（动物遗传育种与繁殖专业论文）家兔gh、ghr及mstn基因多态性及其与产肉性状的关系.pdf

r- y 1 7 8 帆黜 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论 文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东 农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本 学位论文收录到中国学位论文全文数据库并向社会公众 提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名； 盗变邋 绥缈幺 日期：二卅_ 秽善，= o 。 参 。 英文缩略词 英文缩写英文名中文名 a p sa m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸胺 b p b a s ep a i r碱基对 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核苷酸 d n t p d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t脱氧核糖核苷酸三磷脂 e be t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ea c i d已二胺四乙酸 m a im a r k e r - a s s i s t e di n t m g r e s s i o n标记辅助导入 m a s m a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n标记辅助选择 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 q t lq u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s 数量性状位点 r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o 州s m 限制性片段长度多态性 s n p s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m 单核苷酸多态性 s s c p s i n g l es t r a n dc o n s t r u c t i o np o l y m o r p h i s m 单链构象多态性 t b et r i s b o r i ca c i d _ e d l ab u f f e rt r i s 硼酸e d t a 缓冲液 t et r i s h c le d t a ir i s h c i e d t a 缓冲液 t e m e dn ，n ，n , n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n n n - 四甲基已二胺 聪s t r i s h y d r y x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 o - 山东农业火学 目 中文摘要 a b s t r a c t l 引言 1 1 遗传标记及分子标记育种 1 1 1 遗传标记 1 1 2 分子标记育种 1 2 家兔分子遗传研究进展“ 1 3 与产肉性状相关的三个候选基因1 l 1 3 1 生长激素基因ll 1 3 2 生长激素受体基因1 3 1 3 3 肌肉生长抑制素基因。1 5 1 4 本研究的目的、意义17 2 材料与方法1 9 2 1 实验材料及其仪器、试剂1 9 2 1 1 实验样品的来源及采样方法1 9 2 1 2 主要仪器设备2 l 2 2 实验方法2 4 2 2 1 耳组织d n a 的提取。2 4 2 2 2d n a 的模板检测2 5 2 2 3p c r 扩增与检测。2 6 2 2 4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2 8 2 2 5p c r 产物的回收及克隆测序3 0 2 3 统计分析方法3 4 3 结果与分析3 5 3 1 不同品种家兔基因组的提取3 5 3 2p c r 扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果3 5 3 3p c r 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶检测结果3 6 家兔g h 、g h r 及m s t n 基因多态性及其与产肉性状的关系 3 4p c r 扩增片段的克隆测序结果3 7 3 5 突变位点对产肉性状的影响效应分析4 0 3 5 1g h 基因c l l1 t 突变对产肉性状的关联分析4 0 3 5 2g h r 基因t 1 7 9 7 c 突变对产肉性状的关联分析4 2 3 5 3g h r 基因c 2 0 6 7 t 突变对产肉性状的关联分析4 3 3 5 4m s t n 基因t 4 7 6 c 突变对产肉性状的关联分析4 5 4 讨论4 8 4 1 实验群体的选择4 8 4 2p c r - s s c p 分析4 8 4 3g h 基因多态性及其与产肉性状的关系：4 9 4 4g h r 基因多态性及其与产肉性状的关系5 0 4 5m s t n 基因多态性及其与产肉性状的关系5 l 4 6 统计方法的选择及结果分析。5 2 4 7 分子标记技术的应用5 2 5 结论5 4 6 参考文献5 5 7 致谢6 5 8 攻读学位期间发表论文情况6 6 i l 叁 4 i ： ； j 书 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 生长激素( g 基因、生长激素受体( g h r ) 基因和肌肉生长抑制素 ( m s t n ) 基因是与动物肉用性状有关的三个重要基因。本试验以9 个肉兔 纯系及其3 7 个杂交组合为实验材料，采用测序和单链构象多态( s s c p ) 的 分析方法，对础、g h r 和m s t n 基因进行s n p s 扫描和多态性分析，找 到与家兔产肉性状有关的分子标记，为优质、高产家兔品种的选育提供一 条分子育种途径，同时也为我国家兔品种的合理保护及科学利用提供可靠 的理论依据。 g h 基因：本研究对g h 基因的全部核苷酸序列进行了扩增测序。 p c r s s c p 分析及测序结果表明该基因5 个外显子和4 个内含子序列都相 当保守，仅在5 u t r 区发现一处s n p s ( c 11 l t ) 。应用s a s 软件对家兔群 体不同基因型间的生长，屠宰及肉质性状值进行最小二乘一般线性模型 ( g l m ) 分析。发现该突变对家兔胴体重、背腰重、后腿重和皮重等屠宰性 状及肌肉系水率、烹饪损失、熟肉率、肌内干物质含量和蛋白质含量等肉 质性状都有显著性影响( p 0 0 5 ) 。其中突变型个体的胴体重显著高于野生 型和杂合型个体( p 0 0 5 ) ，但背腰重显著低于二者( p 0 0 5 ) 。而后腿重这 一性状上，杂合型个体的最小二乘均值最低，明显低于野生型和突变型。 g h r 基因：本研究在g h r 基因外显子1 0 上发现两个突变位点，分 别为1 7 9 7 ( t c ) 和2 0 6 7 ( c t ) 。对1 7 9 7 ( t c ) 位点不同基因型肉用性状之间 进行最小二乘分析结果显示，不同基因型个体间差异不显著o 0 5 ) 。 2 0 6 7 ( c t ) 突变位点在3 5 日龄体重、7 0 日龄体重、胴体重、肝重、前腿重、 背腰重、后腿重和皮重等屠宰性状及肌内干物质含量和蛋白质含量等肉质 性状的最d - 乘均值杂合型m n 型个体显著优于n n 型和m m 型个体和 ( p 0 0 5 ) 。 m s t n 基因：本研究探讨了m s t n 基因的全部3 个外显子区及部分 5 u t r 区的遗传多态性，发现在5 q j t r 区4 7 6 位点存在l 处t c 的单碱 基突变。通过分析m s t n 基因不同基因型对屠宰和肉质性状的影响，结果 表明该变异对肌肉的熟肉率、滴水损失和部分屠体性状有显著影响，m s t n 的a 等位基因具有降低熟肉率，肌肉滴水损失，提高胴体重、前腿重、 家兔g h 、g h r 及m s t n 基因多态性及其与产肉性状的关系 背腰重、后腿重和皮重等效应。该结果提示m s t n 基因此位点的突变有利 于家兔体躯发育。 本研究在家兔g h 、g h r 和m s t n 基因上找到4 个单核苷酸多态性标 记，并分析了它们与家兔产肉性状的关系，结果表明这三个基因都有可能 是影响家兔的肌肉发育和生长的主效基因，或与控制这些性状的主效基因 连锁。其中，g h 基因和m s t n 基因5 u t r 区突变及g h r 基因2 0 6 7 ( c t ) 突变均可开发为用于家兔产肉性状选育的分子标记。为遗传改良家兔肉用 品质、提高生产性能、选育优质高产品系或配套系提供了分子基础。 关键词：家兔，g 鼠g h r ，m s t n ，产肉性状，s n p s 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t g h , g h ra n dm s t na r ev e r yi m p o r t a n tg e n e sc o n t r o l l i n g m e a t p r o d u c t i o nt r a i t si na n i m a l s t h ep r e s e n ts t u d yp e r f o r m e ds n p sa n a l y s i si n r a b b i tg h , g h ra n dm s t ng e n e s ，i nn i n ep u r e l i n e sa n d3 7c r o s s b r e d so f r a b b i tw a sa n a l y z e d b ys e q u e n c i n g a n dp c r - s s c p ，e x a m i n e dt h e i r p o l y m o r p h i s m si nd i f f e r e n tr a b b i tp o p u l a t i o n sa n de s t i m a t e dt h e i re f f e c t so n m e a tp r o d u c t i o nt r a i t s t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yi st of i n dg e n e t i cd i v e r s i t y o fr a b b i t sa tt h em o l e c u l a rl e v e ra n du s e f u ld n am a r k e r sf o rm e a tp r o d u c t i o n t r a i t s ，a n dt h er e a s o n a b l ep r o t e c t i o no fo u rr a b b i tl i n e st op r o v i d er e l i a b l ea n d s c i e n t i f i cb a s i sf o r t h eu s e t h et o t a ls e q u e n c eo fr a b b i tg hg e n ew a sa m p l i f i e da n ds e q u e n c e d n o m u t a t i o n sw e r ei d e n t i f i e di nt h ef i v ee x o n sa n df o u ri n t r o n sc o m p a r i n gt h e s e q u e n c e s o b t a i n e di nt h e a n a l y z e dr a b b i t s o n l y as i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ( s n p s ) i n5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n sw a si d e n t i f i e d 1 f 1 圮g e n e t i c e f f e c to ft h i sp o l y m o r p h i s mo ng r o w t ht r a i t s ，p a r t i a lc a r c a s st r a i t sa n dm e a t p r o d u c t i o nt r a i t sw e r ei n v e s t i g a t e db yg l m 1 1 1 em u t a n ta l l e l eh a ds i g n i f i c a n t e f f e c to nc a r c a s sw e i g h t ，l o i nw e i g h t ，h a mw e i g h t ，f u rw e i g h t ，w a t e rh o l d i n g c a p a c i t y , c o o k e dr a t e ，i n t r a m u s c u l a rd r ym a t t e rc o n t e n ta n dp r o t e i nc o n t e n t ( p o 0 5 ) m u t a n ti nw h i c ht h e i n d i v i d u a lc a r c a s sw e i g h tw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nw i l d - t y p ea n dh e t e r o z y g o u si n d i v i d u a l s ( p 0 0 5 ) ，b u tl o i nw e i g h t w a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h et w o ( p 0 0 5 ) i nt h et r a i to fh a mw e i g h t ，t h e h e t e m z y g o u sg e n o t y p ew a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ew i l dt y p ea n dm u t a n t ( p o 0 5 ) f o rg h rg e n e ，t w om u t a t i o n sw e r ef o u n di ne x o n10 ，r e s p e c t i v e l y , 17 9 7 i f c ) a n d2 0 6 7 ( c f f ) o n17 9 7i f c ) l o c u s ，t h ec o n n e c t i o na n a l y s i sb e t w e e n g e n o t y p e s a n dm e a tp r o d u c t i o nt r a i t ss h o w e dt h a td i f f e r e n c e sb e t w e e n d i f f e r e n tg e n o t y p e sw a sn o ts i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) o n2 0 6 7 ( c r ) m u t a t i o n , b o d yw e i g h ta t3 5d a y s ，b o d yw e i g h ta t7 0d a y s ，c a r c a s sw e i g h t , l i v e rw e i g h t ， f o r e l e g sw e i g h t , l o i nw e i g h t ，h a mw e i g h t ，s k i nw e i g h t , i n t r a m u s c u l a rd r y m a t t e rc o n t e n ta n dp r o t e i nc o n t e n to fm ng e n o t y p ew e r es i g n i f i c a n t l yb e t t e r 3 家兔g h 、g h r 及m s t n 基因多态性及其与产肉性状的关系 t h a nn na n dm m g e n o t y p e ( p 0 0 5 ) 1 1 1 l i s s t u d yi n v e s t i g a t e dt h em s t ng e n ei na l lt h r e ee x o n sa n dp a r t i a l 5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n s ，a n do n es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( t 4 7 6 c ) i n 5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n sw a si d e n t i f i e d t h r o u g ha n a l y z e st h ei n f l u e n c eb e t w e e n t h em s t n g e n ed i f f e r e n tg e n o t y p ea n ds l a u g h t e ra n dm e a tq u a l i t yt r a i t s ，f i n a l l y i n d i c a t e dt h a tt h i sv a r i a t i o nt om u s c l e 。sc o o k e dr a t e ，w a t e rd r o pl o s sa n dt h e p a r t i a ls l a u g h t e rc h a r a c t e rh a st h er e m a r k a b l ei n f l u e n c e t h em u t a n ta l l e l eh a d s i g n i f i c a n tp o s i t i v ee f f e c t so nl i v ew e i g h t ，c a r c a s sw e i g h t ，l o i nw e i g h t ，h a m w e i g h t ，f u rw e i g h ta n dm u s c l ed r i pl o s s ，a n dr e d u c e dc o o k e dr a t e ( p 0 0 5 ) 1 1 l er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ev a r i a t i o ni nt h eu p s t r e a mr e g u l a t o r yr e g i o no f m s t n g e n ew a sb e n e f i c i a lt ot h eb o d yd e v e l o p m e n t i nd o m e s t i cr a b b i tg h , g h ra n di nt h em s t n g e n e ，t h i sr e s e a r c hf o u n d4 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s mm a r k e r s ，a n dh a sa n a l y z e dt h e i rp e r f o r m a n c e a n dt h er e l a t i o n s h i pa m o n gd i f f e r e n td o m e s t i cr a b b i t s ，f i n a l l yi n d i c a t e dt h a t t h e s et h r e eg e n e sa l el i k e l yt ot h em a j o rg e n ea f f e c t i n gt h er a b b i t sm u s c l e d e v e l o p m e n ta n dg r o w t h ，o rh a v el i n k a g ew i t ht h em a i ne f f e c tg e n e a n d ，t h e m u t a t i o n si nt h eg h g e n e ，t h em s t ng e n e5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n sa n dt h eg 撇 g e n e2 0 6 7 ( c t ) c a nb ed e v e l o p e d 嬲m o l e c u l a rm a r k e r sf o ru s ea td o m e s t i c r a b b i tb r e e d i n g t h e s ec o u l dp r o v i d et h em o l e c u l a rb a s i sf o rt h eh e r e d i t y i m p r o v e m e n to fd o m e s t i cr a b b i tm e a tq u a l i t y , t h ee n h a n c e m e n to fp r o d u c t i o n p e r f o r m a n c ea n dt h eh i g ho u t p u ts t r a i n so rm u l t i p l i c a t i o ns t r a i n s k e yw o r d s ：r a b b i t ，g h , g h r , m s t n , m e a tp r o d u c t i o nt r a i t s ，s n p s 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 在国际上，以遗传学为理论指导的现代育种领域的发展可分为三个阶 段。第一阶段( 1 9 0 0 1 9 6 0 ) ，也就是孟德尔( gm e n d e l ) 论文的重新发现到法 康纳( d s f a l c o n e r ) 数量遗传学概论第一版问世。这一阶段畜禽遗传 的改良主要是“见好就留的表型和表型值选种技术。第二阶段 ( 1 9 6 1 1 9 8 6 ) ，这一阶段中发展起来的两项和动物遗传育种有关的主要技术 是计算机和d n a 重组技术。第三阶段可以说动物遗传育种己从群体水平 进入到分子水平。其标志是对数量性状( 肉、蛋、奶等主要经济性状) 进行 基因定位，主要的是通过参考资源群动物用遗传连锁或候选基因法测定数 量性状座位( q t l ) 的主基因效应。 长期以来，数量遗传学和动物育种学的理论和方法都是建立在微效多 基因假说之上的，即数量性状的表现是由许多微效多基因的共同作用加上 环境效应所决定的。由于不能对微效多基因的效应进行观察和测定，只能 借助统计遗传学描述数量性状的遗传性质。这种根据个体及其亲属的表型 值进行选择的方法，只能有效地利用具有加性效应的基因座位，对具有互 作和上位效应的一些基因座位则无能为力，因此传统的数量遗传学育种方 法虽给家畜育种带来巨大发展，但存在周期长、选择效应小且不稳定的缺 点，这些缺点延缓了家畜改良的速度。而基于分子遗传学和分子数量遗传 学的分子育种技术的兴起有可能克服这些缺点而给家畜育种工作带来一 场革命，大大加快育种进度。 家兔业是畜牧业中的重要产业之一，是目前新兴的规模化养殖行业。 生产中普遍使用多是引入品种或引入品种与地方品种的二元或三元杂交。 与其他畜禽如猪、牛、羊、鸡等相比较，对家兔的研究较少，尤其是有关 分子遗传的研究非常少，对与肉用性状有关的基因及其标记研究在国内还 未见报道。 关于我国大部分家兔品种( 包括引入品种) 的遗传分析，尤其是从分子 水平来研究以便于在品种利用及实际生产方面得到提高的研究尚属空白。 因此，从d n a 分子水平研究来揭示家兔的遗传现状，弄清我国家兔在分 子水平上的遗传多样性，从而系统评估我国家兔品种内、品种间的遗传特 家兔g h 、g h r 及m s t n 基因多态性及其与产肉性状的关系 点，以此取得我国家兔品种资源遗传背景的第一手资料，可为我国家兔的 起源分化提供佐证，同时也为我国家兔品种的合理保护及科学利用提供可 靠的依据。为了向高产、优质、抗病、高效的畜牧业靠近，为了保护人类 赖以生存的生物多样性，对家兔作更深入、更广泛、更全面的研究，尤其 是从分子水平来进行已势在必行。 1 1 遗传标记及分子标记育种 1 1 1 遗传标记 遗传标记是指那些可准确鉴别的，能够用以区别生物个体或群体及其 特定基因型、并能稳定遗传的物质标志，是动植物遗传育种中的重要辅助 工具。理想的遗传标记主要应具备以下4 条标准：( 1 ) 具有较强的多态， 多态是指标记在群体中有多种基因型存在，多态程度越高，个体之间在标 记上就越能表现出差异，反映出更多的信息；( 2 ) 表现为共显性，能够准 确区分出纯合基因型和杂合基因型：( 3 ) 数量多，而且均匀的覆盖整个基 因组；( 4 ) 对它的测定不受年龄、性别、环境等因素的限制，经济方便， 容易观察记录。 传统的遗传标记主要分为3 种类型，即形态学标记( m o r p h o l o g i c a l m a r k e r s ) 、细胞标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 和生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 。 形态学标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，并可通过表型 来推断其基因型，如毛色、有无犄角等。细胞学标记是指染色体形态、数 目和结构的变异，用具有异常染色体的个体与具有正常染色体的个体杂交 或用染色体替换等手段，可对一些基因进行定位。细胞学标记克服了形态 标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物 力进行培养选择；有些物种对染色体结构和数目变异的耐受性较差，难以 获得相应的标记材料；某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常 伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难，从而限制了细 胞学标记的应用。许多生物大分子或生物化合物都具有作为遗传标记的潜 力，由于蛋白质分子比酚类化合物、黄酮类化合物、糖苷分子的分离和检 测简单快捷，因而成为有用且可靠的遗传标记。生化标记就是指血液或乳 中蛋白质( 包括酶) 的多态性，这种多态性可通过免疫反应或电泳技术反映 6 山东农业大学硕士学位论文 出来，并由此判定其基因型，如血型抗原、血液蛋白、乳蛋白、同工酶等。 用作遗传标记的蛋白质通常分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。蛋白质是基 因表达的产物，与形态性状、细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境影 响更小，能更好的反映遗传多态性，因此蛋白质标记是一种较好的遗传标 记，已被广泛的应用于物种起源和进化研究、种质鉴定、分类和抗病性筛 选等多个领域。但蛋白质标记仍存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需 要特殊的显色方法和技术：蛋白质标记的数量还比较有限。虽然至今发展 的酶系统大约可以鉴定1 0 0 多个位点，但在某特定的动物群体中，仅有 1 0 2 0 种同工酶，大约3 0 - 4 0 个等位基因可表现出多态性，这样的数目还 远远不能满足标记辅助育种的需要。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异；而在现代遗传学 中，遗传多态性是指在基因组中任何座位上的相对差异。随着近年来分子 生物学的发展，遗传标记的种类已越来越多，已不只限于传统的形态标记。 轰d n a 分子标记是在二十世纪八十年代后兴起的，它是一种新的以 _ d n a 遗传多态性为基础的标记。d n a 水平的遗传多态性表现为核苷酸的 序列的任何差异，哪怕是单个核苷酸的变异，因此，d n a 分子标记的数 筝量几乎是无限的。理想的d n a 分子标记应具备以下特点：( 1 ) 遗传多态性 墓高；( 2 ) 检测手段简单快捷，易于实现自动化；( 3 ) 遗传共显性，即在分离 群中能够分离出等位基因的3 种基因型。与传统的遗传标记相比，d n a 标记具有以下优越性：d n a 分子标记能对处于各个发育时期的个体、组 织、器官甚至细胞做检测：无表型效应，不受环境及基因表达与否的限制 和影响：数量多，分布在整个基因组范围内，普遍存在于所有生物中；多 态性高，遗传稳定。d n a 分子标记的所有这些特征奠定了它具有广泛应 用的基础，所以从它诞生之日起，就引起了生物学家的极大兴趣，在短暂 的十几年间，迅速发展起来。目前，d n a 标记已广泛地应用于种质研究、 遗传图谱构建、目的基因定位和分子辅助选择等各个方面。d n a 分子标 记的种类繁多，但依其使用的分子生物技术，大致可分为四大类，( 1 ) 基 于s o u t h e r n 杂交技术的分子标记。( 2 ) 基于p c r 技术的分子标记。( 3 ) 基于 p c r 与限制性酶切技术相结合的d n a 分子标记。( 4 ) 基于单核苷酸多态性 的d n a 标记。 7 家兔g h 、g h r 及m s t n 基因多态性及其与产肉性状的关系 1 1 2 分子标记育种 分子标记育种即通过d n a 标记技术对某些重要生产性状直接进行选 择改良。而分子标记技术则可以利用一切有利的基因座位来改良动物的生 产性状，同时能作到真正的基因型选择，这大大提高了选择的准确性和育 种效率。分子标记育种主要包括( 1 ) 标记辅助选择( m a r k e ra s s i s t e ds e l e c t i o n , m a s ) ，( 2 ) 标记辅助导, k ( m a r k e ra s s i s t e di n t r o g r e s s i o n , m a d 。 如何提高选育的效率一直是育种学家关注的问题，其中研究的重点之 一是利用目标性状与标记间进行关联性的标记辅助选择( m a s ) 。所谓标记 辅助选择就是通过对遗传标记的选择，间接实现对控制某性状的数量性状 位点( q t l ) 的选择，从而达到对该性状选择的目的。s a x 于1 9 2 3 年就开始 探讨应用单基因标记选择改良数量性状的可能性。n e i m a n n s o r e n s e n ( 1 9 6 1 ) 和r o b e r t s o n ( 1 9 8 4 ) 通过对奶牛育种群体中1 0 个血型基因座位对产奶量遗 传效应的研究，提出了估计与标记基因座位连锁的遗传效应的统计分析方 法，以评价m a s 在育种上的效率。随着分子标记技术的发展，在许多动 植物上已获得了较完整的高密度的分子连锁图谱，应用分子标记鉴别和选 择单个数量性状基因座( q t l ) 弓i 起了研究者的关注。当前m a s 主要集中 于理论与计算机模拟研究，探讨m a s 效率及其主要影响因素，在育种上 应用m a s 的报道较少( s t u b e r 等，1 9 8 2 , s t r o m b e r g 等，1 9 9 4 te a t h i n g t o n 等，1 9 9 7 ，s c h n e i d e r 等，1 9 9 7sb e r l o o 等，1 9 9 9 ) 。 标记辅助选择主要有以下几个环节：寻找包含q t l 的染色体区段 ( 1 0 2 0 c m ) ：在这些区域内标定q t l 的位置( 5 c m ) ：找到与q t l 紧密 连锁的遗传标记( 1 2 e m ) ：在这些区域内找到可能的候选基因；找到 与性状变异有关的特定基因；寻找这些特定基因的功能基因座；在遗 传标记辅助下对性状进行准确选择。但由于经济性状多受q t l 控制，所 以m a s 的广泛应用还有赖于q t l 的精细定位和d n a 测定成本的下降。 m a s 的效率取决于有显著效应的标记，以适当的数目为宜。d w a r d s 和 p a g e ( 19 9 4 ) m 计算机模拟了遗传标记对数量性状进行m a s 的效果，结果 表明，利用遗传标记在第三代之前进行选择效果较好。因为分子标记与 q t l 连锁不平衡较大，随着世代数的增加，效应较大q t l 的等位基因迅 速被固定，m a s 的效率随之下降。群体大小是影响m a s 效率的重要因素， 山东农业大学硕士学位论文 转移的q t l 数目越多，所需群体就越大；随着群体的扩大，m a s 的效率 随之提高。m a s 的应用对于某些遗传力低的性状、限性性状、晚熟性状 的间接选择及所有经济性状的早期选择，都是一种较为有效的方法和措 施。 m a i 就是通过遗传标记将某一基因从一个品种渗入到另一个品种。 当供体品种与受体品种杂交后在每次回交前先根据标记信息选出携带有 渗入基因的个体，并用这些个体与受体品种进行回交，可以保证在回交过 程中要渗入的基因不会丢失，大大提高基因渗入的效率。进行基因导入时 有两种方式利用遗传标记：( 1 ) 禾l j 用遗传标记对欲导入的基因进行标记；( 2 ) 利用遗传标记来选择或排除某一特定背景的基因型。标记辅助导入方案的 效率取决于终端群体被导入基因的频率和有益经济性状的遗传进展。 1 2 家兔分子遗传研究进展 对家兔的遗传连锁作图开始的比较晚，报道较少。l i t h h a v a l b 等 ( 1 9 9 6 ) 对e m b l 基因组数据库进行搜索，发现家兔的遗传图谱上共有1 8 1 个微卫星标记，在d n a 序列上大约每2 - - - 3 k b 就有一个微卫星，双核苷 酸重复序列是最普遍的微卫星标记，其次是三核苷、单核苷、四核苷重复 序列，其长度分别为2 6 b p 、2 3 b p 、2 3 b p 、2 2 b p 。最常见的重复单位是a g ， 然后是a 、a c 、a g g 、c g g ，而其他哺乳动物最常见的微卫星序列为( t c ) n 。 其中6 1 的微卫星标记位于d n a 序列上的非编码区，1 5 在编码区，：而 2 2 在散布的重复序列内。 h a e r i n g e n w a - v a n 等( 1 9 9 7 ) 使用1 3 种引物从不同家兔品种中扩增出 遗传图上的1 3 个微卫星位点，发现平均每个位点有4 个等位基因( 变化范 围为2 1 1 ) ，同时发现核基因组上重复序列数与等位基因数存在正相关。 m o u g e l 等( 1 9 9 7 ) 使用6 对寡核苷酸混合物作为探针，从牛基因组文库 中获得包含重复序列的6 个克隆( s a t 5 、s a t 7 、s a t 8 、s a t l 2 、s a t l 3 和s a t l 6 ) ， 并从e m b l 基因组数据库中克隆出另外3 种微卫星位点( s a t 2 、s a t 3 、s a t 4 ) ， 在7 只野兔d n a 中进行p c r 扩增，发现这9 个位点均有3 - - 7 个等位基 因，而且呈孟德尔遗传。s u r r i d g e a k 等( 1 9 9 7 ) 从欧洲野兔基因组文库中克 隆出2 个多态微卫星( s 0 1 3 3 、s 0 1 4 4 ) ，这2 个位点和另外4 个以前报道的 多态位点( s 0 1 0 3 、s 0 1 0 8 、s 0 1 2 8 、s 0 1 3 0 ) 均在另外2 0 种兔形目动物中得 9 家兔g h 、铡r 及m s t n 基因多态性及其与产肉性状的关系 到扩增。 黄邓萍等( 2 0 0 7 ) 检测了1 3 个卫星标记( 5 l 1 e 8 、6 l 3 f 8 、7 l 1 8 1 0 、 1 2 l 1 e 1 1 、1 9 l 1 g 6 、d 3 u t r 2 、d 3 u t r 4 、d 3 u t r 5 、d 3 u 仃7 、d 3 u t r l 、s a t 3 、 s a t 5 和s a t 7 ) 与兔生产性状( 产仔数、初生窝重、2 1d 、2 8d 、9 0d 窝重) 间 的相关性，研究结果表明，1 3 个微卫星标记中有5 个标记与家兔生产性 状相关。位点5 l 1 e 8 及d 7 u t r 5 不同基因型除对初生重影响显著外，位点 1 9 l 1 g 5 除对产仔数影响不显著外，分别对其余四个性状的影响均达到显 著水平；而位点d 3 u tr 7 对五个生产性状均达到显著影响。其余8 个位点 对各性状影响均未达到显著水平。 利用随机扩增多态d n a ( r a p d ) 对家兔核基因组进行研究也有报道。 k o h m c 等( 1 9 9 8 ) 使用2 9 种1 0 b p 寡核苷酸( g c 含量为5 0 8 0 ) ，对从 兔肉提取的d n a 进行扩增，结果含8 0 g c 的1 0 种引物中有8 种显示特 异带。 w h e t e h 等( 1 9 9 0 ) 对家兔m t d n a 进行了r f l p 分析，结果发现m t d n a 总长度为1 7 3 k b ，有4 个a v a i 酶切位点、b a m h l 2 个、b e l l 6 个、c l a l 2 个、e e o r v1 个、h i n d l i l 7 个、h p a l 4 个、p s t l 2 个、p v u l l 2 个、s a e l 3 个、 x b a i2 个酶切位点；秦树臻等( 1 9 9 3 ) 用b a g l i i 、b a m h i 、c l a i 、e e o r i 、 e c o r v 、m l u i 、ps t i 、p i 、s a e i 共9 种限制性内切酶对福建黄兔线粒体 d n a 进行分析，得到相似的结果，分别产生3 、2 、2 、2 、1 、l 、2 、2 和 2 条酶切片段。 c a s a n e d 等( 1 9 9 4 ) 对家兔m t d n a 异质性进行了系统的遗传分析，发 现在靠近h 链复制起始点有一特异性的1 5 3 b p 核苷酸重复单位存在，重 复数的不同导致个体内和个体间的长度多态性( 异质性) 。并对8 只母兔及 其后代的m t d n a 进行了系统分析，结果表明：当两种主要的m t d n a 分 子存在于同一母兔时，说明在生殖细胞系中发生了遗传漂变；由于缺失或 者增加重复数而产生分子的多态性，大约每个世代有2 * o 的突变率，从高 频率类型变到其他类型的频率不等，缺失一个重复比缺失两个重复容易发 生，后者又比缺失三个重复容易发生；对体细胞进行短重复序列的选择可 能有效，但不同组织器官m t d n a 类型的分布频率不等。c a s a n e d 等( 1 9 9 0 对家兔肝脏、肾脏、大脑、性腺的m t d n a 进行分析，发现性腺的m t d n a l o 山东农业大学硕士学位论文 有独特的多态分布，表明细胞的分化状态与m t d n a 分子的类型有关。同 时，在旷兔属的棉尾兔和鼠兔的非编码区也发现了与家兔m t d n a 重复序 列相似的串联重复。家兔m t d n a 串联重复的长度和序列单位进化非常快， 但是其重复数仍在一个较小的范围内，其中有一个高度保守的2 0 b p 序列， 可能是长期稳定的选择限制了重复单位中主要序列的进化。 g e l l i n 等( 1 9 8 5 ) 使用2 个放射性e d