（动物营养与饲料科学专业论文）热纤维梭菌β葡聚糖酶热稳定性机制的研究.pdf

a m o a p b p b s a d n s e b e d t a i p l b k a l l k d a l b l i c b l i e m b l i e m b c d m c s o r f o r i p b s p c r r b s s d s s d s p a g e s o e t b e t e t e 匝d n i s x - g a l 主要英文缩写词 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a m m o n i u mp e r s u l f a r e 过硫酸铵 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n es e m ma l b u m i n 牛血清蛋白 3 , 5 d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d 3 , 5 - 二硝基水杨酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a e e t i ca c i d乙二胺四乙酸 i s o p r o p y l t h i o - 1 3 - g a l a e t o s i d e异丙基硫代一b - - d 半乳糖苷酶 k a n a m y c i n 卡那霉素 k i l o d a l t o n 千道尔顿 l u r i a - b e r t a n im e d i u m l b 培养基 l i c h e n a s ef r o mc l o s t r i d i u mt h e r m o c e u u m b - 热纤维梭菌p 葡聚糖酶 m a t u r ep e p t i d eo f l i c b 热纤维梭菌b _ 葡聚糖酶成熟肽 c a t a l y t i cd o m a i no f l i c m b 热纤维梭菌b 葡聚糖酶成熟肽催化结构域 m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s 多克隆位点 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放阅读框架 r e p l i c a t i o no r i g i n 复制起点 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合链式反应 r i b o s o m eb i n d i n gs i t e 核糖体结合位点 s o d i u md o d e e y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s d s p o l y a c r l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i ss d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 s p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o n 重叠延伸剪接术 t r i s - b o r a t ee d t ab u f f e rt b e 缓冲液 t r i s - e d t ab u f f e r t e 缓冲液 n ，n n ，n - t e t r a m e t h y l e n e d i a m i n en n ，n ，n - 四甲基乙二胺 t r i sh y d r o x y m t h y l - a m i n om e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 5 - b m m o - 4 - c h l o r o 3 一i n d o l y - - d - g a i a c t o s i d e5 - 溴一4 一氯- 3 一吲哚- 1 3 - d 半乳糖苷 中文摘要 b 葡聚糖酶是重要的饲用酶制剂，它能特异性地降解p 葡聚糖中与p 1 ，3 键相 邻的b 1 ，4 键，从而可消除由p 葡聚糖引起的抗营养作用。p 一葡聚糖酶主要来源于 微生物，其中热纤维梭菌b 葡聚糖酶有较高的热稳定性，耐热温度可达8 0 。因 此，本研究通过基因缺失、突变及构建杂合基因等方法系统地研究了热纤维梭菌 6 葡聚糖酶的耐热机制，主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 构建和表达了热纤维梭菌6 葡聚糖酶成熟肽( 1 i e m b ) 及其2 个缺失酶 ( l i e m b a 2 3 8 3 0 5a n dl i c m b a 2 1 7 - 3 0 5 ) 。l i c m b a 2 3 8 3 0 5 为l i c m b 在c 末端缺失 了锚定结构域( d o e k e n nd o m a i n ，6 8 个氨基酸残基组成) 的缺失酶：l i c m b a 2 1 7 3 0 5 为同时缺失了连接子( t h r - p r o - b o x ，2 1 个氨基酸残基组成) 和锚定结构域( d o c k e f i n d o m a i n ) 的缺失酶。酶特性研究表明：l i c m b a 2 3 8 3 0 5 和l i c m b 2 1 7 3 0 5 的比活 分别比l i c m b 高9 0 5 8 和3 6 6 5 ：7 5 处理l o m i n ，l i e m b a 2 3 8 3 0 5 、l i c m b 和l i c b a 2 1 7 。3 0 5 的残余酶活力分别为1 0 0 、8 6 0 5 和7 9 0 9 ，l i c m b a 2 3 8 3 0 5 的热稳定性高于l i c m b 和l i c m b a 2 1 7 3 0 5 。以上结果说明热纤维梭菌6 葡聚糖酶 锚定结构域的存在会降低酶活力和热稳定性，而连接子的存在会提高酶活力和热 稳定性，这二个区域对酶的作用相互抵消。因此，热纤维梭菌b 葡聚糖酶成熟肽 的热稳定性与其结构域相当，即热纤维梭菌b 葡聚糖酶的热稳定性与其c 末端尾 巴无关，而与其催化结构域有关。 ( 2 ) 以l i c m b c d ( 热纤维梭菌d - 葡聚糖酶催化结构域) 为材料，构建和 表达了7 个n 一末端缺失和3 个c 末端缺失的l i c m b c d 缺失酶。7 个n ，末端缺 失酶定名为l i c m b c d a n 3 、l i c m b c d a n 5 、l i c m b c d a n 7 和l i c m b c d n 9 、 l i c m b c d a n l1 、l i c m b c d a n l 3 和l i c m b - c d a n 2 5 。分别在n 末端缺失3 、5 、 7 、9 、1 1 、1 3 和2 5 个氨基酸残基；3 个c 一末端缺失酶定名为l i c m b c d a c 3 、 l i c m b - c d a c 6 和l i c m b c d a c 9 ，分别在c - 末端缺失3 、6 和9 个氨基酸残基。 研究结果发现：与亲本酶( l i c m b c d ) 相比，l i c m b c d a n 3 、l i c m b c d a n 5 、 l i c m b c d a n 7 和l i c m b c d a n 9 热稳定性都有不同程度的下降，7 0 c 处理1 0 m i n ， 残余酶活力均在7 0 以上：7 5 c 处理l o m i n ，l i c m b c d ( 亲本酶) 、l i c m b c d a n 3 、 l i c m b c d a n 5 、l i c m b c d a n 7 和l i c m b c d a n 9 的残余酶活力分别为7 9 0 9 、 5 7 7 2 、5 9 8 6 、3 7 1 l 和1 1 9 0 。l i c m b c n 1 3 的耐稳定性下降较大，耐热 温度仅为6 0 ，6 0 处理1 0 m i n 的残余酶活力为6 4 5 1 。l i c m b c a n l l 和 i c m b c n 2 5 热稳定性最低，其耐热温度仅为5 0 。7 5 处理5 m i n ，l i c m b c d c 3 、 l i c m b c d a c 6 和l i c m b c d c 9 的残余酶活力分别为8 3 8 、2 4 1 7 和4 1 3 3 。 以上结果表明，无论是热纤维菌口一葡聚糖酶催化结构域的n 末端还是c 末端氨基 酸残基都对酶的热稳定性有一定贡献，这些氨基酸具有累加作用。第1 0 - 2 1 6 位氨 基酸残基的存在对酶热稳定性的维持必不可少。 ( 3 )以l i c m b c d 为材料，通过p c r 引物介导突变的方法获得了1 0 个 l i c m b c dn 端第1 0 或和第1 1 位氨基酸突变的酶，定名为l i c m b c d a l 0 e 、 l i c m b c d v l l p 、l i c m b - c d a l 0 e v l l p 、l i c m b c d a l 0 g 、l i c m b c d v ll a 、 l i e m b c d a l 0 g v l1 a、l i c m b - c d a l o v、l i c m b c d v l1 w、 l i c m b c d a l 0 w 1 1 w 。研究结果发现：与亲本酶( l i c m b c d ) 相比，这1 0 个 突变酶活力和热稳定性都有不同程度的降低。7 5 ( 2 处理1 0 m i n ，三个第1 0 位氨基 酸单突变酶l i c m b c d a l 0 e 、l c m b c d a l 0 g 和l i c m b 。c d a l 0 v 的残余活力分 别为2 3 4 8 、5 0 6 0 和8 4 6 1 ；三个第1 1 位氨基酸单突变酶l i c m b c d v l1 p 、 l i c m b c d v i i a 和6 l i c m b c d v l l w 的残余活力分别为1 2 8 5 、9 3 6 7 和 9 2 9 4 ；四个双突变酶l i c m b c d a l 0 e v l1 p 、l i c m b c d a l 0 e v l1 t 、 l i c m b - c d a l 0 g v l l a 和l c m b - c d a l 0 v v l l w 的双突变酶残余活力分别为 8 3 3 4 、9 5 0 0 、6 0 5 3 和0 。由于突变后这二个位点氨基酸的疏水性、体积 大小、亲水性等特性发生了变化，使蛋白质在该位点相应发生了空隙变大、氨基 酸相互间拥挤及疏水作用力降低等结构变化，最终导致酶热稳定性降低。以上结 果说明第1 0 和1 l 位氨基酸的特性对酶的热稳定具有重要的影响，而且1 0 位的丙 氨酸( a ) 和l l 位的缬氨酸( v ) 对热纤维梭菌d 葡聚糖酶的热稳定性而言是最 合适的氨基酸残基。 ( 4 ) 以芽孢杆菌p - 葡聚糖酶基因( b g ) 为材料，构建了8 个带有l i c m b ，c d 序列的芽孢杆菌杂台酶，定名为h - n 7 c 3 b 、h n 7 c 8 b 、h - n 1 0 c 3 b 、h - n 1 0 c 8 一b 、 h - n 1 6 c 3 一b 、h - n 1 6 c 8 - b 、h - n 1 0 4 c 3 一b 、h - n 1 0 4 c 8 - b ( 其中n 后的数字代表来 自l i c m b c d n 端的氨基酸数，c 后的数字代表来自l i c m b c d c 端的氨基酸数) 。 酶特性分析表明：除h - n 7 c 3 一b 热稳定性( 残余酶活8 ，7 7 ) 低于芽孢杆菌亲本 酶( 2 1 ，4 9 ) 外，其余杂合酶热稳定性均高于亲本酶( b g ) 。6 0 条件下处理 1 0 m i n ，h - n 7 c 3 b 、h - n 7 c 8 b 、h - n 1 0 c 3 b 、h n 1 0 c 8 b 、h n 1 6 c 3 b 和h n 1 6 c 8 b 残余酶活力分别为3 8 3 0 、2 4 0 0 、3 8 0 0 、4 4 3 3 和7 1 6 7 ，而亲本酶( b g ) 为2 1 4 9 、；h n 1 0 4 b 、h - n 1 0 4 c 3 b 和h - n 1 0 4 c 8 b 的残余酶活力分别为3 8 4 2 、 4 1 9 l 和7 4 1 7 。以上结果说明l i c m b c dn 末端7 个和c 端3 个氨基酸残基 对芽孢杆菌酶热稳定性的提高没有作用，而n 端1 6 d 及c 端2 1 0 e 和2 1 1 y 对酶 热稳定性的提高有较大的作用。另外，l i c m b c dn 端1 6 个氨基酸残基对芽孢杆 菌酶热稳定性的贡献与n 端1 0 4 个氨基酸残基相当，即1 7 1 0 4 位氨基酸序列对酶 热稳定性的贡献不大。h c n l 0 4 c 3 杂合酶的热稳定性稍高于芽孢杆菌酶，但还远 远低于l i c m b c d ，说明l i e m b c d 的热稳定性主要由其c 端9 7 个氨基酸残基 决定。 ( 5 ) 以h - n 1 0 4 c 8 - b 杂合酶基因为材料，构建和表达了5 个h - n 1 0 4 c 8 - b 的突变酶，分别为h n l 0 4 c 8 一m 1 9 7 - 2 0 2 ( s 1 9 7 _ r n l 9 9 d a 2 0 1 r n 2 0 2 t _ ) 、 h n l 0 4 c 8 - m 1 8 9 - 1 9 3 一( t 1 8 9 k _ k s l 9 3 e _ ) 、f i n l 0 4 c 8 - m 1 6 5 - 1 7 2 ( v 1 6 5 h 1 6 9 _ e t l 7 2 r ) 、 h n l 0 4 c 8 t 1 4 4 e和h n l 0 4 c 8 - y 1 2 4 w g l 2 8 e 。其中h n l 0 4 c 8 - m 1 8 9 1 9 3 f t l 8 9 k s l 9 3 e _ ) 和h n l 0 4 c 8 - m 1 6 5 1 7 2 ( v 1 6 5 _ _ t 1 6 9 e t l 7 2 r _ ) 2 个突变酶的热稳定性 明显高于亲本酶( i - i - n 1 0 4 c 8 - b ) ，耐热温度达7 0 - 7 5 c ，与亲本酶相比提高了 1 0 1 5 。分析这些氨基酶突变前后的结构变化，发现突变前后均位于蛋白质表面 的氨基酸对酶热稳定性影响较大，其中位于蛋白质表面的第1 6 9 和1 9 3 位的2 个 谷氨酸残基( e ) 是决定热纤维梭菌b 葡聚糖酶热稳定性的关键氨基酸。 本研究结果提示：( 1 ) 热纤维梭菌o 葡聚糖酶热稳定性与其c 末端尾巴无关， 而与其催化结构域有关；( 2 ) l i c m b c dn 末端和c 末端氮基酸残基都会影响酶 热稳定性，这些氨基酸残基对酶热稳定性的提高具有累加作用。第1 0 2 1 6 位氨基 酸残基的存在对酶热稳定性的维持必不可少；( 3 ) l i c m b c d 第1 0 和1 1 位氨基 酸残基的特性对酶热稳定性具有重要的影响，而且第1 0 位的丙氨酸( a ) 和1 1 位的缬氨酸( v ) 对热纤维梭菌d - 葡聚糖酶热稳定性而言是最合适的氨基酸残基： ( 4 ) l i c m b c d 的热稳定性主要由其c 端9 7 个氨基酸残基决定。( 5 ) 蛋白质表 面氨基酸的静电作用是影响l i c m b c d 热稳定性的主要作用力，其中1 9 3 e 和1 6 9 e 是决定热纤维梭菌b 一葡聚糖酶热稳定性的关键氨基酸。以上研究结果将为通过蛋 白质工程构建高活力、嗜热的b 一葡聚糖酶提供了扎实的理论基础和重要的方法 指导。 关键词：热纤维梭菌，b 一葡聚糖酶，热稳定，芽孢杆菌，突变酶，催化结构 域，n 术端，c 末端，关键氨基酸。 a b s t r a c t b - g l u c a n a s e ( 1 i c h e n a s e ，e c 3 - 2 1 7 3 ) i sam a j o rf e e de n z y m et h a th y d r o l y s e so n l y b e t a - 1 ，4 - l i n k a g e sa d j a c e n tt ob e t a 一1 ，3 一l i n k a g e s i np g l u c a n s ，s oi tc a r la l l e v i a t et h e a n t i n u t r i t i o n a le f f e c t m o s to fb g l u c a n a s e sa r ef r o mm i c r o o r g a n i s m s a m o n gt h e m ， c l o s t r i d i u mt h e r m o c e i l u ml i c h e n a s ef l i c b ) h a dh i g h e s tt h e r m o s t a b i l i t yw i t h8 0 o f t h e m o s t a b l et e m p e r a t u r e s ot h er e s e a r c hw a sc o n d u c t e dt os t u d yi t sm e c h a n i s mf o rt h e h i 卧t h e r m o s t a b i l i t y , t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n d r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h r e e c o n s t l a l c t sd e r i v e df r o ml i c h e n a s eg e n e ( 1 i c b ) o fc l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u mo b t a i n e db yp c rw e r ee x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l i , a n dt h e i rp r o d u c t s w e r ec h a r a c t e r i z e da n dc o m p a r e d t h e s ep r o d u c t sc o r r e s p o n d e dt ot h em a t u r e ( 1 i c m b ) a n dt w ot r u n c a t e dr l i c m b 2 3 8 3 0 5a n dl i c m b a 2 1 7 - 3 0 5 ) f o r m so f l i c h e n a s e s 1 i c m b w a sm a t u r ef o r mo fl i c h e n a s e ，c o m p o s e do f3 0 5a m i n oa c i d sw i t h o u ts i g n a lp e p t i d e l i c m b a 2 3 8 3 0 5l a c k e d6 8a m i n oa c i d sa tc a r b o x y l t e r m i n iw h i c hc o r r e s p o n d e dt ot h e d o c k e r i nd o m a i n ，a n dl i c m b a 2 1 7 - 3 0 5l a c k e dt h r - p r o b o x ( 1 i n k e ro f2 1a m i n oa c i d s ) a n dd o c k e r i nd o m a i n t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fl i c m b a 2 3 8 - 3 0 5a n dl i c m b a 2 1 7 3 0 5 w a s h i g h e rt h a nt h a to fl i c m bb y9 0 5 8 a n d3 6 6 5 t h et h e r m o s t a b i l i t yo f l i c m b a 2 3 8 - 3 0 5w a sl l i g h e rt h a nt h a to fl i c m ba n dl i c m b a 2 1 7 - 3 0 5 t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h ed o c k e f i nd o m a i no fl i c bh a dan e g a t i v er o l eo nt h e r m o s t a b i l i t y a n de n z y m a t i ca c t i v i t yo fl i c h e n a s e ，w h i l et h et h r - p r o - b o xh a dap o s i t i v er o l eo n t h e r m o s t a b f l i t y a n de n z y m a t i ca c t i v i t y t h ee f f e c to ft w or e g i o n so f f s e t ，s o l i c m b a 2 1 7 3 0 5h a ds i m i l a rt h ee n z y m a t i ca c t i v i t ya n dt h e r m o s t a b i l i t yt ol i c m b i t c a nb ec o n c l u d e dt h a tt h el i c m b a 2 3 8 - 3 0 5w i 也d o c k c r i nd o m a i nt r u n c a t e da n d t h i - p r o - b o xr e t a i n e dh a dm o r es p e c i f i ca c t i v i t ya n dt h e r m o s t a b i l i t yt h a np a r e n t e n z y m e ( l i c m b ) ，t h r - p r o b o x ( 1 i n k e r ) a n dd o c k e r i nd o m a i nw e r en o tn e c e s s a r yf o r e n z y m a t i ca c t i v i t y , a n dc a t a i y t i c d o m a i nc o n f c r r e dt h em o s to fa c t i v i t ya n d t h e r m o s t a b i l i t yt oc t h e r m o c e l l u ml i c h e n a s e ( 2 ) s e v e nn t e r m i n a lt r u n c a t e de n z y m e sa n dt h r e ec t e r m i n a lt r u n c a t e de n z y m e so f l i c m b c d ( c a t a l y t i cd o m a i no f m a t u r e l i c h e n a s ef r o mct h e r m o c e l l u m ) w e r e 6 c o n s t r u c t e d s e v e nn - t e r m i n a lt r u n c a t e de n z y m e sw e r ed e s i g n a t e dl i c m b c d & n 3 ， l i c m b c d a n 5 ，l i c m b c d & n 7 ，l i c m b - c d a n 9 ，l i c m b c d n 1 1 ，l i c m b c d a n l 3 a n dl i c m b c d n 2 5w h i c hw e r et r u n c a t e d3 ，5 ，7 ，9 ，1 1 ，1 3a n d2 5a m i n oa c i d sa t n - t e r m i n u so fl i c m b c d r e s p e c t i v e l y , w h i l et h r e ec - t e r m i n a lt r u n c a t e de n z y m e s 惴d e s i g n a t e dl i c m b - c d a c 3 ，l i c m b - c d a c 6a n dl i c m b c d a c 9w h i c hw e r e t n m e a t e d3 , 6a n d9a m i n oa c i d sa tc - t e r m i n u so fl i c m b - c d r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s s h o w e dt h a tc o m p a r e dw i t l lt h ep a r e n te n z y m e ( l i c m b c d ) t h e r m o s t a b i l i t yo f l i c m b c d n 3 ，l i e m b c d a n 5 ，l i e m b c d n 7a n dl i c m b - c d a n 9d e c r e a s e dt o s o m ee x t e n t ，b u tn o ts i g n i f i c a n t l y t h er e s i d u a la c t i v i t yo ft h e mw e r ea b o v e7 0 a f t e r i n c u b a t i o na t7 0 f o r1 0m i n ，a n dt h er e s i d u a l a c t i v i t y o fl i c m b c d ， l i e m b c d a n 3 ，l i c m b - c d a n 5 ，l i c m b c d n 7a n dl i e m b - c d n 9w e r e7 9 0 9 、 5 7 7 2 ，5 9 8 6 。3 7 1 1 a n d1 1 9 0 a r e ra t7 5 f o r1 0m i ni n c u b a t i o n l i c m b c d a n l 3e x h i b i t e dl e s st h e r r n o s t a b i l i t yr e t a i n i n g6 4 5 1 o fi t sa c t i v i t ya f t e r d u r i n gi n c u b a t i o na t6 0 cf o r1 0r a i n l i e m b - c d a n l 1a n dl i e m b - c d a n 2 5h a dt h e l e a s tt h e r m o s t a b i l i t yw h i c hw e r es t a b l eb e l o w5 0 。c t h er e s i d u a l a c t i v i t y o f l i c l 惦- c d c 3 ，l i c m b - c d a c 6a n dl i e m b - c d c 9w e r e8 1 3 8 ，2 4 1 7 a n d 4 1 3 3 d u r i n g5m i n i n c u b a t i o na t7 5 c r e s p e c t i v e l y 1 1 l er e s u l t si m p l i e dt h a tw h e t h e r t h en - t e r m i n a lo rc - t e r m i n a ls e q u e n c eo fl i e m b c dp a r t i a l l yc o n t r i b u t e dt oi t s t h e r m o s t a b i l i t yw i t ha d d i t i v ee f f e c t a m o n gt h e m ，t h e1 0 2 1 6 恤a m i n oa c i d so f l i c m b c dw e r en e c e s s a r yf o ri t sk e e p i n gh i 曲t h e r m o s t a b i l i t y ( 3 ) t e nm u t a n t so fl i c m b - c dm u t a t e da t1 0 血o r 11 t hp o s i t i o nw e r ec o n s t r u c t e d t h e yw e r ed e s i g n a t e dl i c m b - c d a l 0 e l i c m b - c d v l l p , l i c m b - c d a l 0 e v l l p , l i c m b c d a l o gl i c m b - c d v l l a ，l i c m b c d a l 0 g v l l a ，l i c m b - c d a l 0 v , l i c m b - c d v l l w , l i c m b c d a l o v v l l w t h er e s u l t ss h o w e dt e nm u t a n t sa l lh a dl e s s t h e r m o s t a b i l i t y t h a nt h ep a r e n te n z y m e ( l i c m b - c 趴t h er e s i d u a l a c t i v i t y o f 上f c m b - c d a l 0 e ，l i c m b c d a l o ga n dl i c m b - c d a l 0 vw e r e2 3 4 8 ，5 0 6 0 a n d 8 4 6 1 a f t e ri n c u b a t i o na t7 5 f o r1 0 m i n , t h er e s i d u a la c t i v i t yo f l i c m b c d v l l p ， l i c m b - c d v l l aa n d6 工f c m b - c d v i1 ww e r e1 2 8 5 ，9 3 6 7 a n d9 2 9 4 ：t h e r e s i d u a l a c t i v i t y o f三f c m b - c d a l 0 e v l1 p ，l i c m b c d a l 0 e v l1 t ， 7 船m b - c d a l 0 g v l1 aa n d 三i c m b - c d a l 0 v v l1 ww e r e8 3 3 4 ，9 5 0 0 ，6 0 5 3 a n do r e s p e c t i v e l y t h el o s so ft h e r m o s t a b i l i t yw a sr e s u l t e df r o mt h es t r u c t u r ec h a n g e ( s u c ha sm o r ec a v i t y ，b u m p sb e t w e e na m i n oa c i d sa n d l e s sh y d r o p h o b i l i t y ) ，w h i c hw a s 口a u s e db yt h ec h a n g eo fp r o p e r t i e so fm u t a t e da n dm u t a t ea m i n oa c i d s t h er e s u l t s i m p l i e dt h a tt h ep r o p e r t i e so ft h ea m i n oa c i d sa t1 0 山a n d1 1 mo fl i c m b c dc o u l d a f f e c ti t st h e r m o s t a b i l i t y n ea l aa t1 0 出a n dv a la t1 1 ma r em o r es u i t a b l ef o rh i g h e r t h e r m o s t a b i l i t yo f l i e m b - c d ( 4 ) e i g h th y b r i de n z y m e sd e r i v e df r o ml i c m b c da n db a c i l l u sp - g l u c a n a s ew e r e c o n s t r u c t e d t h e yw e r ed e s i g n a t e dh - n 7 c 3 - b ，h - n 7 c 8 一b ，h - n 1 0 c 3 - b ，h - n 1 0 c 8 b ， h - i 4 1 6 c 3 - b ，h - n 1 6 c g - 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