（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪fbxo8基因结构及功能的初步研究.pdf

f!f|ijii jl|lr l lffirllllfffluui州iii y 1812 3 7 7 国家重点基础研究发展规划 国家自然科学基金 国家高技术研究计划 资助 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 堤 如需保密，解密时间 z o io 年莎月8 臼 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：傅日 时间：加以年石月声日 学位论文1 吏用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者张俜日铷始絮碳 签名日期：7 6 7 1 穆年月廖日 签名日期： 劢萨6 月f g 日 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 缩略词表i i i 第l 章文献综述l 1 1 泛素一蛋白酶体途径研究简介1 1 2 泛素一蛋白酶体途径的组成1 1 2 1 泛素( u b i q u i t i n ，u b ) 2 1 2 2 泛素活化酶( u b i q u i t i n a c t i v a t i n ge n z y m e ，e 1 ) 2 1 2 3 泛素结合酶( u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y m e s ，e 2s ) 3 1 2 4 泛素一蛋白连接酶( u b i q u i t i n - p r o t e i nl i g a s e s ，e 3s ) 3 1 2 5 泛素链延长辅助酶e 4s 3 1 2 62 6 s 蛋白酶体3 1 2 7 泛素解离酶( d u bs ) 4 1 3 泛素一蛋白酶体途径对蛋白质降解的作用机制与调节4 1 3 1 泛素蛋白酶体途径对蛋白质的降解机理4 1 3 2 泛素化调节和去泛素化调节5 1 4 泛素一蛋白酶体途径的功能5 1 4 1 泛素一蛋白酶体途径参与的生理过程。5 1 4 2 泛素一蛋白酶体途径与疾病6 1 4 3 泛素一蛋白酶体系统与肉质6 1 5 泛素一蛋白连接酶e 3s 7 1 5 1 泛素一蛋白连接酶e 3s 的分类7 1 5 2e 3s 与泛素化8 1 6f b o x 蛋白家族9 1 6 1f b o x 蛋白家族简介9 1 6 2f b o x 蛋白的结构特征9 1 6 3f b o x 蛋白的功能与参与的生理过程1 l 1 6 4f b o x 蛋白的调控l2 1 7f b x 0 8 蛋白与a r f 1 2 1 7 1a r f 的研究历程1 2 1 7 2a r f 的分类与结构1 3 1 7 3a r f 参与的生理活动15 猪f b x 0 8 基因结构及功能的初步研究 1 7 4a i 江的激活15 2 研究的目的和意义1 7 3 材料与方法1 8 3 1 材料1 8 3 1 1d n a 样品l8 3 1 2 组织样品18 3 1 3 载体、菌株和细胞系1 8 3 1 4 试剂盒、酶及血清1 8 3 1 5 主要试剂l8 3 1 6 主要试剂的配制1 9 3 1 7 主要仪器2 0 3 1 8 主要分子生物学软件2 0 3 2 方法2l 3 2 1 猪f b x 0 8 基因克隆2 1 3 2 2 猪f b x 0 8 基因表达谱分析2 2 3 2 3 猪f b x 0 8 基因蛋白序列比对及进化树绘制2 2 3 2 4 猪f b x 0 8 基因多态性( s n p ) 预测。2 3 3 2 5 细胞总r n a 的提取和反转录2 3 3 2 6 原核表达2 3 3 2 7 真核表达2 4 3 2 8 细胞培养和转染2 6 4 结果与分析2 8 4 1f b x 0 8 基因的克隆与序列分析。2 8 4 2 用粕8 基因的结构域分析3 0 4 3f b x 0 8 基因的修饰位点和亚细胞分布预测3 0 4 4f b x 0 8 基因的进化分析3l 4 5f b x 0 8 基因的表达特征分析3 4 4 6 猪f b x 0 8 基因组织表达谱分析结果3 6 4 7 猪f b x 0 8 基因多态性3 7 4 8f b x 0 8 人同源基因亚细胞定位结果：3 8 4 8 1 空载体p e g f p - n 1 亚细胞定位结果3 8 4 8 2 人f b x 0 8 蛋白质亚细胞定位结果3 9 4 9 猪f b x 0 8 基因过表达4 0 4 9 1 真核表达载体的双酶切验证4 0 4 9 2p c d n a 3 1 ( + ) f b x 0 8 过表达前后细胞形态4 0 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 4 9 3 细胞总r n a 提取及r t - p c r 。4l 4 1 0 猪剧基因的原核表达4 2 4 1 0 1 原核表达载体的双酶切验证4 2 4 1 0 2 原核表达s d s p a g e 结果4 3 5 讨论4 4 5 1 猪f b x 0 8 基因的表达4 4 5 2 猪f b x 0 8 基因的多态性4 4 5 3 亚细胞定位4 5 5 4 真核表达4 5 5 5 原核表达4 5 6 ，j 、 结4 7 参考文献4 9 致谢5 4 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 摘要 猪的遗传改良一直是养猪业界科技工作者关注的重点，传统育种手段在猪的品 种改良方面取得了显著成效。随着生命科学技术的发展，尤其是分子生物学领域的 不断突破，分子育种将成为猪遗传改良的重要手段。 任何经济性状的形成都是受复杂的遗传调控。蛋白质是生命活动的具体执行者， 泛素一蛋白酶体途径是一种重要的蛋白质降解系统，是调节细胞内蛋白质水平的重 要机制。通过降解许多诸如细胞周期因子、转录因子等蛋白，从而参与调节许多重要 的生命活动。 泛素蛋白酶体途径最主要的特征就是底物的多样性和选择性，而这一功能主要 是由泛素一蛋白连接酶e 3 s 的f - b o x 基序直接决定的。本研究利用生物信息学与分 子生物学技术相结合的方法，克隆获得了猪f - b o x 家族的f b x 0 8 基因，初步取得了 如下结果： 1 利用网络数据库的信息，通过生物信息学手段，电子克隆到猪f b x 0 8 基因 的编码序列并对其进行了系统的生物信息学研究。 2 结合猪e s t 数据库的信息，分离并鉴定了猪f b x 0 8 的功能序列。 3 用r t - p c r 的方法，对猪f b x 0 8 基因进行了组织表达谱分析。结果发现这 个基因在所检测的成年五指山猪1 6 个组织中有8 个组织有不同程度的表达。 4 使用p e g f p n i 载体构建了人源、猪f b x 0 8 的亚细胞定位载体。在人肺腺 癌细胞系( a 5 4 9 ) 、猪肾细胞( p k l 5 ) 上分别进行了人、猪亚细胞定位的研究。由 人源f b x 0 8 的亚细胞定位显示，f b x 0 8 主要分布在细胞质中。 5 构建了猪p e d n a 3 1 - - f b x 0 8 过表达载体，通过转染猪肾细胞( p k l 5 ) ，并 提取转染后的3 2 小时细胞r n a ，利用用r t - p c r 验证了过表达水平，为后续的细 胞生物学功能研究奠定了基础。 6 成功构建了猪f b x 0 8 原核表达载体，对猪f b x 0 8 蛋白水平的功能进行了初 步的研究，为后续的研究打下了基础。 关键词：猪，泛素一蛋白连接酶e 3 ，f b x 0 8 , 组织表达谱，亚细胞定位，过 表达，原核表达 猪f b x 0 8 基因结构及功能的初步研究 a b s t r a c t p i gg e n e t i ci m p r o v e m e n ta r ea l w a y sb e e nt h ea t t e n t i o nh i g h l i g h to f t h ep i gi n d u s t r y s c i e n t i f i ca n dt e c h n o l o g i c a lr e s e a r c h e r s t h et r a d i t i o n a lb r e e d i n gm e t h o d si np i g i m p r o v e m e n th a v ea c h i e v e dr e m a r k a b l es u c c e s s e s a l o n g w i t ht h ed e v e l o p m e n ta n d c o n s t a n tb r e a k t h r o u g h so fl i f es c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , e s p e c i a l l ym o l e c u l a rb i o l o g y , t h e m o l e c u l a rb r e e d i n gw i l lb e c o m em o r ei m p o r t a n ta n de f f e c t i v e e c o n o m i ct r a i t sa r ec o n t r o l l e db yc o m p l e xg e n e t i cf a c t o r s p r o t e i ni st h ec a r r i e ra n d f u n c t i o ne x e c u t o ro fl i f ea c t i v i t i e s u b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a t h w a yi sa ni m p o r t a n tp r o t e i n d e g r a d a t i o ns y s t e m ，w h i c hi s i n v o l v e di nm a n yi m p o r t a n tc e l l u l a rp r o c e s s e st h r o u g h d e g r a d a t i o no fm a n ys p e c i f i cp r o t e i n ss u c ha sc e l lc y c l eo rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t h em o s ti m p o r t a n tf e a t u r eo fu b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a t h w a yi st h e s u b s t r a t e s e l e c t i v i t y a n dd i v e r s i t y , a n dt h i sf u n c t i o ni s m a i n l y d e c i d e d d i r e c t l yb y t h e u b i q u i t i n - p r o t e a s o m e - e 3sl i g a s ep r o t e i nf - b o x i nt h i ss t u d y , t h ep o r c i n ef b x 0 8g e n e w a sc l o n e da n df u n c t i o n a l l ya n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sa n dm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d s ， t h em a i nr e s u l t sa r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 u s eo ft h ei n f o r m a t i o ni nt h en e t w o r kd a t a b a s e ，t h r o u g hb i o i n f o r m a t i c st o o l s ， c o n d u c t e dt h es y s t e m a t i cb i o i n f o r m a t i c sr e s e a r c ha n de l e c t r o n i cc l o n e dt h es w i n ef b x 0 8 g e n ec o d i n gs e q u e n c e 2 w i t ht h es w i n ee s ti n f o r m a t i o nd a t a b a s e ，s e p a r a t e da n dg e n e t i ca c q u i r e dt h e s w i n ef b x 0 8s e q u e n c e 3 u s er t - p c rm e t h o d ，t h es w i n ef b x 0 8g e n et i s s u e s d i s t r i b u t i o nr e s u l t ss h o w e d t h a tt h ed e t e c t i o no ft h i sg e n ei na d u l tw u z h i s h a np i g s16t i s s u e st h e r ea r ee i g h tt i s s u e s e x p r e s s e do nd i f f e r e n tl e v e l s 4 u s ep e g f p - n1 v e c t o rw ec o n s t r u c th u m a na n d p i gf b x 0 8s u b e e l l u l a r l o c a l i z a t i o nv e c t o r s e x p r e s s e di nt h eh u m a nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l ll i n e ( a 5 4 9 ) ，p i g k i d n e y sc e l l s ( p k l5 ) ，r e s p e c t i v e l y , f o rt h ep e o p l e ，s w i n e ss u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o ns t u d i e s f r o mt h eh u m a nf b x 0 8s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o nr e s u l t ，o b s e r v e dt h a tf b x 0 8m a i n l y d i s t r i b u t e di nt h ec y t o p l a s m 5 c o n s t r u c t e dp i g - f b x 0 8p c d n a3 1 - e x p r e s s i o nv e c t o r , i nt h ep i gk i d n e y sc e l l s ( p k 15 ) ，a c c o m p l i s h e daf b x 0 8o v e r - e x p r e s s i o n t h ee x p r e s s i o ni nt h ec e l l sa f t e r3 2 h o u r s ，t h e r ew a sn oo b v i o u sm o r p h o l o g i c a lc h a n g e s ，u s er t - p c ra c q u i r ec o m p a r i s o n s a m p l ec e l ld n a 6 s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dt h es w i n ef b x 0 8p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r , l a i dt h e f o u n d a t i o nf o rt h ep i gf b x 0 8p r o t e i nf u n c t i o n a la n df o l l o w - u ps t u d i e s k e yw o r d s ：p i g , u b i q u i t i n - p m t e a s o m e e 3 sl i g a s e ，f b x 0 8 , t i s s u e s d i s t r i b u t i o n , s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n ，o v e r - e x p r e s s i o n , p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n n 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 华中农业人学2 0 0 8 年硕十学位论文 第1 章文献综述 1 1 泛素一蛋白酶体途径研究简介 生命活动以细胞作为基本单元，而蛋白质是细胞功能最主要的执行者，几乎所 有的生命现象都是通过蛋白质的结构与功能最终体现和实现的。真核细胞中含有 6 0 0 0 至3 0 0 0 0 个蛋白质合成基因，这些基因编码至少同等数量的蛋白质。这些蛋白质 分子，往往聚集成大的蛋白质功能单位，各成员作为其中的亚功能单位相互作用协 同完成特定的使命。细胞的有效功能，包括细胞内的物质运输和细胞内外的物质交 换，都需要许多蛋白质分子共同的参与。 在对蛋白质的研究过程中，很多工作都致力于阐述蛋白质在细胞内的合成、功能 与调控，而对蛋白质的降解研究相对较少。1 9 4 2 年左右就已经发现了蛋白质分子的降 解现象。我们知道，大多数降解蛋白质的酶作用时都不消耗能量，例如将小肠中食 物蛋白质转化为氨基酸的胰岛素，以及经典的细胞内溶酶体方式，这些过程均不消 耗能量。但是自2 0 世纪5 0 年代就有研究显示，细胞内蛋白质的降解是需要能量的。 这一现象也引发了研究者的思考，即为何细胞内的蛋白质降解需要能量而细胞外蛋 白质的降解却不需要能量。 1 9 7 7 年，g o l d b e r g 及其同事在这个领域获得了突破性的进展， 他们从不成熟 的红血球及网状细胞中获得了一种提取液，这种提取液在催化异常细胞降解时需要 a t p 的参与。应用这种提取物a a r o nc i e c h a n o v e r 等在7 0 年代晚期和8 0 年代早期进 行了一系列更具划时代意义的研究，这几位科学家成功地揭示了细胞内蛋白质的降 解是一个复杂的多步骤反应，蛋白质首先被一种多肽( 泛素) 标记，然后被分解。这个 过程需要消耗能量，细胞以这种高度特异性的方式对不需要的蛋白质进行降解。而 且这种通过泛素化进行的调节与一些可逆的蛋白质修饰，如“磷酸化”修饰不同，通 常是一个不可逆的过程，最终的靶蛋白被降解而不是被修饰。1 9 8 1 至1 9 8 3 年之间， 这几位科学家及小组成员又新发现了几种反应相关的酶，在此基础上，提出了“多步 泛素引发”假说。后期的研究中，他们利用泛素的抗体，将泛素一蛋白质复合物从细 胞中分离出来。更多的实验结果显示，细胞中存在的错误蛋白确实是通过泛素酶体 系统得以降解。在细胞中多达3 0 的新合成蛋白因为不能通过细胞中严格的质量控 制，在蛋白酶体中被降解f 焦娇等，2 0 0 5 ) 。 泛素一蛋白酶体途径的发现及更为广泛的研究，极大的影响并扩展了人们对生 命科学的探索和认识，这三位科学家，a a r o nc i e c h a n o v e r ，a v r a mh e r s h k o 和i r w i n r o s e ，也因为他们发现关于泛素调节的蛋白质降解的作用，被授予2 0 0 4 年的诺贝 尔化学奖。 1 2 泛素一蛋白酶体途径的组成 泛素一蛋白酶体途径是由泛素( u b i q u i t i n ，u b ) ，泛素活化酶( u b i q u i t i n a c t i v a t i n g e n z y m e ，e 1 ) 、泛素结合酶( u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y m e s ，e 2s ) 、泛素一蛋白连接酶 ( u b i q u i t i n - p r o t e i nl i g a s e s ，e 3s ) 、2 6 s 蛋白酶体和泛素解离酶( d e u b i q u i t i n a t i n g e n z y m e s ，d u bs ) 等组成。 猪f b x 0 8 基因结构及功能的初步研究 1 2 1 泛素( u b i q u i t i n ，u b ) 泛素存在于细菌以外许多生物体的组织器官中，是高度保守的多肽结构，具有 标记待降解蛋白质的重要作用，是能量依赖蛋白质降解途径中的重要组成部分。单个 泛素分子由7 6 个氨基酸组成，分子量约8 5 k d ，由g o l d s t e i n 于1 9 7 5 年左右发现并 报道。“泛素”源于拉丁语 u b i q u e ”，意为“到处”。泛素分子通常折叠成球形，由5 股 混合的b 片层形成一个腔样结构，内部对角线位置有一个旺螺旋，这个结构被称为 泛素折叠。泛素蛋白含有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出非常优异的稳 定性，能够防止在其发挥结合功能以及靶向性降解循环过程中变性失活，从而保证 泛素循环的稳定运行。从泛素折叠中突出来的是具有一定变形性的c 末端延伸部分， 在它的第7 6 位含有一个必需氨基酸：甘氨酸。泛素与所有的其他蛋白互作时，都是 通过连接这个c 末端的第7 6 位甘氨酸。随后的研究又发现了许多类泛素蛋白，尽管 它们也具有与蛋白底物结合的能力，但并不一定促进底物蛋白降解，可能与泛素蛋白 酶途径作用相反或仅作为分子伴侣。 图1 1 泛素的三维结构图( 引自w w w b m r b w i s c e d u ) f i gl - 1 t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f t h eu b i q u i t i n ( c i t e df r o mw w w b m r b ，w i s e e d u ) 1 2 2 泛素活化酶( u b i q u i t i n a c t i v a t i n ge n z y m e ，e 1 ) 泛素活化酶( e 1 ) 是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶，为细胞活性和生 存所必需。它对靶蛋白的特异性几乎没有什么影响。e l 是一个大约1 1 0 0 个氨基酸 的多肽，可能是由两个分子量各1 0 5 k d 的亚基组成的二聚体。含有位置相对固定且 保守的半胱氨酸残基，表达非常广泛。目前只发现了一种有功能的e l 。e l 有2 个 亚型，由同一个m r n a 在不同的起始位点翻译而成，存在于细胞浆和细胞核中。对 酵母进行的e l 基因失活实验发现结果是致命的，说明它对细胞的生存至关重要。 e l 能水解a t p ，并与泛素的c 末端形成高能硫键进而激活泛素。 2 华中农业人学2 0 0 8 年硕十学位论文 1 2 3 泛素结合酶( u b i q u i t i n c o n j u g a t i n ge n z y m e s ，e 2s ) 泛素一蛋白酶体途径级联反应的第二步是泛素分子经过转硫醉反应从e 1 的半 胱氨酸残基转移给活化的e 2 s 半胱氨酸位点，e 2 s 在转移泛素分子到荜巴蛋白上起着 非常重要的作用。e 2 s 在n i - 孚l 动物中至少有2 5 个基因，现在至少有3 0 种e 2 s 被分 离纯化。它们都含有一个保守的约1 5 0 个氨基酸( 1 4 - 1 6 k d ) 的核心结构域，结构 的中央蛋白表面较浅的裂隙里含活性所需的半胱氨酸残基。( s m a l lj 等，2 0 0 4 ) 1 2 4 泛素一蛋白连接酶( u b i q u i t i n p r o t e i nl i g a s e s ，e 3s ) 泛素与蛋白底物结合所需的第三个酶。泛素化过程的最重要特征就是底物的多 样性和选择性，这一功能是由e 3s 决定的。目前对e 3 s 的了解有限，不同类型的 e 3 s 问无序列同源性，且分子量差异较大。 1 2 5 泛素链延长辅助酶e 4s 有些情况下多泛素链的形成还需要泛素链延长因子的辅助，人们将具有这类功 能的酶命名为e 4s 。第一个被鉴定的e 4s 是泛素融合降解蛋白( u b i q u i t i nf u s i o n d e g r a d a t i o n2 ，u f d 2 ) ，它的c 末端含有大约7 0 个氨基酸的保守的u b o x 结构，与有 些e 3s 相似，在功能上可以与含有1 - - 3 个泛素分子的底物结合，催化其它的泛素分子 附加到底物上，形成含有多泛素链的底物。u b o x 家族的另一成员在降解途径中作 为泛素链延长因子，与其他e 3s 协同作用，能够结合伴侣分子识别异常或错误折叠的 蛋白质，导致他们被2 6 s 蛋白酶体所降解，也具有e 4 功能的蛋白质。目前还不清楚 是否含有u b o x 结构域的蛋白质都具有e 4s 的活性。含有u - - b o x 结构域的e 3s 是一个相对较小的e 3s 家族，u - - b o xe 3s 家族成员具有e 4s 的特点，因此也有人将u - - b o xe 3s 与环指状结构域的e 3s 归为一类。 1 2 62 6 s 蛋白酶体 蛋白质复合体，就是几个功能相关甚至结构相似的蛋白质多肽链通过二硫键分 子或者其他共价键形成的复合物，也称“蛋白复合体”。 2 6 s 蛋白酶体是降解泛素化底物的一个a t p 依赖型蛋白水解复合体，主要由2 0 s 核心蛋白酶( c o r ep r o t e a s e ，c p ) 和1 9 s 调节颗粒( r e g u l a t o r yp a r t i c l e ，r p ) 十q 成。c p2 0 s 蛋白酶体由4 个七聚体蛋白组成的环层叠在一起形成的一个空心圆柱体样结构，由内 层2 个b 环和外层2 个a 环组成，每个环含7 个亚基，基本结构可书写为a 7 8 7 8 7 a 7 ， 是2 6 s 蛋白酶体的水解核心。活性区域位于2 0 s 圆柱体空心结构中心的2 个b 环上 含有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰样肽水解活性，具有能够使大多数肽键断裂的能 力。目前从不同物种中共发现了7 0 多种亚基，每种哑基分子量约为2 5 3 5 k d 。a 亚 基主要用于底物识别，b 、亚基主要参与底物降解。不同物种，不同生理状态下，2 0 s 蛋白 酶体活性强度不等。( 徐会会等，2 0 0 5 ) 3 猪f b x 0 8 基因结构及功能的初步研究 1 2 7 泛素解离酶( d u bs ) 泛素本身是一个相对长寿的蛋白，其与细胞内被降解的蛋白作用连接，但其本身 却不随底物蛋白被降解。泛素蛋白偶连物在水解之前会由泛素解离酶( d u bs ) 将泛素 从底物上解离下来。d u bs 能够识别泛素基序，特异性地将泛素与其c 末端最后一个 残基( g l y 7 6 ) 相连的分子断开( n i j m a n 等，2 0 0 5 ) 。根据其催化机制，d u bs 可分为5 类( 天门冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白 酶) ，生物信息学的研究显示大约有7 9 个有功能的d u bs ，大部分为半胱氨酸蛋白酶。 半胱氨酸蛋白酶型d u bs 根据泛素一蛋白酶结构域又可分为4 个亚类，分别是：泛 素特异性蛋白酶( u s p ) 、碳末端水解酶( u c h ) 、卵巢肿瘤蛋白酶( o t u ) 和m j d 蛋 白酶。 1 3 泛素一蛋白酶体途径对蛋白质降解的作用机制与调节 1 3 1 泛素蛋白酶体途径对蛋白质的降解机理 泛素首先在e l 催化下，其c 末端甘氨酸残基与e l 的半胱氨酸残基间形成高能 硫酯键。通常一个泛素分子有一个单独的e l 。e l 的催化效能非常高，在低浓度的 情况下就能激活泛素，满足下游的级联反应过程。e l 与泛素结合的中间体再将泛素 转移给e 2 ，形成e 2 泛素中间体。靶蛋白的泛素化还需要一个特异的泛素蛋白连接酶 e 3s 。e 3s 可以直接或间接与底物结合，使泛素从与e 2s 形成的硫酯中间产物转移到 靶蛋白的赖氨酸残基上。在第一个泛素分子连接到靶蛋白上后，其他泛素分子在e 3s 的催化下相继与底物相连的泛素分子的第4 8 位赖氨酸残基相连，形成一条多聚泛素 链，构成底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。泛素化的蛋白质结构会被展平， 进入并在2 6 s 蛋白酶体的2 0 s 催化中心中被降解。泛素分子最后可被d u b s 从底物 上水解下来，再次被利用。 图1 2 泛素蛋白酶体途径( 引自麻省理工开放课程) f i g 1 2 t h eu b i q u i t i n - p r o t e a s o m ep a t h w a y ( c i t e df r o mm i to p e nc o u r s e s ) 4 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 1 3 2 泛素化调节和去泛素化调节 蛋白质的泛素化降解研究中发现，很多蛋白质本身可以提供特定的信号给泛素 蛋白酶体途径识别，非常著名的有：n 末端规则：即通过蛋白质n 末端的氨基酸来 预测其半衰期。但是具体的机制还不是很清楚。p e s t 序列：降解的信号序列，在短 短8 个氨基酸的片段上富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸。移除p e s t 会延长 半衰期。 通常这些泛素化的信号被掩盖在正常的蛋白质结构中，所以一些蛋白质在天然 状态下不被降解。但是一旦蛋白质的正常结构出现变化或者受损，暴露这些信号，就 会被泛素系统识别发现。这就是折叠异常和突变蛋白容易被降解的原因。但是具体 的机制还在进一步研究当中。蛋白泛素化调节是一个可逆的过程。细胞内同时还存 在一些进行负向调节的特异去泛素化蛋白酶( h o p p et 等，2 0 0 5 ) ，其过程就是泛素 解离酶( d u bs ) 功能的体现。 目前，泛素化或去泛素化的利用，以此调控细胞内蛋白质的水平并影响其功能已 成为蛋白质研究的重要策略。如已知p 5 3 的泛素化降解与许多肿瘤发生相关。有研 究发现，特异性的蛋白酶能结合p 5 3 泛素化链，使其去泛素化，p 5 3 降解减少，稳定性增 强，并抑制肿瘤细胞的生长。 1 4 泛素一蛋白酶体途径的功能 1 4 1 泛素一蛋白酶体途径参与的生理过程 所有机体组织细胞中都存在多种蛋白降解途径，如溶酶体途径等。研究证实，细胞 内8 0 9 0 的蛋白通过泛素一蛋白酶体途径降解。泛素的靶蛋白包括：细胞周期调 节因子、肿瘤抑制因子、转录激活因子和抑制因子、细胞表面受体以及突变或受损 蛋白质，通过以上靶蛋白的多聚泛素化并经蛋白酶体降解后，可以影响或调节多种细 胞活动。 泛素蛋白酶体途径是细胞内环境稳定的关键调节因素，细胞的许多重要蛋白都 在此通路的调控之下。如泛素蛋白酶体系统对核内转录因子n f r , b 信号通路的调 控。泛素蛋白酶体系统调控n f k b 通路可以在多个不同水平上进行。在受刺激细 胞中，n f k b 的抑制因子( i k b ) 被i ) c b 激酶( i k k ) 作用磷酸化，形成多聚泛素化链并被降 解，从而使n f r , b 活性增加，相关的基因表达增强。在上游，各种不同的上游信号分子 可以激活相应e 3 连接酶，促进i k k 的泛素化与降解，而对应的去泛素化特异酶则起相 反作用，从而对i k k 的活性形成正、反双向调节。在核内，泛素系统除影响n f - r , b 的 抑制因子l r bs 外，与i ) c b s 的前体p 1 0 0 和p 1 0 5 的活性调节也有关。参与i r , b 与其前 体p 1 0 5 等的泛素化及降解( 吴慧娟等，2 0 0 6 ) 。 与泛素蛋白酶体途径有关的生理功能有：细胞周期的调控，抗原提呈，转录的调控以及凋亡 猪f b x 0 8 基因结构及功能的初步研究 1 4 2 泛素一蛋白酶体途径与疾病 泛素一蛋白酶体途径与疾病，泛素蛋白酶体途径的研究已在不同的方向有了很 大突破和应用：肿瘤，遗传性疾病，骨骼肌的代谢，神经系统疾病等。 肿瘤：泛素蛋白酶体通路在肿瘤的发病机制中起重要作用。肿瘤抑癌基因的不稳 定可以引发肿瘤。某些常规通过蛋白酶体降解的癌基因蛋白，如果不能及时地从细胞 中清除，就会诱导细胞恶变，一些抑癌基因的不稳定，如p 5 3 和p 2 7 也已经证实与泛素 化降解密切相关。泛素蛋白酶体途径在肿瘤发生发展过程中的重要作用和认识，使肿 瘤发病机制与临床防治的研究开拓了新的领域和思路，也进入一个新的深度。已有研 究发现抑制某些蛋白的蛋白酶体降解可以产生抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡或 杀死肿瘤细胞等作用( z a v r s k ii 等，2 0 0 5 )。2 6 s 的蛋白酶体抑制剂抗肿瘤药已被 美国食物和药物管理委员会批准用于治疗一些肿瘤疾病。 遗传性疾病：囊性纤维化( c y s t i cf i b r o s i s ) 是一种先天性常染色体隐性异常的疾病。 研究发现，其致病原因之一是在某些组织细胞中，囊性纤维化跨膜调节因子( c y s t i c f i b r o s i st r a n s m e m b r a n er e g u l a t o r , c f t r ) 的合成减少。c f t r 是受泛素化调节降解的， 当其基因出现某一位点突变，使c f t r 变异，引起泛素化及降解增强，上皮细胞膜的功 能改变并引起囊性纤维化病变。 在神经系统疾病发病机制中的作用：近年来发现泛素系统也与神经细胞变性有 关。如引起帕金森病的重要因子p a r k i n ，p a r k i n 自身通过泛素化调节降解。一旦p a r k i n 变性，影响某些蛋白降解，就会引起多巴胺类神经元的毒性损伤而引起常染色体隐性 的帕金森病( 吴慧娟等，2 0 0 6 ) 。 骨骼肌的高代谢：在严重的创伤，脓毒等多种病理条件下，骨骼肌蛋白质会表现为 高分解代谢，长期的高分解代谢对机体十分不利，可引发肌肉萎缩和消耗，延迟患者康 复，甚至危及患者生命。近期研究表明，泛素蛋白酶体途径在骨骼肌高代谢中起着重 要的作用。 1 4 3 泛素一蛋白酶体系统与肉质 肌蛋白是动物机体氨基酸的主要储存形式。当进食紊乱或患病时，肌肉蛋白质 会被降解以提供肝脏、肾脏糖异生原料，导致肌肉萎缩。 正常动物在每天的生长中，体内的蛋白质合成与降解量都非常高，这其中也包 括许多的肌蛋白。大量的蛋白质更新主要是为了弥补由于转录和翻译错误所导致的 蛋白质失活或者是由于某些共价修饰和机械损伤所造成的蛋白丢失。失活的蛋白质 需尽快被降解除去，这都需要各种蛋白质降解途径的参与。衰老、疾病、营养不良、 运动性创伤、药物以及其它一些环境因子的作用均可导致组织中细胞和分子水平发 生变化，最终肌纤维丢失，骨骼肌质量大大降低。 随着我们对泛素一蛋白酶复合体系统的不断研究，我们对肌肉消耗的生化机制 有了更深入的认识。现已清楚，与体重及肌肉蛋白丢失有关的肌肉适应性变化均是相 似的，即蛋白质降解作用被增强了。那么要了解不同的代谢状况下肌肉蛋白的加速分 解，就要深入了解其中的生化机制，就必须掌握加快蛋白流出的关键途径。 6 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 泛素一蛋白酶体途径中，蛋白泛素化水平的提高可以加快蛋白降解。不同的特 异性调节蛋白的降解研究表明，其中的限速步骤是泛素与蛋白底物的连接，即由 e 2 ，e 3 催化的反应。在几种类型的肌肉萎缩中均可观察到泛素一蛋白复合物水平的 上升，说明在这些代谢情况下，蛋白底物与泛素的连接被加速进行。 蛋白泛素化水平的提高可以加快蛋白降解，因此在不同的情况下，直接测定泛素 与蛋白结合的速率非常重要。有实验发现，在肿瘤恶病质、糖尿病、慢性肾衰竭、 甲状腺功能亢进等人类疾病状态下，肌肉蛋白分解作用的激活均与泛素结合物水平 的上升有关。还有实验显示，小鼠的萎缩性肌肉中取得的可溶性提取物中，泛素结合 物与内源性蛋白的比值比对照组高出2 到3 倍。原理上，细胞蛋白的修饰促进其接近 e 2 或e 3 ，或是泛素化系统的激活均可增强泛素化作用。在这些萎缩性肌肉提取物中， 加入的外源性溶菌酶的泛素化水平同样上升。所以可见，泛素化作用的加强是泛素 结合系统酶类的激活或诱导的结果( 赵洪玉等，2 0 0 4 ) 。 除了以上所述情况激活泛素一蛋白酶体途径，降解肌蛋白，还有很多肌肉的储 存机制，也是得以借助泛素一蛋白酶体途径实现的( 谭银玲，