（农药学专业论文）枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的生化性质及晶体结构研究.pdf

中图分类号： u d c ： 学校代码： 1 0 0 5 5 密级： 公开 高蕊炙淫 硕士学位论文 枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的 生化性质及晶体结构研究 t h er e s e a r c ho ft h ep r o p e r t i e sa n dc r y s t a ls t r u c t u r ei n p r o t o p o 印h y r i n o g e ni xo x i d a s eo fb a c i l l u ss u b t i l i s 论文作者 萱夔瑶 申请学位 壅堂亟 学科专业 壅药丝堂 答辩委员会主席 1 8 3 s 9 3 s 指导教师 廑真熬攮 培养单位 丝堂堂瞳 研究方向 丝堂生塑堂 评阅人 南开大学研究生院 二。一。年五月 i ， lo 删jff|f|fjjjijjjjf朋 y 1813 7 5 3 。 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务；解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ： 2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 j f 作者暨授权人签字： 萱夔疆 2 0 1 0 年6 月 2 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的生化性质及晶体结构研究 姓名 曹琼瑶f 学号i 2 1 2 0 0 7 0 7 2 9 l 答辩日期i2 0 1 0 年5 月2 7 日 论文类别 博士口学历硕士 硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院深噘化学学院i 专业 农药学 联系电话1 3 6 7 2 1 9 9 7 2 7e m a i l c a o q i o n g y a o s y n n a n k a i e d u c n 通信地址( 邮编) ：天津市南开区南开大学元素有机研究所2 0 1 宝3 0 0 0 7 1 备注： i 是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 i 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 j 学位论文作者签名： 萱堕堡 2 0 1 0 年6 月2 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人审 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的生化性质及晶体结构研究 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期2 0年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密l o 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长l o 年，可少于1 0 年) 摘要 摘要 原卟啉原氧化酶广泛存在于动物、植物、细菌和真菌中，是叶绿素和亚铁 血红素相同的生物合成步骤中的最后一个酶。原卟啉原氧化酶催化无色的原卟 啉原失掉六个电子氧化生成共轭的光敏物质原卟啉。它是一个重要的药物 作用靶标，具有医学和农学研究意义。 本文的研究工作以来源于枯草芽孢杆菌的原卟啉原氧化酶为模型展开，因 为其与真核体系的原卟啉原氧化酶相比，既有共性，又有特性。 本论文主要完成了以下三个部分的工作： 一、以枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶中与人体原卧啉原氧化酶中r 5 9 位点 对应的d 6 5 位点为中心，研究它及其周围的带电氨基酸残基。实验结果表明， d 6 5 位点与周围的氨基酸残基可能形成一个相互作用的残基簇，以此来共同稳定 酶的活性空腔，保证其与底物、f a d 的结合。 二、从枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的天然抗性出发，比较枯草芽孢杆菌 原卟啉原氧化酶与烟草线粒体原卟啉原氧化酶的活性空腔表面的氨基酸残基， 进而设计研究了$ 9 5 r 和t 3 4 6 l 两个突变体。实验结果表明，枯草芽孢杆菌原卟 啉原氧化酶活性空腔内表面的氨基酸残基大小影响着其与底物或者抑制剂的结 合，这可能也就是枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶存在天然抗性的原因之一。 三、我们分别成功培养了枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶野生型和突变体 d 6 5 r 两个蛋白质与抑制剂三氟羧草醚复合物的晶体，并成功解析了野生型枯草 芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的晶体结构，比较了不同种属间原卟啉原氧化酶的差 异性。 关键词：枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶，定点突变，动力学常数，残基簇， 抗性机制，晶体结构 a b s t r a c t a b s t r a c t p r o t o p o r p h y r i n o g e n i xo x i d a s ei st h el a s tc o m m o ns t e po ft e t r a p y r r o l e b i o s y n t h e s i sf o rt h ef o r m a t i o no fh a e m sa n dc h l o r o p h y l l s i tc a t a l y s e sp r o t o g e ni x w h i c hi sc o l o r l e s st op r o t o p o r p h y 血i x i ti sa i li m p o r t a n tt a r g e tb o t hi nm e d i c i n ea n d a g r i c u l t u r e ic h o o s eb a c i l l u ss u b t i l i sp r o t o p o r p h y r i n o g e ni xo x i d a s ea sa ni d e a lm o d e l b e c a u s ei th a ss o m ec o m m o np r o p e r t i e sw i t ho t h e rp r o t o p o r p h y r i n o g e n li xo x i d a s e ， a n di t so w nu n i q u ep r o p e r t i e st o o s oi nt h i s p a p e r , lh a v er e s e a r c h e db a c i l l u ss u b t i i i sp r o t o p o r p h y r i n o g e ni x o x i d a s ei nt h r e ep a r t s ： f i r s t ，w er e s e a r c h e dt h er e s i d u ed 6 5w h i c hw a se q u i v a l e n tt oa r 9 5 9i nh u m a n a n ds o m eo t h e rr e s i d u e sn e a ri ti nb a c i l l u ss u b t i l i sp r o t o p o r p h y r i n o g e ni xo x i d a s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r em a ye x i tac l u s t e rw h i c hw a se s s e n t i a l 南rf a da n d s u b s t r a t e b i n d i n g s e c o n d , w er e s e a r c h e df r o mt h en a t u r a lh e r b i c i d er e s i s t a n c eo fb a c i l l u ss u b t i l i s p r o t o p o r p h y r i n o g e ni xo x i d a s e $ 9 5a n dt 3 4 6w e r ep r o p o s e dt ob er e s p o n s i b l ef o r t h eh e r b i c i d er e s i s t a n c e s ow eg e tt h e i rm u t a n t sa n dt h ek i n e t i c sr e s u l t ss h o w e dt h a t r e s i d u e s v o l u m ei sr e l a t e dt ot h ee n z y m e ss u b s t r a t ea n di n h i b i t o r - b i n d i n g t h i sm a y b eo n er e a s o no fb a c i l l u ss u b t i l i sp r o t o p o r p h y r i n o g e ni xo x i d a s e sn a t u r a lh e r b i c i d e r e s i s t a n c e t h i r d ，w ec r y s t a l l i z e db a c i l l u ss u b f i l i sp r o t o p o r p h y r i n o g e ni xo x i d a s ea n di t s m u t a t i o nd 6 5 rw i t hi n h i b i t o ra f t h er e s o l u t i o ni s2 8 aa n d3 1 a a n dw ec o m p a r e d t h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nd i f f e r e n ts p e c i e so fp r o t o p o r p h y r i n o g e ni xo x i d a s e k e yw o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i sp r o t o p o r p h y r i n o g e ni xo x i d a s e ，k i n e t i c sc o n s t a n t ， s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，c l u s t e r , r e s i s t a n c em e c h a n i s m ，c r y s t a ls t r u c t u r e i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i 】 目录；一i i i j 第一章研究背景介绍1 第一节原卟啉原氧化酶的研究背景介绍1 1 1 1 原卟啉原氧化酶在细胞器中的定位及其作用一l 1 1 2 不同种属的原卟啉原氧化酶的亚基组成2 1 1 3 原卟啉原氧化酶的底物和辅酶一2 j 1 1 4 对原卟啉原氧化酶的反应机理研究3 1 1 5 己报道的原卟啉原氧化酶晶体结构一6 1 1 6 原卟啉原氧化酶的活性测定原理和底物制备方法1 3 第二节原卟啉原氧化酶的相关研究17 1 2 1 原卟啉原氧化酶的医学相关研究1 7 1 2 2 原卟啉原氧化酶的农学相关研究2 2 第三节本文的研究目的和主要研究内容2 6 第二章枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶及其突变体的研究体系2 8 第一节枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶介绍2 8 2 1 1 枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的基本性质及研究价值2 8 2 1 2 本文体外构建的枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶质粒2 9 第二节枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶突变体的构建3 1 2 2 1 基因的定点突变方法简介3 l 2 2 2 实验材料与方法3 2 i t t 目录 2 2 3 实验结果与小结3 7 第三节枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的表达与纯化3 7 2 3 1 实验材料与仪器3 7 2 3 2 实验方法：3 9 2 3 3实验结果与小结4 4 第四节枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的活性测定4 5 2 4 1 底物原卟啉原的定量方法。4 5 2 4 2 原卟啉原氧化酶的活性检测方法_ 4 6 f _ 第三章由人体原卟啉原氧化酶r 5 9 位点引申而来的枯草芽孢杆 菌原卟啉原氧化酶d 6 5 位点及其周围残基的相关研究4 7 第一节有关人体原卟啉原氧化酶r 5 9 位点的研究4 7 第二节实验目的4 9 第三节实验方法。5 0 3 3 。1突变体的构建j 5 0 3 3 2 蛋白质的表达与纯化5 0 3 3 3 酶反应动力学常数测定5 0 3 3 4 辅助因子f a d 解离常数k d 的测定5 0 3 3 5 热稳定性常数t l ，2 的测定5 1 3 3 6 电荷值统计5 1 第四节实验结果与讨论5 2 3 4 1 突变位点的选择5 2 3 4 2 蛋白质表达纯化结果5 3 3 4 3 野生型及突变体的动力学常数分析5 4 3 4 4 讨论与小结j 5 8 第四章枯草芽孢杆菌与烟草线粒体原卟啉原氧化酶对抑制剂三 氟羧草醚的抗性对比结构研究6 0 i v 目录 第一节烟草线粒体原卟啉原氧化酶的活性位点及对抑制剂的抗性机制研 究6 0 第二节枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的活性位点及对抑制剂三氟羧草醚a f 的抗性机制研究6 2 第三节实验目的6 4 第四节实验方法6 4 4 4 1 突变体的构建6 4 4 4 2 蛋白质的表达与纯化6 4 ：4 4 3 酶反应动力学常数测定6 4 4 4 4 酶的抑制剂常数测定6 5 第五节实验结果与讨论6 5 4 5 1 突变位点的选择6 5 4 5 2 蛋白质表达纯化结果6 6 4 5 3 野生型及突变体的动力学常数分析6 6 4 5 4 讨论与小结6 9 j 第五章枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶及其突变体的蛋白质晶体 培养和解析一7 0 第一节蛋白质晶体学简介7 0 5 1 1 蛋白质结晶背景介绍7 0 5 1 2 蛋白质结晶方法7 l 5 1 3x 射线晶体衍射原理及衍射数据的收集与处理7 3 第二节实验目的一7 4 第三节实验仪器与材料7 4 5 3 1仪器7 4 5 3 2 材料7 4 第四节实验方法7 6 5 4 1 用于结晶的枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的蛋白纯化7 6 5 4 2 枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶晶体培养7 7 v 目录 5 4 3 硒代枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的培养、表达7 7 第五节实验结果与讨论7 7 5 5 1 枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的晶体培养条件7 7 5 5 2 枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶与抑制剂a f 复合物晶体的结构解析7 9 5 5 3 讨论与小结8 4 第六章全文总结8 6 参考文献8 8 ； 附录9 6 致谢一1 0 4 个人简历一1 0 6 v i 第一章研究背景介绍 第一章研究背景介绍 第一节原卟啉原氧化酶的研究背景介绍 1 1 1原卟啉原氧化酶在细胞器中的定位及其作用 原卟啉原氧化酶( p r o t o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e ，p r o t o x p p o ) ( e c1 3 3 4 ) 广泛的存在于动物、植物、细菌和真菌中，它是植物中的叶绿素和动物体内的 亚铁血红素相同生物合成步骤中的最后一个酶 1 , 8 4 - 8 6 】。如图1 1 所示为原卟啉原氧 化酶在叶绿素和亚铁血红素生物合成过程中所处的位置。在真菌与动物体内它 一般位于细胞的线粒体中，而在植物中则存在两种同工酶，一种位于线粒体中， 另一种则位于叶绿体中【2 ，引。研究表明线粒体中的原卟啉原氧化酶位于线粒体内 膜；而质体原卟啉原氧化酶则倾向位于叶绿体中类囊体膜靠基质的一侧，还有 - - d , 部分酶则位于外被的内膜中4 ，5 1 。 a ia i ； _ptotopocph)虹ngen l 一 p f o f q p o 印蛐。琴奄| 、竺：l m 弘p 糟静辨啷履证 i i l c 埘锻戮q h 妒l $ f 种r o l 郫嘞埘口 t l t l l h 缎e $ 图1 1 原卟啉原氧化酶是叶绿素和亚铁血红素相同生物合成中的最后一个酶 a l a ：6 一氨基酸1 1 夕 第一章研究背景介绍 1 1 。2 不同种属的原卟啉原氧化酶的亚基组成 不同种属的原卟啉原氧化酶有着不一样的亚基组成。据报道，小鼠9 1 ，菠菜 1 1 0 1 ，莱茵衣藻1 1 1 ，粘球菌属 1 2 1 ，枯草芽孢杆菌1 3 1 中的的原卟啉原氧化酶都是以 单体形式存在的；人体8 1 和烟草的原卟啉原氧化酶则被证明是以二聚体的形式存 在的7 1 ；而厌氧菌原卟啉原氧化酶则是由三个亚基组成的，并且这三个亚基都通 过二硫键相互结合。 1 1 3 原卟啉原氧化酶的底物和辅酶 不同种属来源的原卟啉原氧化酶基本都显示出了对底物原卟啉原的专一 选择性，但仍然有部分原卟啉原氧化酶还是对原卟啉原i x 的类似物也表现出了 一定的催化活性。以枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶为例，它对原卟啉原的催 化效率是最好的，k m 值仅为1 o “m ，但其依然对粪卟啉原i i i 有催化活性，k m 值 为5 3 p , m 1 3 1 。 已有研究表明，不同种属( 厌氧菌除外) 来源的原卟啉原氧化酶都属于黄 素蛋白家族中的一员，它们以f a d 为辅酶，并且以非共价键的形式相互结合。 如图1 2 所示，大多数黄素蛋白的氨基酸序列都在其n 末端都存在一段特征的 氨基酸序列，这段序列是高度保守的g x g x x g 序列，x 代表任意氨基酸残基，它 能形成一个与0 c b a d p 相结合的结构，其中的甘氨酸残基与f a d 的磷酰基相互作 用【7 ，强】，而对原卟啉原氧化酶进行研究后发现，其n 末端同样存在着这样一段序 列【l9 】，所以说，原卟啉原氧化酶也是黄素蛋白这个大家族中的一个成员。 2 第一章研究背景介绍 甓p h _ 冀n d m hdbn r c l p _ m a s d a h _ d b a s c ：p ：o 置y c - 一p h y 暑d e h _ d b m 辫y x o c a e c 口t p h y t d o h _ d b n r e a p p 矗y ：d h _ d b m 村u r o ，p o r t p h y c d 毫d 蠢啊 m y x o c 口c c u _ h n d b 一口扫蕾 a r a b i o o p s ：t p h y o d o h _ 翻鞠 z o a p h y c 矗矗一d b 曩 c a p - i c 钍丑一p h y t d o h d 知曩 s o y b e m , n _ p h y c 6 e h _ d b l 嚣- o 土a _ p 玳d e h d 量 皇y b c h o c o c c t ：曩一p 矗y ：6 a 一0 i 煅 皇- 一恕a o b d b l r q 霉- n 一羚- o bd h m 取轧拧 0 一m o ad bm r 毫c m o t d 备 葛o v t n 一麓 o 一d h 嚣 冀u 口t ：一p o 口b 再 x 争翟一p p o 一9 b 膏 t 4 c p p 口一n b 壤 ；：幂； 黧| |麓羹 k a 逛 x 从西 基裟毪： 委：嚣叠 蕤 瓣篓 t 拿c n t 囊口m s c 辑p 工m 蛔瓦日嘎r 瓣鋈娶甄一i 垂萋鐾麟冀篝鬻寨魏麟 q $ 图1 2 黄素蛋白家族的氨基酸序列比对图n 町， 红色方框内为不同种属原卟啉原氧化酶的序列比对图 1 1 4 对原卟啉原氧化酶的反应机理研究 原卟啉原氧化酶是催化氧化原卟啉原转化生成原卟啉i x 的物质。在原 啉原氧化酶的催化作用下，无色的原卟啉原i x 被氧化，失掉六个电子生成红色 的共轭光敏物质原卟啉i x ，如图1 3 所示。 p r o t o p o r p h y r i ni x 图1 3 原卟啉原氧化酶催化氧化反应【2 0 】 上个世纪7 0 年代以前人们发现原卟啉原i x 只要在有氧气存在的情况下就可 以自氧化生成原卟啉i x 。因此很长时间以来，人们一直都认为原卟啉的生物 合成过程是一种不需要酶参与的可以自氧化的生物过程。 3 f _ 卟 第一章研究背景介绍 直到1 9 6 1 年，s a n o 和g r a n i c k 第一次证明了原卟啉原转换生成原卟啉的 过程在生物体内是被一种酶所控制的，它催化氧化原卟啉原生成原卟啉的 速度要远远快于原卟啉原i x 自氧化的速度。因此直到1 9 6 1 年才正式将这种能以 极快速度氧化原卟啉原生成原卟啉的酶命名为原卟啉原氧化酶【2 0 j 。 后来，越来越多的课题组开始了对原卟啉原氧化酶的研究，这其中，又以 对其反应机制和晶体结构的研究最为热门。 对于原卟啉原氧化酶氧化底物原卟啉原的过程，至今仍未有充分的实验 证据。 最初，人们普遍接受的是a k b t a r 课题组 2 6 1 所提出的氧化机理，如图1 4 所示。 即原卟啉原到原卟啉的氧化过程可能是经过三步去饱和的过程和一步质子 转移重排的反应机理【2 5 2 7 1 。 f。axi。i；e。，。、，；。-聋-蟹 f 缸戗i d i e dl l o v i n 飞一；乒尹、 f 心# r 酣蛳dl l a ，疆 茹 图1 4a k h t a r 等人提出的原卟啉原i x 可能的氧化机理【2 6 】( 图中只显示主环结构) 2 0 0 4 年的时候，k o c h 课题组【7 j 解析得到了烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体 结构。通过对晶体结构的分析，他们认为由于空腔大小的限制，底物原卟啉原 与酶只能采取一种模式结合，且底物原卟啉原的氧化只能起始于空间上距离 f a d 的n 5 最近的次甲基，于是他们在a k h t a r 课题组工作的基础上把原卟啉原i x 的氧化机理具体化，如图1 5 所示。 4 第一章研究背景介绍 图1 5k 。c h 等人所提出的原卟啉原i x 可能的氧化机理【7 1- 原卟啉原被氧化时，所有的电子都是从c 2 0 ，即a 环和d 环之间的亚甲 基开始失去的，在他们模拟的原卟啉原i x 与原卟啉原氧化酶的模型中，原卟啉 原的c 2 0 比较靠近f a d 的异咯嗪环，k o c h 等人又指出，b 环和c 环之间的 c l o 由于b 环上的乙烯基位阻效应不大可能靠近f a d 。 他们提出的原卟啉原氧化酶催化氧化原卟啉原的机理表明，原卟啉原 被氧化为原卟啉i x 的过程可分为三步，每一步辅酶f a d 异咯嗪环上的n 5 原予 被原卟啉原的四吡咯大环所还原，继而辅酶f a d 异咯嗪环被分子氧所氧化， 氧分子则被还原成过氧化氢。每次的氧化一还原过程都以辅酶f a d 异咯嗪环上的 n 5 原子氧化原卟啉原上的c 2 0 为起始，伴随着原卟啉原的四吡咯环上亚胺一 烯胺的互变异构和氢的重排使得原卟啉原逐步被氧化。详见图1 5 ，在第一 步的f a d 氧化原卟啉原的过程中，伴随n 3 ( d 环上的n ) 上氢的重排f a d 从 c 2 0 夺取了两个氢，随后原卟啉原的c 环和d 环之间的c 1 5 上的一个氢迁移 到c 2 0 的位置，伴随a 环n 上的氢重排的过程f a d 开始第二步的氧化，随后 c 5 、n l 、c l o 上分别有一个氢进行了重排，之后f a d 开始第三步的氧化，最终 将原卟啉原i x 氧化成为原卟啉i x 。 5 第一章研究背景介绍 1 1 5 已报道的原卟啉原氧化酶晶体结构 截止n 2 0 l o 年为止，已有文献报道的原卟啉原氧化酶晶体结构一共有三个， 一个来源于烟草线粒体f 刀，一个来源于粘球刮1 2 】，最后一个是我们课题组与生科 院沈月全教授课题组合作解析出的枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的晶体结构 z 4 1 。虽然这三个原卟啉原氧化酶来源于不同的种属，但是晶体结构表明这三个 酶的主体结构是非常类似的，都由三个结构域组成。 1 1 5 1烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体结构 1 日 2 0 0 4 年，烟草线粒体原卟啉原氧化酶与抑制剂i n h 复合物的晶体结构第一次 由德国a l b r e c h t 课题组报道了，并且其分辨率达到了2 9 a 。这是第一个解析出来 的原卟啉原氧化酶的晶体结构。 据文献报道，烟草线粒体原卟啉原氧化酶9 - 聚体的形式存在，如图1 6 所 示，并且酶以非共价键的形式与辅助因子f a d 结合。 图1 6 烟草线粒体原卟啉原氧化酶与其抑制剂i n h 复合物的晶体结构 7 】 二聚体中的每一个单体都由三个结构域组成，分别是f a d 结合域，底物结 合域以及膜结合域，如图1 7 所示。并且活性空腔位于底物结合域和f a d 结合域 的交界面。 6 第一章研究背景介绍 图1 7 烟草线粒体原卟啉原氧化酶与其抑制剂i n h 复合物的单体晶体结构【7 】 由于作者得到的是抑制剂i n h 与烟草线粒体原卟啉原氧化酶复合物的晶体 结构，因此，作者根据晶体结构中i n h 与酶的结合位置模拟了底物原卟啉原与 烟草线粒体原卟啉原氧化酶的结合情况。在这个基础上，作者提出了活性空腔 中几个比较重要的残基，如图1 8 所示。 f 1 、9 8 位点的精氨酸：由于精氨酸是一个带正电荷的氨基酸残基，因此作者 认为它起着稳定抑制剂i n h 与底物底物原卟啉原i x 的羧基的作用。 2 、3 9 2 位点的苯丙氨酸：苯丙氨酸是一个带苯环的芳香氨基酸残基，它与 抑制剂i n h 的吡唑环存在着7 c 一兀堆积的相互作用，因此，这个位点的残基也极有 可能与底物原卟啉原的a 环存在同样的相互作用。 3 、3 5 6 位点和3 7 2 位点的亮氨酸：如图1 8 a 所示，这两个残基像三明治结构 一样分别位于抑制剂i n h 的苯环的上下方，稳定了抑制剂与酶的结合。因此，作 者猜测，这两个残基与底物原卟啉原i x 的b 环同样可以存在这样的相互作用，从 而稳定酶与底物的结合。 7 第一章研究背景介绍 a 图1 8a ：烟草线粒体原卟啉原氧化酶与底物、产物以及抑制i n h 的结合副7 】； b ：底物原卟啉原和抑制剂i n h 的结构图【_ 7 】 由于人体卟啉症的致病机理近年来一直是各国科学家的研究热点，因此， 作者也根据烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体结构对人体卟啉症进行了探讨和 研究。 f 据文献报道，有9 4 的卟啉症患者，他们体内的原卟啉原氧化酶都有一个共 同的特点，那就是他们体内的原卟啉原氧化酶5 9 位点的精氨酸都不约而同的突 变成了色氨酸。而根据不同种属的原卟啉原氧化酶序列比对可知，在烟草线粒 体原卟啉原氧化酶中，与人体内5 9 位的精氨酸相对应的是6 7 位的天冬酰胺。这 个残基位于底物原卟咻原与辅助因子f a d 的异咯嗪环之间，所以作者猜想， 在人体内当5 9 位点的精氨酸突变成带大体积侧链的色氨酸之后，必然会极大的 影响酶与底物以及f a d 的结合。 另一方面，在烟草线粒体原卟啉原氧化酶中，在结构上与6 7 位点的天冬酰 胺位置相对的是3 7 4 位点的丝氨酸，这是一个在各个植物原卟啉原氧化酶中高度 保守的位点。而在人体原卟啉原氧化酶中，与烟草线粒体原卟啉原氧化酶3 7 4 位 点的丝氨酸相对的是3 4 9 位点的天冬氨酸。这是一个带负电的氨基酸残基，其与 5 9 位点的带正电的精氨酸极有可能通过静电相互作用而形成盐桥，从而起到了 稳定整个酶活性空腔的作用。从这一点来说，就不难理解当人体内5 9 位带正电 的精氨酸突变成不带电荷的色氨酸之后，它与3 4 9 位点天冬氨酸的相互作用将被 破坏，从而导致整个酶活性空腔结构的破坏，最终使得酶活性降低或者丧失， 从而导致卟啉症的发生。 8 第一章研究背景介绍 作者还根据所得到的烟草线粒体原卟啉原氧化酶晶体结构建立了一个在四 吡咯生物合成中原卟啉原氧化酶与上下游酶结合的模型，如图1 9 所示。 a d o c k i n gm o d eo ft h et h r e el a s te n z y m e si np o r p h y r i nb i o s y n t h e s i s o 印p o r p 州n 0 9 e r io x m m s e o u t e r 州l o d w 辩d r i a lm e m b r a n e b 图1 9 a ：粪卟原i i i 氧化酶，原卟啉原氧化酶，亚铁鳌和酶的结合方式模拟图1 7 ； b ：通道示意图【7 】 关于原卟啉原氧化酶与上游粪卟原i i i 氧化酶以及下游亚铁鳌和酶之间的结 合方式一直以来几乎没有过报道，而作者利用晶体结构推测了一个展现四吡咯 生物合成途径的直观模型，特别是他在烟草线粒体原卟啉原氧化酶的膜结合域 上发现了一个可能存在的u 型通道，原卟啉原氧化酶的底物或者产物可以在其中 通过。这一通道的重大发现与前面文献报道的人体亚铁鳌和酶的晶体结构中的 通道能很好的交叠，因此有理由相信粪卟原i i i 氧化酶催化得到的原卟啉原i x 在 经过原卟啉原氧化酶氧化后直接顺着此通道直接进入下游亚铁鳌和酶的活性空 腔。这样一个通道的存在可以使得四吡咯生物合成过程中生成的各种极易氧化 的卟啉原能在一个安全的环境下顺利的进行反应。 9 第一章研究背景介绍 综上所述，a l b r e c h t 课题组首次报道了烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体结 构，这也是第一个已知原卟啉原氧化酶的晶体结构。他的重大贡献不仅是第一 个获得了原卟啉原氧化酶的晶体结构，更为其他工作者对这一领域的研究提供 了可贵的基础资料和理论指导。 1 1 5 2 粘球菌原卟啉原氧化酶的晶体结构 在烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体结构报道的两年之后，2 0 0 6 年，c o r r a d i 课题组又报道了粘球菌原卟啉原氧化酶的晶体结构。这在原卟啉原氧化酶的研 究领域又是一个重大突破，因为其是首个原核生物中原卟啉原氧化酶的晶体结 构。作者不仅培养出了粘球菌原卟啉原氧化酶的晶体结构，还培养了其与抑制 剂a f ( 三氟羧草醚) 复合物的晶体结构。 晶体结构表明，尽管粘球菌原卟啉原氧化酶与烟草线粒体原卟啉原氧化酶 的序列相似性较低，但它们在主体结构上却有着很高的相似性。与烟草线粒体 原卟啉原氧化酶类似，粘球菌原卟啉原氧化酶也由三个类似的结构域部分组成， 分别是f a d 结合域，底物结合域以及膜结合域，如图1 1 0 所示。而其活性空腔则 位于这三个结构域的交界处。 s 话 图1 1 0 粘球菌原卟啉原氧化酶的晶体结构，黄色分子为f a d ，绿色分子为抑制剂a f 1 2 】 同样的，作者根据晶体结构中抑制剂a f 与酶的结合位置进行了底物原卟啉 原与粘球菌原卟啉原氧化酶的对接模拟。并且在这个基础上，作者也提出了 活性空腔中几个比较重要的残基，如图1 11 所示。 l o 第一章研究背景介绍 图1 1 1 粘球菌原卟啉原氧化酶与底物( 紫色) ，抑制剂( 绿色) 结合图n 幻 1 、9 5 位点的精氨酸和4 4 7 位点的甘氨酸：这两个氨基酸残基之间的距离与 底物原卟啉原i x 的宽度很接近，因此，它们可能限制了活性空腔的宽度。而粘 球菌原卟啉原氧化酶中9 5 位点的精氨酸对应的是烟草线粒体原卟啉原氧化酶的 9 8 位点的精氨酸，更重要的是，这个精氨酸在很多种属的原卟啉原氧化酶中都 是高度保守的。 2 、1 6 7 位点的甘氨酸：从晶体结构止看，f a d 就像天花板一样位于活性空 腔的上方，底物在空腔内，而1 6 7 位点的甘氨酸则正好在空腔的底部，并且其主 链上的羧基直指底物的中心。 3 、3 2 9 位点的苯丙氨酸：从对接的模型来看，3 2 9 位点的苯丙氨酸其苯环恰 好与底物原卟啉原的b 环之间存在者7 c - 兀堆积的相互作用，并且这个位点的苯 丙氨酸在很多种属的原卟啉原氧化酶中也都是高度保守的。 作者在得到了粘球菌原卟啉原氧化酶与抑制剂a f 复合物的晶体结构之后， 提出了一个新的关于枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶天然高抗性的观点。即二苯 醚类化合物三氟羧草醚这种原卟啉原氧化酶抑制剂，它是在结构上模拟了一半 的底物原卟啉原，然后通过竞争性抑制了酶的活性。而从粘球菌原卟啉原氧 化酶与抑制剂a f 复合物的晶体结构中可以看到，这个抑制剂a f 小分子位于酶活 性空腔的深处，通过疏水作用而与原卟啉原氧化酶的疏水活性空腔相结合。而 它们之间的结合又主要依托于三个十分重要的氨基酸残基，如图1 1 2 所示。 第一章研究背景介绍 图1 1 2 粘球菌原卟啉原氧化酶与抑制剂a f 的结合图n 2 3 l 、9 5 位点的精氨酸与抑制剂a f 的硝基相互作用；2 、1 6 4 位点的缬氨酸通过 水分子的介导作用而与抑制剂a f 的羧基产生疏水相互作用；3 、3 2 9 位点的苯丙 氨酸凶为含有苯环也与抑制剂a f 的硝基相互作用。 一 由于抑制剂a f d 分子与粘球菌原卟啉原氧化酶是通过疏水相互作用而与酶 结合的，这就要求了抑制剂自身的结构要与酶的活性空腔高度匹配。因此，在 这个基础上，作者模拟了枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶与对其有抗性的抑制剂 a f 的对接模型。发现这个基于烟草线粒体原卟啉原氧化酶晶体结构建立的模型 与另外两个已知的晶体结构是非常类似的，但相对于粘球菌原卟啉原氧化酶的 主要活性位点来说，在枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶中都变成了小体积的氨基 酸。因而使得其活性空腔比粘球菌原卟啉原氧化酶的大，这就会导致抑制剂与 酶的结合不够紧密，从而产生了枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶对抑制剂的抗性。 这从一方面也解释了为什么枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶比别的种属的原卟啉 原氧化酶要有更多的底物适应性了。 与a l b r e c h t 课题组类似，作者也根据粘球菌原卟啉原氧化酶晶体结构对人体 卟啉症的致病机理进行了研究。在人体原卟啉原氧化酶中的5 9 位点的精氨酸对 应着粘球菌原卟啉原氧化酶中6 3 位点的天冬酰胺。而从粘球菌原卟啉原氧化酶 的晶体结构上看，6 3 位的天冬酰胺与其周围的几个残基( 分别是3 5 4 位点的精氨 酸，3 6 3 位点的丝氨酸，5 9 位点的谷氨酸) 以及f a d 的n 5 在水分子的介导下形成 了一个氢键网，如图1 1 3 所示。 1 2 第一章研究背景介绍 _ 图1 1 3 粘球菌原卟啉原氧化醇a s n 6 3 残基与周围残基和f a d 的n 5 形成一个氢键网【1 2 】 作者认为，这个氢键网是维持整个酶活性空腔结构的重要组成部分，它保 证了酶活性空腔的完整，稳定了酶与f a d 的结合，对酶的催化活性起着重要的 作用。而在人体卟啉症患者的原卟啉原氧化酶的基因中发现，他们的基因突变 位点都在结构上与f a d 十分相近。因此，作者认为，卟啉症的致病原因很有可 能就是由于基因突变从而影响了酶与f a d 的结合，使得人体原卟啉原氧化酶不 能发生其应有的生物学功能，从而导致了疾病的发生。 综上所述，c o r r a d i 课题组是第一个获得原核生物的原卟啉原氧化酶晶体结 构的课题组，他们为原卟啉原氧化酶的研究又提供了重大的突破。作者根据粘 球菌原卟啉原氧化酶的晶体结构对酶与抑制剂的结合，以及人体卟啉症可能的 致病机理提出了新的观念，把对原卟啉原氧化酶的研究又推上了一个新台阶。 1 1 5 3 枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶的晶体结构 我们课题组与南开大学生命科学学院沈月全教授课题组合作，成功解析出 了枯草芽孢杆菌原卟咻原氧化酶与抑制剂a f 复合物的晶体结构i l 引。 有关这部分的内容将在本论文的第五章进行详细的介绍。 1 1 6 原卟啉原氧化酶的活性测定原理和底物制备方法 1 1 6 1原卟啉原氧化酶的活性测定原理和测定条件 由于酶反应产物原卟啉是共轭光敏的物质，因此可以用它的光学性质， 1 3 第一章研究背景介绍 通过测定其生成量来监测原卟啉原氧化酶反应的进行。 最早的活性测定方法是紫外法，因为原卟啉在特征波长处有吸收，因此 可以利用它的这个性质来对它进行定量，并且也可以依据产物原卟啉的生成 速度表征酶反应的速度。 后来，又发展了荧光测定法。因为荧光测定法比紫外测定法更灵敏，检测 极限更低，因此随着荧光技术的逐渐成熟，荧光测定法成为了原卟啉原氧化酶 活性检测的主要手段。 荧光法检测原卟啉原氧化酶活性的具体条件是：测定产物原卟啉的荧光 发射强度( e x c i t a t i o n4 1