（动物营养与饲料科学专业论文）猪抵抗素基因克隆表达及elisa检测方法的建立.pdf

猪抵抗素基因克隆，表达及e l i s a 检测方法的建立 摘要 木研究根据g e n b a n k 中猪抵抗素( r e s i s t i n ) 基因e d n a 序列设计引物，采用r t - p c r 的方法成功的从猜脂肪组织中扩增到r s t n 基因e d n a 片段，并将其克隆到p m d l 8 - t 载体中进行序列测定，结果表明：r s t n 基因e d n a 长度为3 3 0 b p ，编码1 0 9 个氨基 酸和一个终止密码予。它们与g e n b a n k 巾猪r s t n 基因c d n a 核符酸序列同源性为 1 0 0 ，与o e n b a n k 其它5 个物种( 牛、狗、人、大鼠和小鼠) 的c d n a 序列进行比 较，发现投苷酸序列同源性在6 7 8 7 之州，氮基酸序列同源性在5 6 7 9 之 间，说明不同物种之间r s t n 基因差异较大。 根据r s 烈基因测序结果设计另一列引物，用p c r 方法扩增到r s t n 基因并将 其亚克隆至p e r - 3 2 a ( + ) 表达载体，获得重组质粒p e t - r s t n 。用p e t - r s t n 转化大肠 杆菌皿一2 1 ( d e 3 ) 感受态细胞，用i p t g 诱导表达。s d s p a g ej f 白= 测结果表明，重 组r e s i s t i n 蛋白分予量大小约3 0 k d 。列表达条件如温度、i p t g 浓度及诱导时间进i j 优化并用s d s p a g e 检测。结果表明，3 0 、4 h 、i p t g 浓度为1 m m o l l 时，可溶性 重组r e s i s t i n 的表达量最高。w e s t e r nb l o t 检测结果表明，重组r e s i s t i n 可与其抗体发生 特异性结合，并在分予量大小约3 0 k d 处形成特异性反应条带，表明r s t n 基因已在 大肠杆菌成功表达。 用5 0 n i n t a 柱对重组r e s i s t i n 进行纯化，在s d s p a g e 凝胶上为单一电泳条 带。用纯化的重组r e s i s t i n 蛋白免疫健康家兔，制各抗血清，初步建立了r e s i s t i n 检测 的e l i s a 方法。结果表明，该方法具有较强的特异性和灵敏度，抗原抗体最佳工作 浓度为i ：2 0 0 和1 ：4 0 0 ，r e s i s t i n 最低检出限量为1 9 3 7 5 n g m l 。 综上所述，本研究成功克隆了猪r s t n 基阕e d n a 序列，并且构建了r e s i s t i n 原 核表达载体，获得了可溶性重组r e s i s t i n 蛋白，初步建立了r e s i s t i n 检测的e l i s a 方法， 为进一步研究r e s i s t i n 的生物学功能奠定了基础。 关键词：抵抗素( r e s i s t i n ) ，克隆。表达，e l l s a c l o n i n g ，e x p r e s s i o no fp o r c i n er e s i s t i ng e n ea n d e s t a b l i s h m e n to fe l i s am e t h o d a b s t r a c t r e s i s t i ng e n ee d n ao fp i gw e r ea m p l i f i e db yr t - p c ru s i n gap a i ro fp r i m e r d e s i g n e da c c o r d i n gt or s t ng e n ts e q u e n c e si ng e n b a n k ，t h ea m p l i f i e df r a g m e n tw a s i n s e r t e di n t op m d l 8 tv e c t o ra n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a ss e q u e n c e d ，t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h er s t ne d n ao fp i gc o n s i s t e do f3 3 0 b p ，c o d i n gf o r10 9a m i n oa c i d s n u c l e o t i d es e q u e n c eh o m o l o g ya m o n gp i g ，c a t t l e ，d o g ，h u m a n ，r a ta n dm o u s ew e r e b e t w e e n6 7 8 7 a n dt h ea r m n oa c i d ss e q u e n c eh o m o l o g yw e r ef o u n dt ob e5 6 7 9 a n dt h er s t nn u c l e o t i d es e q u e n c e so fp i g sr e p o r t e dc a m et o1 0 0 t h ed a t ea b o v e i n d i c a t e dt h a tt h er s t ng e n ef r o md i f l i j r e n ta n i m a l sh a ds i g n i f i c a n td i f f i ：r e n c e s a c c o r d i n gt o t h en u c l e o t i d e s e q u e n c eo fr s t ng e n e ，a n o t h e rp a i ro fp r i m e r c o n t a i n i n gb a m hi a n dh i n d l l ir e s t r i c t i o ns i t er e s p e t i v e l yw a sd e s i g n e d t h er s t n g e n ew a ss u b c l o n e dt ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 3 2 a ( + ) a n dt h er e c o m b i n e dp l a s m i d p e t - r s t nw a so b t a i n e d t h ep e t - r s t nw e r eu s e dt ot r a n s f o r m e de o l i b l 一2 1 ( d e 3 ) c o m p e t e n tc e l l st oo b t a i nr e c o m b i n a n tb a t e r i a t h ef u s i o np r o t e i n ，i e ，r e s i s t i nw e r e e x p r e s s e du n d e ri m m o l li p t gi n d u c t i o n t h er e c o m b i n a n tr e s i s t i nw a sd e t e c t e db y s d s p a g ea n dw e s t e r n b l o w i n g o nb o t ho f t h ep a g eg e la n dn i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e ，a s p e c i f i cp r o t e i nb a n dw i t hm o l e c u l a rw e ! 曲t so f3 0 k dw a sd e t e c t e d t h e nt h ee x p r e s s i o n c o n d i f i o n ss u c ha st e m p e r a t u r e i p t gc o n c e n t r a t i o na n di n d u c f i o nt i m ew e r es c r e e n e d t h e r e s u ks u g g e s t e dt h a tt h er e c o m b i n a n tb a t e r i ac u l t u r e da t3 0 f o r4 h 、v i t i il m m o l li p t g i n d u c t i o n ，m a y b et h ea p p o p r i a t ep a r a m e t e r st oo b t a i nt h eb e s te x p r e s s i o no fs o l u b l e r e c o m b i n a n tr e s i s t i np r o t e i n ， t h es o l u b l er e c o m b i n a n tr e s i s t i nw a sp u r i f i e dw i t l l5 0 n i - n t ar e s i na f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ya n dt h e r ew e r eo n l yo n es t r a po nt h es d s p a g eg e l w e s t e r n b i n n i n g d e t e c t i o na l s os h o w e dt h a tt h ep u r i f i e dp r o t e i nc a l lb es p e c i f i c a l l yr e a c tw i t hr e s i s t i n a n t i b o d y t h ep u r i f i e dr e s i s t i nw a su s e da sa n t i g e nf o ri m m u n i z i n gr a b b i tt oo b t a i nr e s i s t i n s p e c i f i ca n f i s e r a t h ee l i s af o rr e s i s t i nd e t e c t i o ni sd e v e l o p e di n i t i a l l y t h ew o r k i n g c o n c e n t r a t i o no f a n t i g e n - a n t i b o d y w a s1 ：2 0 0a n d1 ：4 0 0 , t h e l o w e s td e t e c t a b i l i t y o fr e s i s t i n i i w a sa b o u t1 9 3 7 5 n g m i ， t os u m m a r i z e ，p i gr s t ng e n ew a sc l o n e da n de x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y f u r t h e r m o r e ， t h es o l u b l er e c o m b i n a n tr e s i s t i na n di t sa n t i b o d yw e r eo b t a i n e d 1 h ee l i s am e t h o df o r r c s i s t i nd e t e c t i o nw a ss e tu p t h e s ew o r ka b o v el a i dt h ef u n d a t i o n f o rt h es t u d yo f b i o l o g i c a lf u n c t i o no f r c s i s t i n k e y w o r d s ：r e s i s t i n ，c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ，e l i s a i l l 英文缩写 a m p a p o d b s a e d n a d a b d t t e b e c o l i e d t a e l i s a h i s h r p 儿吓g k d l b m r n a n i n t a o d p a g e p b s p c r r s t n r p m b d s t b s 英文缩写词表 英文全称 a m p i c i l i i l l a m m o n i u mp e r s u lf a t e b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m b le m e n t a r yo fi i l r n a 3 ，3 - d i a m i n o b e n z i d ir e t e t r a h v d r o c h i 0 一r i d e d it h j o t h r e jt o l e t h i d i u mb r o m i d e e s t h e r i c h i ac 0 1i e t h y l e n e d i a m i n el e t r a a c e t i ca c i d e n z y m e li n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y h i s t i d i n e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e l s o p i o p y 卜t h i o 一口一d - g a l a cl o s i d e k 1 0d a l t o n l u r i ab e r t a ni m e s s e n g e rr n a n je k e l 一n i t r n o t r i a c e t i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y a e r y la m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t eb u f f e r c d s a l i n o p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s i s t i n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u lf a t e t r is b u f f e r e ds a lir e 中文全称 氨苄青霉素 过硫酸铵 碱基对 牛l 清白蛋白 与m r n a 互补的d n a 3 ，3 一二氨基联苯胺 二硫苏糖醇 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸二钠 酶联免疫吸附分析 组氨酸 辣根过氧化物酶 异丙基硫代b d - 半乳糖苷 千道尔顿 l b 培养基 信使r n a 镍一次氮基三乙酸 光密度值 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸豁缓冲液 聚合酶链反应 胰岛素抵抗素 得分钟的转速 、二烷基硫酸钠 t r i s 缓冲盐溶液 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑重声明：所呈交的论文足我小人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得术校或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我同工作的同志埘本研究所做的任何贡献均已存论文中作了蛸确的 说明并表示了谢意。 本学位论文成果归广东海洋大学所响。 指导教师签名：毒出屹殇匆4 枷 娜占年6 月f 口开 研究生签名：哥勿 妒g 年6 月肜同 广东海洋大学硕十学位论文 1 研究目的和意义 第一章引言 随着畜牧业的伙速发展，人民生活水平的提高，消费肯肘肉类制品的品质和风味 提出了更高的要求。尽管育种改良、营养控制在提高瘦肉率方面发挥了定作用，但 肌州脂丰富、风味独特的肉作品质也受到人们的青昧。因此，如f t 在提高商品猪瘦肉 率的基础上，改善肉体风味，满足消费者的要求受到了广大畜牧工作者的高度重视。 近年米大量的研究表明：动物脂肪组织不仪是能量储存场所，同时也分泌多种生 物活性物质，如瘦素( 1e p t i l 2 ) 、肿瘤坏死囚子n ( t n fa ) 、补体d 、脂肪细胞补体 相关蛋白( a dj p o n e c t i n ) 等，芙问影响机体的脂肪代谢。抵抗素一一r e s s t j n 是 sl e d j a n 等新近发现的一种山脂肪细胞分泌的独特的促胰岛抵抗的信号分子“。它的 发现引起了学术界极人关注，近年来对浚基凶的结构与生物学功能等方面的研究已经 取得了相当的进展。人、小鼠、大鼠、猪、牛、狗等的r e s i s t i n 基因先后被克隆， 其单核苷酸多态性( s n p ) 的研究也在不同人种中进行。动物实验表明，r e s i s t i n 能 够降低胰岛素敏感性、升高血糖；机体不同组织r e s i s t i n 表达情况差异较：人；给p 重组r e s i s t in 町调节体脂分靠，给予r e s i s t i n 抗体可中和上述生理活性；体外实验 显示，r e sj s t jn 可调节3 1 3 一j 1 脂肪细胞对葡萄糖的摄取水平和转运能力。以上研究 表明，r e m s t i n 可以作为信号分子调1 ，机体脂肪生长发育和分布沉积。部分研究还 认为人类和小鼠脂肪组织i e s i s t i n 与肥胖、糖尿病有关。 r e s i s t i n 目前的研究主要局限于离体试验和和动物实验，且r s 州与胰岛索抵抗、 肥胖及2 型糖尿病的关系方面，结论不一。r e s i s t i n 的作用机制，猪t e s i s t i n 的表 达、分布情况等问题有待进一步解决。 本研究目的是克隆猪的r e s i s t i n 基因，将其在大肠杆菌中表达，用所获得的重 组r e s i s t i n 蛋白免疫动物，得到r e s i s t i n 抗体，初步建立了检测r e s i s t i n 的e l i s a 方法，为进一步研究r e s i sl i n 的生物学功能奠定基础。 2 抵抗素( r e s is t i n ) 的研究综述 在畜牧业生产中，提高瘦肉率和改善肉体品质一直是畜牧生产者关注的问题之 一。为了解决这一问题，科研工作者做了大量工作：传统方法是通过遗传育种的方式 提高瘦肉率和改善肉质；也有些研究是通过改变营养摄入量，尤其是调节氨基酸摄入 l 猪抵抗素摧凼克隆、表达及e l i s a 检测方法的建市 水平术达到目的；还有一些研究是通过添加外源物质，例如：生长激素、b 一兴奋剂、 铬化合物、甜菜碱、肉碱、y 一亚油酸等来提高瘦肉牢。但是，某些外源物质的添加 剐动物机体有一定负作用，如，r 一兴奋剂的残留问题，铬化合物的毒性问题等等。 近年来，由于分子营养学的发展，分子生物学技术的革新，使人们对脂肪组织生 长发育的调控在分子水平_ j ：有了更深刻的认弘 ，从f i 使人们刘提高瘦肉聿i 、改善肉体 品质的研究【旦转移到分子水平匕来。肥胖基因( o b ) 、瘦素( 1 e p t n ) 、胰岛素样生艮 凶子i i 基因( i g f i i ) 、肌肉7 l 长抑制素基因( m s t n ) 、肿瘤上1 i 死凶子a ( t n f o ) 、 脂肪酸结合蛋白( f a b p ) 等调控机体脂肪代谢的基因先后被发现并克隆。 抵抗素一一f e s js t i l 3 是s t e p p n n 等新近发现的 种由脂肪细胞特异性分泌的促 胰岛抵抗的信弓分子。它的发圳引起了学术界极大关注，近年来对该基因的结构与 生物学功能等方面的研究已经取得了相当的进展，j - 而就泼领域的研究进展作一简要 的综述。 2 1r e s i s t i n 的发现 人们在研究用噻哗烷二酮类( t z d s ) 药物改善胰岛素抵抗、治疗糖尿病的机理叫 发现，t z d s 能通过过氧化物酶增殖物激活受体y ( p p a ry ) ，降低脂肪细胞分泌的 某种导致胰岛素抵抗的因子，从而显著提高机体对胰岛紊的敏感性。“。s t e p p a n 等o 。2 1 通过m r n a 差异显示技术发现经7 1 2 1 ) s 处理的脂肪细胞中某种m r n a 的表达水平下 降，其产物是富含胱氨酸的分泌蛋白，这种m r n a 编码的蛋白质因j 胰岛素抵抗有关， 因而被命名为r e s i s t n 。另有学者k i mk h 采用微阵列分析的方法也分离出r e s i s t in ， 并证_ ：艾是脂肪细j 旭特异的分泌因了“1 。 2 2r e s i s t i n 基因结构的研究 r e s i s t i n 抵抗素是由白色脂肪组织特异性分泌的一种促胰岛索抵抗的多肽类激 素。s t e p p a n 等根据人r e s i s tj n 基因核苷酸序列推测其半胱氨酸构成模式为x h - c x 。c - x c x 。一cx 。一c x p x c x 。一c cx 。”。2 0 0 2 年，c e p i e a 克隆了全长为1 4 1 4 b p 的 猪r e s i s t i n 序列，该序列由3 个外显予和2 个内含予组成。其中内含子i 长度为3 9 4 b p ，内含子i l 为3 3 9b p 。3 个外显子拼接组成r e s i s t i n 基因编码区，长度为3 3 0 b p ”1 ， 编码1 0 9 个氧基酸的多肽，分子量约为1 2 5 k o ”l 。猪的r e s i s t i n 基因可能位于2 号染 色体上，不同猪的品种的r e s i s t i n 基因的5 调控区存在较大差异，这种差异是否 影响胰岛素的敏感性和体脂分布有待进步研究。 小鼠r e s i s t i n 蛋白分子量约为1 2 5 k d ，由1 1 4 个氨基酸组成。其中含有2 0 个氨 基酸组成n 端信号肽，而其余的9 4 个氨基酸多肽含有l1 个半胱氨酸，占1 2 。不同 品系的小鼠r e s i s t f n 基因编码区碱基组成有所不同。封闭群s w i s s 小鼠与近交系 广东海洋大学硕士学位论文 c 5 7 b l 6 小鼠的r e s is t i n 基因编码区t 2 5 0 个碱基均相同。而从2 5 1 b p 丌始有较大 差别。c 5 7 b l 6 同其支系c 5 7 b l 6 j 具有相同的编码区和5 端调控区，但3 端调控 区有差异。c 5 7 b l 6 小鼠r e s i s t i n 的基因位于第8 对染色体上”l 。 人鼠f e n js t j n 基冈c d n a 全长3 4 5 b p ，0 1 e r r 大鼠与w is t a r 大鼠仅存编码区上游 一l 一1 0 个碱犟处有所不同”1 。 m o o n 克隆了奶牛f e s i s t i n 基因，全长9 8 2 b p ，其巾包括3 个外显子和2 个内含 子。编码氨基酸的三个外显子长度分别为】8 、7 8 和1 3 4 ”。 人的f e s i s t i n 基因也已阐明，其e d n a 全长为3 2 7 b p ，3 个外品子长度分别为 1 1 8 ，7 8 ，1 3 1 b p ”。人的f e s is t i n 基凼定位于1 9 号染色体j _ ，其氨基酸序列有5 9 与鼠序列相同。r e s js t i n 基因在人脂肪组织中的表达水平要低于存小鼠脂肪组织中 的表达水平。 2 3r e s i s t i n ii k e 的家族 r e s is t i n 属于富龠半胱氮酸的分泌型蛋白抵抗素样分子家族( r e l m s ) 。r e l m s 家族足一组含有1 0 5 一】17 个氨皋睃的蛋白质，分为二个区：n 端信号序列、可变的中 问部分、高度保守的半胱氨酸重复基序构成独特的c 术端功能区，c 术端氨基酸序列 决定了分子的种属或品系特性。其成员除了r e s i s t i n 还柯r e l ma 、r e l m b 和r e i my 等。 r e i 。mo ，义称f i z z 4 ，是一种以币体形式分泌的蛋白质，与r e s is t i n 有6 3 的例 源性。人鼠和小鼠的r e l ma 蛋白质含有1 1 1 个氨基酸。人鼠r e md 定位存1 1 号染色 体上，面小鼠的在1 6 号染色体上。r e l md 具有严格的组织表达特异性，在脂肪组织 r 】含量丰富，同时在小鼠的乳房、舌、肺组织有定水平的表达，但在3 t 3 一l 1 脂肪 前体细胞和其它脂肪前体细胞不表达。“1 ，r e l mn 可能参与炎症反应过程。 r e l m b 又称f i z z 2 ，是种咀二聚体形式分泌的蛋白质，分子量约9 k d 。r e l m b 与r e s is t i n 有3 7 的同源性“，人类和小鼠r e l m0 蛋白分别由1 1 l 、1 0 5 个氨基酸组 成，分别定位f3 号和1 6 号染色体上，r e l mbm r n a 的表达具有肠道特异性，仅在胃 肠道尤其是结肠表达，在小鼠和人类的肠道增生上皮细胞中，r e l mb 的基因表达水平 最高，在肿瘤细胞的表达水平也显著增高，表明r e l m b 在肠道上皮增生中具有一定 的作用”。 r e l m y 是最近发现的r e l m s 家族中的一员，它是在受烟雾刺激的大鼠的鼻粘膜 上皮检测到的。大、小鼠r e l m y 蛋白质均含有1 1 1 个氨基酸。大鼠r e l m y 位于1 l 号染色体，小鼠的位于1 6 号染色体。r e l mym r n a 除了在烟雾刺激大鼠的鼻粘膜上 皮高度表达以外，在白色脂肪组织中也有表达，另外，在血浆中r e l m g 的含量也很 高，说明r e l mg 具有细胞因予的功能“” 猪抵抗素基因克隆、表达及e l i s a 检测方法的建立 2 4r e s i s t i n 生物学特性 2 4 1r e s is t i n 基因的组织分布 r e s i s t ir lm r n a 存大鼠”“、小鼠。和人类”的白色脂肪组织( w a t ) 和”3 一l 1 脂 肪细胞中表达量多于棕色脂肪( b a t ) 。b a r l 对激素和其它介质的反应不同于w a t ， r e s is t i n 在i i a t 的作用还不清楚。胰岛素和噻哗烷二酮促进r e s i s t i n 存b a t 中的表 达，地塞米松和异丙基肾 二腺素则抑制y e s is t j f l 的表达。抵抗素m r n a 在不同功能脂 肪组织中的表达各异，雌性生殖部位脂肪表达最高，附睾门色脂肪抵抗索含量办丰富。 定量聚合酶联反应研究发现，抵抗素m r n a 表达在腹部皮下脂肪高丁下肢皮下脂肪”3 。 拊报道，r e s i s t i n 蛋白在大鼠肾卜腺有定程度的表达。”，运用免疫组化和 r tp c r 发现在大鼠胃底半l i 膜壁细胞和神绎内分泌细胞及幽门处有f e s isl in 存在。通 过r t p c r 分析发现，f e n i s t j n 也存在丁小鼠脑垂体巾，其定位在乖体前、中叶。 免疫组化实验证实了r e s i s t i n m r n a 在下丘脑弓形核有较高表达，在腹内侧核有一定 表达。饮食诱导的肥胖小鼠( o b o b ) 和糖尿病小鼠( d b d b ) 血浆中y e s is t i n 水平 有所增加。“。r e s i s t j nm r n a 在人类巨噬细胞”5 、外岗血淋巴细胞、急件白f l 病和 u 9 9 3 7 、h l 6 0 骨髓细胞“”中均有表达。人类血浆r e s i s t jn 水平约1 4 3 n g m p ”，在 脾脏、骨骼肌、胎枯、胰腺和滑膜浆液等组织办有分布，可见f e s i sl jr l 对机体内稳 念的调节有一定作用。 2 4 2r e s i s t i n 与胰岛素抵抗 胰岛素抵抗表现为肝脏、肌肉及脂肪组织等外剧靶组织对胰岛素的敏感性降低， 并伴有代偿性的高胰岛素血症。s t e p p a n 等的研究显示，在正常小鼠血清中存在少量 r e s i s t i n ，小鼠禁食4 8 h 后r e s i s t i n 水平f 降，在采食后升高”“”。k i mk 旷1 等的 研究也发现，在禁食4 8 h 的小鼠以及胰岛索抵抗的糖尿病小鼠模型中r e s i s t i n 水平 极低，给予前者高糖无腊日粮1 6 h 后脂肪组织的r a ms t i n 水平增高2 5 倍，给予后者 外源胰岛素3 0 m i n 后r e s i s t i n 水平增高2 3 倍，作者认为胰岛素能通过调节r e s i s t i n 水平来调节自身活性”。 对于高脂口粮诱发的肥胖小鼠和胰岛素抵抗小鼠，连续给予4 周高脂日粮后血浆 中r e s i s t i n 水平上升并伴有胰岛素抵抗和肥胖发生，8 周后更加显著。先天性肥胖 小鼠和o b o b 和d b d b 小鼠在给予高脂口粮后，血浆中的r e s i s t i n 水平也明显升高 “1 ，表明r e s i s t i n 可能参与饮食诱导的与胰岛素抵抗相关的肥胖的调节”“。给禁食 2 4 hc 5 7 b l 6 j 小鼠腹腔注射重组r e s i s t i n ，并在1 2 h 后重复注射1 次。2 h 后检测葡 萄糖耐受量发现：高峰血糖值较对照组上升2 8 ，血浆胰岛素浓度也升高。表明注射 重组y e s i s t i n 可以导致糖耐受量降低和胰岛素抵抗“】。 r e s i s t i n 抗体的免疫球蛋白y ( 1 9 c , ) 可以中和血浆中r e s i s t i n 活性，达到封 闭其功能的作用。注射r e s i s t i n 抗体可以降低同粮诱发的肥胖小鼠和胰岛索抵抗小 广东海洋人学硕士学位论义 鼠的血糖，对胰岛素的敏感性也增加。停止注射r e s i s t i n 抗体i g g 后血糖恢复。向 3 t 3 一l i 脂肪细胞培养基中加入r e s i s t i n 的i g g 抗体可以增强胰岛素刺激的葡萄糖摄 取。 脂多糖可诱导大鼠和人发生高血糖和胰岛索抵抗。用脂多糖处理人鼠后，其白色 脂肪组织和白细胞r p r e s i s t i nm r n a 水平升高。t z d s 可通过p p a ry 增强胰岛素的敏感 性，同时降低了r e s i s t inm r n a u 血清r e sj s t n 的表达水平，印证了r e s i s t i n 可降低 胰岛素敏感性的说法”43 。给大鼠注入r e s i s t i n ，可引起肝急性胰岛素敏感性和葡萄糖 代谢水平下降，这是由于r e s i s t i n 使血糖含量增高而引起的“。 令外有研究表明有不同的结果，w - y 第一个证实在实验忭肥胖动物存_ 在，m 霞的抵 抗素表达减少”。以后几个研究也证实抵抗素表达减少与胰岛素抵抗和肥胖症相关， 例如，在胰岛素抵抗大鼠模型，抵抗素基因表达受抑制”。高脂饮食诱导的转基凼鼠， 抵抗素基凼在脂肪细胞的表达卜调”i 。代谢综合痘动物模型雕4 4 中，抵抗素基冈 表达似乎未参与胰岛素抵抗的病因学机制“。 2 4 3r e s i s t i n 与糖代谢 r e s i s t i n 可看作足一种脂肪组织感受动物营养状态的信息因子，调节脂肪细胞 生成的一个反馈信号分子“1 。3 t 3 一l i 脂肪细胞常用于研究胰岛素刺激葡萄糖摄取能 力。体外实验表明，3 t 3 一l 1 脂肪细胞可在培养基中分泌丰富的抵抗素，说明这一激 素可能以自分泌或旁分泌的方式调控胰岛素介导的葡萄糖转运过程。为了证实这设 想，将3 1 3 一l i 脂肪细胞培养于含有抵抗素抗体的培养基中，临测 3 h 2 一脱氧葡萄糖 在胰岛素( 5 n m o 1 ) 刺激后的摄取水平，结果显示，脂肪细胞葡萄糖摄取能力提高 4 2 ，而对照组葡萄糖摄取率无变化。给予纯化的抵抗素i g g 抗血清，高脂同粮诱导 的胰岛素抵抗( i r ) 肥胖小鼠血糖水平降低，胰岛素敏感性增强，而用非特异i g g 抗血清则无降糖作用。 另外，用胰岛素处理3 r 3 一l l 脂肪细胞4 8 小时发现其r e s i s t i n 的m r n a 水平显著 降低，比生理水平降低5 0 脚1 另外个相似的研究瑚也证实了r e s i s t i n 的m r n a 及 蛋白水平都出现相当数量的降低。这些体外的研究结果与以前在体内获得的研究结果 相悖，即服用胰岛素可以诱导r e s is t i n 蛋白的表达”1 。但是，不论是在体外3 t 3 - l i 细胞的研究还是在体内利用葡萄糖夹技术对大鼠的研究”“，均表明高血糖水平可以非 常显著地诱导r e s i s tin 蛋白的表达对这些显然是矛盾的研究结果的一种解释是血 耱或胰岛素在体外的急性升高并不足以模拟高血糖、高胰岛素或胰岛素抵抗状态对体 内r e s i s t i n 蛋白表达的影响。 2 4 4r e s i s t i n 与肥胖和体脂分布 资料显示r e s i s t i n 与肥胖和体脂分布相关联。王学晶等”2 1 研究正常入和单纯性 肥胖人群血浆中r e s i s t i n 水平时发现：正常人群组r e s js tjn 平均水平为( 2 0 5 猪抵抗素基因克降、表达及e l i s a 检测方法的建立 2 8 5 ) u g l ，r e s is t i n 水平与体重指数( 体重身高：) 呈正相关，与抵抗指数 i ( 血 糖胰岛素) 呈负相关。肥胖组的r e s is t fn 平均水平高于正常对照组。也有分析显 示空腹血清抵抗素浓度与葡萄糖曲线f 面积和体内脂肪百分比呈正相关，与胰岛素敏 感指数成显著负相关。“。m c t e m a n 等通过3 2 例人类不同部位脂肪组织样本采用定量 聚合酶链反j 衄技术检测其r e s is t i nr a r n a 水平，发规腹部脂肪组织r e s is ti nm r n a 水平较腿部高4 1 8 ，作者认为降低c o s i s t i nm r n a 水平，可能减少腹部脂肪和腿部 脂肪沉积“。c h e nxd 等指出：与瘦肉型仔猪相比，脂肪型仔猪脂肪组织中r e s i s t n 的表达量较高n “。 支持r e s i sl i n 蛋白与肥胖所引发的胰岛素抵抗相关的另外一个证据来源亍二比较 研究内脏脂肪组织与皮f 脂肪组织内y e s i s t i n 蛋白的表达，r e s is t i n 在内脏脂肪组 织内的表达比其在皮下脂肪组织内高15 倍”。而内脏脂肪组织被认为是导致胰岛素 抗性的一个重要的危险因素，增加内脏脂肪组织的堆积呵以降低胰岛素的敏感性“。“ 。对氨基末端激酶墓区| 敲除小鼠( a m in o t e r m i n a lk i n a s ek n o c k o u t ) 的研究表明 其血浆r e s i s t i n 蛋白水平被显著降低，而其胰岛素的敏感性得到明显的改善“。 但是w a y ”“和f u k u j 及m o t o j i m a 。= ”发现与瘦的小鼠比较，包括o b o b ，d b d b ， t u b t u b 和k k ay 在内的遗传型肥胖小鼠体内f o s i s t i 】蛋白的表达明显降低其它利 用o b o b 小鼠进行的研究也获得了相似的结粜”。”。肥胖型动物模型体内f o s is t i n 表达的降低，原因n j 。能是：单个脂肪细胞r e s i s t i nm r n a 的表达降低了，但是由于总 脂肪组织增加所以使循环中r e s i s t i n 蛋白水平增高。 2 5r e s i s t i n 表达和调控 2 5 1 人r s t n 基因启动予区域有s r e b p 、c e b p 和p p a ry 结合位点，s r e b p 和c e b p 在c b p 和p 3 0 0 存在时强烈增加r e s i s t i n 的表达，p p a ry 则抑制r e s i s t i n 表达“”。 i l a r t m a n 等认为”这是由于脂肪细胞特异性的表达t e s i s t i n 基因和c e b pd 结合， 并激活p 3 0 0 和c r e b 结合蛋白( c b p ) ，明显地提高邻近r o s is t i n 启动子的组蛋白乙酰 化，从而增加r e s i s t i n 的表达。另外此种作用也部分地是通过二磷酸肌醇激酶( p 1 3 k ) 和有丝分裂原激活蛋白激酶( m a p k ) 信号转导途径进行调节。 2 5 2r s t n 基因在启动予区及内元序列中含有多个促进脂肪细胞分化的关键性转录 因子( 如p p a r y 、c e b e a 、a d d l ) 的结合位点，推测r e s i s t i n 具有促进脂肪前体 细胞分化的作用( 二聚体形式) ”“”3 。但现有文献大多报道，分泌性的重组r e s i s t n 蛋白及其家族r e l ia 均抑制3 他一l l 细胞分化”“”。 2 5 3 含有信号肽的r e s i s t i n 前体蛋白含有一个典型的l e u 拉链结构，并具有核定 位的可能性。由于r e s i s t i n 及其前体蛋白含有多个潜在的磷酸化位点，并以多种聚 合状态共存于细胞培养上清中，提示r e s i s t i n 前体蛋白的磷酸化状态可以明显影响 r e s i s t i n 的功能”。 6 广东海洋大学硕lj 学位论文 2 5 4r s t n 基因的表达调控研究小结如图： 调节因子动物模型 r t f e r e n e 姻 s u o o r e s s r o r s t h i a z o l i d i n e d i o l i e s 3 t 3 l l s 、m i c e 、r a t s3 ，4 7 ，2 9 ，4 8 ，9 1 ，4 9 o b e s i t y m i c e 4 6 ，3 1 。2 5 。5 0 ，2 7 i n s u l i n3 t 3 、l l s2 9 4 8 t nf - 旺3 t 3 一l l s 3 1 ，4 8 ，5 l i s o p t o t e r e n o l3 t 3 l 1 s 5 4 e p i n e p h r i n e 3 t 3 - l 1 s4 8 s o m a t o t r o p h i n3 t 3 - l 1 s 4 8 f a s t i n g m i c e 3 , 3 1 ，5 l i p o p o l y s a c c h a r i d e m i c e3 i g r o w t hh o r m o n e d g 5 5 i n d u c e r s lh i a z o l | d f l e d i o n e sm i c e 2 5 ，5 0 g l u c o s e 3 t 3 l ls 、r a t s 3 1 4 8 i n s u l i nm i c e5 d e x a m e t h a s o n e 3 t 3 一l l s 、m i c e2 9 ，4 8 h y p e r p r o l a c t i n e m i a m i c e 5 2 t e s t o s t e r o n em i c e5 2 g r o w t hh o r m o n es d r r a t s 5 3 r e f e e d i n g m i c e 3 , 3 1 ，5 l i p o p o i y s a c c h a r i d e 3 t 3 l 1s 、r a t s 1 7 n oe f k c t i n t e r l e u k i n 63 t 3 l 1 s3 l l i p o p o l y s a c c h a r i d e 3 t 3 l 1 s 、m i c e 3 1 a n g i o t e n s i n - 2 3 t 3 l 155 1 g r o w t hh o r m o n e3 t 3 ，l ls 5 1 p - a g o n i s t s 3 t 3 l 1 s 、m i c e2 9 ，4 9 2 6 抵抗素基因单核苷酸多态性研究进展 目前抵抗素基因单核苷酸多念性研究主要是人抵抗素基因单孩苷酸多态性与肥 胖和2 型糖尿病关系的探讨。人抵抗素基因存在单核苷酸多态性，此多态性在不同国 家、不同种族、不同动物品种中有很大差异，其与肥胖和2 型糖尿病关系的报道亦不 一致。c a oh 1 通过对加拿大人1 9 号染色体上抵抗素编码基因r s t n 进行全基因组扫 描，发现抵抗素基因3 非编码区和内含子2 备存在1 个s n p ( + 3 9 c ) ，r 和+ 6 2 g ) a ) ，编 码区未发现突变。w a n g 等”6 1 在具有糖尿病高危因素的高加索人中研究了4 4 例2 型糖 尿病和2 2 例非糖尿病家族成员，发现抵抗素基因非编码区没有