（农药学专业论文）木霉菌孢子生产工艺研究及设备设计.pdf

沈阳农业丈学硕士学位论文 摘要 本研究采用正交设计试验方法对木霉发酵工艺条件进行了系统的研 究，确定最佳固态发酵培养基配方：用a u t oc a d 2 0 0 2 和s o l i dw o r k s 2 0 0 1 p l u s 软件设计连续式固态发酵罐；为了将培养基中的孢子分离出来，首次 设计并制造了“孢子分离器”，该设备已达到中试水平，分离效率达到9 0 以上，可直接投入使用：为节约能源，特设计了节能型木霉制剂生产工艺 流程，其中首次提出太阳能发酵室的概念。 木霉菌( t r i c h o d e r m av i r i d e )由田间分离筛选出来，该菌种具有防治 多种土传病害的功效。经过多年的探索，现已制成“健根宝”粉剂，通过 灌根施药达到使作物抗病增产的效果，其使用范围已辐射整个辽宁省。获 得了很好的经济效益、社会效益。另外，木霉对入畜无毒害作用，也是新 时期的绿色环保型生物农药。 本研究改良木霉发酵工艺条件，采用固态发酵，通过正交试验设计方 法确定最大木霉孢子产量。同时也运用均匀设计试验方法，用以减少试验 次数，提高试验效率。在试验过程中，涉及到的因素包括：p h 、温度、湿 度、培养基厚度、水分含量、基质组分等。以木霉菌t r 8 作为发酵初始菌 株，以农副产品( 麸皮、稻壳、稻草粉、玉米粉、豆饼粉、酒糟) 作为固 态发酵培养基原料，经过筛选，得到最佳原料组合及配比为麸皮：稻草： 稻壳：玉米粉= 6 ：1 ：l ：1 2 ，加水为总质量的1 5 倍。其产孢量达到i0 9 级。 试验过程中逐渐放大发酵规模，从三角瓶放大到托盘再到大托盘，大 量木霉孢子附着在固态培养基颗粒的表面。人工分离具有危险性大、效率 低、不彻底等的特点，为了克服上述缺点设计“木霉孢子分离器”，利用气 体作为分散介质，在离心场中将木霉孢子分离出来。该设备为间歇式操作， 进料排渣方便，单批次进料1 5 k g ，经过l o m i n 循环分离效率可达9 0 ，己 摘要 达到中试水平，使用此设备，可以大大降低劳动强度，改善工作环境。 为了进一步扩大发酵规模，实现工业化生产，使单批次处理发酵原料 量达到吨级，根据木霉菌发酵的特点，特设计“多层浅盘式连续化发酵罐”， 该罐具有：自动进排料、原位灭菌、c i p ( 原位清洗) 、自动温控、湿控等 功能；此设备可实现动态进排料，静态发酵( 不破坏菌丝生长) ，以流动无 菌空气作为载体，对发酵系统输送氧气、水分，以及调节温度。该灌不仅 适用于木霉菌的固态发酵，而且还适用于其他类型真菌及细菌的固态发酵， 因为该设备的生产过程实现了连续化、自动化，所以可用做工业化生产， 进行推广。 当发酵产物中具备足够量木霉孢子粉后，将孢子粉与填料助剂按一定 比例混配，可配置成粉剂和可湿粉剂。其中可湿性粉剂原料配比为一木霉 粉：3 0 ；白碳黑：2 0 ；n n o ( 萘磺酸钠甲醛缩合物) ：3 ；十二烷基苯 磺酸钠：1 ；m f ( 烷甲基黄酸甲醛缩合物钠盐) ：5 ；最后以轻质碳酸钙 补齐至1 0 0 。该制剂悬浮率可达8 6 以上。 由于在生产工程中，木霉发酵及干燥需要大量的热能，因此采用太阳 能做热源( 常规能源为辅) 设计节能型木霉发酵室和节能型木霉孢子干燥 室，通过集热器、储热池、工作室、风机等装置使太阳能集中并转化为热 能，该设备即使是在北方的冬天，也可以借助太阳光进行孢子的生产。 根据剂型特征，设计生物农药木霉可湿性粉剂生产工艺流程。在可湿 性粉剂剂型加工过程中，采用填料助剂预先超微粉碎，然后与木霉粉混合 的工艺，以保证木霉孢子的完整性。 关键词：木霉菌：固态发酵：设备：孢子分离器；工艺流程 沈阳农业大学硕士学位论文 前言 由于长期大量施用化学农药，不但污染环境。而且使作物产生抗药性。 高毒、难降解的农药在环境中驻留，进而随着食物链逐级污染，其最终的 受害者是人类。木霉菌( t r i c h o d e r ms p p ) 作为一种重要的植物病害生物防 治真菌，可防治土传病害：立枯病、白绢病、猝倒病；尤其对镰刀菌( f s a r i u m s o l a n i ) 引起的作物萎蔫、根腐病、茎腐病有特效。木霉菌防治病害的机制 有竞争作用、抗生作用、重寄生作用、诱导抗性和促生长作用。虽然木霉 孢子具有广谱的抑菌作用，但是它对人畜无毒或低毒，对环境具有良好的 兼容性，是一种高效的生物农药。 木霉菌通过发酵产生大量的孢子，将孢子与填料助刺以一定比例混合， 配置成可湿粉剂，可用于茎叶面喷洒。为扩大发酵规模，设计固态发酵罐， 并设计制造了孢子分离器，该分离器已达到中试水平，而且可应用于连续 化生产。前期准备工作完成以后，进行生物农药木霉可湿粉刺生产工艺设 计，该设计以木霉孢子粉为原药，并添加助剂填料，后期实现工业化生产。 目前生物农药在农药市场占有的分额还比较小，其产品标准的制定还有待 于完善，而且农民对其功效的认识程度也有待于提高，但是随着人们生活 水平的不断提高和绿色农业的发展，健康指数越来越受到人们的重视，生 物农药的推广使用将具有广阔的发展前景。 第一章木霉菌生物防治研究进展 第一章木霉菌防治植物病害及发酵工艺研究进展 一、木霉菌研究的历史 目霉的研究最早可追溯到2 0 0 多年前，p e r s o o n ( 1 7 9 4 ) 建立了木霉属 ( t r i c h o d e r m ap e r s ) 。现己证明p e r s o o n 当时所研究的4 个真菌只有 t r i c h o d e r m av i r i d ep e t s 属于木霉，而其余3 个真菌分别是：s p o r o t c h u m a u r e u mp e r se f r , x y l o h y p h an i g r e s c e n s ( p e r s e x f r ) m a s o n , t c h o t h e c i u mr o s e u , m ( p e r s ) l i n k s f g r a y 。p e r s o o n 当时并没有认识到木霉的有性型。直到半 个多世纪以后，t r i c h o d e r m av i r i d e 和其有性型h y p o c r e ar u f a 的关系才由 t u l a s n c ( 1 8 6 0 ) 阐明。1 9 0 2 年，木霉与其有性型的关系才“被完全接受”。 h a r z ( 1 8 7 1 ) 提出了第一个精确的木霉属的定界，强调微观特征，特 别是瓶梗( p h i a l i d e ) 在木霉属定界上的重要性。 o u d e m a n s 和k o n g i n g ( 1 9 0 2 ) 最早在土壤中分离出了几种木霉。为表 彰其贡献，特以他们的名字命名了一种重要的土壤微生物- - t r i c h o d e r m a k o n i n g ( 康宁木霉) 。随着世界各地对土壤中木霉的报道日益增多，木霉便 成了土壤微生物的主要成员。 b i s b y ( 1 9 3 9 ) 在研究了大量本霉菌株之后，认为木霉形态豹差异是由 于培养条件的变化造成的，且这些差异不稳定也不一致，因而他认为木霉 属只有一种绿色木霉( t v i r i d e ) ，所有孢子为绿色的菌株都是绿色木霉。他 肯定了t v i r i d e 与h y p o e r e a r u f a ( p e r s ) f r ( 红棕肉座茵) 之间在遗传学 上的联系，提出h r u f a 的分生孢子时期是一种典型的木霉。1 9 5 7 年d i n g l e y 对此提出不同观点和更多的补充，他认为肉座菌属( h y p o c t r e af r ) 的9 种 肉座菌的分生孢子状态都是木霉。 总的来说，在p e r s o o n 之后约一个半世纪里，木霉只是一些真菌分类学 者偶尔涉及的问题，并没有引起人们的特别关注( 张初龙，2 0 0 0 ) 。这种状 沈阳农业大学硕士学位论文 况一直持续到第二次世界大战。从二战到上世纪6 0 年代后期的2 0 多年间， 由于认识到木霉菌具有非凡的纤维素分解本领，美国以及欧洲和亚洲的许 多家的实验室开始对木霉进行深入的研究。这是木霉研究的第一个黄金时 期。 w e b s t e r 及r i a i 等人( 1 9 6 4 ) 通过更严格的实验手段，证明了h r u f a 等5 种肉座菌的分生孢子阶段分别是5 种完全不同的、有明显区别的木霉。 也是在上世纪6 0 年代，i u 筋和w e b s t e r 开始了木霉菌的分类研究，发表了 一系列的研究论文，并集其大成于“ar e w v i s i o no f t h eg e n u s t r i c h o d e r m a ”， 提出了第一个木霉属的分类系统。r i f a i 将木霉属分为9 个集合种( s p e c i e s a g g r e g a t e s ) ，集合种概念的提出受到了许多研究者的欢迎，使人们第一次可 以比较准确地认识木霉“种”。研究者们感兴趣的并不是分类本身，也不是 纤维素的降解，而是某些木霉种( 多数是t h a r z i a n u m 和t v i r i d e ) 有拮 抗植物病原真菌生长的本领。至今，将木霉的这种拮抗作用应用于生防实 践仍然是各国科学家深入研究的重要课题之一。这是木霉研究的第二个黄 金时期。 除了r i f a i 和w e b s t e r 以外，d i n g l c y ( 1 9 5 7 ) 通过子囊孢子培养的方法 研究了木霉及其有性型的联系。而在这个方面，以日本学者d o i ( 1 9 6 0 ) 的 研究最具特色，他研究了木霉及其有性型，发表了一系列的研究论文。 s a m u e l 和同事进一步研究了有性型的分类。除了h y p o c r e a 以外，p o d o s t r o m a p 。k a r s i 也对木霉的有性型做了相关研究。1 9 6 9 年，英联邦真菌研究所 m a r i f a i 较系统地收集了世界各地木霉研究资料及各地真菌学家收集的和 自己分离培养的木霉菌株，并通过培养、镜检，发表了对木霉种属的订 正一文，较系统地阐述了木霉种类鉴别的依据和9 种木霉的形态及培养 特征。 上世纪7 0 年代末至8 0 年代初，日本真菌学者小松光雄博士研究了发 第一章木霉菌生物防治研究进展 生在香菇木段上的肉座菌，证实这些肉座菌的分生孢子阶段分别是各种不 同的木霉，这一研究基本上揭示了香菇木霉病的有性及无性时期的整个生 活史，进一步肯定了它们的遗传学关系，他还研究了木霉侵害香菇菌丝的 机制，该项研究在国内外曾引起很大震动。 上世纪8 0 年代中后期到9 0 年代初b i s s e t t 提出了一个新的分类系统。 并在其分类系统中引进了“组”的概念，他将木霉属分成5 个组，组下设 若干个种。g a m s 和b i s s e t t ( 1 9 9 9 ) 接受了4 个组，取消了s a t u m i s p o r u m 组。 上世纪9 0 年代初，国际上对木霉分类的研究进展到分子生物学水平。 英国女皇大学动植物保护生物工程中心于1 9 9 2 年正式立项研究，从不同种 的木霉菌丝中提取d n a ，用特定的酶把它们分离为许多小的片断；从遗传 学的理论看，不论菌株来自哪里同一种木霉总是产生出特定大小的d n a 片断，只要将大量不同的d n a 片断加以比较，就能确定它们是否是相同的 种类。 国内研究木霉的历史也很悠久，但都是从土壤微生物和普通真菌学的 角度来认识和研究的。早在上世纪3 0 4 0 年代，就已报道了1 0 多种木霉， 而对危害食用菌的木霉，不论是种类还是危害情况及受害菇的种类、防治 方法等，正式报道既少又晚，这与食用菌的发展史密切相关。 二、木霉菌的生防机制 木霉对植物病原真菌的拮抗作用包含多种机制，一般认为有竞争作用、 重寄生作用及抗生作用。另外，h a r m a n 建议，在木霉的生防机制中可能还 包括：在逆境中，如干旱、养分的胁迫下，通过加强根系和植株的发育， 提高耐性：可诱导植物对病菌的抗性：增加土壤中营养成分的溶解性，并 促进其吸收；使病原菌的酶钝化( 张初龙，2 0 0 0 ) 。 竞争作用：主要为对生存空间和营养的竞争，木霉生命力强、生长快， 沈阳农业大学硕士学位论文 能迅速地占领空间，吸收营养。 重寄生作用：重寄生现象是指对病原菌的识别、接触、缠绕、穿透和 寄生一系列连续步骤的复杂过程。在木霉与病原菌互作的过程中，寄主菌 丝分泌一些物质使木霉趋向寄主真菌生长，一旦寄主被木霉寄生物所识别， 就会建立寄生关系。 抗生作用：木霉在代谢过程中可以产生拮抗性化学物质来毒害植物病 原真菌，这些物质包括抗生素和一些酶类。许多木霉菌株产生挥发性或非 挥发性的抗菌素类物质，如木霉素( t r i e h o d e r r n i n ) 、胶霉素( g l i o t o x i n ) 、绿 木霉素( v i r i d i n ) 、抗菌脓( p e p f i d ea n t i b i o t i c ) 等。 诱导抗性：木霉菌的木聚糖酶或其它的激发子能够诱导植物的抗病性。 促生长性：木霉还可以明显地促进植物的生长。 拮抗木霉菌的生防效果已在很多应用实验中得到证实，利用木霉防治 由立枯丝核菌、腐霉菌、齐整小核菌、镰刀菌等引起的棉花、杜仲、人参、 三七等的幼苗立枯病，以及对茉莉、花生和辣椒的白绢病、番茄的猝倒病 等，在各种小型试验中已获得较好防效，国内外许多学者还将其用于防治 水稻纹枯病。此外，木霉还可以用于叶面、花器和果实的保护，在葡萄园 于始花期至收获期喷施绿色木霉的孢子液，可以降低灰霉引起的藤蔓腐烂 以及果实在储藏期的腐烂，有效地防治灰霉病。在杨树烂皮病的生防研究 中发现，木霉对烂皮病菌也有较好的防效。 现代生物技术日新月异，为生物防治提供了新的契机，为生防因子木 霉提供了更加广阔的发展空间；利用基因工程技术和原生质体融合等基因 改良方法筛选耐化学农药、耐低温干燥及高效表达水解酶活性的生防工程 菌株；寻找拮抗本霉菌的适宜发酵培养条件，控制次生代谢水平，提高制 剂抗生素的产量，增强防治效果：改良田间施药环境条件，促进拮抗木霉 菌群体的生存能力和繁殖能力。 第一章木霉菌生物防治研究进展 目前生产上常用的木霉菌荆多为它的孢子制剂，将木霉发酵制成的孢 子制剂进行种子包衣或土壤处理，可以有效地防治苗期病害。 三、发酵的历史以及过程优化的应用 发酵( f e r m e n t a t i o n ) 这个英文最初是由拉丁语f e r v e r 即“发泡”“沸 涌”派生而来的，指酵母作用于果汁或谷物，进行酒精发酵产生二氧化碳 ( c 0 2 ) 的现象。在酒类酿造过程中人们仍以发泡现象作为直观观察发酵的 指标。巴斯德讨论了酵母酒精发酵的生理意义，认为发酵是酵母在无氧状 态下呼吸的过程，即无氧呼吸，并阐明了它和呼吸一样是生物获得能量的 一种方式。从生物学观点来看，发酵是有机化合物进行无氧代谢释放能量 的过程。从糖进行分解代谢是产生还原型n a d h ( 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 的过程，还原型n a d h 一定要被氧化生成氧化型n a d ，这样代谢才能继续 进行。在有氧条件下，n a d h 被氧化是通过细胞色素系统进行电子转移来 实现的，通入的氧是作为末端电子的受体；在无氧条件下，还原型n a d h 被氧化是与有机物被还原相偶联的，结果产生分解代谢途径中间产物或某 些分支代谢途径的产物。然而，从更严格的生化意义上来说，发酵是供能 氧化还原反应，有机物( 代谢中间体) 起着供氧体和受氧体的两方面的作 用，既是电子的供体，也是电子的受体。 发酵的历史分为以下几个阶段： ( 一) 天然发酵阶段 从史前到1 9 世纪，人类在知其然而不知其所以然的情况下，即不了解 发酵本质之前，就利用发酵现象制造各种饮料酒和其他食品。3 0 0 0 年前中 国的医师们就知道使用生长在豆腐上的霉菌治疗皮肤病。直到中世纪，人 们不断地积极努力地改进酒类、面包、啤酒、干酪等的风味及品质，但对 这种“发酵”本质直到1 9 世纪末仍是一知半解，因此当时完全靠经验而进 沈阳农业大学硕士学位论文 行的作坊式的生产，时常被杂菌污染所困扰。此时代称为天然发酵时代。 ( 二) 纯培养技术的建立 荷兰博物学家h n t h r yv a nl e e w e n h o c k ( 1 6 8 0 ) 发明了显微镜( 放大 2 7 0 倍) ，人类历史上第一次看到了大量活动的微生物。1 9 世纪中叶，法国 科学家l o u i s p a s t e u r 以著名的p a s t e u r 实验证明了发酵原理，指出发酵现象 是微生物进行的化学活动。b r e f e l d ( 1 8 7 2 ) 创造了霉菌纯种培养法。1 8 8 1 年德国科学家r o b e r t k o c h 完成了细菌纯培养技术：1 8 7 8 年丹麦的h a n s e n 建立了啤酒酵母的纯培养方法，从而确立了单种微生物的分离和纯培养技 术，使发酵技术从天然发酵转变为纯培养发酵。因此，人类开始了人为地 控制微生物发酵过程，使发酵技术得到巨大的改良，提高了产品的稳定性。 ( 三) 通气搅拌技术的建立 英国人a f l e m i n g ( 1 9 2 9 ) 发现青霉素，英美两国合作对青霉素生产进 一步地研究和开发，联合国将青霉素作为医治战伤的药物而大力推进青霉 素工业化生产的研究，获得成功。青霉素发酵的成功，在发酵史上写下了 崭新的一页，同时也给发酵技术带来了两大功绩：开拓了以青霉素为先锋 的庞大的抗生素发酵工业；建立了深层培养法( s u b m e r g e dc u l t u r e ) ，把通 气技术引入发酵工业。它使需氧的发酵从此走上大规模工业化生产途径， 通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业最主要的生产方式。 ( 四) 代谢控制的发酵技术 1 9 5 0 1 9 6 0 年，随着基础生物科学即生物化学、酶化学、微生物遗传学 等的飞速发展，再加上新型分析方法和分离方法的应用，发酵工业也有了 显著的进步。其一是采用微生物进行甾体化合物的转化，其二是从谷氨酸 和赖氨酸发酵生产成功为契机的代谢控制发酵技术的出现。前者是以美国 为中心的，采用微生物的生化反应，对甾体化合物转换付肾上腺皮激素、 第一章术霉茁生物防治研究进展 性激素等技术，进行非常广泛的研究。结果几个甾体化合物系列的激素投 入工业生产。其技术特点是将对微生物具有高度专一性的酶反应作为合成 反应的一部分加以利用，也给今天的酶制剂利用工业以极大的促进。后者 是自1 9 5 6 年由日本木下祝郎发明谷氨酸发酵技术开始，而逐渐发展的，至 今已成为发酵生产的一种基本思路和主要技术手法。代谢控制发酵技术是 应用动态生物化学的知识和遗传的理论选育微生物突变株，从d n a 分子水 平上，控制微生物的代谢途径，进行最合理的代谢，积累大量有用发酵产 物的技术。此技术不仅在一系列的氨基酸以及核苷酸物质的发酵生产中得 到应用，而且在抗生素等次级代谢产物的发酵中也得到广泛应用。 ( 五) 开拓发酵原料时期 1 9 6 0 一1 9 7 0 年这段对间是代谢控制发酵技术广泛应用的鼎盛时期，几乎 所有的氨基酸和核苷酸物质都可以采用发酵方法生产。粮食问题是未来全 球性的主要问题之一，为了扩大未来粮食、饲料的来源，开展了发酵蛋白 ( 单细胞蛋白) 的研究和生产，为世界各国所重视。目前已确认采用发酵 法生产单细胞蛋白是粮食工业化生产的最佳途径。尽管以正烷烃为原料生 产蛋白的安全性有待深入研究，但采用甲醇、醋酸、甲烷、氢气等原料也 可以生产单细胞蛋白。发酵原料不仅能制造发酵蛋白，还能够从这些原料 发酵生产各种发酵产品。 ( 六) 基因工程阶段 1 9 7 0 年以来，随着基础生物科学的日益发展，以及边缘科学技术的发 展，使发酵工业更加五彩缤纷。尤其进入8 0 年代以来，随着世界生物技术 的发展，发酵技术又有了突飞猛进的进步。例如：在微生物育种上，应用 分子生物学和分子遗传学的方法，人为地将任意生物特定有用的遗传基因 组合到特定的微生物的基因中去，在分予水平上选育新的有用微生物，从 0 沈阳农业大学硕士学位论文 而达到定向改变生物状况与性能，创造新物种，使发酵工业能够生产自然 昴微生物所不能合成的产物，使发酵工业发生了革命性的变化。又如固定 化酶和固定化细胞利用技术的大发展。另外，从省力、节能，有利于环境 保护的需要出发，进行新型反应器的研究和设计，对特殊环境微生物的研 究，动植物组织培养技术的研究，都将使传统的发酵工业向综合的生物技 术工业发展，进而成为现代生物技术的重要组成部分。 ( 七) 发酵优化的研究进展 2 0 世纪4 0 年代初抗生素工业的兴起，标志着发酵工业进入了一个新的 阶段，从此发酵工业在产品更新、新设备和新技术的应用都达到了前所未 有的水平，这也为发酵优化提供了物质基础。一门反映生物和化工相互交 叉的学科一生化工程也随之诞生并飞速发展。h a s t i n g ( 1 9 5 4 ) 指出，生化 工程要解决十大问题：深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容 器、冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害。2 0 世纪6 0 年代中期，生 化工程的研究人员在发酵及与之相关的管路设计、操作中推行了无菌的概 念，建立了一整套无菌操作技术。1 9 6 4 年a i b a 等人认为通气搅拌与放大是 生化工程学科的核心，其中放大是生化工程的焦点。由于通气搅拌尤其是 发酵罐放大问题不仅与发酵罐的特性、液体的流态有关，而且与微生物的 代谢反应紧密相连。其后，生化工程的研究重点逐渐从对过程的物理特性 研究过度到对微生物反应进行定量研究上来。2 0 世纪5 0 年代中后期以来， 有关微生物反应动力学的研究已经逐步发展成为生化工程的一个重要分支 一生物反应工程( b i o r e a c t i o ne n g i n e e r i n g ) 。这一名词最早于1 9 7 1 年被英国 的阿特金森采用，1 9 7 4 年在他编著的生物反应器一书中指出，生物反 应工程的目的是提供合适的能描述微生物体系的动力学表达式，并通过实 验求出半经验常数。1 9 7 9 年日本学者山根恒夫编著了生物反应工程一 书，认为生物反应工程是- - i q 以速度为基础，研究酶反应、微生物反应以 第一章木霉菌生物防治研究进展 及废水处理过程的合理设计、操作和控制的工程学。1 9 8 5 年德国学者卡 尔许格尔认为生物反应工程应包括两个方面的内容：一是宏观动力学，它 涉及生物、化学物理之间的相互关系：二是生物反应器工程，它主要涉及 反应器本身，特别是不同反应器对生物化学和物理过程的影响。 目前一般认为生物反应工程是一门以生物反应动力学为基础，研究生 物反应过程优化和控制以及生物反应器的设计、放大与操作的科学。生物 反应工程的研究主要采用化学动力学、传递过程原理、设备工程学、过程 动态学及最优化原理等化学工程原理，也涉及到生物化学、微生物学、和 遗传学等许多学科理论，因此是一门综合的边缘学科。它的核心是生物反 应过程的数量化处理和动力学模型的建立实现发酵过程优化则是生物反 应工程的研究目标。 ( 八) 发酵优化研究的内容 发酵过程最主要的特点就是有微生物的参与，微生物作为有生命的一 种物质，其行为比化学催化剂更难控制，因而导致某些发酵参数难以检测， 其可控性也相应的困难。因此，如何把发酵过程模型化的概念和一些微生 物生理学的基本问题结合起来已经成为生化工程学者在进行发酵过程优化 研究时面临的主要问题之一。 发酵过程通常在一个特定的反应器中进行，由于微生物反应是自身催 化反应，其自身也是反应器，所有耍从细胞这个微反应器中出来的物质都 必须通过细胞和环境之间的边界面，使得所有在细胞体内( 生物相) 发生 的反应都与环境状况( 非生物相) 密切联系在一起。实际的生物反应体系 是个非常复杂的= - n 系统，即气相、液相、固相的混合体，要对如此复杂 的系统进行优化研究，必须做大量的假设使问题得以简化。因为有关生物 反应的单个步骤、进出细胞物质的传递以及反应器内的混合等问题的研究 已经相当成熟，如果能通过适当的假设使复杂的反应过程简化至能够进行 沈阳农业大学硕士学位论文 定量讨论的程度，一般来说就能够实现发酵过程的优化。 发酵过程优化主要设计以下四个方面的研究： 1 细胞生长过程 了解微生物的生理特性和胞内的生化反应是研究反应动力学和发酵过 程优化的前提基础，研究细胞的生长反应不仅要清楚地了解微生物从非生 物培养基摄取的营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向， 还要确定环境条件下代谢产物的分布。 2 微生物反应的化学剂量 理论上，根据质量守恒定律，所投入的原料的质量及元素种类都可以 在生物反应器的排出物一菌体细胞、剩余底物以及代谢产物中找到。虽然 生化反应过程中在线( o nl i n e ) 检测还比较困难，但是运用基于化学剂量 关系的代谢通量分析方法，仍可提出该微生物代谢途径的可能改善方向， 为过程优化奠定基础。 3 生物反应动力学 生物反应动力学是发酵过程优化研究的核心内容，主要研究反应速率 及影响因素。发酵过程的反应动力学指微生物反应的本征动力学或微观动 力学，即在没有反应器结构、形式及传递过程等工程因素影响时，微生物 固有的反应速率。除了反应本身的性质外，该反应速率只与反应组分的浓 度、温度及溶剂性质有关。在一定反应器内检测到的反应速率即总反应速 率及其影响因素，属于宏观动力学研究范畴。根据宏观动力学及其对反应 器空间和时间的积分结果，可推算达到预计反应程度所需的反应时间和反 应器的容积，从而进行反应器的设计。建立动力学的模型就是为了模拟实 验过程，对适用性强的模型，还可以推测待测数据，进而确定最佳生产工 艺条件。 4 生物反应器工程 实验室阶段的产品必须经过放大才能实现大规模的发酵生产。但是， 第一章木霉菌生物防治研究进展 反应器的简单放大与实际生产有着巨大的差异。从放大过程来说，主要分 为两个基本问题：其一，是发酵条件的研究和设计，实质上是发酵过程宏 观动力学的问题，涉及生物、物理、化学之间的关系：其二，是设计满足 这些过程条件的反应器，指的是反应器工程水平的传递和混合问题，主要 涉及反应器本身，特别是不同的生物反应器对生物化学和物理过程的影响。 从研究的对象看，两个问题交叉在一起成为一个复杂系统，在生物反应动 力学的研究基础上，以化学工程为专业背景引进了一系列的研究方法：包 括因次分析法、经验法则法、时间常数法、以及综合机理的数学模拟法等 放大方法。例如：结合相似原理及因次分析法的经验放大，提出了单位体 积功率( p v 。) 相等、氧传递系数相等、剪切速率相等或混合时间相等的 原则，包括生物反应器及参数的检测与控制，生物反应器的形式、结构、 操作方式、物料的流动与混合状况、传递过程特征等是影响微生物反应宏 观动力学的重要因素，在工程设计中，化学剂量式、微生物反应和传递现 象都是需要解决的问题。参数检测与控制是发酵过程优化的最基本手段， 只有及时检测发酵状态参数，才能了解发酵的情况，进行优化。 ( 九) 发酵过程优化的应用状况 发酵过程参数具有时变性、多样性、偶合性和不确定性。在建立数学 模型的过程中，以自动控制专业为背景引进一系列现代控制理论，如r a n i 等综述了生物反应器的控制过程，l e e 等( 1 9 9 7 ) 综述了分批发酵过程的控 制，其中有系统辨识、动态优化、自适应控制、专家系统、模糊控制、神 经元网络、直到各种混沌现象的研究，以实现过程的优化。 四、木霉发酵及过程优化 国内外学者对木霉发酵进行了广泛的研究，王德培，刘茨等( 2 0 0 2 ) 对里氏木霉和酵母菌混合发酵玉米秸杆提高其粗蛋白的含量的研究，表明 沈阳农业大学硕士学位论文 其发酵最优工艺条件：以尿素作为氮源，里氏木霉接种2 4 h 后接种假丝酵 母，接种量比例为1 ：4 ( 酵母：里氏木霉) 。常志州。宁运旺等( 1 9 9 3 ) 利 用木霉发酵改善稻草饲用价值，研究发现p h 对发酵影响最大，而发酵反过 来也对p h 产生影响。刘梅，徐同( 2 0 0 0 ) 对木霉的营养生长及发酵条件进 行了研究，结果表明：大部分木霉对营养的需求并不十分严格，可以分解 利用纤维素、半纤维素、几丁质等多种多聚物作为其生长的碳源物质，也 可以利用多种简单的和复杂的氮源化合物生长。为了应用木霉防治真菌病 害，摸索了各种培养条件、以求在低成本的前提下获得高产量的培养产物。 其中包括应用糖蜜、麦麸、植物秸扦、虫草头孢废液和玉米粉等进行的固 体培养、液体培养和固液两相培养，为大规模工业化生产奠定了一定的基 础。孙玉梅，王培患等( 2 0 0 1 ) 研究了利用啤酒麦糟培养木霉生产单细胞 蛋白的条件，适宜培养条件为：在麦稽中加入0 。5 ( n h 4 ) ：s 0 4 和0 2 的c a c l 2 ，在3 0 c 恒温培养4 5 天，在此条件下的培养物粗蛋白含量可达 2 9 ( 干基) 以上。 王芊( 2 0 0 2 ) 利用术霉菌研究孢子萌发条件表明，当木霉所利用碳源 为蜜二糖，氮源为蛋白胨时的孢子萌发率最高；2 5 3 0 c 为最适温度；光照 对萌发率影响不大；同时还阐述了碳氮源对菌丝生长的影响。赵蕾( 1 9 9 9 ) 使用液固两相法制备木霉菌高孢粉，该研究利用两种农副产品作为固态发 酵基质，其产孢量达到6 0 0 亿克。秦芸，叶华智( 2 0 0 2 ) 对木霉产生厚垣 孢子的因素进行研究，结果表明，以啥瑞木霉为培养菌株，在g o r o d k o w a 培养基中，控制温度3 0 ，p h 为6 0 ，保持黑暗状态，所产生的厚垣孢子 量最大。 本研究目的是在有限的基质中，获得尽可能多的孢子量，以达到生产生 物制剂的要求。然而，在农业生产中，考虑实际情况，要求孢子产量大、 成本低、价格便宜。因此木霉在发酵过程中，所利用的培养基( 原材料) 第一章木霉菌生物防治研究进展 要求来源广泛、价格低廉、无污染、易于处理和控制等。 所利用的材料一般为农副产品，包括米糠、麸皮、稻草粉、秸杆粉、玉 米粉等。所采用的发酵方式为固态发酵，以利于产孢。虽然木霉在利用底 物的过程中，要产生纤维素酶将大分子物质分解为可利用的碳源、氮源， 在此基础上进行孢子生长，此过程需要牺牲一定的发酵底物及发酵时间， 但所用的是自然培养基，( 只加少量的微量元素) 比起合成培养基来说要经 济得多。 发酵过程本身也是矛盾统一的，纤维素酶的产生是不可避免的，它的 产生势必影响孢子数量，而分解纤维素得到的糖可以作为碳源供菌丝生长。 我们要做的就是：利用发酵过程优化理论，寻找适合的碳氮比、加水比、 以及微量元素的种类和比例，将产酶量控制在一定的范围内，使得孢子量 最大。这样既解决了原料中菌体可利用物质的供应问题，也实现了产孢最 大量的目的。 沈阳农业大学硕士学位论文 第二章木霉菌孢子固态发酵工艺条件研究 木霉菌( t r i c h o d e r m av i r i d it r - 8s t r a i n ) 菌丝在适宜的条件下快速生长， 占据营养及空间，分泌的抗生素具有抑制植物病害的功能，但菌丝不易保 存，用它制成的农药货架期短：其孢子为抗逆性休眠体，当环境适宜又可 萌发，因此可与助剂、填料混配成生物农药。通过正交试验设计方法，以 麸皮、稻壳、稻草、玉米粉等农副产品为原料，摸索木霉发酵工艺条件， 结果表明固体培养基原料适宜配比为一麸皮：稻壳：稻草：玉米粉= 6 ：1 ： 1 ：1 ，2 ，其中水的质量为混合固体培养基的1 5 倍。并对比了固液两种发酵 方式的产孢效果。 一、材料与方法 ( 一) 供试菌株 绿色木霉r t - 8 ，由沈阳农业大学植物保护学院农药系提供。 ( 二) 培养基制备 1 p d a 培养基( g l ) 马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂1 8 9 。1 2 1 灭菌3 0 m i n ，备用。 2 液体培养基( g l ) 玉米粉2 0 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 7 5 9 ，m n s 0 4 h 2 0 0 , 0 0 2 5 9 ，z n s 0 40 0 0 2 9 。n a n 0 3 ，k h 2 p 0 4 ，c a c l 2 ，( n h 4 ) 2 s 0 4 ，葡萄 糖，脲 c o ( n h 2 ) 2 】，p h5 - 6 。 3 固体发酵培养基 麸皮，稻草粉，稻壳，玉米粉，脲和水。 ( 三) 培养方法 1 试验步骤： l7 第二章木霉菌孢子固态发酵工艺条件研究 保藏菌种活化 固体发酵培养基灭菌冷却发酵稀释后计数 2 菌种活化 将p d a 培养基加热溶化后倒入灭菌的培养皿中，冷却至室温。在超净工 作台下接4 c 保藏的绿色木霉菌种。培养温度2 80 c ，时间7 2 h 。 3 液体种子 将1 5 0 m l 液体培养基倒入2 5 0 m l 三角瓶中，加棉塞后用报纸将瓶口包 好，于1 2 1 灭菌3 0 m i n ，取出后冷却至室温，接活化的菌种2 环，于2 5 c ， 1 1 0 r m i n 摇床培养。 4 固体发酵 芝2 8 要 看2 7 基 星2 5 世 赠2 5 2 4 o2 4蓥诧 9 51 2 01 4 4 时间t r i t e h 图1 发酵工艺温度 f i g 1t e m p e r a t u r ec u r v e 沈阳农业大学硕士学位论文 将搅拌均匀的固体发酵培养基3 0 9 装入2 5 0 m l 三角瓶中，加棉塞后用 报纸包好，于1 2 1 灭菌l h ，取出后冷却至室温，接入液体种子，于培养 箱中培养。发酵过程中前3 d 保持温度在2 8 c ，用以大量生产菌丝，以后降 温至2 5 。c ，以利于产孢。 二、结果与分析 ( 一) 液体培养基的选择 液体培养基中基本物质是玉米粉( 2 0 9 l ) ，除空白试验外其余另加入 n a n 0 3 、k h 2 p 0 4 、c a c h 、( n h 4 ) 2 s 0 4 、葡萄糖、脲和微量元素( m g s 0 4 7 h 2 0 o 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 0 7 5 9 ，m n s 0 4 h 2 0o 0 0 2 5 9 ，z n s o , 0 0 0 2 9 ) ：p h 调 至6 。 表1 培养基配比因素水平表 t a b l e1f a c t o r sa n dl e v e l so fm e d i u mc o m p o s i t i o nt a b l e 每个三角瓶装1 5 0 m l 液体培养基，于1 2 1 灭菌3 0 分钟，取出后冷却 至室温，接p d a 平板上的活化木霉孢子2 环，2 5 。| c ，1 1 0 转分摇床上培养。 7 天后，发现液体培养基中生长的菌丝呈白色、球状，未产绿色孢子。将此 时的液体培养基作为种子，按2 的接种量分别接种到已灭菌的固体培养基 第二_ 二章木霉菌孢子固态发酵工艺条件研究 ( 麸皮：稻草：稻壳：玉米粉= 6 ：3 ：3 ：2 ) 中培养。5 天后，测量孢子数。均匀设 计及最后换算成的每克固体发酵物中的孢子数目如表2 。 表2 培养基配比均匀设计表i j 。( 7 e ) t a b l e2u n i f o r md e s i g nu 6 ( 7 6 ) o fm e d i u mc o m p o s i t i o nt a b l e 结果分析如下：a i b 2 c 3 d 4 e 5 f 6 ( 二) 固体培养基的选择 选用麸皮，稻壳，稻草，玉米粉和水，按表3 作l 1 6 ( 4 5 ) 的正交设计， 培养基中加入1 的脲。2 5 0 m l 三角瓶所装固体培养基的厚度为2 c m 。1 2 1 灭菌1 小时，取出后冷却至室温，接2 环绿色木霉孢子。 表3 培养基配比因素水平表 t a b l e3f a c t o r sa n dl e v e l so fm e d i u mc o m p o s i t i o nt a b l e 沈阳农业大学硕士学位论文 表4 培养基配比正交设计表l 。( 4 5 ) t a b l e4o r t h o g o n a lt e s tt a b l el l 私o fm e d i u mc o m p o s i t i o n 喾篙，鬈嚣n c 球o r n 粉w e a t e r 翟篇= ? 。 b r a nh u s ks t r a w p o w d e r 。5 。 5 0 5 0 x1 0 9 2 2 2 5 x 1 0 9 3 1 0 0 x 1 0 9 1 6 5 0 x 1 0 9 2 3 5 0 x 1 0 9 4 2 5 0 x1 0 9 2 8 7 5 x1 0 9 2 1 2 5 x 1 0 9 6 9 0 0 x 1 0 9 2 ，0 0 0 x1 0 9 1 6 2 5 x 1 0 9 2 6 5 0 x 1 0 9 4 0 7 5 x 1 0 9 1 4 6 7 x 1 0 9 3 5 3 3 x 10 9 1 64 41322 6 5 0 x 1 0 9 ，_ _ _ _ - _ _ r _ _ _ _ ，_ _ - _ _ _ - - _ _ _ - ，- _ _ _ - - r _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ - _ _ 一 1 直观分析 表5 培养基配比极差分析表 t a b l e 5 a n a l y s i so f e x t r e m e v a l u eo f m e d i u mc o m p o s i t i o n t a b l e 项目 a 麸皮b 稻壳 c 稻草d 玉米粉e 水 i t e m s ( w h e a t ) b r a n r i c eh u s kr i c es t r a w c o r np o w d e rw a t e r r0 3 9 3 7 52 3 2 5 0 7 4 81 5 5 8 2 51 8 8 9 5 优水平a 3b l c i c 3d 4e z 主次顺序 b e d c a 先将以上结果除以1 0 9 ，然后逐列计算各因素同一水平之和k i j 及其平方 k 2 p 平均数l u 和极差r 。计算结果列于表5 。结果表明，稻壳的极差( 影 2 l 2 3 4 4 3 2 l 2 1 4 3 3 4 l 2 3 4 3 4 2 4 3 2 1 2 4 l 2 3 4 2 1 4 3 3 4 2 4 3 2 l 2 3 4 1 2 3 4 l 2 3 4 l 2 3 ，l2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 2 3 4 5 6 7 8 9 吣n n h 苎三雯查兰堕翌王旦查茎壁三苎墨生婴塞 响因素) 最大，其次是水、玉米粉、稻草、麸皮。最优工艺条件为a 3 8 1 c 3 d 4 e 2 。 2 方差分析见表6 表6 培养基配比方差分析表 3 发酵培养基厚度与p h 值对产孢子的影响 ( 1 ) 发酵培养基厚度对产孢子的影晌 按照最优化设计结果进行配料( 麸皮：稻草：稻壳：玉米粉= 6 ：l ：1 ： 1 2 ，加水为总质量的1 5 倍) ，将混合培养基分别装入5 0 0 m l 烧杯中，其装 填厚度为2 5 c m 、4 e m 、5 5 e m 、7 c m 、8 5 c m ，然后用四层纱布封住烧杯口， 并用线绳扎紧，高温高压灭菌，待冷却后接入刚生成的分生孢子，然后放 入培养箱中，调节温度3 0 。c ，自然干湿条件。培养7 天，计量孢子数。 由图1 可知。在发酵过程中，孢子数随培养基厚度的增加呈现先增加后减 少的趋势，培养基厚度在4 - 7 c m 范围内，产孢量相对较大。本试验中，通 气量与湿度是决定因素，通过调节培养基的厚度可以改变这两个因素，从 而决定产生的孢子数。通气效果越好，产孢量越大；同样湿度越大，产孢 量越大。由于烧杯口未盖玻璃纸，培养基中水分可与外界( 大气) 自由交 换，当表层水分散失后，在固体培养基上表面结一层致密的硬盖，硬盖阻 沈阳农业大学硕士学位论文 碍0 2 进入、c 0 2 排出。培养基厚度少于4 c m 时，虽然氧气充足，但水分散 失严重，所以不利于孢子的产生，在当培养基厚度小于 4 c m 对产孢量随厚 度增加而增加；随着培养基厚度的增大，水分散失减少，当培养基厚度处 于4 - 7 c m 范围内时，表现为孢子产生的适宜厚度：当厚度大于7 c m 时，虽 然培养基内湿度大，但通气量不够，产孢量表现为随厚度增大而明显减少。 在丁业化生产中，考虑到设备利用率以及成本问题，可采用6 7 c m 作为浅 盘发酵培养基厚度。 2 03 04 05 06 07 。08 09 0 厚度t h i c k n e s s ( c i n ) 图2 术霉发酵产孢子数与培养基厚度关系图 f i g 2r e l a t i o no f t h i n k n e s so f s a b s t r a t ea n dn u m b e ro f s p o r e ( 2 ) 发酵培养基p h 值对产孢子的影响 由图2 可知，术霉在中性偏酸的环境中生长较好。从图线的趋势来看，p h 值从6 到l o 的过程中，图线先下降，然后平缓上舞，这主要是因为，木霉 菌适宜偏酸性环境下生长，然而在生长代谢过程中，碳源基质转化为酸物 质，使得p h 值缓慢回落。 0 5 0 5 0 王 1 1 0 0 等dds毫恐q11r【矗簌巾侧 第二章术霉菌孢子固态发酵工艺条件研究 5 o 复4 。 苦 童。 兰2 鼎 当l 0 o 5689l o“ d h 图3 木霉发酵产孢与p l t 值之间的关系 f i g 3t i l e 哪由由n d m e p h 涮k 辩越s 珊托珊m l b e r h 恤l n 鲴嘲岛m 捆丝衄由