n c e 2 2 2 酶促反应的终止 终止酶促反应对检测结果重现性的影响见表6 。在不进行沸水浴终止反应 的情况下，0 2 5 珊m o l l 标准液产物相对荧光强度的变异系数为1 4 9 ，而1 5 r t n o l l 标准液的产物相对荧光强度的变异系数达到2 8 6 l ，结果重现性很差。 进行沸水浴终止酶促反应时，两种浓度的1 3 一羟丁酸钠标准溶液产物的相对荧光 强度均比较稳定，变异系数在2 以内。本试验发现，当底物1 3 羟丁酸钠浓度 较低时，可以保证反应产物的重现性，但当底物浓度较高时，反应结果的重现 性较差，可能是因为随着反应时间的变化，产物生成量也在不断地变化，因而 对、钡l 定的重复性产生较大的影响。因此通过沸水浴15 分钟使d 羟丁酸脱氢酶 失活终止酶促反应，可以提高检测结果的准确性。 1 4 l 0 9 8 7 6 5 4 3 8 8 7 7 7 7 了7 7 浙江大学硕士学位论文 表6 终止酶促反应对检测结果重现性的影响 t a b l e 6 t h et e m p e r a t u r ee x p e r i m e n to ns o d i u mp - h y d r o x y b u t y m t e ( 0 2 5a n d1 5m m o l l ) 注：# 表示样品相对荧光强度 2 2 3 适宜反应酶剂量 b 一羟丁酸脱氢酶剂量对产物相对荧光强度的影响见图5 和表7 。横坐标表 示不同的酶剂量，纵坐标表示产物的相对荧光强度。从图5 可以看出，使用三 种不同浓度的b 一羟丁酸脱氢酶溶液进行酶促反应时，其产物相对荧光强度之间 有极显著差异( p o 0 1 ) ，其中3 u l 浓度进行反应的产物生成量最高，2 u m l 酶剂量组次之，4 u m l 组最低。本试验采用酶荧光法对乳中b 一羟丁酸含量进行 测定。b 一羟丁酸脱氢酶的剂量是该酶促反应的关键因素之一。试验结果表明， 当底物浓度为4 m m o l l 时，使用3 u m l 的1 3 一羟丁酸脱氢酶可以使反应进行得较 为充分，获得较高的产物荧光强度，而当使用4 u m 1 的b 一羟丁酸脱氢酶时，产 物荧光强度下降。说明适宜的反应酶剂量是3 u m l 。 蜊 骠 米 唰 靛 罂 00 511 522 533 544 5 酶剂量( u m 1 ) 图5 不同酶剂量对反应产物荧光强度的影响 f i g u r e 5 t h er e s u l t so ft h er e l a t i v e f l u o l e s 0 * t l c ew i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nb h y d r o x y b u t y r i c d e h y d r o g e n & s e 们踮衢加坫m 5 0 赵占字奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 表7 不同酶剂量对反应产物荧光强度的影响 t a b l e 7 t h er e s u l t so ft h er e l a t i v ef l u o r e s c e n c ew i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n b - h y d r o x y b u t y r i c d e h y d r o g e n a s e 注：表中数据为i + s x 。同一列数据不同上标字母a 、b 、c 间表示差异极显著( p o 0 5 ) ，与防腐剂处理组有显著差异( p 0 0 5 ) ，灭菌处理组 与防腐剂处理组之间有极显著差异( p 0 0 1 ) 。说明防腐剂对乳样有一定的影 响，以不添加为好，为使实际操作更为简便，乳样也不需经过灭菌处理。 试验选取奶牛均为健康奶牛，但该试验测定的乳中b 一羟丁酸浓度为 2 1 9 r m o l l 以上，均超出健康正常范围( 1 6 r m o l l ) ( 孙斌等，1 9 9 9 ) ，说明 脱蛋自方法存在一定问题，因此进行如下试验以确定适宜的脱蛋白方法。 表8 防腐剂处理对乳中b 一羟丁酸浓度的影响 t a b l e 8 e f f e c t so fp o t a s s i u md i c h r o m a t ea d d i t i o na n d a u t o c l a v i n g o n 1 3 - h y d r o x y b u t y r i c d e h y d r o g e n a s e c o n c e n t r a t i o n nm i l k 注：同一列数据不同上标字母a 、b 、c 问表示差异极显著( p o 0 1 ) ，上标a 、b 、c 间表 示差异显著( p o 0 5 ) 。 1 9 赵占宇奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究 2 0 0 5 年5 月 o 目 v 哒 避 籍 卜 鼎 吐 子 辞 未处理 灭菌处理 防腐剂处理 脱脂脱蛋白双重处理处单纯脱蛋白处理 图6 防腐处理对乳中d 一羟丁酸浓度的影响 f i g u r e 6 e f f e c t so fp o t a s s i u mb i c h r o m a t ea d d i t i o n a n da u t o c l a v i n go n i - h y d r o x y b u t y f i c d e l l y d r o g e n a s ec o n c e n t r a t i o ni nm i l k 3 2 2 不同脱蛋白处理对乳中d 一羟丁酸浓度的影响 不同脱蛋白处理对乳中b 一羟丁酸浓度的影响见表9 ，表中数据均经过换算， 五组方法中的乳样测定体积一致。由表9 可以看出未处理组和处理组的乳样在 反应后的荧光强度均高于反应前，说明反应后产生了大量的n a d h ，可据此检 测样品b 一羟丁酸浓度。未处理乳样在反应后检测的1 3 一羟丁酸浓度达到 1 5 5 8 m m o l l ，大大超出了健康奶牛的正常范围( 1 6 r e t o o l l ) ( 孙斌等，1 9 9 9 ) ， 说明乳样不经处理会对测定结果产生较大的影响。三氯乙酸法反应前的荧光强 度是反应后的6 9 2 3 ，变异程度较大，说明三氯乙酸法处理的奶样进行酶促 反应不彻底，其基底空白与真实测量值比较接近，不能反映测定结果的准确性。 乙酸法及乙酸锌和亚铁氰化钾法反应前的荧光强度分别是反应后的2 5 4 5 和 3 9 0 4 ，i 司样说明该两种方法对容易对测定结果造成较大误差。磷钨酸沉淀法 反应前的荧光强度是反应后的7 2 3 ，说明该方法处理的奶样进行酶促反应比 较完全，能够较准确地反映测定结果。此外，乙酸法、三氯乙酸法及乙酸锌和 亚铁氰化钾法测定的乳中d 一羟丁酸含量均高于1 8 m m o l l ，尤其是乙酸法测定 的乳中6 一羟丁酸含量高达3 m m o l l ，大大超出了健康奶牛的正常范围，说明这 三种处理方法在测定过程中存在干扰。使用磷钨酸沉淀法测定的乳中p 一羟丁酸 含量为1 0 5 m m o l l ，在健康奶牛的正常范围内，说明该方法处理的比较干净， 干扰比较小，能够较为准确的反应乳中的p 一羟丁酸含量。 5 3 5 2 5 1 5 0 3 2 l 0 浙江大学硕士学位论文 表9 不同脱蛋白处理对乳中b 一羟丁酸浓度的影响 t a b l e 9 t h ei n f l u e n c e so fd e p r o t e i n a t i o nm e t h o d so n1 3 - h y d r o x y b u t y r i ca c i dc o n c e n t r a t i o ni n m i l k 注：# 表不平均值 3 t 2 3 不同脱蛋白处理对1 o m m o l l1 3 - 羟丁酸钠标准液的影响 由表1 0 可见，对1 o m m o l l 标准1 3 一羟丁酸钠溶液经过乙酸法、三氯乙酸 法、磷钨酸沉淀法与乙酸锌和亚铁氰化钾法处理后，磷钨酸沉淀法对溶液的浓 度影响较小，误差仅为6 ，而乙酸法和三氯乙酸法对溶液的影响较大，误差 达到4 0 和5 0 ，乙酸锌和亚铁氰化钾法对溶液浓度的影响最大，其测定浓度 比原有浓度高出4 倍以上。因此，该试验进一步说明磷钨酸沉淀法是适宜的前 处理方法。 表1 0 不同脱蛋白处理对1 o m m o l l1 3 - 羟丁酸钠标准液的影响 t a b l e l 0 t h ei n f l u e n c e so fd e p r o t e i n a t i o nm e t h o d so ns o d i m ni ，- h y d r o x y b u t y r a t ec o n c e n t r a t i o n i n m i l k 注：# 表示平均值 赵占宇奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 4 酶荧光法检测乳中d 一羟丁酸的精确度和准确度( 试验三) 美国国家临床实验室标准化委员会( n c c l s ) 制定和公布了一系列标准化文 件，其正式标准的一致化已在世界范围内得到公认。本试验采用n c c l s 评价方 案对酶荧光法测定乳中b 一羟丁酸含量进行了精密度和准确度评价。 4 1 材料与方法 4 1 1 试验材料 牛乳样品：采自余杭南湖奶牛场，泌乳时间3 0 6 0 天、产奶量2 5 4 0 k g d 的健康奶牛。 4 1 2 仪器与试剂 王维试剂由t r i s h c l 缓冲液0 i m m o l l ( p h = 8 5 ) ，n a d + 1 0 o m m o l l ， b 一羟丁酸脱氢酶3 u m l 组成，4 保存。 骚一5 鹾麟鬻戮壤渗美国p e r k i ne l m e r 公司 冷臻菠濑德国s i g m a 公司 其余试剂同3 1 2 4 1 3 试验方法 霉b 祥菰处理 采集的新鲜乳样采用磷钨酸沉淀法进行脱蛋白处理。具体方法见3 1 3 。 线壤簿固测寝 将l o om m o l l1 3 - 羟丁酸钠标准贮存液逐级稀释成0 2 5 、0 5 、1 0 、1 5 、 2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、5 0 、6 0 、7 o 、8 0 、9 o m m o l l1 3 - 羟丁酸钠标 准液，各取1 0 0 “11 3 - 羟丁酸钠标准溶液，按2 1 2 操作程序加入其它反应试剂， 于3 7 。c 水浴保温反应l o 分钟，1 0 0 。c 沸水浴中1 5 分钟终止反应，然后测定相 对荧光强度。以6 一羟丁酸钠浓度为纵坐标，产物相对荧光强度为横坐标，绘制 曲线，进行相关性分析。 标准酾线麟谯 取不同浓度1 3 一羟丁酸钠标准溶液( o 、0 2 5 、0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、 3 0 、3 5 、4 0 、5 0m m o l l ) 各1 0 0 1 j 1 ，按上述相同步骤进行操作，测定相对 浙江大学硕士学位论文 荧光强度。以d 一羟丁酸钠浓度为纵坐标，产物相对荧光强度为横坐标，绘制标 准曲线，进行相关性分析。 耩密度试验 以1 0 、2 5 和4 o m m o l l 的b 一羟丁酸钠标准溶液作为重复性试验的样品 溶液。对每一个样品重复2 0 次同样的处理和测定，每天测定一次，测定l o 天。 计算批内和批间重复性。 试验条件同上。 准确度试验 通过测定回收率反映该酶荧光法的准确度。选用两种已知b 一羟丁酸含量的 牛乳，按1 ：1 的比例分别加入0 5 、1 0 、1 5 m m o l lb 一羟丁酸钠标准溶液，用 磷钨酸沉淀法进行脱蛋白处理后，按照上述相同的操作步骤，测定样品相对荧 光强度，计算回收率。每组均设3 个重复。 试验条件同上。 4 1 4 结果计算 回收率计算公式 样本回收率忙竺! 二! ! 1 0 0 ，挖t m l 一外加的o 一羟丁酸数量( m m 0 1 ) m 2 一添加标样后乳样的实测b 一羟丁酸数量( r m f n 0 1 ) m 3 一原始乳样的b 一羟丁酸数量( r e t 0 0 1 ) 4 1 5 统计方法 所有数据用e x c e l 软件进行数据处理，用s a s 软件( 6 1 2f o rw i n d o w s ) 中 的平衡试验设计方差分析过程( a n 0 v a ) 进行统计，均值的多重比较采用d u n c a n 法进行。 赵占宇 奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 4 2 试验结果 4 2 1b 一羟丁酸测定的线性范围与标准曲线 世 黧 装 斌 靛 墨 06 b 一羟丁酸钠浓度( m m o l l ) 图76 一羟丁酸测定的线性范围与标准曲线 f i g u r e 7 t h e i n e a r i t y a n dt h es t a n d a r dc b r v e 由图7 可以看出，p 一羟丁酸浓度为8 0 m m o l l 时的相对荧光强度与 7 0 m m o l l 接近，从趋势线分析，p 一羟丁酸浓度- 8 0 m m 0 1 l 时，相对荧光强 度与趋势线吻合性不强，因此该酶荧光法的线性范围为0 7 m m o l l ，其标准曲 线方程为y = 1 0 5 2 8 x + 2 4 8 3 8 ( r 2 = 0 9 9 1 3 ) 。 4 2 2b 一羟丁酸测定的精密度 酶荧光法测定p 一羟丁酸的重复性试验结果见表1 1 。在三种b 一羟丁酸钠浓度 下测得的批内批间重复性均较好，变异系数分别为在2 0 1 和3 9 7 以内，批 内平均变异系数为1 3 6 ，随着样品浓度的增加而减少，批间平均变异系数为 3 。9 3 ，随着样品浓度的增加而增加。该结果表明，用酶荧光法测定d 一羟丁酸 具有较高的精密度。 浙江大学硕士学位论文 表1 l 酶荧光法测定乳中8 一羟丁酸浓度的精密度测定结果 t a b l e l l t h e m s u l t s o f p r e c i s i o n f o r d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n 注：c v 为变异系数，即s x 4 2 3b 一羟丁酸测定的准确度 乳样p 一羟丁酸测定回收率的结果见表1 2 。当乳中p 一羟丁酸浓度为 1 4 4 m m o l l 时，其回收率平均为9 0 9 5 1 ，乳中b 一羟丁酸浓度为 0 3 6 m m o l l 时，回收率较高，平均为9 4 3 9 6 。外加b 一羟丁酸浓度与原 乳样浓度越接近，回收率越高。总平均回收率达到9 3 9 ，说明用酶荧光法测 定乳中b 一羟丁酸的准确度较高。 表1 2 酶荧光法测定乳中1 3 一羟丁酸浓度的回收率( ) t a b l e l 2 r e c o v e r yo f l 3 - h y d r o x y b u t y r i ca c i df r o mm i l k 注：标样和乳样以1 ：1 的比例添加 赵占字奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 5 乳中d 一羟丁酸与血中的关联性( 试验四) 本试验通过与血中p 一羟丁酸浓度的相关性研究评价了测定乳中p 一羟丁酸 浓度的准确性和可行性。 5 1 材料与方法 5 1 1 试验材料 率巍选择产奶量分别为2 0 k g d 以下、2 0 2 5 、2 5 3 0 、3 0 3 5 、3 5 4 0 k g d 的奶牛各1 8 头，4 0 k g d 以上的奶牛1 5 头。采集的新鲜牛乳用磷钨酸沉 淀法进行脱蛋白处理。 簪盎采用尾静脉采血法对奶牛进行采血。 5 1 2 仪器与试剂 工後谶潮由t r i s h c i 缓冲液0 1 m m o l l ( p h = 8 5 ) ，n a d + l o m m o l l ， 6 一羟丁酸脱氢酶3 弘m l 组成，4 c 保存。 r 8 n j 若x 公司试裁盒 宁波慧诚公司葡萄糖、首油兰醑、监清镁澍瘴罅剩盒 南京建成生物技寒公司游离脂肪酸测定试裁盒 l s 二s o b 荧光分光光度诗美围p e r k ine m e r 公司 冷冻离心机德国s i g m a 公司 其余试剂同3 1 2 5 1 3 试验设计与方法 嚣样蔚处臻 采集的新鲜乳样用磷钨酸沉淀法进行脱蛋白处理。具体方法见3 i ，3 。 _ _ f 艇群处理 将全血在3 0 0 0 转分钟下离心i 0 分钟，提取血清，保存待用。 程关性蜀! 究 采集1 0 5 头奶牛的新鲜乳样，进行脱蛋白处理后用酶荧光法钡4 定乳中d 一羟 丁酸浓度。与此同时，用r a n d o x 公司试剂盒测定该1 0 5 头奶牛血清中b 一羟丁 酸浓度，根据产奶量的不同，计算二者的相关系数。 浙江大学硕士学位论文 血渍生化搔标澳定 使用宁波慈诚公司试莉盒测定该1 0 5 头奶牛血清中葡萄糖、甘油三酯和镁 含量，用南京建成生物技术公司试剂盒测定游离脂肪酸的含量，比较各生化指 标在不同产奶量的奶牛体内的变化，并判断是否存在发生亚临床酮病的可能性。 试验条件同2 1 2 5 1 4 数据处理与统计 所有数据用e x c e l 软件进行数据处理，用s a s 软件( 6 1 2f o rw i n d o w s ) 中 的平衡试验设计方差分析过程( a n o v a ) 和非平衡试验设计方差分析过程( g l m ) 进行统计，均值的多重比较采用d u n c a n 法进行，非均值的比较用p r o cs o r t 程序、p r o ct t e s t 程序和p r o cr e g 程序进行。 5 2 试验结果 5 2 1 乳中6 一羟丁酸及与血中的关联性 不同产奶量奶牛乳中p 一羟丁酸与血中d 一羟丁酸的含量及相关性见表1 3 。由 表1 3 可知，产奶量越高，其乳中和血中b 一羟丁酸含量也较高，且二者的相关 系数也较高；产奶量3 5 k g d 以上奶牛血中仔一羟丁酸含量最高，产奶量2 0 k g d 以下奶牛血中b 一羟丁酸含量最低，为0 1 7 m m o l l ，比最高组降低了1 4 倍；产 奶量3 0 k g d 以上奶牛乳中b 羟丁酸含量较高，达到0 8 9 m m o l l 以上，产奶量 3 0 k g d 以下奶牛乳中p 一羟丁酸含董较低，为0 7 1 m m o l l 以下，最低组p 一羟丁 酸含量比最高组降低了5 8 5 ：产奶量3 0 k g d 以上的乳中和血中6 一羟丁酸含 量与3 0 k g d 以下相比均有极显著差异( p o 0 1 ) ：乳中d 一羟丁酸含量与血中 的相关系数随着产奶量的降低而下降，产奶量3 0 3 5k g d 奶牛二者的相关系 数最高，达到0 9 2 0 8 ，产奶量3 0k g d 以上奶牛二者的相关系数高于产奶量 3 0 k g d 以下的奶牛，不同产奶阶段二者的相关系数均达到极显著相关。乳中b 一 羟丁酸浓度与血中的相关性见图8 ，由图8 可以看出，二者的关系式为y = 0 6 1 9 8 x 一0 2 3 8 ( r 2 = o 8 5 7 8 ) 。本试验表明乳中b 一羟丁酸浓度与血中具有较高 的相关性。血中的p 一羟丁酸可以影响乳中的p 一羟丁酸，血中含量低，乳中含量 也低；血中含量高，乳中的含量也高，并可根据乳中8 一羟丁酸含量估算出血中 p 一羟丁酸的含量。 赵占宇 奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 从表1 3 也可看出，各产奶量阶段奶牛乳中和血中的d 一羟丁酸含量均在正 常范围内( 乳中1 3 一羟丁酸浓度 1 6 r a m o l l ，血中6 一羟丁酸浓度 1 0 m m 0 1 l ) ( 孙斌等，1 9 9 9 ) ，从而说明该1 0 5 头奶牛无均酮病病例。 表1 3 不同产奶量奶牛乳中p 一羟丁酸与血中p 一羟丁酸的含量及相关性 t a b l e1 3 t h e8 一h y d r o x y b u t y r i ca c i dc o n c e n u a t i o n si nb l o o da n dm i l ka n dt h e i rc o r r e l a t i o n 注：同- - y u 数据不同上标字母a 、b 、c 间表示差异极显著( p o 0 1 ) ，表示极显著相关 ( p o 0 5 ) ，产奶量2 5 3 0k g d 之间的奶牛的葡萄糖含量 最高，达到3 5 3 m m o l l ，产奶量4 0 k g d 以上和2 0 2 5 k g d 的奶牛其葡萄糖含 量最低，为3 0 6 m m o l l ；血中游离脂肪酸的含量随产奶量的增加而增加，产奶 量为4 0 k g d 的奶牛血中游离脂肪酸的含量为4 7 6 9 5 j n 0 1 l ，比最低组增加了 2 7 倍，组间的游离脂肪酸含量有极显著差异( p o 0 5 ) ，产奶量2 0k g d 以下奶牛的甘油三酯含量最低，为 1 1 9 n u n o l l ；血中镁含量随着产奶量的增加略有升高，产奶量3 5 4 0 k g d 的奶 牛血清镁含量为1 0 7 m m o l l ，2 0 k g d 以下奶牛血清镁含量为0 9 2 m m o l l ，这 两组间有极显著差异( p o 0 1 ) 。孙斌等( 1 9 9 9 ) 报导健康奶牛血清葡萄糖的 含量在2 8 m m o l l 以上，江精华等( 2 0 0 4 ) 报导健康奶牛游离脂肪酸含量为0 2 0 5 m m o l l ，试验证明试验奶牛群该两种生化指标均在正常范围值内，表明该 1 0 5 头奶牛中未见亚临床酮病病例。 表1 4 不同产奶量奶牛血液生化指标结果 t a b l e1 4 g l u c o s e ，i r i g l y c e r i d e ，m ga n dn o n e s t e r i e df a t t ya c i df r o mb l o o do fd a r yc o w sw i t h d i f f e r e n tm i l kp r o d u c t i o n 注：同一列数据不同上标字母a 、b 、c 间表示差异极显著( p 0 0 1 ) 赵占宇奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 6 综合讨论 6 1 酶荧光法检测b 一羟丁酸的适宜反应条件 徐锋等( 1 9 9 9 ) 和王玉舜等( 2 0 0 2 ) 的研究认为该酶促反应的适宜反应条 件为3 7 保温反应1 0 分钟后，即可进行上机测定相对荧光强度。本试验结果 与之相近，由图4 可知，3 7 。c 保温l o 分钟时，产物的相对荧光强度比保温5 分钟时有了较大的提高，保温反应1 0 分钟以后各个时间点产物相对荧光强度的 变化较小，说明1 0 分钟为最适宜的反应时间。 终止酶促反应对荧光强度影响的试验结果表明，不进行沸水浴的情况下， 0 2 5 m m o l l 标准液相对荧光强度的结果重现性较好，而1 5 m m o l l 标准液相对 荧光强度的变异系数达到2 8 6 l ，结果重现性很差。当进行沸水浴终止酶促 反应时，两种浓度的b 一羟丁酸产物的相对荧光强度均比较稳定，变异系数在2 以内。徐锋等( 1 9 9 9 ) 和王玉舜等( 2 0 0 2 ) 报导认为3 7 保温反应i 0 分钟 后，即可进行上机测定相对荧光强度。本试验发现，当底物b 一羟丁酸钠浓度较 低时，可以保证反应产物的重现性，但当底物浓度较高时，反应结果的重现性 较差，可能是因为随着反应时间的变化，产物生成量也在不断地变化，因而对 测定的重复性产生较大的影响。因此通过沸水浴1 5 分钟使b 一羟丁酸脱氢酶失 活终止酶促反应，可以提高检测结果的准确性。 李文静等( 1 9 9 0 ) 的研究中使用4 0 u m l p 一羟丁酸脱氢酶进行该酶促反应。 本试验使用三种不同浓度的b 一羟丁酸脱氢酶溶液进行酶促反应时，其产物相对 荧光强度之间有极显著差异( p 0 0 5 ) ，与防腐剂处理组有显著差异( p o 0 5 ) ， 灭菌处理组与防腐剂处理组之间有极显著差异( p o 0 1 ) 。防腐剂处理和灭菌处 理与未处理之间均有显著差异( p o 0 5 ) ，血糖和游离脂肪酸含量均在正常水平内。肖定 汉等( 1 9 9 4 ) 的研究中认为亚临床低血镁是奶牛酮病的预兆，本试验结果表明 不同产奶量奶牛血中镁含量无显著差异。综合试验结果，说明该1 0 5 头奶牛无 亚临床酮病病例。 赵占宇奶牛乳中酮体检测及其与血酮的关联性研究2 0 0 5 年5 月 7 结论 7 1 酶荧光法测定p 一羟丁酸含量的适宜反应条件为：反应体系p 一羟丁酸 脱氢酶剂量3 u m l ，反应温度3 7 。c 水浴1 0 分钟，随后于i 0 0 沸水浴1 5 分钟 终止酶促反应，于激发波长3 4 0 n t o 、发射波长4 6 5 n m 条件下测定相对荧光强度。 7 2 为保证测定牛乳中d 一羟丁酸测定的准确性，乳样脱蛋白处理是必要 的过程，其中磷钨酸沉淀法是最佳的乳样脱蛋白处理方法。 7 3 应用酶荧光法检测乳中b 一羟丁酸可达到较高的准确度和精确度，其 中样本回收率达到9 3 9 ，样本变异系数批内i 3 6 ，批间3 9 3 。 7 4 不同产奶量奶牛，乳中b 一羟丁酸浓度与血中浓度具有较高的相关性， 二者的相关系数达0 8 9 0 4 ；采用乳中b 一羟丁酸检测诊断奶牛酮病，可达到与血 中b 一羟丁酸或生化检测相一致的结果。因此可通过乳中p 一羟丁酸检测，反映机 体内酮体状况，作为奶牛酮病早期诊断的依据。 浙江大学硕士学位论文 参考文献 a n d e r s s o n ，l 1 9 8 4 d e t e c t i o n , o c c u r r e n c e ，c a u s e sa n de f f e c t so fh y p e r k e t o n a e m i ai ns w e d i s h d a i r yc o w s s k a r a , s w e d e n a n d e r s s o n , l 1 9 8 8 s u b c l i n i c a lk e t o s i si nd a i r yc o w s v e t c l i n n a m f o o da n i m p r a c t 4 ：2 3 3 2 51 b e l l a w 1 9 7 9 l i p i dm e t a b o l i s mi nt h el i v e ra n ds e l e c t e dt i s s u e sa n di n t h ew h o l eb o d yo f r u m i n a n t a n i m a l s p r o g l i p i d r e s 1 8 ：1 1 7 - 1 6 4 b a r e i l l e n ，b e a u d e a u f ，b i l l o n s ，r o b e r t a ，f a v e r d i n p2 0 0 3 e f f e c t so fh e a l t hd i s o r d e r so n f e e di n t a k ea n dm i l kp r o d u c t i o ni nd a i r yc o w s l i v e s t o c kp r o d u c t i o ns c i e n c e8 3 ：5 3 6 2 d a g m a rh o e b e n , r o g e rh e y n e m a n ，c h r i s t i a n b u r v e n i c h 1 9 9 7 e l e v a t e dl e v e l so fb - h y d r o x y b u t y r i ca c i di np e d p a r t u d e n tc o w sa n di nv i t r oe f f e c to nr e s p i r a t o r yb u r s ta c t i v i t yo f b o v i n en e u t r o p h i l s v e t e r i n a r yi m m ua n di m m u5 8 ：1 6 5 1 7 0 d i r k s e n ，g ，a n dw b r e i t n e r 1 9 9 3 an e wq u i c kt e s tf o rs e m i q u a n f i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f b e t a t t y d r o x y b u t y r i ca c i di nb o v i n em i l k z b l v e t m e d a4 0 ：7 7 9 7 8 4 d r a c k l e yj km j + r i c h a r d , d ，c b e i t z , a n dj w y o u n g 1 9 9 2 m e t a b o l i cc h a n g e si nd a i r y c o w s 、v i t l lk e t o n e m i ai nr e s p o n s et 0f e e dr e s t r i c t i o na n dd i e t a r y1 , 3 一b u t a n e d i 0 1 j d a i r ys c i ， 7 5 ：1 6 2 2 1 6 3 4 d r a c l d e yj k 1 9 9 9 b i o l o g yo f d a i r yc o w sd u r i n gt h et r a n s i t i o np e r i o d ：t h ef i n a lf r o n t i e r j d a i r y s c i 8 2 ：2 2 5 9 2 2 7 3 d o b b e l a a r , e t 一, n y a b a d z a , c ，h o b b s , e j ，e l l i o t t - m a r t i n , r j ，s c h u k k e n ，y h 1 9 9 6 ，d e t e c t i o n o f k e t o s i si nd a i r yc o w sb ya n a l y s i so f e x h a l e db r e a t h v e t q u a r t ，1 8 ：1 5 1 - 1 5 2 d o h o o , j r a n ds w m a r t i n 1 9 8 4 s u b c l i n i c a lk e t o s i s ：p r e v a l e n c ea n da s s o c i m i o nw i t h p r o d u c t i o na n dd i s e a s e c a n j 。c o m p m e d 4 8 ：1 - 5 e l l i o t t - m a r f i n , r j ，m o t t r a m ，t t ，g a r d n e r ，j w ，h o b b s ，p j ，b a r t l e t t , r n 1 9 9 7 p r e l i m i n a r y i n v e s f i g m i o n o f b r e a t h s a m p l i n g a sam o n i t o ro fh e a l t hi n d a i r y c a t t l e j a g e n g r e s 6 7 ：2 6 7 - 2 7 6 e m e r y , r s j s l i e s m u a ，a n dt h h e r d t 1 9 9 2 m e t a b o l i s mo fl o n gc h a i nf a t t ya c i d sb yr u m i n a n t l i v e r j n u t r 1 2 2 ：8 3 2 - 8 3 7 e p 0 5 - a e v a l u a t i o no f p r e c i s i o np e r f o r m a n c eo fc l i n i c a lc h e m i s t r yd e v i c e s ；a p p r o v e dg u i d e l i n e 3 5 赵占字奶牛乳中酮体检溺及其与血酮的关联静研究2 0 0 5 年5 月 n c c l s e p 0 6 - a e v a l u a t i o no ft h el i n e a r i t yo fq u a n t i t a t i v ea n a l ”i c mm e t h o d s ；a p p r o v e dg u i d e l i n e n c c l s f o u r i c h o n c ，h s e e g e r s ，a n dx m a l h e r 2 0 0 0 e f f e c to fd i s e a s eo nr e p r o d u c t i o ni nt h ed a i r y c o w s ：am e t a - a n a l y s i s ：t h e r i o g e n o l o g y5 3 ：1 7 2 9 1 7 5 9 f r a n c e s ，g ，g 1 n s t e r , a n dg d i r k s e n 1 9 9 7 r o u t i n et c s f i n gf o rm i l kb e t a - h y