（作物遗传育种专业论文）水稻矮秆基因D68的遗传分析及精细定位.pdf

扬州大学硕士学位论文 符号说明 简写符号英文全称 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r - a f l p p h i s m b a c b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e b c b a c kc r o s s b l a s t b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b l b r a s s i n o l i d e b p b a s e p a i r b rb r a s s i n o s t e r o i d c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o 州c $ e - c a p s q u e n e e s e d n ac o m p l e m e n t a r yd n a c mc e n t i m o r g a n c t a b c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d n ad e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d h d o u b l e dh a p l o i d d n t pd e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a e e t i ca c i d e s te x p r e s s e ds e q u e n c et a g g i n g o ag i b b e r e l l i n i r r i 、 i n t e r n a t i o n a lr i c er e s e a r c hi n s t i t u t e k b k i l o b a s c n i l n e a ri s o g e n i cl i n e p a c p 1 - d e r i v e da r t i f i c i a lc h r o m o s o m e p c rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 中文全称 扩增片段长度多态性 细菌人工染色体 回交 局部排列搜索工具 油菜素内酯 碱基对 油菜素类固醇 切割扩增长度多态性 互补d n a 厘摩 溴化十六烷三甲基铵 脱氧核糖核酸 加倍单倍体 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 表达序列标签 赤霉素 国际水稻研究所 千碱基对 近等基因系 质粒人工染色体 聚合酶链式反应 曾龙军本疆矮秆突变体d w a r f 6 8 ( d 6 8 ) 遗传分析及基因的精缨塞堡三 简写符号 q t l r f l p r n a 戳l s s r s t s 翰c 英文全称 q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u , $ r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y - m o r p h i s m r i b o n u c l e i ca c i d r e c o m b i n a n ti n t n e dl i n e s i m p l es e q u e n c er e p e a t s s e q u e n c et a g g e ds i t e y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e 中文全称 数量性状座位 限制性酶切片段多态性 核糖核酸 重组自交系 简单序列重复( 微卫星) 序列标签位点 酵母人工染色体 3 2 2水稻d 6 8 突变体的遗传分析3 7 3 3水稻d 6 8 突变体的生物学分析- 3 8 3 4d 6 8 基因的图位克隆。3 8 3 4 1d 6 8 基因的初步定位，3 8 3 4 2d 6 8 基因的精细定位”4 0 第四章结果与讨论4 2 4 1g a 3 处理鉴定水稻矮秆基因”4 2 4 2 图位克隆过程中分子标记的选择4 2 下一步工作：。4 4 参考文献：”4 5 致谢 图表目录 图1 1 水稻野生型植株与矮秆突变体的节间伸长模式( 引自t a k e d a1 9 7 7 p o 】) 8 图1 2 内根一贝壳杉烯和内根一赤霉素烷的分子结构式。l o 图1 3g a 的生物合成途径1l 图1 4g a 信号在拟南芥( 左) 和水稻( 右) l 蚓中的转导模型1 4 圈1 。5d e l l a 的结构以及d e l l a 结构域突变的不同生长效应，1 6 图1 6 谷类种子在萌发过程中各组织器官的功能“1 8 图1 7g a 诱导糊粉层产生淀粉酶的复合模型【2 6 l 2 0 图i 8b r 生物合成途径( 引自s u n g h w ac h o e ，2 0 0 6 ) f 叫2 2 图1 9 b r 的信号转导途径( 引自：l e i l ia n d x i n g w a n g d e n g ，2 0 0 5 ) 【。町2 5 表2 1 不同激素浓度处理突变体- 3 1 表2 2 电泳缓冲液：1 0 x t f i s 一硼酸( t b e ) 3 3 图3 1 水稻突变体d 6 8 与野生型日本晴的表型3 6 表3 1d 6 8 和5 个矮杆突变体的等位性测定3 7 表3 2 矮杆植株和正常植株在杂交后代f 2 群体中的分离3 7 图3 2d 6 8 和野生型( 日本晴) 苗期对外施g a 3 ( 左) 和b r ( 右) 的敏感性3 8 图3 3r m l 2 8 2 、r m 3 7 4 0 、r m 5 3 3 6 和r m 5 3 0 2 引物在f 2 d n a 混池中的偏分 离情况3 9 图3 4r m 3 7 4 0 弓l 物在f 2 群体中韵分离r 3 9 图3 5s t s 标记l t i o 在d 6 8 n j - 6f 2 后代群体中的分离4 0 图3 6 d 6 8 基因的精细定位”4 1 曾尼军水稻矮秆突变体d w a r f 6 8 c d 6 a ) 遗传分析及差崮的精缌定位 l 水稻矮秆突变体d w a r f 6 8 ( d 6 8 ) 遗传分析及基因 的精细定位 硕士生：曾龙军 导师：钱前研究员 ( 扬州大学农学院，江苏扬州2 2 5 0 0 9 ) 摘要 水稻即是我国重要的粮食作物，也是单子叶植物生长发育生物学研究的模式植 物。通过水稻突变体的筛选及其相关基因的克隆和功能分析，对赤霉素的生物合 成和信号转导途径已经有了大致的了解。但是赤霉素如何与其他基因相互作用来 调控水稻株高性状，目前还不是很清楚，这还有待于新的相关基因的克隆，以及 有关株高突变体的筛选和分离。 本研究用e m s 的方法处理水稻粳稻品种日本晴，得到了一株矮杆突变体 d w a r f 6 8 ( d 6 8 ) ，该性状能够稳定遗传。遗传分析和定位性实验结果表明，d 6 8 受 单隐性基因控制，并且与已知的矮杆突变体d l ，d l l ，d 2 和本实验室已经克隆的 矮杼体变体d 6 3 ，幽仞夕1 i k e 不等位，这表弱d 6 8 可能是一个新的矮杆突变体突 变体d 6 8 经赤霉素( g a 3 和油菜素类酯( b r s ) 处理后，d 6 8 只对g a 3 有响应， 并且能恢复到野生型的表型，但是对b 凡无反应，所以d 6 8 突变体是典型的o a 敏感型。我们从d 6 8 突变体与籼稻品种南京6 号杂交得到的f 2 群体中，共鉴定出 1 3 7 7 株矮杆表型的突变体。采用图位克隆的方法。将d 6 8 基因精细定位在第一号 染色体的短臂上，物理距离为6 l k b 。序列分析表明该区域含有8 个开放性阅读框 关键词：水稻，矮杆，赤霉素，油菜素类酯，图为克隆，精细定位 扬州大学硕士学位论文 2 g e n e t i ca n a l y s i sa n dg e n em a p p i n go far i c e ( o r y z as a - t i v al ) d w a r fm u t a n tg e n ed 6 8 p o s t g r a d u a t e ：l o n g j u nz e n g s u p e r v i s o r ：p r o lq i a nq i a n ( a g r i c u l t u r a lc o l l e g e ，y a n g z h o uu n i v e r s i t y ，y a n g z h o u2 2 5 0 0 9 ) a b s t r a c t r i c e ( o r y z as a t i v al 1i sn o to n l yo n eo f t h em o s ti m p o r t a n tf o o dc r o p si l lc h i n a , b u t a l s oam o d e lp l a n tf o rs t u d i n gt h ed e v e l o p m e n t a lb i o l o g yo fm o n o c o t s t h ep a t h w a yo f g i b b e r e l l i n sm e t a b l i s ma n ds i g n a l i n gt r a n s d u c t i o nh a sb e e ni n t e n s e l ys t u d i e dt h r o u g h s c r e e n i n g ，g e n ec l o n i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i so fr i c em u t a n t sd e f i c i t e di ng i b b e r e l l i n b i o s y n t h e s i sa n ds i g n a l i n gt r a n s d u c t i o na n di m p o r t a n tp r o g r e s s e sh a v eb e e nm a d er e - c e n t l y h o w e v e r , i ti su n c l e a rt h a th o wg i b b e r e l l i n si n t e r a c t e dw i t ho t h e rg e n e si nr e g u - l a t i n gt h ed e v e l o p m e n to fr i c eh e i g h t 。c l o n i n go fm o r er e l a t e dg e n e sa n di d e n t i f i c a t i o n o fn u m e r o u sg i h b e r e i l i n sm e t a b o l i s mo rs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o nd e f i c i e n tm u t a n t si s n e e d e di ne l u c i d a t i n gs u c hac o m p l e xp a t h w a y w ef o u n dad w a r fm u t a n t , n a m e dd w a r f 6 8 ( d 6 8 ) ，f r o mj a p o n i c av a r i e t yn i p p o n b a r e t r e a t e dw i t he m s g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h es e g r e g a t i o nr a t i oo fw i l d - t y p et o d w a r f p l a n t si si na c c o r d a n c ew i t h3 ：1i nt h ef 2p o p u l a t i o n sa n d t h a td 6 8i sc o n t r o l l e db y o n er e c e s s i v eg e n e a l l e l i ct e s ts h o w e dd 6 8w a sn o n a l l e l i cw i t hk n o w nd w a r fm u t a n t s d l ，d 1 1 d 2a n dd 6 3 d w o 吲 l l i k ew h i c hh a v eb e e nc l o n e db yo u rl a b t h e r e f o r e , t h e m u t a n tm a yb e 矗n o v e ld w a r fm u t a n t a p p l i c a t i o no fg a 3l e d st os t e me l o n g a t i o no f d w a r f m u t a n td 6 8w h i c hi sr e s e m b l ew i t ht h a to f w i l d t y p e ，w h e r e a se x o g e n o u sb r sh a s l i t t l eo rn oe f f e c to nt h em u t a n t t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h em u t a n ti ss e n s i t i v et og a t oe l u c i d a t et h em o l e c u l a rf u n c t i o no fd 6 8 ，w eu s e d1 , 3 7 7d w a r fm u t a n t ss e l e c t e di n o n ef 2p o p u l a t i o nd e r i v e df r o mt h ec r o s sb e t w e e nd 6 8a n di n d i c av a r i e t yn a n j i n g - 6a s m a p p i n gp o p u l a t i o n , a n dt h e1 9 6 8g e n e 辅髑f i n a l l yf i n e l ym a p p e db e t w e e nt h es t s ! 垄兰奎翌丝堑苎望旦竺塑鳖坌堑墨苎塑塞垡 ! m a r k e r sl t la n dl t 6o nc h r o m o s o m e1t h r o u g hm a p - b a s e dd o i n gs t r a t e g y t h ei n t e r - v a ll 锄g t hi s6 1k b ，o r fa n a l y s i so f t h i sr e g i o nr e v e a lt h a tt h e r ea r ee i g h to p e nr e a d i n g f r d l n c ( o r f ) i nt h i sr e g i o n k e yw o r d s ：r i c e ( o r a z ys a t i v al ) ，d w a r f , g i b b e r e l l i n s ，b r a s s i n o s t e r o i d ，m a p - b a s e d c t o i n g ，f i n e - m a p p i n g 扬州大学硕士学位论文 6 第一章文献综述 水稻( o t t os a t i v al ) 是人类赖以生存的主要粮食作物，全世界约有l ，2 的 人口以大米为主食。水稻不仅是重要的粮食作物，而且还是单子叶植物遗传学和 基因组研究的模式植物。水稻突变体对基因克隆和功能分析具有着重要的作用， 目前通过各种方法已经建了许多水稻突变体库水稻株高是一个很重要的性状， 一直以来都是育种家关注的重点，2 0 世纪6 0 年代水稻矮化育种实现了水稻产量的 又一次飞跃，被誉为“绿色革命”。株高性状即受基因的控制，也受到各种激素 和环境因子的影响。近年来，对水稻高杆，矮杆突变体的筛选和基因克隆，逐渐阐 明了激素在水稻中的合成和信号转导途径。但是激素是如何与其他因子相互作用 共同调控水稻株高这一性状，还有待更多的与激素相关基因的克隆和功能分析。 因此，水稻矮生性基因的克隆对于深入研究禾本科植物茎杆生长发育的分子生物 学机理和激素调控模型具有重要的意义。 1 1水稻矮杆性状的遗传研究 稻种资源是水稻育种工作的生命线，优良种质的发现和利用是水稻育种工作 能够不断发展的前提条件。早在上世纪4 0 年代术，人们就开始利用矮秆基因进行 水稻矮化育种，台湾省台中区农业改良场于1 9 4 9 年用矮源低脚乌尖作母本，与高 秆地方品种在来种杂交，并在1 9 5 2 年选育出中国第一个矮秆釉稻品种台中在来1 号( 也称台中本地i 号) 。1 9 6 2 年，国际水稻研究所( i r r i ) 利用低脚乌尖和印 度尼西亚的一个高杆品种p e m 杂交，并予1 9 6 6 年育成了后来被称为“奇迹稻”的 半矮秆品种i r 8 n 1 。随着台中在来l 号和取8 的育成和推广，低脚乌尖携带的矮秆 基因得到了育种家的高度重视和充分利用，并将其命名为s d l 哪。根据国际水稻所 的遗传调查，除中国大陆以外，低脚乌尖几乎是所有籼稻矮化品种的共同祖先。1 。 根据对我国1 9 5 0 1 9 8 5 年推广的6 4 6 个籼稻品种的亲缘分析，我国普遍利用的籼 稻矮源主要有4 个，即矮仔占、矮脚南特、低脚乌尖和印尼水田谷，由它们衍生 的品种占到总品种数的8 3 9 “3 。与籼稻不同，粳稻矮化育种利用的矮源可分为两 曾尼军水稻矮秆突变停咖口矿醒( d 6 8 ) 遗传分析及基因的耩细定位 7 类：类是由单个主效矮秆基因控制的，另一类则是由多个微效基因控制的o ” 矮生性由主基因控制的粳稻矮源主要是由剐i n i i i l 嘶和c a l r o s c 分别经丫射线诱变 育成的r e i m e i 和c a l r o s e 7 6 “。1 ，以及自然突变而来的一个半矮秆品种j i k k o k u 啊。 随着矮秆品种在生产上的应用，它们的矮生性遗传也引起了人们的关注。卢 永根等对我国早籼稻四大矮源( 矮脚南特、矮仔占、低脚鸟尖和广场矮) 的矮生 性遗传进行了系统的研究，结果也发现四大矮源的矮生性都属简单遗传，受对 隐性主基因控制，同时存在一些修饰基因作用 1 0 e 顾铭洪和朱立宏经过等位性分 析发现。在生产上利用的大部分籼稻矮源均携带等位的矮秆基因，仅有桂阳矮l 号所携带的矮秆基因与它们是不等位的“。同时，国外的研究者也发现j i k k o k u 、 r e i m e i 和c a l r o s e 7 6 所携带的矮秆基因也都是s d l 的等位基因“”。为了拓宽水稻 矮化育种的遗传基础，实现水稻产量的新突破，广东省农科院的黄耀祥提出了丛 生快长型高产水稻的育种设想，并选育出了著名品种桂朝和双桂“”。顾铭洪等研 究表明这类品种的矮生性受一个与s d l 不等位隐性矮秆基因控制，并将桂阳矮l 号基因定名为s d g “”。 1 2水稻矮秆的分类与命名 根据水稻的矮化效应，在广义上，矮生性是指成熟期株高比正常植株缩短的 遗传特性。在狭义上可将矮秆分为3 个大类：矮秆、半矮秆和极矮秆。矮秆( 狭 义) 是指成熟时植株高度等于或低于原正常植株高度一半的矮秆突变系；半矮秆 则是指株高介于矮秆和正常高度之间的类型。 1 9 8 0 年成立的日本水稻基因连锁群和命名委员会( t h ej a p a n e s ec o m m i t t e eo i l n o m e n c l a t u r ea n dl i n k a g eg r o u po f r i c eg e n e s ) 将矮秆基因及少数半矮秆基因统一 命名，其中具有强矮化效应，植株表现为矮秆的以d 为符号，根据被鉴定的时间 顺序，已从们编录至彩j ，其中缺街、们5 、d 1 6 、d 2 3 、和d 3 6 ，因而共有5 5 个 以d 命名的矮秆基因。这些矮秆大都来自粳稻品种，且经常伴随出现许多不良性 状，难以在生产上直接利用。而具有弱矮化效应，植株表现为半矮秆类的基因则 以埘为符号，目前已有1 5 个鲥类型的报道，其中由s d l 基因控制的矮秆只对株 扬州大学硬士学位论史s 高起抑制作用，并不影响其它农艺性状，生产应用广泛。在已报道的矮秆中，有 部分基因是相同或等位的，如：d 6 和d 3 4 ；d l o 、以j 和d 1 6 ；d 1 2 和d s o ；d 4 7 ， d 4 9 和s d l 等位“” 1 3 水稻植株矮化与节问的关系 一般认为，水稻植株的矮化是由于节问长度缩短或节间数减少的结果，也可 能是两者共同作用的结果。t a k e d a 等以节间长度占株高的比例为指数，将矮秆分 为砌、d i n 、彩、耐和幽5 种基本类型( 如图1 - 1 ) “”“，而将节间比例正常的品 种标定为型。咖型的特征是节阃比例与型相同；d l n 型的特征是倒2 节间特别 短；彩型的特征是只有穗下节间伸长，其它节间不伸长；川型的特征是有颈叶， 倒l 节间短而第4 节间长，偶尔有第6 伸长节间：s h 型的特征是倒1 节几乎不伸 长，穗子包藏在剑叶叶鞘中。除砌型以外的所有矮秆类型都存在某一节间显著缩 短的特征，这表明不同的矮秆基因作用于水稻植株的不同伸长节问，他们对植株 的矮化作用只是在某一特定生长时期发生，结果导致某些节间显著缩短。 nd nd md 6n 1s h 图1 i 错误l 未找到引用源错误l 未找到引用源错误l 未找到引用源水稻野生型植株 与矮秆突变体的节间伸长模式( 引自t a k e d a1 9 7 7 2 0 i ) f i g u r e l 1 t h e m o d e lo f s t e m s e l o n g a t i o n o f r i c e d w a r f m u t a m a n d w i d 叻e l 州 1 4植物矮化的分子生物学机制 箱如如0 憾半葭罂厘轵半擘 曾龙军水稻矮秆突变体a w a , - f 6 s ( d 6 8 ) 遗传分析及基因的精细定位 9 植株矮化是矮秆主基因表达作用的结果，同时也受到修饰基因或抑制基因的 影响唿捌。一般认为矮秆基因的作用能直接导致水稻植株形态学或细胞学的变化， 如节间变短和细胞个数减少等，从而造成了植株的矮化。丽矮杆基因的表达受到 各种激素的调控，其中赤霉素( g i b b e r e l l i n , o a ) 和油菜素类固醇( b r a s s i n o s t c r o i d , b r ) 是影响植物高度最主要的两类激素。植物激素矮化突变体分为两类：缺陷型 和钝感型。激素缺陷型矮化突变体是指活性激素的生物合成途径被抑制或阻断， 造成植物体内源活性激素缺乏或含量较低，这类突变体外源施加相应的活性激素 后可恢复野生型表型；激素钝感型矮化突变体，其内源活性激素水平变化不大， 有时甚至比野生型的还高，这种矮化表型的突变体在外施相应的活性激素后不能 恢复野生表型。钝感型突变体可能有3 种机制：1 ) 激素受体突变，使之不能与激 素结合或结合后不能活化；2 ) 信号转导中某个关键步骤突变而丧失功能；3 ) 外 源激素并非是体内活性形式，将此物质转化为活性形式的酶发生突变o ”。 1 4 1 赤霉素( g i b b e r e i i n g a ) 与植物的生长发育 赤霉素是第二大类植物激素，最早是由日本科学家黑泽英一在1 9 2 6 年研究水 稻赤霉病( 即恶苗病) 时发现的。该病能使植株增高，产量下降。后来研究发现， 这是由一种真菌病原体( 即赤霉菌g i b b e r e l l a f u j i k u r o i ) 感染植株后分泌的具有活 性的化学物质所引起的，并且将该化学物质从赤霉菌的培养液中分离出来了。直 到2 0 世纪3 0 年代，日本科学家矢布田程次郎和林武志成功地从该致病菌中得到这 种不纯的生长诱导因子晶体，并根据该化合物的化学结构将其命名为赤霉素 ( g i b b e r e l l i n ，g a ) 嘲。2 0 年后，日本和欧荚科学家同时从赤霉菌中分离出纯的 g a 3 ，g a i 也于1 9 5 8 年从高等植物中被分离鉴定出来。随着越来越多的来自于真菌 和植物赤霉素的发现，1 9 6 8 年，人们根据赤霉素被发现的顺序将其命名为g a x ，x 仅仅是为防止g a 种类多造成混乱而给出的一个数字，相邻两种赤霉素之间并没有 特殊的代谢关系或化学结构相似性。赤霉素是一类四环二萜类化学物家族，因为 所有的赤霉素都来源于内根一贝壳杉烯( e n t - k a u r e n e ) ，具有一个共同的分子结构 式内根一赤霉素烷( e n t - g i b b e r e l l a n e ) ( 图i - 2 ) 。但是由于碳2 0 和碳1 3 上基 扬州大学碗士学位论文 1 0 团的改变，而出现各种各样不同种类的g a s 。到目前为止，虽然已经发现了1 2 7 多 种赤霉素。但是遗传分析表明仅有少数几种具有生理活性( 如g a t 、g a 3 、g a 4 、 0 加) 。 ：潞仃 卜k a u r e n e e n t j g i b b e r e n a n es t t , j c t u m 图1 2 内根一贝壳杉烯和内根一赤霉素烷的分子结构式“ f i g u r e1 2 t h ec h e m i c a ls t 矾l c t u r e o f e n t - k a u r e n ea n d e n t - 舀b b e r e l | a n e t 2 6 1 赤霉素不仅能促进矮杆和莲座叶植物茎节伸长，导致植株快速增长，而且在很 多生理学现象( 如光周期) 上有着重要的作用，影响着植物生长发育的各个时期。 赤霉素作用于草本植物节问附近的屠闻分生组织，使矮杆突变体的茎伸长，达到 野生型的高度，同时茎秆变细、叶片颜色变浅，但是外施g a l 对高杆植株的高度 影响并不是很明显。除此之外，赤霉素还影响着种子的萌发( 包括打破种子休眠 和胚乳储藏物质的转运) 、植物幼嫩期向成熟期的过渡、花器官的形成、性别的 决定和果实的生长发育。”。目前的研究表明，与赤霉素相关的矮化突变主要是通 过g a 的合成代谢与信号转导两个途径对植株高度进行调控。 1 4 1 g a 的生物合成及相关突变体 赤霉素的合成是萜类化合物代谢途径的一条分支，萜类化合物是由异戊二烯 基团首尾相连丽成。k o b a y a s h i 等利用同位素示踪法和放射法来检测各种具有放射 性的前体、中间产物和其他代谢产物，研究g a 在各种植物品种的种子和营养器 官的生物合成途径渊。g a 的合成与代谢可分为3 个阶段，每个阶段都是在不同的 细胞器中完成：1 ) 栊牛儿栊牛儿基二磷酸( g e r a n y lg e r a n y ld i p h o p h o s p h a t e ，g g p p ) 转化为内根一贝壳杉烯( e n t - k a u r e n e ) ，该阶段在质体中进行；2 ) 在内质网上由内 根一贝壳杉烯合成g a l 2 或g a s 3 ；3 ) 在细胞质中g a l 2 或g a 5 3 生成各种o a s ( 如 图l 一3 ) 伽。 竺些兰查塑璧堑窭壅笪丝堡! ! 竺! 垫堡坌堑墨苎里堕堕堡塞堡! ! 图1 3 g a 的生物合成途径 f i g u r e1 3t h ep a t h w a yo f g i b b e r e l l i n sb i o s y n t h e s i s 扬州大学殛士学位论文1 2 第一阶段：萜类前体物质和内根一贝壳杉烯的合成。 g a 生物合成的起始涉及到异戊烯二磷酸( i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t e ，i p p ) 的形 成，以及其经过萜类合成途径转化为栊牛儿拢牛几基二磷酸( g e r a n y lg e r a a y ld i p h o p h o s p h a t e ，g g p p ) 在g a 合成过程中。i p p 位于绿色组织的质体内，由3 一磷 酸甘油醛和丙酮酸相互作用而成的m 1 ，但是在南瓜种子的胚乳中，i p p 是在细胞质 中由乙酰辅酶a 的中间代谢产物一3 一甲基一3 ，5 - 二羟基戊酸合成的。因此，在不 同的组织器官中i p p 的合成是在不同的细胞器内完成的。i p p 一旦合成后。几个 异戊二烯基团首尾相连。生成1 0 碳( 即犍牛儿基二磷酸) 、1 5 碳( 即法尼基二磷 酸) 和2 q 碳( 鄂g g p p ) 韵开环结构中间产物。g g p p 是许多萜类化合物的前体 物质。可合成赤霉素、油菜素内酯、脱落酸、类胡萝h 素和许多提炼油等萜类化 合物。 g g p p 在酶的作用下发生环化生成内根一贝壳杉烯( e n t - k a u r e n e ) ，是赤霉素 在第一阶段合成过程中的特征反应。g g p p 首先在柯巴基二磷酸合成酶( c p s ) 的 催化下完成a 和b 环的闭合，生成内根一柯巴基二磷酸( e n t - c o p a l y ld i p h o s - p h a t e ，c p p ) ；然后c p p 经内根一贝壳杉烯合成酶( k s ) 催化，c 和d 环闭合生成 内根一贝壳杉烯。a a c h t 圳等研究发现，催化这两步反应的酶位于茎分生组织的原生 质体上。而在成熟的叶绿体中并没有发现这两种酶。因此，叶绿体发育成熟后叶 片就失去了把i f p 转化成g g p p 的功能。 第二阶段：内根一贝壳杉烯在内质网上氧化成g a t 2 或g a s 3 。 高度疏水的内根一贝壳杉烯在质体中合成后被转运到内质网的膜上，在内根一 贝壳杉烯氧化酶( k o ) 的作用下分三步氧化成内根一贝壳杉烯酸( e n t - k a u r e n o i c a c i d ) 。然后内根一贝壳杉烯酸氧化酶( k a o ) 把内根一贝壳杉燔酸进一步氧化生 成o a t 2 一醛( g a l 2 - a i d e h y d e ) 。在这些过程中，内根一贝壳杉烯上的一个甲基被氧 化成羧基，而且b 环从6 碳环缩成5 碳环，另外在碳6 位置加了一个醛基。o a t 2 一 醛上的醛基被g a 7 0 x 氧化成羧基就转变成o a t 2 ，g a l 2 是所有植物g a 合成途径 过程中的最初产物，也是所有其他g a s 的前体。g a l 2 通过两条途径进一步氧化就 生成了不同种类的赤霉素。一条是1 3 一羟基化途径，另一条是非1 3 一羟基化途径， 曾龙军水稻矮秆突变体d w a r f 6 8 ( d 6 8 ) 遗传分析及基因的精细定位 1 3 两者的区别取决于是碳1 3 位置上是否发生羟基化。大多数植物都是以1 3 一羟基化 途径为主，g a 。的碳1 3 被1 3 一羟化酶催化。增加了一个羟基生成g a s 3 ，而拟南芥、 水稻和其他作物主要是非1 3 一羟基化途径这个阶段大多都是细胞色素p 4 5 0 单加 氧酶，他们位于细胞的内质网上，其中k o 还可能与质膜有关”。 这一阶段的突变体有d 3 5 。脚j 基因编码内根一贝壳杉烯氧化酶，作用于在g a 合成的初始阶段，该酶催化内根一贝壳杉烯一内根一贝壳杉烯酵一内根一贝壳杉烯醛 一内根一贝壳杉烯酸转化的三步反应。i t c hh 等叫1 利用同源克隆法从水稻基因组 中分离了5 个戤) - l i k e 基因( 伪煦兀伽加u ) ，这些基因编码的蛋白与已克隆 的拟南芥和南瓜的k o 高度同源。其中o s k o l 2 基因与1 ) 3 5 对应，表达分析显示 伪鼢睨2 和仍鼢睨4 在各种器官中转录活跃。而o s k o l l 和o s k o l 5 只是低水平 的表达，o s k o l 3 可能是个假基因。 第三阶段：各种g a s 的形成。 这一阶段是在细胞质中完成的，g a l 2 或g a 5 3 经过一系列的可溶性双加氧酶催 化生成各种赤霉素。这些酶需要分子态氧和辅助因子抗坏血酸、f e 2 + 的参与。在非 1 3 - 羟基化途径过程中，g a l 2 的在g a 2 0 0 x 氧化酶的催化不断被氧化，分别形成 g a l 5 、g a 2 4 和g a 9 ，这些反应都是发生在碳2 0 位置上，并最终将其氧化成c 0 2 。 g a 9 在o a 3 0 x 和g a 2 0 x 的作用下碳3 和碳2 分别羟基化，生成有生物学活性的 g a 4 和无生物活性的g a s t ，最后g a 4 被g a 2 0 x 羟化酶催化合成没有生理活性的 g a 3 4 。除g a l 2 一g a l 5 _ g a 2 4 _ o a 9 - g a 4 ( 或g a s i ) 一g a 3 4 之外，z h u 等哪! 在研 究水稻长穗颈突交体e u i l 时发现了另外一条新的降解途径来参与活性g 乜的去活 性过程，1 6 a ，1 7 - 环氧化酶可将g a l 2 、g a 9 和g a 4 氧化成1 6 a ，1 7 o h 2 - g a s 。1 3 一 羟基化途径与非1 3 - 羟基化途径一样，都是g a 2 0 0 x 、g a 3 0 x 和o a 2 0 x 这三个氧化 酶参与了整个过程，但是代谢产物不同：g a ，3 一g a 4 4 一g a l 9 一g a 2 0 g a l ( 或 g a 2 9 ) 一g a | 。1 3 - 羟基化途径是否存在1 6 a ，1 7 一环氧化酶代谢支路还有待以后的 进一步研究。 这一阶段的突变体有蒯、e u i l 、d 1 8 。s a s a l d 等嘲发现水稻的s d i 基因编码与赤 霉素合成有关的g a 2 0 氧化酶( g a 2 0 0 x ) ，该酶是g a 合成途径中的一个关键酶，它 扬州大学预士学位论文1 4 催化g a 5 3 一g a “一g 9 一g a 加三步反应。水稻基因组至少携带2 个g a 2 0 0 x 基因 ( g a 2 0 0 x - i 和g a 2 0 0 x 一2 ) ，其中g a 2 0 0 x - 2 在叶片、茎和未展开的叶片中活跃表达， 而g a 2 0 0 x - i 优先在未开的花中表达。尽管植物花器的形成与育性均与有生物活性 的g a 相关。但耐，突变体开花结实均正常。水稻e u i l ( e l o n g a t e d u p p e r m o s t i n t e r n o d e i ) 明显的表型特征为最上节间剧烈伸长。通过组织细胞的研究发现，e u i l 最上节问细 胞显著伸长导致了最上节问长度的改变。e u l l 编码一个新的p 4 5 0 氧化酶 ( c y p 7 1 4 d 1 ) ，催化赤霉素合成中非1 3 羟化途径的1 6 0 01 7 - c 的环氧化作用。转基 因结果显示，1 6 a ，1 7 - c 的环氧化作用减少了有生物活性的眠的产生，证明e u l l 是 t 3 a 合成中的一种失活酶“。d 8 的突变属于功能缺失型，它的花和种子的发育却 没有受到影响。d 8 编码g a 3 p 一羟化酶( o s g a 3 0 x 2 ) 啪1 。在水稻中也至少有两种 g a 3 旷羟化酶，而且特异表达。其中o s g a 3 0 x 2 在地上部各器官中广泛表达； o s g a 3 0 x l 贝l j 只在生殖器官中特异表达。由o s g a 3 0 x 2 控制合成的有生物活性的g a 作用于新芽的伸长，而与生殖与发育无关。 图1 4g a 信号在拟南芥( 左) 和水稻( 右) p 9 1 中的转导模型 f i g u r e1 4 t h e m o d e l o f g as i g n a l i n g t r a n s d u c t i o n i n a r a b i d o p s i sa n d d c c l 3 9 1 1 4 1 2 g a 的信号转导及相关突变体 币j 用突变体来研究赤霉素信号在植物体内的转导和分析相应基因的功能，是目 前研究g a 信号转导途径的一种非常有效的方法。通过克隆突变基因进行功能分 簧龙写坠螯矮秆突变体w 4 矿甜( d 硒) 遗传分析及基因的精细定位 1 5 析，结合双突变或多突变的表型，确定各组成元件之间的上下游关系，最终得出 g a 的转导模型啪1 同时，根据对水稻o a 突变体基因的克隆和功能研究，也得到 了o a 信号在水稻上转导的简单模型( 如图1 - 4 ) 。 具有生物学活性的g a 通过与细胞膜上的g a 受体结合，受体蛋白跨膜运输将 g a 信号从细胞膜外转导至内膜，然后与g 蛋白结合。g 蛋白以不依赖c a 2 + 的途径在 各种酶的作用下将g a 信号从细胞质中转导到细胞核内。在细胞核内，g a 信号与 g i d i 蛋白形成的g a g i d l ，或者是通过s p y 蛋白介导d e l l a 蛋白被蛋白酶体降 解，从而调控植物的生长。 d e l l a 蛋白是一类潜在的转录因子，在g a 信号转导过程中有着非常重要的作 用，是g a 信号转导途径的负调控因子。当细胞不能接收到g a 信号时，d e l l a 蛋 白处于活性状态，从而抑$ 0 0 a - 诱导基因的表达，阻遏植物的生长；在g a 信号存 在下，d e l l a 蛋白接受g a 信号失活而被蛋白酶体降解，g a 一诱导基因表达行使其 功能，植株正常生长。d e l l a 蛋白具有四个结构区域：1 ) n 一端g a 信号感知结构 域；2 ) 调节结构域；3 ) 亮氨酸重复序列l z 区域；4 ) c 一端的阻遏结构域( 如图1 - 5 ) h 0 1 。d e l l a 蛋白的n 一端信号感知结构域是g a 信号感受区域，对于d e l l a 蛋白的 降解起着重要作用。该区域含有d e l l a 和t h y n p 两个保守的酸性结构域，以及两 个区域自j 的不保守间隔域。d e l l a 和t h y n p 域的三级结构排列对g a 信号的感知 非常重要m ，而且d e l l a 域还是g a - g i d l 蛋白的识别位点“”，他们构成 g a g l d l d e l l a 蛋白复合体，然后与e 3 泛素连接酶结合。研究表明不保守的间隔 域能协助d e l l a 和t h y n p 域与g a 信号分子相互作用功能的行使，该区域的缺失 会造成n 一端区域的构象发生改变洲，特别是n 一端连接d e l l a 和t h y n p 域的第1 0 8 个氨基酸，它是g i d i 结合不可或缺的重要部分。调节结构域是丝氨酸苏氨酸 缬氨酸富集区( s c r t h r n a l r i c hd o m a i n ) 。由于p l o ys t v 结构特殊，该区域可能 是旷乙酰葡萄糖胺( o o i c n a c ) 修饰位点“”。当p l o ys t n 区域被s p y 编码的o 一 乙酰葡萄糖胺转移酶磷酸化或糖基化后，d e l l a 蛋白的阻遏功能会有所增强， 但是在水稻中却正好相反，p l o ys 仃 区域的缺失会引起阻遇作用的增强。l z 区域是二聚化结构域，介导蛋白与蛋白之间相互作用，形成同源蛋白二聚体结构。 扬州大学颈上学位论文 1 6 c 一端的阻遏结构域包含v h i i d 、p f y r e 、s a w 和g r a s 四个区域，s c f 泛素连接酶 正是通过与g r a s 结构域结合，而将d e l l a 蛋白降解1 。水稻的s l r 和拟南芥的 g a i 悯、r g a “町、r g l “”，还有小麦的r f i t “町和玉米的d 8 ，都属于d e l l a 蛋白 家族通过转g f p 融合蛋白技术对这些蛋白进行分析发现，d e l l a 蛋白家族位于 细胞核内。 圈1 5d e l l ab q 结构以及d e l l a 结构域哭燹的不同生长效应 f i g