（动物遗传育种与繁殖专业论文）荣昌猪BPI基因全长cDNA克隆及SNP分析.pdf

摘要 荣昌猪b p i 基因全长c d n a 克隆 及s n p 分析 动物遗传育种与繁殖专业硕士研究生袁树楷 指导教师：谢和芳教授王金勇研究员 摘要 杀菌通透性增强蛋白( b a c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t y - i n c r e a s i n gp r o t e i n b p l ) 是人和哺乳动物内 源性阳离子蛋白质，主要存在于多形核白细胞的嗜苯胺蓝颗粒中。它具有很强的杀菌( 主要 指革兰氏阴性细菌) 活性、中和内毒素或脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e , l p s ) 活性和调理功能， 在动物机体天然防御中起到很重要的作用。目前，人、牛、鼠的b p i 基因序列都已清楚但猪 b p i 基因全长c d n a 序列未知。此外，人b p i 基因外显子3 和4 区域存在多态性，猪b p i 基因第4 和1 0 外显子的r f l p 多态性与沙门氏菌的易感性有关，并被确定为抗病育种的候选基因。而被 联合国粮农组织列为重点保护猪种的荣昌猪，其b p i 基因外显子3 和4 区域的多态性还有待研 究。 本试验拟克隆出荣吕猪b p i 基因的全长c d n a 序列，并应用聚合酶链式反戍单链构象多态 性( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n - s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，p c r - s s c p ) 技术，检测 其第3 和4 外显子的单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s n p ) 位点。这些结果的 获得，不仅可以为猪b p i 功能研究、荣昌猪b p i 基因多态性提供基础数据，而且对进一步寻找 到合适的抗病育种或相关分子标记、分析b p i 基因多态性与荣昌猪抗病力的相关性和荣吕猪的 保种选育等研究具有基础贡献意义。 试验的方法及技术路线： ( 1 ) 荣吕猪b p l 基因全长c d n a 克隆及生物信息学分析： 首先选取一头1 0 0 日龄左右健康的荣昌猪，提取其前腔静脉m 总r n a ，然后进行r t p c r 得到c d n a 第一链；再根据同源性克隆方法，结合3 和5 e d n a 末端快速扩增( r a p i d a m l i f i c a t i o no f c d n a e n d s ，r a c e ) 技术，分别克隆出荣吕猪b p i 序列的中间编码区序列、3 非 编码区序列( u n t r a n s l a t e dr e g i o n 。u t p ) 和5 - u t r ：拼接出全长c d n a 序列，并进行序列比对、 结构功能预测等生物信息学分析鉴定。 ( 2 ) 荣昌猪b p i 基因第3 和4 外显子序列s n p 位点分析： 随机选取1 2 0 头健康的荣昌猪，提取其耳组织基因组d n a ，再以其为模板扩增出第3 1 1 4 # b 显子序列；p c r 产物经1 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p a g e ) ， 1 2 0 v ，4 c 持续1 4 h ，然后银染显带；统计不同带型出现的频率( 即基因型频率) 和等位基因 频率，并将显示不同带型的p c r 扩增产物克隆测序；最后根据测序结果比对分析出外显子3 和4 区段存在的s n p 位点，并根据这些s n p 位点在等位基因中的分布和等位基因频率，计算出各 s n p 位点的优势碱基频率。 i i l 两南大学硕十学位论文 试验结果与结论： ( 1 ) 本试验首次克隆得到了荣吕猪b p i 基因全长c d n a 序列，也是猪b p i 基因全长c d n a 序 列的首次报道，其g e n e b a n k 登录号为：e f 4 3 6 2 7 8 。序列比对和结构功能预测显示，荣吕猪b p i 同人、牛等物种b p i 具有相似的结构和功能。 ( 2 ) 本试验应用p c r - s s c p 分析方法，在荣昌猪b p i 基因外显子3 区段检测到一个新的s n p 位点，即第3 9 7 位的g a 突变引起氨基酸由j 恤替换为g 1 n 。且产生带正电荷的a r g 的碱基g 为该位点的优势碱基，频率为0 7 4 1 7 。该位点的突变可能对荣昌猪b p i 蛋白功能及机体天然免 疫力有重要影响。外显子4 区段共检测到4 个s n p 位点，它们是t 5 1 2 c ，g 5 5 1 t ，c 5 6 3 t ，g 5 9 9 a 。 其中t 5 1 2 c ，g 5 5 1 t ，c 5 6 3 t 为首次报道，g 5 5 1 t 突变还产生了一个新的限制性内切酶m s ci 或 b a l 【酶切位点( t g g c c a ) 。第5 1 2 ，5 5 1 、5 6 3 、5 9 9 位的优势碱基分别为c 、g 、c 、g ，出现的 频率分别为0 6 3 3 4 ，0 7 2 5 ，o 7 2 5 ，o 7 5 0 1 。此外，通过荣昌猪外显子4 序列与猪e s t 序列比对 分析还发现了一个第4 7 9 位的t c 突变。荣昌猪b p i 基因外显子4 区段的高度多态性，表明该 区段有较大的遗传选择潜力。 通过分析推断，本试验检测到的外显子3 和4 区段的某些s n p 位点，可能成为猪机体抗某些 革兰氏阴性病原菌或其引起的疾病的分子标记。 关键词：b p i荣昌猪r a c es n pp c r - s s c p a b s t r a c t c l o n i n g a n ds n p a n a l y s i so f b a c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t y - i n c r e a s i n gp r o t e i n g e n ei nr o n g c h a n g p i g s h u k a iy u a nm a s t e ro fa n i m a lb r e e d i n ga n d g e n e t i c s s u p e r v i s o r ：p r o lh e f a n gx i e p r o lj i n y o n gw a n g a b s t r a c t b a c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t y i n c r e a s i n gp r o t e i n ( b p i ) i sah i g h l yc a t i o n i cp r o t e i nw h i c hi sl o c a t e d m a i n l yi nt h ep r i m a r yg r a n u l e so fp o l y m o l p h o n u c l e a rl e u c o c y t ef p m n ) b p ih a sah i g ha f f i n i t yf u r l p so fg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a b i n d i n go fb p it os u s c e p t i b l eb a c t e r i ai sf o l l o w e db yi n c r e a s i n g o u t e rm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y ，i n h i b i t i o no fg r o w t ha n du l t i m a t e l y ，i r r e v e r s i b l el o s so fv i a b i l i t y i n a d d i t i o n ，b p ia l s op o s s e s s e sa no p s o n i cf u n c t i o n b e c a u s eo f t h e s e m p o r t a n tf u n c t i o n s ，b p ip l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei nh o s ti n i t i a ld e f e n s e a tp r e s e n t , t h ef u l l - l e n g t i 】e d n as e q u e n c e so fb p ig e n eh a s b e e ne l u c i d a t e di ns e v e r a ls p e c i e s ，i n c l u d i n gh u m a n , b o v i n e ，b r o w nr a ta n dm o a s e ，b u tn o ti np i g i n a d d i t i o n ，s e v e r a lp o l y m o r p h i cs i t e sw e r ef o u n di ne x o n s3a n d4o fh u m a nb p ig e n e i th a sb e e n s h o w nt h a tt h er e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s mf r f l p ) s i t e si ne x o n s4a n d1 0o fp o r c i n e b p ig e n ea r er e l a t e dt ot h es u s c e p t i b i l i t yo fs a l m o n e l l ac h o l e r a s u i si ns e v e r a lp i gb r e e d s t h e p o r c i n eb p ig e n ew a sc o n s i d e r e da sac a n d i d a t eg e n eo fb r e e d i n gf u rd i s e a s er e s i s t a n c e h o w e v e r , t h ep o l y m o r p h i s mo fe x o n s3a n d4i nr o n g c h a n gp i gb p ig e n e ，as t r e s sp r e s e r v i n gp i gb r e e db y f o o da n da g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o no f u n i t e dn a t i o n s ，i su n c l e a r i nt h i ss t u d y ，t h ef u l l l e n g t hc d n ao f r o n g e h a n gp i gb p ig e n ew a sc l o n e da n dt h es n ps i t e si n e x o n s3a n d4o ft h i sg e n ew e r ed e t e c t e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n - s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m 伊c r - s s c p ) a n a l y s i s t h e r er e s u l t sw i l lo f f e rs o m eb a s i cd a t at o t h ef u n c t i o n s t u d y i n go fp o r c i n eb p i ，t h ea s s o c i a t i o nr e s e a r c hb e t w e e nb p ig e n ep o l y m o r p h i s ma n dt h ed i s e a s e r e s i s t a n c eo fr o n g c h a n gp i ga n dt h eb r e e d i n ga n dp r e s e r v a t i o no fr o n g c h a n gp i g s o m eu s e f u l m o l e c u l a rm a r k e r so fb r e e d i n gf u rd i s e a s er e s i s t a n c ea r ea l s oe x p e c t e dt of i n di nt h ep o s s i b l es n p s i t e s t h em a i nt e c h n i c a lr o u t ea n dm e t h o & o f t h i sw o r kw e r ec a r r i e do u ta sf u l l o w s ： ( 1 ) c l o n i n ga n da n a l y s i so f t h ef u l l l e n g t hc d n a o f b p ig e n ei nr o n g c h a n gp i g ： f i r s t l y ，a b o u t5m la n t i c o a g u l a n tp e r i p h e r a lb l o o dw a sg a i n e df r o ma1 0 0 dh e a l t h yr o n g c h a n gp i g ， t h et o t a lr n af r o mt h i sb l o o dw a se x t r a c t e du s i n gt h er n ae x t r a c t i o nk i t t h e nt h er n aw a st a k e n t oc o n v e r tm r n a si n t oe d n a f o l l o w i n g ，t h ec o d i n gs e q u e n c e ，y - u t ra n d5 - u t ro fr o n g c h a n g p i gb p lw e r ec l o n e du s i n gh o m o l o g yc l o n i n ga p p r o a c hc o m b i n e dw i t h3 a n d5 r a c e f i n a l l y ，t h e v 西南大学硕士学位论文 f u l l l e n g t he d n ao fr o n g c h a n gp i gb p ig e n ew a so b m i n e db yo v e r l a p p i n gt h et h r e es e q u e n c e s a s s e s s m e n t a n da n a l y s i so f t h e f u l l l e n g t hs e q u e n c e w e r e d o n e b y b i o i n f o r m a t i c s m e t h o d s ( 2 ) s n pa n a l y s i so f t h ee x o n s3a n d 4o f r o n g c h a n gp i gb p ig e n e ： f i r s t l y ，t h eg e n o m i cd n a w a se x t r a c t e df r o m1 2 0h e a l t h yr o n g c h a n gp i g s e a rt i s s u e s a n dt h e e x o n s3a n d4f r a g m e n t sw e r ea m p l i f i e du s i n gt h eg e n o m i cd n at e m p l a t e s t h e nt h e s ep c r p r o d u c t sw e r ed e t e c t e db yp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) a t1 2 0v f o r1 4ha t4 1 2 ，a n d g e l sw e r ed e v e l o p e dw i t hs i l v e rs t a i n i n g t h ep c rp r o d u c t ss h o w i n gd i f f e r e n tp a t t e r n sw e r ep u r i f i e d a n dc l o n e di n t op m d l 8 tv e c t o rf o rs e q u e n c i n g f i n a l l y ，t h ef i e q u e n e i e so fd i f f e r e n c eg e n o t y p e s w e r ea c c o u n t e da n dt h ea l l e l i cg e n e sf r e q u e n c i e sw e r ec a l c u l a t e da c c o r d i n gt ot h ef o r m e rr e s u l t f u r t h e rm o r e ，t h es n ps i t e si ne x o n s3a n d4w e r ef o u n db ys e q u e n c ea l i g n m e n to fd i f f e r e n ta l l e l i c g e n e s f r e q u e n c i e so f t h eb a s e sw i t hh i g i l e l a p p e a r a n c ef e q u e n c yi nt h e s es n ps i t e sw e r ec a l c u l a t e d a c c o r d i n gt ot h ed i s t r i b u t i o no f s n ps i t e si na l lt h ea l l e l i cg e n e s t h er e s u l t sa n dc o n c l u s i o n so f t h i ss t u d yw e r el i s ta sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ef u l l l e n g t hc d n ao fr o n g c h u n gp i gb p ig e n ew a sc l o n e df o rt h ef i r s tt i m ei nt h i ss t u d y a n di tw a sa l s ot h ef i r s tt i m er e p o r t i n gt h ef u l l l e n g t hc d n ao fp o r c i n eb p ig e n e i t sg e n e b a n k a c c e s s i o nn u m b e ri se f 4 3 6 2 7 8 t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fr o n g c h a n gp i gb p lw e r es i m i l a rt o t h o s eo fh u m a n ，b o v i n ea n do t h e rs p e c i e s b p ib ys e q u e n c e sa l i g n m e n ta n ds t r u c t u r ea n df u n c t i o n p r e d i c t i o n ( 2 ) t h e r ew a so n en o v e ls n p ( g 3 9 7 a ) d e t e c t e di nt h ee x o n3o fr o n g c h a n gp i gb p ig e n eb y p c r - s s c p t h i sm u t a t i o nm a d ea r g l 0 1 g l ns u b s t i t u t i o na n dt h eb a s ew i t hh i g h e ra p p e a r a n c e f r e q u e n c yi nt h i ss n ps i t ei sb a s eg i t sa p p e a r a n c ef r e q u e n c yi so 7 4 1 7 i nt h ee x o n4f r a g m e n t t h r e en o v e l ( t 5 1 2 c ，g 5 5 1 t ，c 5 6 3 do ff o u rs n p s 仃5 1 2 c ，g 5 5 1 t ，c 5 6 3 t ，g 5 9 9 a ) w e r ed e t e c t e d a n da l lo fm es n p sw e r es y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o n s t h eb a s e sw i t hh i g l l e ra p p e a r a n c ef r e q u e n c yi n t h e s es n ps i t e sw e r eb a s ec ，g ，ca n dga n dt h e i ra p p e a r a n c ef e q u e n e yw e r e0 6 3 3 4 ，o 7 2 5 ，0 7 2 5 a n do 7 5 0 1r e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ，a n o t h e rn o v e ls n p ( t 4 7 9 c ) i ne x o n4w a sf o u n db ya l i g n i n g e x o n4s e q u e n c ew i t hp o r c i n ee s t s 1 1 a f f l u e n tp o l y m o r p h i s mo fe x o n4i n d i c a t ei t s h u g e p o t e n t i a l i t yi ng e n e t i cs e l e c t i o n s o m eo ft h es n ps i t e sd e t e c t e di nt h i ss t u d ym a yb ei m p o r t a n tm o l e c u l a rm a r k e r so fp o r c i n e d i s e a s er e s i s t a n c e ，s p e c i f i c a l l yr e s i s t a n tt og r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a sa n di t sc a u s e dd i s e s e s e s k e y w o r d s ：b p ir o n g c h a n gp i g r a c es n pp c r - s s c p 中英文缩写对照表 独创性声明 学位论文题目：苤昌猹旦旦! 基固全筮曼q 丛忘隆丞墨监金扭 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：袁确蓿 签字日期：加吖年b 月够日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：袁阿措 签字日期：卿年b 月弘日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：渊审岛 签字日期： 川年易月妒日 邮编： 第1 章文献综述 第1 章文献综述 目前，预防和控制猪疾病的主要手段是疫苗接种和药物治疗。但由于有些药品的滥用和 环境污染的影响，致使病原微生物耐药性增强、变异加快，从而导致疫病控制更加困难以及 给猪肉产品带来严重药物残留的后果。药物和疫苗对疾病控制的“失败”，让人们反思“是否 可以通过遗传手段来提高猪机体天然抗病力，使猪机体发病几率减少”，从而达剑控制疫病， 减少药物残留的目的。过去的研究发现。很多动物疾病的发病机制受单基因或多基因控制， 亦即动物对一些疾病存在完全或部分抗性。因此，对这些传染性疾病抗性相关候选基因或分 子标记的深入研究，将有助于在分子水平上对动物进行抗性选育。 1 1 猪抗病育种候选基因研究进展 随着分子生物学等生命科学对动物遗传育种领域的快速渗透，许多控制动物优良性状的 候选基因或分子标记得以发现。其中控制猪机体抗病性状的候选基因主要有四类：受体类基 因、抗菌肽或蛋白类基因、信号传导类基因、s l a 基因家族，它们都显示出对抗病育种研究 具有重大价值。 1 1 1 受体类基因 受体类基因，它们是作为某些病原菌或配体分子特异结合吸附到宿主组织细胞上的结构 和功能基因。这类基因的突变或缺失，会引起该受体的结构和功能的改变或缺失，从而使病 原菌和配体分子不能结合上去，也就对某些特定的病原菌和某些遗传缺陷病显示出抗性。 1 1 1 1i 型兰尼定受体基因 猪虑激综合症( p o r c i n es t r e s ss y n d r o m e ，p s s ) 是由i 型兰尼定受体( r y a n o d i n er e c e p t o ri 。 r y ri ) 基因控制的一种单基因隐性遗传病，可导致猪的应激死亡和产生灰白水样( p a l e ，s o f t 。 e x u d a t i v e ，p s e ) 肉【lj 。p s s 在皮特兰、长白猪等瘦肉率高的外种猪中发生率较高。 r y ri 基因物理定位于s s c 6 q 1 1 1 2 ，又称钙离子释放通道( c a l c i u mr e l e a s ec h a n n e l c r c ) 基因或氟烷敏感( h a l o t h a n e ，h a l ) 基因，隐性纯合子( h a l l a p ) 发病。应激敏感猪的 r y ri 基因e d n a 第1 8 4 3 位碱基由c 突变为t ，导致受体蛋白第6 1 5 位的精氮酸( a r g ) 替换为半 胱氨酸( c y s ) ，引起结构和功能改变o ”。当应激敏感猪受到应激因子( 如运输、高温等) 的 刺激时，骨骼肌中c a 2 + 大量非止常释放，引起肌肉持续收缩因而产生应激综合症。该位点突 变导致限制性内切酶酶切位点改变，即由h h ai 的酶切位点( 5 g c g i _ c 3 - ) ，变为h g i ai 的 酶切位点( - 5 g t g c t j , c 3 - ) ，因而可以通过酶切图谱鉴别氟烷基因型。这对生产上消除氟 烷基因影响很有意义。 此外，r y ri 外显子“上的突变( a l a 2 3 5 0 t h r ，a r 9 2 3 5 5 t r p ，g l y 2 3 7 5 a l a ) ，显示与人恶性 高温症有关i 4 。此突变是否对猪机体相关疾病易感性有关，还不清楚。 1 1 1 2 肠毒素型大肠杆菌受体基因 两南大学硕+ 学何论文 肠毒素型大肠杆菌( e n t e r o t o x i g e n i ce s c h e n c h i ac o l i e t e c ) 是引起仔猪腹泻水肿的主要 病原体之一，它可引发仔猪腹泻和水肿等多种大肠杆菌病。e t e c 与共生性非致病性大肠杆菌 不同，其致病性决定于它们在宿主小肠上皮细胞上的定居能力和产生毒素的能力。e t e c 定居 宿主小肠上皮细胞的能力是由菌体表面的宿主特异菌毛介导的p 6 1 。这种e t e c 特异菌毛通常称 为定居网子( c o l o n i z a t i o nf a c t o r ) 或粘附素( a d h e s i o n ) 。它包含多种黏附素类型，其中f 4 ( 义称 为k 8 8 ) 和f 1 8 ( 又称为k 9 9 ) 研究较多。e t e c1 7 4 和f 1 8 能否结合到小肠粘膜引起发病决定 于猪小肠粘膜有无其受体1 7 ”。 e t e c1 ：4 有3 种抗原类型( f 4 a b ，f 4 a c ，f 4 a d ) 。s e l l w o o d 等”1 首次报道了对e c o l if 4 a c i j l 起的 腹泻具有抗性的猪是由于小肠粘膜缺乏f 4 a c 受体。随后的研究表明，引起e 扛f 4 a c 粘着的受 体按孟德尔型两等位基因遗传，显性基因s 控制有受体，猪只表现为f f ；e c o l if 4 a c 敏感型，隐 性基因s 为无受体，表现为抗性型1 9 ) 。据b i j l s m a 等报道，f 4 a b 和f 4 a c 两种粘附素受体受1 个位点 同时编码而且2 个受体紧密连锁i l ”。目前，f 4 a b 和f 4 a c 受体被定位于猪1 3 号染色体的微卫星 标记s w 2 0 7 与s w 2 2 5 之间( 相隔6 9 c m ) 【l “。f 4 a d 受体的遗传研究较少，有些研究结果表明无 受体可能为隐性遗传【1 2 ”1 。此外。在寻找e t e cf 4 抗性选育遗传标记的试验中发现，我国梅山 猪中，与f 4 a c 、f 4 a b 受体紧密连锁的转铁蛋白继因型及基因型频率不同于其它品种猪，且梅 山猪表现出相对较强的针对ec o i lf 4 a b 和f 4 a c 的抗性，显示出梅山猪对ec o l if 4 的抗性可能与 癌冈掣频率有关l ”1 。刘鑫等试验表明，猪1 3 号染色体上与f 4 受体紧密连锁的微卫星s w 4 5 8 座位a c 基冈型，在沙子岭、大白两个猪种中无黏附表氆，可望作为e t e cf 4 抗性选育的遗传 标记。 e t e cf 1 8 受体基闻定位于猪的6 号染色体，并与血型抑制子s ( i n h i b i m rs ) 、红细胞酶系 统及氟烷基囡紧密连锁【i ”l 。对e t e cf 1 8 的敏感性是可以遗传的抗性或敏感性是由一对等 位基冈控制的，敏感性相对于抗性是显性口】。研究发现，f 1 8 受体基因位点旁侧存在一个m f 基 因簇，并且o ( 1 ，2 ) 岩藻糖转移酶基因l ( f u f l ) 可作为对e t e cf 1 8 介导的粘附呈敏感性或抗性遗 传性状的一个候选基因。f u n 基因定位于猪染色体6 q 1 1 ，在其第3 0 7 位碱基可发生m g 改变为a 的点突变。g g 型和g a 型的猪个体为e t e cf 1 8 敏感型，a a 型为e t e cf i b 抗性型【1 92 “。且 抗性型对肉质和胴体性状具有正遗传效应这对在抗病选育中利用该基因很有利口1 i 。 此外，可能还有多种类似的受体基因，它们的突变引起机体对某些疾病的易感性发生变 化。如过氧化物酶体增殖激活受体t ( p e r o x i s o m ep r o l i f c r a t o ra c t i v a t e dr e c e p t o rg a m m a ，p p a r y ) 基吲编码的一种核激素受体与细胞的分化和成长有关。该基因的突变极有可能引起心肌梗 塞和i i 型糖尿病的发生| 2 2 ，”1 。但是该基冈在猪上的研究却比较少。 1 1 2 抗菌肽或蛋白类基因 抗菌肽或蛋白类基因，其编码的产物，在动物机体大然防御中起着很重要作用。这类基 冈的突变会引起其表达产物结构功能的变化，或导致产物在体内含餐的变化。如果这些变化 引起的是机体大然抗菌活性的增强，那么，机体则表现出对某些病原菌的抗性。 1 1 2 1 杀菌通透性增强蛋白基因 杀曲通透性增强蛋白( b a c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t y - i n c r e a s i n g p r o t e i n ，b p i ) 是人和哺乳动物的 2 第1 章文献综述 内源性阳离子蛋白质，1 9 7 8 年首次由w e i s s 等从人中性粒细胞中分离纯化得剑，冈其能通过 增加革兰氏阴性细菌外膜通透性而逐步使其失活而得名1 2 4 1 。它主要存在于多形核白细胞的嗜 苯胺蓝颗粒中，也表达于嗜酸性粒细胞和单核细胞表面，以及粘膜和上皮细胞中口1 。 人b p i 基因位于2 0 q l l - 2 3 q 1 2 上，其基因组由3 1 5 1 0 k b 组成，包括1 5 个内含子和1 4 个外显 子，具有高度保守性。完整的b p l 分子量为5 5 k d ，p h 4 5 6 个氨基酸残基组成【2 6 2 ”。b p l 分子晶 体结构显示口，它呈特殊的“回飞棒”形，最大直径1 3 5n m ，且星对称的蛋白质构象。由各2 0 0 个氨基酸左右的n 末端区和c 末端区及中间2 1 个氨基酸的连接区组成( 见图1 1 ) 。n 末端区 富含阳离子性氨基酸和亲水残基，c 末端氨基酸残基高度疏水，连接区富含脯氨酸。尽管仅 有2 0 的氨基酸相同，但晶体结构显示n 末端区与c 末端区结构显著相似各包含一个由两个 a 螺旋和高度扭曲反向平行的p 片层组成桶状结构。两个桶状结构由中间一段反向平行的b 片层 连接。b p l 分子另一特殊结构是，两区各包含一个非极性的脂质结合袋，位于“回b 棒”的凹 面，紧邻于桶状结构和中间的b 片层。结合袋的疏水性侧链可与脂质的酰基链形成广泛的范德 华接触，而脂质两性离子集团位于袋状结构开口处，暴露于溶液内。与b p i 同属脂转移脂多糖 结合蛋白( l i p i dt r a n s f e r l i p o p o l y s a c c h a d d eb i n d i n gp r o t e i n ，l t b p ) 家族的胆固醇酯转移蛋白 ( c h o l e s t e r y le s t e r t r a n s f e rp r o t e i n ，c e t p ) 、脂多糖结合蛋白( 1 i p o p o l y s s c c h a r i d eb i n d i n gp r o t e i n 。 l b p ) 、磷脂转移蛋白( p h o s p h o l i p i d st r a n s f e rp r o t e i n , p l t p ) ，它们相似袋状结构参与到l p s 的结合、转运和磷脂的结合i ”一o l 。b p l 非极性的脂质结合袋也可能是与l p s 的结合位点，亲和 力研究显示仍存在有其他结合位点p 1 。此外，序列分析显示在b p i 蛋白的中心，靠近脂质结合 袋区，基因序列具有高度的保守性。这一区域几个保守的、正电荷氨基酸的突变，可使l p s 的 结合与转运活性降低p “。 图1 1 人b p l 晶体结构及示意图 f i 9 1 1c r y s t a ls t r u c t u r ea n ds c h e m a t i cd i a g r a mo f h u m a nb p i 图a ，显示人b p i 晶体结构的卷丝带模型图，左边蓝绿色部分为n 末端区，右边蓝色部分为c 末端区淡 绿色为富含脯氰酸的连接区红色为脂质结合袋结合的两个磷脂分子i ：图b 硅示人b p i 各个结构区的分布 与所包含的氯嬉暖选段：图c 硅求人b p i 晶体结构的二级结构组成示意图，每个桶状结构由曲个小蝶旋和高 度扭曲反向平行的b 片层组成。脂质结合袋。位于每个桶状结构和中间的b 片层之问的凹面处p o l 。f i ga ，ar i b b o n d i a g r a mo fh u m a nb p i t h en - t e r r a i n a ld o m a i n ( o nt h el e f t ) i sc y a n , t h ec - t e r m i n a ld o m a i ni sb l u e a n dt h e p r o l i n e - r i e hl i n k e ri si nl i g h tg r o ，t h et w ob o u n dp h o s p h o l i p i d sa r ei nr e d ；f i gb 。s c h e m a t i cs h o w i n gt h e a r r a n g e m e n to fs t r u c t u r a le l e m e n t sr e l a t i v et ot h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fb p i a m i n oa c i dn u m b e r sf o re a c h s t r u c t u r a lu n i ta r ei n d i c a t e db e l o w ；f i gc ，s c h e m a t i cd i a g r a mo fb p is h o w i n 窟t h ee l o n g a t e ds h a p ee a c hb a r r e li s t o m p o s e a lo f t w oa - h e l i c e s ( h e l i c e saa n dbi nb a r r e ln ：a 。a n db i nb a r r e lc 1a n dat w i s t e dp s h e e t t h et w oa p o l a r b i n d i n g p o c k e t sa r cs i t u a t e dn e a rt h ei n t e r f a c e sb c l w o c ne a c hb a r r e la n dt h ec e n t r a ls h e e t 西南大学硕士学位论文 由rn 端片段的高度刚离子化，当b p i 蛋白与革兰氏阴性细菌胞膜表面带负电荷的l p s 结合时，亲和力很强，结合很牢固。在早期，b p i 蛋白与细菌外膜特异性结合后激活一系列酶 解系统，促使膜磷脂和肽聚糖降解，使得细菌外膜通透性改变，生长受抑制，但细菌还可以 修复和生长。在晚期，随着作用时间延长b p i 蛋白浓度增加，细菌胞膜屏障被破坏，出现结 构和功能性改变，其生长受到不可逆性抑制。最终裂解、死亡帆。研究表明，n 末端区独 立具有b p i 的全部杀菌活性和中和l p s 活性，l p s 结合功能区位于8 4 1 0 0 氨基酸之间 3 5 , 3 6 i 。 c 末端区主要起剑增强b p i 的稳定性，以及增强机体细胞免疫的调理作用 3 7 1 目前，人( g e n e b a n k 登录号：n m0 0 1 7 2 5 ) 、牛( n m1 7 3 8 9 5 ) 、小鼠( n m1 7 7 8 5 0 ) 和 褐鼠( n m0 0 1 0 0 4 0 7 9 ) b p i c d n a 序列已知，家兔( u 6 1 2 7 0 ) 和猪( a f 2 5 2 8 7 4 ) 的c d n a ， 只有部分序列报道。此外，在美国专利网中有一段关于猪b p i 基因的1 0 号序列，长1 4 5 2 b p 。 但没有相关注释”。 关于猪b p l 的研究，目前还比较少。周红等从猪中性粒细胞中提取纯化了猪源b p i ，其体 内外生物活性研究显示猪源b p i 同样具有中和内毒素，杀灭革兰氏阴性菌的作用p 4 0 l 。随后 他们的试验发现，抗人b p i 抗体可增强猪源b p i 体外生物活性。推测猪源b p i 三维结构可能 与人b p i 有些不同1 4 l i 。c h r i s t o p h e r 等在约克、汉普夏、杜洛克、长白、大白，野猪和眉山猪 中，检测到b p i 基因外显子4 和1 0 分别存在a v ai i 和h p ai i 酶切多态性，通过攻毒试验表 明其基冈型与猪沙门氏菌的易感性有关，并把b p i 基因确立为抗病育种候选基园p ”。 i 1 2 2 天然抗性相关的巨噬蛋白l 基因 天然抗性相关的巨噬蛋白1 ( n a t u r a lr e s i s t