（动物遗传育种与繁殖专业论文）鹅LXRα基因的序列变异、表达特性及其在脂质代谢中的作用研究.pdf

四川农业土学黝7 届硕士学位论文 摘要 本研究以天府肉鹅和朗德鹅作为试验对象，研究鹅肝脏x 受体n ( l x ra ) 基因部 分序列的特征、组织表达特性及其与脂肪沉积、血浆参数、血浆l p l 活性和l p l 表达间 的关系。研究结果表明： 获得的1 0 0 5 b p 鹅l x rn 部分序列包含一个p 盒和锌指结构单元以及完整的配体结 合区( l b d ) ，与其它物种有较高的相似性，其中与原鸡的相似性最高( 9 5 2 ) ，但 存在8 个氨基酸变异变异位点；l x r - - l b d 区域长度为6 6 0 b p ，编码2 2 0 个氨基酸，有 1 0 个a 螺旋结构。 两品种鹅l x ra 基因在肝脏、腹脂和皮脂中都有表达，但在肝脏中的表达量最高。 填饲引起鹅皮脂、腹脂和肝脏的l x r am r n a 表达丰度的显著增加，在天府肉鹅肝脏和 腹脂中的表达显著高于朗德鹅( p 0 0 0 1 ) ，而在皮脂中的表达显著低于朗德鹅 ( p 0 0 5 ) 。表明不同的品种、不同组织的填饲效应不同。 填饲后，两品种鹅l x r m r n a 的表达丰度与三个脂肪性状在两个品种中都表现出 不同程度的正相关，对天府肉鹅腹脂、皮脂的上调能力大于朗德鹅，但上调肝脏脂肪 沉积的能力则是朗德鹅大于天府肉鹅：两品种鹅在肝脏中l x r qm r n a 表达量与血浆t g 、 v l d l 和肝脂质含量均表现出了中等强度的正相关( 0 5 3 0 8 9 ) ，表明肝脏l x r q i n r n a 对血浆t g 、v l d l 和肝脂质含量可能具有正向的调控作用，而l p l m r n a 表达量与血浆t g 、 v l d l 和肝脂质含量问的相关性不明显。鹅l x ra 基因对l p l 基因的m r n a 表达水平具有正 向的调节作用，其调节程度在不同的组织中表现不同；与l p l 的活性之间相关性不显 著。 关键词：鹅；填饲；l p l ；l x ra ；序列分析；表达调控 四川农业上学8 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t t i a n f um e a tg o o s ea n dl a n d e sg o o s ew e r es t u d i e di nt h i sr e s e a r c h t h el x r up a r t i a l g e n es e q u e n c e so fg o o s ew e r ea n a l y z e d ，a n dt h ee x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i co f l x r ag e n ei n t i s s u ew e r es t u d i e d m o r e o v e r ，t h er e l a t i o nb e t w e e nl x r am r n aa b u n d a n c ea n df a t t y d e p o s i t i o n ，p l a s m ap a r a m e t e r , t h ea c t i v i t yo fl p l ，t h em r n aa b u n d a n c eo fl p l t h e s e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e d ： t h ep a r t i a ll x r ag e n es e q u e n c e so fg o o s e ，c o n t a i n e dap b o x ，az i n cf i n g e r s c o n s t i t u t i o n a lu n i ta n dac o m p l e t el i g a n db i n d i n gd o m a l n ( l b d ) ，w h i c hw a s1 0 0 5 b pl o n g a n di tw a sh i g h l ys i m i l a rt oo t h e rs p e c i e sw h i l et h es i m i l a r i t yb e t w e e ng o o s ea n dg a l l u s w a sh i g h e s t ( 9 5 2 ) ，b u te i g h ta m i n oa c i dv a r i a t i o nl o c a t i o n se x i t e d t h el b do fl x r a h a d6 6 0 b pa n de n c o d e d2 2 0a m i n oa c i d sw h i c hc o n t a i n e dt e nuh e l i c a ls n l 】c f u r e t h em r n ae x p r e s s i o no fl x r ug e n ew a sd e t e c t e di nl i v e r ，a b d o m i n a la d i p o s et i s s u e s a n ds u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u e so fl a n d e sa n dt i a n f um e a tg e e s e ，w h i l ei tw a sh i g h e s ti n l i v e r f o r c e - f e e d i n gm a r k e d l yi n c r e a s e dt h em r n ae x p r e s s i o n o fl x r ag e n ei n l i v e r ，a b d o m i n a la d i p o s et i s s u e sa n ds u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u e sa n di t se x p r e s s i o n a b u n d a n c eo f t i a n f ug e e s ew a sh i g h e rt h a nl a n d e sg e e s ei nl i v e ra n da b d o m i n a la d i p o s e t i s s u e s ( p 0 0 0 1 ) ，b u t l o w e ri ns u b c u t a n e o u s a d i p o s et i s s u e s ( p ( o 0 0 1 ) t h e s e d a t a s u g g e s t e dt h a tt h ee f f e c to f f o r c e - f e e d i n gi sd i f f e r e n ti nd i f f e r e n tb r e e d sa n dt i s s u e s t h em r n aa b u n d a n c eo fl x r uw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dt ot h ew e i g h to f l i v e r , a b d o m i n a la d i p o s et i s s u e sa n ds u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u e si nd i f f e r e n td e g r e ea f t e r o v e r f e e d i n g t h eu p r e g u l a t i o na b i l i t yo ft i a n f ug e e s ei ns u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u e sa n d a b d o m i n a la d i p o s et i s s u ew a sb i g g e rb u tt h eu p r e g u l a t i o na b i l i t yo fl x r at ol i v e rf a t t y d e p o s i t i o nw f l sb i g g e ri nl a n d e sg e e s e t h er e l a t i o n sb e t w e e nl x r am r n aa b u n d a n c e a n dp l a s m ac o n c e n t r a t i o no ft g ，v l d l ，t h el i p i dc o n t e n to fl i v e ra r es h o w e dp o s i t i v e c o r r e l a t i o n ( o 5 3 0 8 9 ) o fm e d i u mi n t e n s i t y ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h em r n aa b u n d a n c e o fl x r ac o u l du pr e g u l a t e dt h ep l a s m ac o n c e n t r a t i o no ft g ，v l d la n dt h el i p i dc o n t e n to f l i v e r b u tt h em r n aa b u n d a n c eo fl p lw a sn o ts i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t ew i t hp l a s m ac o n c e n t r a t i o n o ft g ，v l d l ，a n dt h el i p i dc o n t e n to fl i v e r t h el x r ag e n eo fg e e s eh a st h ea b i l i t yt ou p r e g u l a t et h em r n aa b u n d a n c eo fl p l ，w h i c hw a sd i f f e r e n ti nd i s t i n c tt i s s u e s ，a n dt h e c o r r e l a t i o nw i t ht h ea c t i v i t yo f l p lw a sn o ts i g n i f i c a n t k e y w o r d s ：g o o s e ；o v e r f e e d i n g ；l i p o p r o t e i nl i p a s e ；l i v e rxr e c e p t o ra ：s e q u e n c e s a n a l y s i s ；e x p r e s s i o nr e g u l a t i o n i i 符号说明 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 虢童晚芍 年舌月诉日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被夯阅平借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以州不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 渊年莎月咖 撕) 年夕月文日 l 芍 观厄 多以 名名篙研导 四川农业土学2 0 0 7 届硕士学位论文 月j j 吾 肝脏x 受体( l i v e rx a c t i v a t er e c e p t o r sd ) 是核受体超家族的一名成员，也是重 要的脂质传感器，在一些脂肪代谢旺盛的组织中如肝脏、小肠、心脏中大量存在，通 过其相应的配体过氧化物酶增殖受体( p p a r ) 或维甲酸x 受体( r x r ) 等形成异二 聚体，然后在特定的激活剂( 氧化固醇类) 的激活下调控靶基因的转录，从而影响机 体内脂类和糖类物质的代谢。脂蛋白脂酶( l i p o p r o t e i nl i p a s e ，l p l ) 是水解酶家族 ( 包括肝脂酶和胰脂肪酶) 的一种三酞甘油蛋白酞基水解酶，是甘油三酯( t a g ) 降 解的限速酶，参加各种脂蛋白的代谢并对其进行调控，使血浆中富含脂质的脂蛋白降 解。在哺乳动物中，l p l 是动物肥胖基因借以调节脂质代谢的重要功能蛋白，通过控 制其在脂肪组织与其他组织器官中的表达水平的高低直接决定脂肪组织与其他组织 器官脂质底物配额的相对量，从而间接决定从食物中摄入脂类的代谢前途，以体脂形 式贮备起来或作为能源底物消耗掉，并晟终对机体脂质蓄积状况产生决定性影响。目 前，在哺乳动物上已经证实l p l 是l x ra 的靶基因，受到l x r d 的调控。因此，研 究l x ra 基因的序列和结构特征、组织表达特性，以及对l p l 的表达调控机制，对 探讨水禽不同部位脂肪形成的机理及脂代谢相关基因调控等具有重要的理论意义。 1 文献综述 1 1 家禽的脂肪沉积 动物脂肪沉积主要与遗传、饲料能量水平及某些具体调控作用的因子相关，这些 调控因子表达的质和量的差异均会影响到动物机体能量的重新分配。组织中的某些功 能性蛋白因子对各组织的分化和基因表达起着重要的作用，也可造成脂肪沉积能力出 现差异。不同品系长白猪的研究表明，脂肪沉积能力差异与脂肪组织中c a m p 水平 腺苷酸环化酶活性以及影响组织中1 4 碳和1 6 碳脂肪酸转化为1 8 碳脂肪酸的因素( 如 酶) 显著相关【1 1 ，表明组织中存在着某些与脂肪沉积直接或间接相关的活性蛋白质因 子，它们在动物体脂肪沉积中起着重要的调控作用。 已知哺乳动物皮下脂肪组织的发育早于腹脂，研究发现禽类的情况也类似于哺乳 动物。0 h e a 等研究发现鸡生长期的第1 周龄脂肪细胞的增生是其脂肪组织生长发育 的主要现象，并观察到这种现象一直持续到1 5 周龄【2 】，这一结论被h o o d 等用肉仔鸡 所做的实验结果进一步证实，1 5 周龄后随着鸡生长发育过程的推移，脂肪细胞的肥 四川农业上学g 0 0 7 届硕士学位论文 大作用成为脂肪组织增长的主要过程【3 。4 】。f u l l e r 等发现随着生长过程的推移，鸡的 腹脂垫增长速度高于体重增长速度【”。s i m o n 等对瘦鸡系和肥鸡系脂肪组织的个体发 育研究获得了类似结果，表明通过遗传选择降低体脂量在不同部位存在着差异，而此 种差异似乎是人们所期望的。这些研究结果证实了不同体躯部位脂肪组织形成及其调 控的遗传机制是不同的，其机理可能与不同部位脂肪组织对激素和酶控制下的脂质分 解与沉积，以及微血管组织发育状态存在差异有判7 】。c a h a n e r 等对肉鸡几个部位的脂 肪组织测定表明，以腹部脂肪为最高，其次为颈部皮下脂肪，再次为腿部皮下脂肪【s j 。 b u t t e r w i t h 等研究表明，5 5 日龄肉仔鸡腹脂重是腿部脂肪重的4 倍，是颈部皮下脂肪 重的3 4 倍1 9 】。 家禽体脂肪沉积程度取决于基础代谢中的营养分配，其中胰岛素起着重要作用。 胰岛素敏感个体的肝细胞葡萄糖转运速度快，脂肪合成酶活性较高，v l d l 合成和前 脂肪细胞的增殖也极强。g r i f f i n 等研究表明，血浆中v l d l 浓度与脂肪沉积之间存 在很强的相关，如果脂肪合成速度超过v l d l 的分泌能力，t g 就在肝脏中沉积【j 0 1 ， 除了填鸭、鹅脂肪肝等的生产，在实际中并不希望发生这种情况。l p l 的生理功能恰 恰是水解v l d l 中的t g ，负责脂肪的贮存，并证实l p l 是l x ra 的靶基因，受l x r q 的调控l l u 。 由于水禽有着与鸡不同的脂肪储存系统，除了同鸡一样可将脂肪存储在腹部外， 水禽的脂肪还可以大量沉积在皮下和肝脏中。宁中华等研究北京鸭发现，皮脂始终随 着体重的增加而呈正比例增加，和屠体重的比率也基本保持在1 8 5 左右，但是后期 有增加的趋势。e v a n s 发现鸭的皮下脂肪发育早于腹脂垫【3 l 。脂肪性状是受多基因 控制的数量性状，其变异的遗传部分由基因决定。脂肪组织在不同部位沉积的时间和 数量存在着差异，可能是调控不同部位脂肪组织的基因在序列的启动时间和空间上存 在着差异所致。肉仔鸡体脂沉积规律研究表明旧1 4 1 ，各部位脂肪沉积不仅按一定的顺 序进行，而且不同部位脂肪沉积量不同，有关鹅体脂沉积规律的研究尚未见报道。 1 2l x r 研究进展 l x rfl i v e rx a c t i v a t e dr e c e p t o r ) 是细胞核受体超家族的成员之一，也曾被称为孤 儿受体【1 5 】。作为转录因子，l x r 调节与胆固醇代谢、脂代谢以及糖代谢有关基因的 表达，从而调控着机体内的相关代谢活动，被认为是重要的脂质传感器，目前l x r 成为国内外研究的热点。 四川农业文学2 0 0 ；r 届硕士学位论文 1 2 1i _ x r 的结构特点 l x r s 是核受体超家族的成员，具有两种亚型：l x r a ( n r l h 3 ) 和l x r1 3 ( n r l h 2 ) 1 1 5 1 ，在结构上有着共同的特征，分为六个部分，即a 、b 、c 、d 、e 和f 区，b 区在 长度、序列和结构上高度多变，该区含有一转录活化区，称为a f l ，其通过和基础转 录因子、辅活化子或其他转录因子的相互作用活化目标基因。c 区为d n a 结合区 ( d n a b i n d i n gd o m a i n , d b d ) ，高度保守i t 6 。各种核受体的d b d 有很高的同源性， 在结构上有两个锌指( z i n cf i n g e r ) ，分别称为p 盒( p 2 b o x ) 和b 盒( b 2 b o x ) ，d 区为一多 变的绞链区，允许核受体蛋白曲折或者改变构型，通常含有一核定位区和一转录活化 区。e 区相对较大( 约2 5 0 个氨基酸) ，并高度聚合，其功能较复杂，配体结合区( 1 i n g e d b i n d i n gd o m a i n ，l b d ) 在e 区，此外，e 区还具有和热休克蛋白结合、聚合、核定位、 转录活化、分子内沉寂、分子间阻遏的作用。核受体的d 区的转录活化区，称为a f 2 。 l x r s 在c 端还含有一段多变的f 区，目前还没有发现f 区的特定功能。d b d 区域包含 了两个锌指结构和两个具有特殊基序列的p b o x ，负责识别相应的靶基因顺式元件并 与之结割 9 1 。w u 等通过不同的划分显示核受体家族包含两个d b d 结合域并指出该 结构有可能识别靶基因特殊序列并与之结合，参与二聚化过程；含有两个d b d 的核受 体共享同一个祖先基因并通过复制而形成两个d b d 域1 2 叭。人l x rq l b d 是e 1 2 4 8 个氨 基酸构成的，其保守性相对d n a 结合区较低，包括了三个小的功能区，分别是转录 活化结构域、二聚化结构域以及c 端疏水区【2 1 l 。l b d 至少具有四种功能：参与二聚化、 与配体结合、与共激活因子或共抑制因子结合和反式激活作用【2 2 ，2 3 1 。近年来，各种 生物物理技术( 如荧光色谱、圆二色谱和等温差热分析) 的广泛使用，使得对受体与 配体结合特性的研究越来越广泛f 2 4 l ，但对受体二聚化作用的研究相对较少。核受体家 族大都是通过l b d 来实现二聚化的，因此，研究l b d 就有利于研究二聚化过程的动力 学性质。l o n a r d 等研究报道l x r 在激活剂的作用下，通过l b d 区的第3 、4 、1 2 个 q 螺旋发生构象变化和相应的配体结合而产生基础转录来传递生物信息【2 3 】。s t e f a n 等 首次对l x r l b d 的晶体结构进行研究，指出l x rn ，l b d 含1 2 个a 螺旋和2 个b 折 叠，并对其电子云密度与配体结合待进行研究，其结论和l o n a r d 的研究相同 2 6 1 。o u 等2 0 0 1 年报道多不饱和脂肪酸可竞争性的结合到l x r q l b d 上而抑铜j l x r 与配体 的结合从而抑制其功能的发挥 2 7 1 。而s t e f a n 进一步证实在e 2 6 7 的突变更明显的抑制转 录的产掣2 6 j 。j e a n p a u lr e n a u d 等选用t l b d 相似的三个核受体成员( r e v e r b a ，r v r ， 口川农业大学彩刃届硕士学位论文 r a r ) 进行研究证实r e v - e r b a 和r v r 的同源性校r a r 高，l b d 叉的疏水面在激活剂和 辅助抑制剂的作用下可影响受体转录的发生【2 8 1 。l x r 与视黄醛衍生物受倒k ( r e t i n o i d - x - r e c e p t o r ，r x r o ，亦称n r 2 b1 ) 可以先与各自的配体结合，然后两者再形成异二聚体， 它们也可以先形成异二聚体然后再与各自的配体结合，此异二聚体可以被其两个组成 部分的配体单独或共同激活且共同激活时作用相互叠加。激活之后，l x r r x ra 就与靶基因上特定的顺式作用元件( l x rr e s p o n s ee l e m e n t ，l x r e ) 相结合。l x r e 是由 两个被四个核苷酸分隔的六核苷酸直接重复序列构成，如：a g g t c a n 4 a g g t c a ( d r 4 ) ( 其半数核苷酸保守，另一半核苷酸变化显著) ，从而增强参与胆固醇和脂肪酸 代谢的靶基因的表达 2 9 - 3 2 1 。y u 等报道显示，在人的l x r q 启动子区域存在3 个l x r e ， 第一个l 型l x r e 比后两个相同的2 型l x r e 有更强的与l x r q r x r 亲和力，在l x r d 诱导调节中更具有重要的作用【3 3 】。此外，现在的研究表明：l x r 还能调控与炎症反应 有关的细胞因子的表达如1 n f a 、i l 4 、i l 6 等 3 4 - 3 8 】，并参与糖类代谢的调节，在小 鼠研究模型中，激活后的l x r d 可以调节相关糖代谢基因，抑制肝脏糖异生从而增强 对糖的耐受能力【3 9 , 4 0 。 图l ：l x r q 的结构模式图 f i g 1t h e s t r u c t u r eo fl x rn 1 2 2l x r 亚型的组织分布特点 l x r om r n a 的表达具有组织特异性，它主要表达在肝脏、肠、肾和巨噬细胞， 其中在肝脏表达最高，而l x r l 3 几乎在所有组织中表达h “4 2 1 。但与l x r 相比， l x rb 在所有组织都以低水平表达。在人的单核细胞衍生的巨噬细胞内有较高的 l x r m r n a 表达水平【4 3 - 4 5 1 人巨噬细胞的l x ra 是l x ra 基因的一个靶基因， 4 四川农业文学助7 届硕士学位论文 l x r q 被激活后可增加l x r 的m r n a 表达丰度，受l x ra 的自我向上调节【4 5 】。l x r q 的表达也存在时间的特殊性，a z u s a s a k a m o t o i 等对鼠胎儿期l x ra 的表达进行研 究显示：小鼠肝脏巨噬细胞在第1 2 天出现l x rq 阳性，到第1 8 天出现高峰值i 拍l 。 l x rn 和l x rb 的d n a 结合域，配体结合域有7 7 的氨基酸是一致的，而且都能够 以相似的亲和力与内源性氧化甾醇结合 4 7 1 。l x r a r x rc l 和l x r b r x ra 异二聚 体能分别与l x r e s 结合，调节靶基因的表达。但l x ra 和l x rb 的功能是不完全 相同的。 1 2 3l x r 的配体 到目前为止，己经有一系列l x r 的天然配体氧化型 j 醇( o x y s t e r 0 1 ) j 丕渐被发现如 2 4 ( 8 ) ，2 5 一环氧胆固醇 2 4 ( s ) ，2 5 - e c 、2 0 ( s ) 一羟基胆固醇 2 0 ( s ) 一h c 、2 2 ( r ) 一羟基 n 固醇 2 2 ( r ) h c 、2 4 ( s ) 一羟基胆固醇【2 4 ( s ) 一h c 】和2 7 羟基胆固醇【2 7 h c 】等陋5 0 1 。 此外j a n o w s k i 等通过配体结合分析实验发现，这些天然配体氧化型 醇以其在体内 的浓度能够直接与l x r s 结合【4 8 j 。研究还表明：固醇侧链的特殊位置加上一个氧，是 以高亲和力结合并活化l x r s 所必要的：c 2 4 位上含酮基的配体其结合并激活l x r s 的能力更高，因为侧链的酮基可以作为氢键受体；如果在固醇的b 环上引入一个氧 就会形成l x r oq f 型选择性配体【5 “。己有研究显示：在2 4 s ，2 5 环氧胆固醇的基础上已 经合成了l x r o 亚型选择性配体5 ，6a2 4 s ，2 5 一双环氧胆固醇i5 2 1 。目前，两种人工 合成的l x r 配体t 0 9 0 1 3 1 7 和g w 3 9 6 5 经证实也能有力激活l x r ，但它们在结构上 与天然配体氧化型 j 醇无关。实验证明当给予啮齿动物t 0 9 0 1 3 1 7 时，其饮食胆固醇 的吸收减少，血浆和肝脏的甘油三脂、磷脂水平增加。这些合成的配体对l x r o 和l x r b 两个亚型有相同的激活效应。亚型特异性配体的研制可能对测定两个受体的相对作 用有很大帮助【5 鲋。 1 2 4l x r 的靶基因 随着对l x rc l 研究的进一步深入，己经有一系列参与脂和胆固醇代谢的l x r 靶 基因被识别。如：胆固醇7 a 羟化酶( c y p 7 a i ) 、固醇调节元件结合蛋i 刍( s r e b p l e ) 、载 脂蛋白e ( a p o e ) 、脂肪酸合成酶( f a s ) 、胆固醇酯转运蛋白( c e t p ) 、脂蛋白脂酶( l p l ) 、 a t p 结合盒转运蛋白a i ( a b c a l ) 、a t p 结合盒转运蛋白g i ( a b c g l ) 、a t p 结合盒 转运蛋白g 5 ( a b c g 5 ) 、a t p 结合盒转运蛋白g 8 ( a b c g 8 ) 等。除了a b c g 8 尚未确 定之外，其余靶基因上都己经找到明确l x rn 的作用元件，它们在调节胆固醇向胆 四川农主土学黝7 届硕士学位论文 汁酸转化( c y p 7 a 1 ) 、脂肪酸合成( s r e b p i c 、f a s ) h d l 形成a p o e 、血清脂蛋白代 谢( c e t p , l p l ) 、固醇的跨膜转j 垂( a b c a l ，a b c g i ，a b c g 5 ，a b c g g s ) 中发挥了重要 作用。目前报道的l x ra 对靶基因的调节如图2 ，毫无疑问，如果l x r l l 的基因缺 失将会引起脂代谢的重要改变 5 3 , 5 4 1 。 1 2 5i _ x ra 的作用机制 w o n g 等通过对甲状腺激素受体( t h y r o i dh o r m o n er e e e p t o e ，t r ) 异二聚体( t r r x r q ) 的研究提出，核受体靶基因的转录活化过程可分为三步，而对野生型和以 l x r a 敲除小鼠的研究证明，此转录调节模式同样适用于以l x re l ：( 1 ) 配体缺乏时， 辅阻遏物与以l x r q r x r a 结合抑制转录；( 2 ) 激动剂与以l x r 或r x r 结合， 使辅阻遏物解离，产生基础转录；( 3 ) 辅助激活因子补充结合到活化的以l x r n r x r 上，l x r q 相关靶基因的转录被完全激活( 图2 ) p 5 1 。 图2 ：l x r 作用机理图 f i g 2 t h em e c h a n i s mo f a c t i o no fl x r d 1 3l x rq 和i _ p l 的调控研究 1 3 1 动物t x rq 的表达调控研究 l x r l ：1 的表达受到不i 一因素的影响，多个研究表明甾体类激动剂( 胆固醇的氧化 物及其类似物) 和非甾体类激动剂( t 0 9 0 1 3 1 7 、g w 3 9 6 5 、p a x i l l i n e 等) 都可以正向 调节l x r q 基因的表达【5 6 删。大多数内源性l x r a 配体对l x r o 作用均比较强。c h a w l a 6 四川农业史学黝7 届硕士学位论文 等在l x r n 的启动子序列中找到了过氯化物酶体增殖子激活受体( p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r a c t i v a t e dr e c e p t o r ，p p a r ) 反应元件，巨噬细胞的胆崮醇输出由p p a r - y 激 活，并通过l x r a 介导，p p a r x 能诱导l x r 的表达，p p a r 与l x r 之j 日j 存在串话 ( c r o s s t a l k ) 1 6 1 1 ，这一研究结果可能解释t t o b i n 等的发现：脂肪酸能诱导大鼠肝细胞 瘤细胞和原代肝细胞l x r dm r n a 水平和蛋白水平的表达，但对l x r b 的表达无影响 6 2 j 。脂肪酸通过对p p a r 的激活诱导了l x r 的表达，但o u 等的研究揭示脂肪酸是 l x r 的竞争性抑制剂1 6 3 】，所以，脂肪酸在对l x rq 的调节中起着十分复杂的作用。此 外，研究己表明在肝细胞中胰岛素能诱导l x rc i 的表达【硎，这一发现揭示l x r 可能是 胰岛素作用信号通路的组成部分，也提示了l x r a 新的生物学作用。有关t 0 9 0 1 3 1 7 的研究资料表明，在体外实验中它能诱导l x ra 靶基因，导致缅胞内t g 沉积。当用 于动物时，显著增加肝脏的脂肪沉积 6 5 , 6 6 1 。在l x r a 缺乏配体时，其表达则受到抑制。 不饱和脂肪酸作为l x r 配体的竞争性抑制剡，阻止l x r r x r 异二聚体与l x r e 结合， 拮抗l x r 的活性【6 5 , 6 6 j 。人血浆中也含有天然的l x r s 的拮抗剂，如甲轻戊酸的代谢物、 二垅牛儿基焦磷酸4 5 ，4 7 ( g e r a n y l g e r a n y p p , g e r a n y l g e r a n y l p yr o p h o s p h a t e ) 1 6 7 1 。 1 3 2l x ra 对靶基因的表达调控 目前发现的l x ra 靶基因有3 4 个，它们参与机体内多种物质的代谢活动，主要 包括脂质代谢、碳水化合物代谢、炎症应答、能量平衡等，而l x ra 对它们的调节 各有不同( 图3 ) ，除了与糖代谢有关的p e p c k 、f b p l 、g 6 p 、p f k f b 3 基因和参与炎 症应答的对多数靶基因外，l x ro 表现出对靶基因的正向调控作用，在对脂质和胆固 醇代谢的相关靶基因上均表现出一致的正向调节功能。 胆固醇7 羟化酶c y p 7 a 是肝脏中胆固醇合成胆汁酸的限速酶，对于调节体内胆 固醇经胆汁酸途径的分解代谢，维护胆固醇内环境稳定起重要作用。研究发现给l x r q 基因敲除小鼠高脂饲料可导致小鼠肝脏中胆固醇酯快速积聚，目前己证明这主要是 由于l x rd 的缺失造成机体在高脂饲料情况下c y p 7 a 的表达不能正常上调。c y p 7 a 启动子中有功能性l x r e 存在，l x r a 通过调控c y p 7 a 的合成控制机体内胆固醇合 成，胆汁酸的排泌途径，促进胆固醇的逆转运。虽然在l x ra 基因敲除小鼠的肝脏 中l x r l 3 的表达不受影响，但并不能弥补l x ra 缺失造成的影响，提示二者具有不 同的生理功能【6 8 】。 a b c 转运蛋白( a t p - b i n d i n gc a s s e t t et r a n s p o r t e r ) 是与a t p 相耦联的膜结构蛋 四川农业土学黝卯届硕士学位论文 白，能对多种物质进行跨膜转运，目前发现a b c 超家族中的a b c a l 、a b c g l 、 a b c g 5 和a b c g 8 基因是l x ra 的靶基因。a b c a l 蛋白是实现胆固醇逆转运( r e v e r s e c h o l e s t e r o lt r a n s p o r t ，r c t ) 过程第一步的关键所在，a b c a i 运转蛋白主要分布在肝 脏组织和巨噬细胞中，能转运胆固醇磷脂使它们与游离的a p o a l 结合启动h d l 的 形成旧1 。a b c a i 基因的失功能性突变可引起t a n g i e r 病 7 0 - 7 2 】，病人由于a b c a i 基 因发生变异。细胞胆固醇外流功能障碍导致血浆h d l 缺失、胆固醇酯大量积聚在外 周组织中，表现出h d l 分解代谢过度和早发动脉粥样硬化现象。研究证明l x r d 可 通过调控a b c a i 靶基因的合成促进胆固醇逆转运过程并可能逆转泡沫细胞的形成 及抑制动脉粥样硬化 7 3 , 7 4 。骨髓移植实验研究表明，选择性的使巨噬细胞a b c a i 基 因功能丧失在没有改变血脂的情况下，可导致小鼠动脉粥样硬化病变程度加重1 7 5 7 6 。 相反，使人的a b c a i 基因在动脉粥样硬化小鼠中大量表达则明显降低了小鼠动脉粥 样硬化病变的面积 7 7 , 7 8 i 。a b c g s a b c g 8 主要在人和小鼠的肝、十二指肠以及小肠近 端的上皮细胞中表达，能够介导甾醇从肝脏的分泌及食物f 醇从肠道的吸收、排泌和 运输。通过对常染色体隐性遗传性疾病谷固醇血症及以转基因小鼠进行的研究证明 a b c g 5 、a b c g 8 基因能直接被l x r 调控1 7 9 。 脂蛋白脂肪酶( l p l ) 是脂蛋白代谢的关键酶，能够水解血浆中的甘油三酯，释 放游离脂肪酸到外周组织。在肝脏中，l p l 还能促进h d l 胆固醇的吸收，从而促进 胆固醇的逆转运。z h a n g 等的研究表明，l p l 基因是l x r 的直接靶基因并主要依赖 于l x r a 而受l x r1 3 的影响较小j 。 当l x r o 过表达时，在不同的饮食状况下对于敲除l d l r 的小鼠其作用是不同的， 在食用低脂肪低胆固醇的小鼠中，l x r o 的过表达可选择性地调节某些靶基因，而导 致t g 和v l d l 均显著增高；在高脂肪高胆固醇营养状况下，l x r o 的过表达可调节 大量的靶基因，而使得t g 和v l d l 均显著降低，血液脂质得到改善i g o 。 动脉壁中巨噬细胞分泌的载脂蛋白e ( a p o e ) ，能够产生抗动脉硬化作用，但分 子机制不清楚。最近t a y l o r 等i sj l 在人a p o e 基因中发现了两个增强子：m u l t i e n h a n c e r 1 ( m e 1 ) 与m u l t i e n h a n c e r2 ( m e 2 ) 。随后l a f f i t t e 等吲证明，l x rq 与l x r1 3 及 它们的氧化甾醇配体是巨噬细胞和脂肪细胞组织中a p o e 表达的关键调节因子。 l x r r x r 异源二聚体通过与m e i 和m e 2 中共有的保守l x r 反应元件相互作用而直 接调节a p o e 的转录。 8 四川农业土学黝刀届硕士学位论文 除了以上几种外其它靶基因还有甾醇调节元件结合蛋白- l c ( s r e b p i c ) ， 胆固 醇酯转移蛋白( c e t p ) ，载脂蛋白一a p o c i 、a p o c i i 、a p o c i v ，磷脂转运蛋白( p l t p ) 等，它们的表达呈现出以下两种生物学功能，首先，通过促进胆固醇外流、分解或减 少吸收，清除体内多余的胆固醇；其次，有脂肪酸合成作用1 3 3 洲。l x r 通过调控体 内胆固醇的代谢，在脂代谢方面发挥十分重要的作用，因此，它又有体内胆固醇感受 器之称。 1 m i i 强i j r 科g 峭 i 1 i k n 0 1 1 “n 柑帅i d 目 l 喇d d i e m h l h 岫 c 押抽i h 删豫机胛h 驰e c + l v p n l m 日d l o l 蜘4 i o m e 鲥f 呲 1 3 f ：f 丌m 垲”倒ho f 曲o l e 蜘j 【啪聃m 川m 4 ，一洲n 怖唧喊蛐tl 艘h 虻眦a “b t h t + 椰e 巾j ：n u 娜删i 删n 嗍3 ma 【 o p 舢0 4fl 船e6 蕾 酗g lh 伽4r 陋蝴咖二w 制l m i m d 巾仲h m f 眦1 i 。出卸相呻坤自t 18 b c 瑚c e i l 址i m 鼬【哇1 1 e m d 日咖i 咖l 州a m 1 1 船f9 b r 删日 i m p o l t 洲胁l n 啦f m 蚋缸# p _ ) r 【f 盯 最肪p l c t ，”一m 啊虻眦fp d 丝恻，n 鲫口硝d 懈 晖螂fl 皿啦t 越 助- 垤 刚哪n 蛐嗍p m 啪p * 日咖咖啡h o n 仙槲n n 脚蛐蛔f 2 嚼 m t r 州r a t w 协锄l n 群j 蚴tm mp r 岫u + l a g 靳 t h 目 r 昭c t 岍z * 帅f o m 圳j m i o 喈r l m h f 舢蝴mp p + t t ta r 啦! 一油fl ej 6 卸 埘c 帅o ：n 褂w m 时瞄1 0m a 叶酏m 岫邓r 吲s 日h 非蛐f 嘲7 耐国1t 艇7 l i 舢tf 吼蹦* o m 吲删o m 幢m 心m p n l 哪“t 神噩bfl 强 l l l 2 陋哪f f 帆m 聊嗍砷玎即删efl 眦 口 l x 自_ m - 辨叫胁tl 砒期 l p l l # m o ”* 弈r 帅bm 日蚰g h 晔_ 州舯i e i 皓f l x 雎s l p m t 锄诳l 十岍f 一j p m t 咖i h 西c 目m p n m 【耵。啪吣吼f 船 日m i l i d l 吼r m 删mr ，h “倒巾1 月【q mfu 旺 器 嚼 d v 嘣曲日h 鼎鼬d 卿d w t 删o p 蛐fl x 雎 o n 蚶1 哪m 自口豳 p _ 瞧 b m + - l m l m m h e f _ i n 和嘲叫，岫 l斗墨 f 卸lo竹r呻t 型 哪 a m * 晰p 咻山鼬煞 阳曲a 嘶r 目柙n r 町附 h p z j 砒蛳捌3 i m l | n 艚t g u t ia幽帅m目t 盟 n 日删r 目帷 t w 州咖越n 目哪日k 鼬t “i x e g施q i 惦舡m 啦“日珊删时-盯 c 髓l n 衄m q k 聃皿衄l行 叫咖劬【呻蜘l 村i 开 口目口m _ l 研- in 栅q 眦i n 船o 岫埘联n * i蹭 a m 惰 f 耐乜 拥讯蚴翱雕船蜘咖肆蜘胛g 帆i m n 山嚯lc 弛1 咖网啪m i ”赳ie n l 霹 霭 p m 蝴刎啤绸f p 删n 口f 酬州岫幽呦畸l l e 日d n 畔 哪! t 自d p u i n 哪聱e 瞄t o l + 螂+ a l e 脚虮岫印p 蛐h c n l 瞄翟 m p u l ： l i ) - m l j - l 伽帅眇1 孵删蚺dl 删靶删t 枷m 晰eo w 细【l蓝 ( 岫目“啄哪嗑e 蛔e k 刊口妇p 喇删畸呷酵嘲目坍眦砒1 ，u f 。州瘦tj 山帅吖山州m 6 * ，吼r 利目州 h r 咄l 协r l 蛐q h dm | 叫h 1 hh 池am i 州1 w 一【n 砒。 r 。玎i f ”p 懈畦嗍l 如叶m e b l 丑d 目山雌- 神蛐d n 矗m 一 【龃，耵i me b 嗥v a h 乒0 j 鼬 蓦6s d t 咖i 扎，删e t 驯柚蝴d 越 图3 ：l x ra 的靶基因【8 5 】 f i g 3t h et a r g e tg e n eo fl x r a 【8 5 1 1 3 3 动物l x rq 对l p l 的表达调控与脂肪沉积研究 d a v a i l 等指出脂肪肝产生于食物碳水化合物新合成的t a g 的大量贮存8 郇7 ，而肝 脏的脂类蓄积量可能取决于由v l