（农药学专业论文）多杀菌素产生菌的基因组重排育种.pdf

多杀菌素产生菌的基因组重排育种 摘要 多杀菌素( s p i n o s y n ) 是由刺糖多孢菌( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) 经有氧发酵 产生的一类新型大环内酯类化合物。它是一种低毒、低残留、对昆虫天敌安全、作 用机理独特的天然杀虫剂。本试验通过建立刺糖多孢菌原生质体制各再生最佳条件， 运用抗性耐受突变及基因组重排技术，开展了刺糖多孢菌高产多杀菌素的菌株选育 工作。 试验结果显示& s p i n o s a 原生质体制备的最佳条件为2 5 0 r a l 三角瓶( 带有不锈钢 弹簧) 装5 0 m l 含1 0 蔗糖的t s b 培养基、孢子悬液接种，2 8 ，2 0 0 r m i n 培养4 8 h ； 3 0 0 0 r m i n 收集菌丝体并用0 3 m o l l 蔗糖清洗一次；用含3 m g m l 溶菌酶p 缓冲液悬 浮菌丝体，3 2 下处理1 0 0 m i n ；m g 培养是最合适的原生质体再生培养基；原生质 体可在一7 0 保存。 以刺糖多孢菌n 2 2 9 1 7 ( 多杀菌素产量3 3 4 i t g m l ) 和c 1 3 1 2 4 ( 多杀菌素产量 2 7 9 p g m l ) 为出发菌株，进行原生质体亚硝酸和微波诱变，筛选船+ 和g e n + 抗性菌 株，结果显示菌株的抗性水平与多杀菌素产量呈正相关，并得到了菌株y 2 3 ( s t r + g e n 3 和w 1 6 ( s t r 。g e n + ) 。通过y 2 3 和w 1 6 进行原生质体融合研究试验，结果显示4 0 的 p e g l 0 0 0 对原生质体融合有很好的促进作用。以y 2 3 、w 1 6 、p 1 3 1 、u 1 0 8 4 1 和n 6 1 3 为亲本菌株进行基因组重排研究，结果显示随着重排深入，高产菌株出现频率增加。 通过3 轮g e n o m es h u f f l i n g 处理，筛选获得菌株f 11 3 ( 5 2 8 肛g m l ) ，发酵效价较原 始菌株n 2 2 9 1 7 提高了5 8 1 ，传代试验表明菌株稳定性好。 关键词：多杀菌素、刺糖多孢菌、原生质体、基因组重排 注：本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司自选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 a b s t r a c t s p i n o s y n s ，n o v e lm a c r o l i d e s ，a r e n a t u r a lm e t a b o l i t e s p r o d u c e db y a e r o b i c f e r m e n t a t i o no ft h ea e t i n o m y c e t es a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a s p i n o s a d ( am i x t u r eo f s p i n os y na a n dd ) i san a t u r a lp e s t i c i d ew i t hu n i q u em o d eo fa c t i o n i ts h o w ss l i g h t t o x i c i t yt om a m m a l i a n ，s a f et ob e n e f i c i a li n s e c t sa n dl i t t l er e s i d u ei ne n v i r o n m e n t i nt h i s p a p e r , o p t i m i z a t i o n o f s p i n o s ac a r r i e do u tt h r o u g ha n a l y s i so fr e s i s t a n tm u t a t i o na n d g e n o m es h u f f l i n ga f t e re s t a b h s h e dt h ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s e x p e r i m e n t sr e s u r ss u g g e s t e dt h eo p t i m u mc o n d i t i o nf o rp r e p a r a t i o nt h ep r o t o p l a s to f s s p i n o s a s p o r e ss t o c k sw e r ei n o c u l a t e di n t ot h e2 5 0 m lf l a s k i t hs t a i n l e s ss t e e ls p r i n g ) c o n t a i n5 0 m lt s bc u l t u r em e d i u mq l u s10 s u c r o s e ) a n di n c u b a t e da t2 8 cf o r4 8 ho n a r o t a r ys h a k e ra t2 0 0 r m i n m y c e l i aw e r ep e l l e t t e dt h r o u g hc e n t r i f u g a t i o na t3 0 0 0 r r a i na n d w a s h e dw i t h0 3 m o l ls u c r o s e m y c e l i aw e r er e s u s p e n d e dw i t hpb u f f e r ( c o n t a i n3 m g m l l y s o z y m e ) a n di n c u b a t e da t3 2 c f o r1 0 0 r a i n t h em gm e d i u mw a ss u i t a b l ef o r r e g e n e r a t i o no f s s p i n o s ap r o t o p l a s t t h ep r o t o p l a s tc a l lb ep r e s e r v e di n - 7 0 c t h ep r o t o p l a s t so fss p i n o s an 2 2 9 17a n dc131 - 2 4w e r et r e a t e dw i t hh n 0 2a n d m i c r o w a v er e s p e c t i v e l y s t r + m u t a n t sw e r es e l e c t e d 丘o mn 2 2 9 17 a n dg e n + m u t a n t s w e r e f r o mc131 2 4 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es p i n o s y nt i t e r so fm u t a n t sw e r e c o r r e l a t e dw i t ht h er e s i s t a n c et os t r e p t o m y c i na n dg e n t a m y c i n t h es p i n o s y n st i t e r so f s t r a i n sy 2 3 ( s t r + g e n ) a n dw l6 ( s t r g e n + ) w e r e38 5 p g m la n d3 2 4 p g m l s t r a i n sy 2 3a n d w 1 6w e r eu s e df o rp r o t o p l a s tf u s i o na n a l y s i s 4 0 p e g l 0 0 0c o u l di n d u c et h em o s t f u s i o n o f p r o t o p l a s to f s s p i n o s a s s p i n o s ay 2 3 、w 1 6 、p 1 3 1 、u 1 0 8 - 4 1 a n dn 6 1 3w e r eu s e da st h ep a r e n t a ls t r a i n sf o r g e n o m es h u f f l i n g f e r m e n t a t i o na n a l 3 ： s i ss h o w e dt h a tm o r em u t a n t sh a dh i g h e rt i t e r sf o r s p i n o s y n sw i t hf u r t h e rs h u f f l i n g a f t e rt h r e er o u n d ss h u f f l i n g ，t h es t r a i nf ll3 w a so b t a i n e d ， w h i c hc a np r o d u c e5 2 8 p g m ls p i n o s y n s i tw a si n c r e a s e d5 8 1 m o r et h a nt h eo r i g i n a l s t r a i nn 2 2 9 1 7 s u b c u l t u r ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h ef l1 3w a sg e n e t i c a l l ys t a b l e k e yw o r d s ：s p i n o s y n , s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a , p r o t o p l a s t , o e n o m es h u f f l i n g 注：本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司自选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间 年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：巷萄曾 时间：w 了年 月呷日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到( 弘i 叶啼 l 15r pn ljhf bd r 1 图1 3 多杀菌素生物合成基因簇 f i g 1 3 t h e b i o s y n t h e s i sg e n ec iu s t e ro fs p i n o s y n s 注：本图摘自( c h c m 3 s t r ya n db i o l o g y ) ) 2 0 0 1 年第8 卷第5 期 这2 3 个基因有明确的分工( 表1 6 ) ：其中，s p n a 、s p n b 、s p n c 、印加和印旭 基因与大环内酯结构的形成有关；s p n f ，印彬、印厄和印雌因将大环内酯修饰为 糖苷配基；s p n g ，s p n h 、s p n k ，s p n r 基因用于鼠李糖的合成与连接；印，z 、s p n o 、 印胪，s p n q ，印艘、印刀蹉因用于合成和添加福乐糖胺( w a l d r o ne ta 1 ，2 0 0 0 ： w a l d r o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 表1 - 6 多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能 t a b l e1 - 7 p r o p o s e df u n c t i o n so fg e n e si nt h es p i n o s y nb i o s y n t h e t i cc l u s t e r 3 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 注：i 同源性最高的基因( 除s p n r 同源性最高的不是放线菌的基因) 2 编码的蛋白氨基酸序列的相同( i d e n t i t i e s ，i d ) 或者相似( s i m i l a r i t i e s ) 性 3 本表摘自c h e m i s t r ya n db i o l o g y 2 0 0 1 年第8 卷第5 期 多杀菌素编码聚酮合成酶( p k s ) 的基因包含1 个装载模件( 1 0 a d i n gm o d u l e ) 和1 0 个延伸模件( e x t e n d i n gm o d u l e ) ，这些模件的基因按顺序头尾相连，分属5 个同一转 录方向的开放阅读框( 图1 - 4 ) 。 9 多a 苗女p 生自基目组重排育种 一型，马型，型，型 o 焉灞蕊溃勰溃鼎蕊黼 1 + z t m l 帆j 础2舳k 】洲cjm 舢；1 抽6籼7m 删s眦， b h k ：q 蛐 图1 - 4 多杀菌素模件化聚酮合成酶( p k s ) 基因簇。( 箭头示印h 基因转录的方向，k s 聚酮合成酶，a t - 酰基转移酶，a c p 酰基载体蛋白，d h - 脱氢酶e r 烯酰还原酶， k r 酮还原酶，t e - 硫m 酯酶) f i g 1 - 4m o d u l a ro r g a n i z a t i o no ft h es p i n o s y np k sg e n ec l u s t e r ( t h ed i r e c t i o no f t r a n s c r i p t i o no ft h es p ng e n e si si n d i c a t e db ya l t o w s t h em u l t i f u n c t i o n a lp r o t e i n s a n dt h e i rf u n c t i o n si np o l y k e t i d ea s s e m b l ya r ei l l u s t r a t e db e l o wt h eg e n e s k s ， k e t o s y n t h a s e ；a t , a c y l t r a n s f e r a s e ；a c p ，a c y lc a r r i e rp r o t e i n ；d h ，d e h y d r a t a s e ； e r ， e n o y lr e d u c t a s e ；k r ，k e t o r e d u e t a s e ；t e - t h i o e s t e r a s e 、 注本图摘自g c h e m i s t r ya n db i o l o g y 2 0 0 1 年第8 卷第5 捌 s s p i n o s a 的大多数a t 结构域都只掺入乙酸，但起始装载模件和延伸模件3 的a t 序列中具有丙酸掺入结构域( h a y d o c ke ta l ，1 9 9 5 ) ，模件8 的a t 结构域也类似于丙 酸掺入结构域，但丙酸掺入的比例只有2 0 ，且使产物朝多杀苗素d 的方向合成。 当合成主要产物多杀菌素a 时，模件8 应掺入乙酸( k a k a v a se ta l 。1 9 9 7 ) 。 162 多杀菌素的生物合成途径 多杀菌素为大环内酯类抗生素，这粪抗生素在结构上属聚酮类物质，而聚酮类物 质在生物合成过程呈现相似的规律，即生物合成采用聚酮合成途径( 苏建亚和沈晋 良，2 0 0 3 ) 。图1 5 为多杀菌素a 的生物合成途径假| 兑。 但多杀菌素的合成过程有其独特的一面： a 多杀菌素的聚酮部分不同于常见的i 型聚酮( 如红霉素、雷帕霉素、泰乐菌素) ， 其聚酮内含有3 个环内分子间c c 键( s p a r k se ta l ，2 0 0 0 。 b 鼠李糖、福乐糖胺是在内酯化形成糖苷配基后分别连到第9 位和第1 7 位羟基 上，然后再对鼠李糖的2 ，3 ，4 羟基进行甲基化。图i 5 展示了多杀菌素a 的合成途 径假说( w a l d r o ne ta l ，2 0 0 0 ) 。 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 图1 5 多杀菌素a 的生物合成途径假说 f i g 1 - 5p r o p o s e db i o s y n t h e t i cp a t h w a y t os p i n o s y na 注：本图摘自中国生物工程杂志2 0 0 3 年第2 3 卷第5 期 l l 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 多杀菌素的聚酮是通过在起始单位丙酸上按a a p a a - a a a a - a ( a 乙酰， p 丙酰) 的顺序添加l o 个酰基缩合而成的，这l o 个延伸单位的顺序缩合及其还原修 饰过程分别由装配成1 0 个模件的一系列酶所催化( b a l t ze ta 1 ，2 0 0 1 ；w a l d r o ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。聚酮链延伸完成后，在模件1 0 中硫酯酶的催化下环化，接着在印心、印彬、 s p n l 和印雅因所编码酶的催化下，在大环内酯核分子内c 3 一c 1 4 、c 4 一c 1 2 及c 7 - c l l 之 间形成交联桥( w a l d r o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 鼠李糖接到糖苷配基上是糖苷配基转换为多杀菌素必需的第一步，3 个甲基是 鼠李糖接好后才加上去的，并且连接顺序为2 。3 和4 - o h 基。这3 个甲基来源于 s 腺苷甲硫氨酸，鼠李糖则是由葡萄糖1 磷酸经n d p 4 酮6 脱氧d 葡萄糖合成 ( k e r n s ，1 9 9 6 ) 。 福乐糖胺i 由n d p - 4 酮6 脱氧d 葡萄糖( 是上述合成三甲氧基鼠李糖的共同中间 物) 经一系列酶( f h s p nn 、s p n0 、s p nq 、s p nr 、s p ns 基因编码) 催化生成n d p - 福乐糖胺，再由福乐糖胺转移酶催化将n d p 福乐糖胺连接到糖苷配基上合成多杀菌 素( w a l d r o n e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。虽然目前对多杀菌素合成的途径已大致明确，但这方面的 研究还不如阿维菌素、红霉素等抗生素进行得深入，如对多杀菌素合成途径中的某些 基因功能还未完全明确，整个合成途径的调控也还未知，还需要进一步的研究。 1 7多杀菌素的育种 1 。7 1常规育种 1 7 1 1 经典诱变育种 主要是采用紫外线、氮离子注入、6 0 c o q ，硫酸二乙酯、微波等单独诱变处理或 多种方法相结合的组合诱变处理( 杜顺堂等，2 0 0 5 ) 。 代鹏等对多杀菌素产生菌n - 2 3 1 0 7 的孢子采用逐步诱变的方式，先进行超声波 处理，再用紫外线、氮离子注入、6 0 c o 吖射线等进行物理诱变，分别以不同诱变处 理的正变菌株作出发菌株，得了高产菌株c 1 2 1 ，其发酵效价达到4 6 0 j _ t g m l ，是出 发菌株效价的1 7 1 倍( 代鹏等，2 0 0 5 ) 。 陈晓霞等通过u v 、6 0 c o - 1 , 射线等诱变剂处理，结合培养基配方的改良，将产生 菌的产素能力提高了1 5 0 ( 陈晓霞等，2 0 0 2 ) 。 1 2 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 1 7 1 2 原生质体育种 原生质体由于去除外壁障碍，因而对各种诱变剂敏感性较强，往往正突变率高， 因而利用原生质体直接诱变经过多种诱变剂处理过的钝化菌株而言，是一种较有意 义的诱变方法( 陈立梅等，2 0 0 6 ) 。贺玉平等采用多杀菌素原生质体紫外诱变、等离 子束辐射、6 0 c o y 射线3 种诱变处理对多杀菌素产生菌出发菌株c 1 2 1 进行分步诱 变，通过菌块一薄层层析法初筛、摇瓶发酵复筛和终筛，最终获得的高产菌株c 0 3 2 9 的产素水平比出发菌株提高1 7 4 ，经h p l c 测定其发酵效价达1 2 6 0 9 9 m l ( 贺玉平 等，2 0 0 6 ) 。 1 7 1 3 定向筛选育种 又称为推理育种，起源于2 0 世纪6 0 年代，是诱发突变和理化性筛选方法相结合 的一种育种方法。因此通过筛选抗高浓度自身代谢终产物的抗反馈或抗阻遏突变型， 有可能获得高产突变菌株( 张晓勇等，2 0 0 6 ) 。 程休根据抗生素的产量与抗性成正相关的原理，将出发菌株经紫外诱变后在含 有不同浓度多杀菌素的双层抗性培养基上筛选获得了比出发菌株提高了5 9 1 的菌 株( 程休，2 0 0 6 ) 。 张苑以s p i n o s y n2 7 ( 效价为1 8 4 9 9 m l ) 为出发菌株，先将其单孢子悬液经紫外 照射后在含有鼠李糖的平板上筛选鼠李糖抗性突变株，然后将得到的鼠李糖抗性突 变株再经紫外照射后在含有葡萄糖类似物的平板上筛选葡萄糖抗性突变株。葡萄糖 抗性突变株的效价在鼠李糖抗性突变株的效基础上提高了3 0 ，达到了2 6 8 m g l ( 张 苑，2 0 0 4 ) 。 1 7 2 分子育种 从2 0 世纪7 0 年代初发展起来的基因工程技术，经过3 0 多年来的进步与发展，已 成为生物技术的核心内容。 多杀菌素生物合成机制的初步阐明为人们设计分子育种方案提供了依据。比如， 在多杀菌素的生物合成中鼠李糖的合成是一个限速步骤，因为鼠李糖既是刺糖多孢 菌菌株细胞壁的组分，同时又是多杀菌素生物合成的重要前体。2 0 0 1 年，b a l t zrh 等研究发现鼠李糖的生物合成受g t t ，g d h ，e p i ，k r e 4 个基因的编码。将同时携带( g t t ， g d h ，k r e ) 的质粒转进多杀菌素n r r l l 8 5 3 8 菌株中，其发酵产物中多杀菌素a 和d 的产量得到了明显的提高，可能是由于增加了g 仃和g d h 基因产物的量从而克服n d p - 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 酮6 脱氧葡萄糖的供应限制。n d p 酮6 脱氧葡萄糖供应量的大量增加导致鼠李糖 合成的增加，提高了糖苷配基转化为了鼠李糖的能力，从而引起菌株产量的提高 ( b a l t ze ta 1 ，2 0 0 1 ；m a d d u r ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 随着对多杀菌素生物合成途径及其控制基因的进一步了解，我们可以在某个基 因中引入突变来改善刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力，或定向合成某些新衍生物作 为创制新农药的前体。例如，将编码福乐氨糖基因( s p n p ) 的部分片段导入刺糖多 孢菌中，被转化的分离菌株经培养后会积累未连接福乐氨糖的拟多杀菌素前体，而 不产生多杀菌素a 和d ，拟多杀菌素可进一步用作化学修饰的底物而研制出新结构 化合物( c r e e m e re ta 1 ，1 9 9 8 ；b a l t ze ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 8 基因组重排育种 1 8 1 基因组重排简介 2 0 0 2 年，z h a n g 等在n a t u r e 上发表了一篇题目为“g e n o m es h u f f l i n gl e a d st or a p i d p h e n o t y p i ei m p r o v e m e n ti nb a c t e r i a ”的论文，在这篇文章中他们首次提出了基因组重 排( g e n o m es h u f f l i n g ) 的概念( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。该技术的出现被称为：“细 胞改良中的一个重要里程碑 ( g r e g o r y ，2 0 0 2 ) 。 基因组重排技术是分子定向进化在全基因组水平上的延伸，它将重组对象从一 个单基因扩展到整个基因组，因此可以在更为广泛的范围内对菌株的目的性状进行 优化组合( 陈涛等，2 0 0 4 ) 。基因组重排首先需要有一个含有各种正突变的基因组库， 然后通过原生质体融合将这些正突变菌株的全基因组进行随机重组，并筛选目的性 状进一步改进的菌株来进行下一轮基因组重排，这样通过循环多轮的随机重排可以 快速、高效的选育出表型得到较大改进的杂交菌种( s t e m m e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 基因组重排的优点：与经典原生质体融合在每一代只有两个亲本进行重组相比， 具有多亲本杂交的优势。其优点主要表现在： a 基因组重排的对象是细胞内整套基因组，在许多情况下，参与次级代谢产物 生物合成的结构基因在染色体上成簇排列，但控制基因表达的调节基因则位于生物 合成基因簇外，因此将微生物整套基因组视作一个单元进行基因组重排更适合于微 生物级代谢产生菌的遗传改造( 朱林东，2 0 0 6 ) 。 b 基因组重排技术无需了解微生物的代谢途径、编码生物合成酶的基因以及基 因表达调控的知识，尤其适用于微生物代谢产物产生菌的遗传改造。 1 4 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 c 用于基因组重排的亲本为多个亲本以增加突变基因的来源，多个亲本原生质 体融合后的再生细胞不需要进行分离、筛选，而是直接用作下一轮原生质体融合的 次级混和亲本，如此循环数次，以达到迅速产生基因突变和重组的目的。 d 基因组重排技术简化了育种的步骤，缩短了周期，可对理化诱变不敏感的菌 株提供新的改良方法( 朱欣杰和程瑶，2 0 0 6 ) 。 1 8 2 基因组重排方法 基因组重排有两个重要部分：其一是正突变基因组文库的筛选，这是进行有效 的基因组改组的前提。另一个是筛选模型的构建，这是基因组改组的关键( 罗剑等， 2 0 0 8 ) 。具体的操作过程是通过对出发菌株进行诱变，然后在模拟d n a 重组的条 件下对原生质体进行递推式多次融合( r e c u r s i v ep r o t o p l a s t ) ，最后筛选出具有多重 正向进化标记的目标菌株。传统诱变通常是将每1 轮产生的突变体库中筛选出的最 优的一株作为下l 轮诱变的出发株，而g e n o m es h u f f l i n g 则是将包含若干正性突变 株的突变库作为每一轮原生质体融合的出发菌株( 图1 6 ) ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 罄 量 征 p 叠1 1 e r 3 j 蛔e 籼a is 删a i c y e l e a ( e v o l u t i o n a r yt i m e 图1 - 6 无性( 传统诱变育种) 和有性( 基因组改组) 进化的比较示意图 f i g 1 - 6 a s e x u a lv e r s u ss e x u a le v o l u t i o n 注：本图摘自( n a t u r e ) ) 2 0 0 2 年第1 5 期 如图所示：无性反复突变是一个累积个体突变的连续过程。每次诱变后，只选 择一个突变株为最佳菌株进行下一轮诱变。这种菌株选育过程非常缓慢，因为群体 1 5 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 中只有一个个体得到了进化，而不是以多遗传信息的群体进行进化。这种进化过程 丢失了遗传多样性，却积累了很难丢失的有害突变。而有性反复重组在特定群体中 进行重组，产生杂合子代群体，选择表型得到改进的群体在此进行重组，通过累积 有益突变和减少突变的组合机制增加了遗传多样性。这样，通过几轮有性反复重组 得到的群体中，将产生比亲本适应性显著提高的个体( z h a n ge ta 1 。2 0 0 2 ) 。 具体做法如下：在采用递推式原生质体融合对目标菌株进行融合的过程中，首 先要进行原生质体的制备，然后模拟d n a 改组的反应温度条件对原生质体进行融 合，然后在非选择条件下再生，再生原生质体孢子混和就构成了f l ：f 1 长成菌落， 长出的菌落再被制各成原生质体，同时用同样的方法再进行融合再生，这一过程重 复三四次得到后代目标菌落( d e l e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 8 3 基因组重排应用 尽管基因组重排技术诞生的时间很短，但已经在许多领域获得了成功的应用， 众多研究表明g e n o m es h u f f l i n g 是一种有效的菌种改良方法：2 0 0 2 年，z h a n g 等应 用此技术提高了费氏链霉菌合成泰乐星的能力，经过两轮基因组重排加上1 次经典 诱变育种共筛选了2 4 0 0 0 株，历时1 年，得到菌株的生产能力与经过2 0 年所得到的 菌株的生产能力相当( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 2 0 0 4 年，d a i 等通过3 轮基因组重排将 s p h i n g o b i u mc h l o r o p h e n o l 耙u m 菌株对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓度提高了1 0 倍 以上，并可以将培养基中所含有的3 m m o l l 五氯苯酚完全降解( d a ia n dc o p l e y 2 0 0 4 ) 。2 0 0 6 年，朱惠以4 株链霉素抗性菌株作为出发菌株，进行基因组重排育种， 经过2 轮循环原生质体融合，筛选得到了1 株高产重排菌株s g i l v o s p o r e u s g s - 7 4 ， 其生产能力较出发菌株s g 提高了1 1 7 倍( 朱惠，2 0 0 6 ) 。 1 9目的和意义 多杀菌素作为一种新颖的大环内酯类抗生素，其突出的特点符合当今农药的发 展趋势。目前国内多杀菌素依赖进口，成本比较高，而国内在多杀菌素的研究方面 目前的起点相对比较低，未能有高产量的菌株进行产业化生产。 在此基础上本课题期望通过遗传改造获得多杀菌素的高产菌株，以满足生产的 基本要求，降低生产成本，提高企业的利润，产生显著的经济效益和社会效益。 1 6 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 2 材料与方法 2 1材料 2 1 1供试菌株 多杀菌素产生菌：刺糖多孢菌( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) n 2 2 9 、c 1 3 1 ，由武 汉天惠生物工程有限公司研究所保藏。 2 1 2 培养基 2 1 2 1 斜面培养基 葡萄糖1 0 9 ，酵母粉o 1 9 ，牛肉膏0 1 9 ，n z a m i n e0 2 9 ，琼脂1 5 9 ，p h 自然 2 1 2 2 种子培养基 酪蛋白胨1 7 9 ，大豆蛋白胨o 3 9 ，葡萄糖0 2 5 9 ，n a c l0 5 9 ，k 2 h p 0 40 2 5 9 ， 定容至1 0 0 m l ，p h 7 2 7 4 2 1 2 3 发酵培养基 葡萄糖4 o g ，豆饼粉1 5 9 ，棉子粉1 0 9 ，豆油0 5 9 ，玉米浆1 5 9 ，可溶性淀粉 3 0 9 ，c a c 0 30 5 9 ，酵母粉o 5 9 ，定容至1 0 0 m l ，p h7 2 7 4 2 1 2 4 原生质体制备培养基 t s b 3 0 9 ，蔗糖1 0g ，去离子水1 0 0 m l ，p h 自然，1 2 1 ，1 5 m i n 2 1 2 5 原生质体再生培养基 再生培养基1 ( m g ) 可溶性淀粉2 0 9 ，n a c l0 0 5 9 ，k n 0 3o 1 9 ，k 2 i - i p 0 40 0 5 9 ，酵母粉0 2 9 ，f e s 0 4 0 0 0 1g ，m g s 0 4 o 0 5 9 ，琼脂2 0 9 ，定容至1 0 0 m e ，p h7 2 - 7 4 高温灭菌 再生培养基2 ( 氏) 蔗糖2 0 0 9 ，糊精1 o g ，酸水解酪素0 1 9 ，m g s 0 4 0 0 0 5 9 ，琼脂2 o g ，定容至1 0 0 m l ， p h7 2 7 4 ，高温灭菌。使用前加入g l u t a m i ca c i d ，s o d i u ms a l t l 1 9 ，微量元素液0 1 m l ， k 2 s 0 40 0 1 9 ，c a c ho 7 9 ，m o p s1 0 0 m l 再生培养基3 ( m ) 蔗糖1 0 3 9 ，k 2 s 0 40 0 2 5 9 ，m g c h1 0 1 2 9 ，丙酸钠0 0 9 6 9 ，酸水解酪素0 0 1 9 ， 酵母抽提物o 5 9 ，2 8 2 9b i s t r i sp r o p a n e ，微量元素液0 2 m l ，2 0 9 琼脂，定容至 l o o m l ，p h 7 2 7 4 ，高温灭菌。使用前加入0 5 k h 2 p 0 41 0 m l ，2 5 m o l lc a c l 2o 8 m l 和2 0 l p r o l i n e1 5 m l 1 7 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 再生培养基4 ( c x ) k h 2 p 0 4 0 0 2 5 9 ，蔗糖1 0 3 9 ，m g c l 21 0 1 2 9 ，葡萄糖1 o g ，酵母粉0 1 9 ，蛋白胨 o 0 1 9 ，t e s1 0 m l ，微量元素液0 2 m l ，2 0 9 琼脂，去离子水8 0 m l ，p h7 2 7 4 ，高 温灭菌。使用前再加入0 5 k 2 h p 0 42 5 m l ，2 5 m o l lc a c l 22 m l ，l m o l ln a o h 1 7 5 m l 再生培养基5 t s b 3 0 9 ，蔗糖1 0 3 9 ，p h 7 2 7 4 ，1 2 1 ，1 5 m i n 再生培养基6 葡萄糖1 0 9 ，可溶性淀粉2 o g ，酵母抽提物0 5 9 ，n z a m i n e0 5 9 ，c a c 0 30 1 9 ， 琼脂2 o g ，定容至1 0 0 m l ，p h 自然，1 2 1 ，1 5 m i n 再生培养基7 蔗糖1 0 3 9 ，m g c l 21 0 1 2 9 ，k 2 s 0 41 0 1 2 9 ，葡萄糖1 0 9 ，酪蛋白氨基酸0 0 1 9 ， 2 0 9 琼脂，定容至8 0 m l ，p h 7 2 - 7 4 ，高温灭菌。使用前增补：o 5 k h 2 p 0 41 0 m l ， 3 6 8 c a c l 28 m l ，5 7 3 t e s 缓冲液( p h 7 2 ) 1 0 m l ，2 0 l 脯氨酸1 5 m l ，微量 元素液0 2 m l ，1 m 0 1 ln a o ho 5 m l 再生培养基8 葡萄糖4 0 9 ，豆饼粉1 5 9 ，棉子粉1 0 9 ，豆油o 5 9 ，玉米浆1 5 9 ，可溶性淀粉 3 0 9 ，c a c 0 30 5 9 ，酵母粉o 5 9 ，2 0 9 琼脂，去离子水1 0 0 m l ，p h7 2 7 4 2 1 3 培养条件 2 1 3 1 斜面菌种培养条件 培养温度3 0 ；培养时间7 1 0 d ，依据菌种具体情况而定。 2 1 3 2 种子培养条件 用新鲜斜面，甘油管保存的孢子悬液或种子液适量接入种子培养基中，种子瓶 装液量为3 0 m l 2 5 0 m l 或8 0 m l 5 0 0 m l ，摇床转速2 10 r m i n ，培养温度3 0 ，培养 时间4 8 h 。摇瓶中放有8 颗直径为5 m m 的玻璃珠。 2 1 3 3 发酵培养条件 将种子液按5 的接种量接入发酵瓶中，发酵瓶装液量为3 0 m l 2 5 0 m l 或 8 0 m l 5 0 0 m l ，摇床转速2 1 0 r r a i n ，培养温度2 9 ，培养时间9 d 。 1 8 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 2 1 3 4 原生质体制备培养条件 将新鲜斜面上的适量孢子接入t s b 培养基中，摇瓶装液量为5 0 m l 2 5 0 m l ，摇 床转速2 1 0 r r n i n ，培养温度2 8 c ，培养时间4 8 h 。摇瓶中放有不锈钢弹簧。 2 1 3 5 原生质体再生培养条件 培养温度3 0 ；培养时间6 7 d 。 2 1 4 主要试剂和仪器 2 1 4 1 试验中所用到的主要药品和试剂 表2 - 1 主要药品和试剂一览表 t a b l e2 - 1c h e c kl i s to fm a i nm e d i c i n e sa n dc h e m i c a lr e a g e n t s 1 9 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 2 1 4 2 试验中所用到的主要试验仪器 表2 2 主要试验仪器一览表 t a b l e2 - 2c h e c kl i s to fm a i nl a b o r a t o r yi n s t r u m e n t s 仪器型号生产厂家 可控温金属振荡培养箱h z q f哈尔滨东联电子技术开发有限公司 高效液相色谱仪 2 4 8 7 入d e t e c t o r ；1 5 2 5 p u m p w a t e r s 垂直流双人超净工作台z h j h 1 1 0 9上海智城分析仪器制造有限公司 数显水浴锅 型电子天平 通风橱 光栅分光光度计 移液器 超低温冰箱 离心机 p h 仪 微波炉 h h s b s l 2 4 s s 、胙 7 2 2 s 0 2 m l ，l m l ，5 m l v x 5 7 0 c f l 5 r p b - 1 0 g 8 0 2 3 c t l k 3 上海锦屏仪器仪表有限公司 德国赛多利斯公司 北京森雷博瑞实验室设备有限公司 上海第三分析仪器厂 德国艾本德股份公司 法国j o u a n 公司 日本日立公司 德国赛多利斯公司 格兰仕公司 2 1 5 重要溶液和缓冲液 2 1 5 1 微量元素液 z n c h4 0 r a g ，f e c l 3 。h 2 02 0 0 m g ，c u c h 。2 i - 1 2 0 10 r a g ，m n c h 4 h 2 010 m g ， n a 2 8 4 0 7 1 0 h 2 01 0 0 m g ，( n h 4 ) 6 m o t 0 2 4 4 h 2 01 0 0 r n g ，去离子水1 0 0 0 m l 。高温灭菌。 2 1 5 2p 缓冲液 蔗糖l o 3 9 ，k 2 s 0 40 0 2 5 9 ，m g c l 20 2 0 2 9 ，微量元素液0 2 m l ，去离子水8 0 m l ， p h7 2 7 5 ，灭菌后增补：o 5 k i - 2 p 0 41 0 m l ，3 6 8 c a c h1 0 m l ，5 7 3 t e s 缓冲 液( p h 7 2 ) 1 0 m l 2 1 5 3 溶菌酶溶液 称取0 5 9 的溶菌酶于1 0 m l 的p 缓冲液中，充分溶解后用0 4 5 i t m 的无菌微孔 滤膜过滤除菌配成5 0 r n g m l 母液，分装到e p 管中，于- - 2 0o c 下保存备用。 2 1 5 4t r i s h c l 缓冲液 将1 2 1 0 9 的t r i s 碱溶解于约o 9 l 水中，再根据所要求的p h ( 2 5 c 下) 加一定 量的浓盐酸，去离子水定容至1 l 。 多杀菌素产生菌的基因组重排育种 2 1 5 5 结晶紫染液 a 液：结晶紫o 2 9 ，9 5 乙醇2 m l b 液：草酸铵0 0 8 9 ，d d h 2 08m l 混合a 、b 两种溶液，静置4 8 h 后，1 0 倍稀释后使用( 杨世辉和方呈祥，2 0 0 0 ) 2 2 方法 2 2 1分析方法 2 2 1 1 初筛( t l c 法) 将诱变处理后的单菌落涂布于发酵培养基琼脂平板，置于恒温培养箱中3 0 培 养1 0 1 5 d 后，用打孔器均匀打出菌块，每菌株挑取2 菌块用2 0 m l 甲醇浸2 4 h 后， 在超声波下超声3 0 m i n ，离心，用点样器吸取1 0 此点样于1 0 c m x1 0 c mg f 2 5 4 硅胶 板，在充满饱和展开剂( 甲醇：乙腈：水= 4 5 ：4 5 ：1 0 ) 的层析缸中展开，于紫外 灯( 2 5 4 n m ) 下观察有无斑点以及斑点颜色的深浅。斑点颜色的深浅被证明与菌株 效价有相关性( 吴红宇等，2 0 0 3 ) 。 2 2 1 2 复筛( h p l c 法) 该方法快速、准确、重复性好，在多杀菌素的测定中广为应用( w e s ta