（卫生毒理学专业论文）环境溶藻细菌的检测与评价.pdf

中文摘要 环境溶藻细菌的检测与评价 研究生赵传鹏指导老师浦跃朴教授 东南大学公共卫生学院 中文摘要 我国盲营养化湖泊的比例达到6 0 太湖、滇池等重要水源水体在复秋季= 竹频繁爆发蓝 藻水华，严重影响了当地人民生活乖j l 农、j e 发展。在各种理化手段治理效果不甚理想的情况 下，微生物除藻技术已经越来越受到研究者的关注。溶藻细菌在此技术中起着重要的作州。 本课题旨在建立分子生物学方法分析、检测环境溶藻细菌，并对太湖土著溶藻细菌进行分离 与除藻效果的初步评价，为微生物除藻技术的构建和应用提供科学依据。 本文分四个部分进行阐述： 1 环境溶藻细菌p c r 定性检测法的建立 假单胞菌属是较为常见的环境溶藻细菌。本研究根据假单胞菌属1 6 sr r n a 基闻序列设 计特异性引物，应用p c r 技术打增目标细菌。针对p c r 反应条件中的m g ”、d n t p 、引物、 t a q 酶，应用止交试验设计确定了假单胞菌属特异性引物p c r 扩增的最佳反应体系：反应 总体积为2 0 l l l ，含d n a7 0 1 0 0 ng 、d n t p 3 0 0 “m 一匕f 游引物各1 0 p m 、m g c l 21 0 m m 、t a q 酶1 5 个单位、l o r e a c t i o nb u 髓r25 此。热循环条件为：9 5 ，5 m i n ：3 0 个循环9 2 ， i m i n ；6 4 1 ，1 m j n ：7 2 ，l m i n ：7 2 ，延伸1 0 m i n 。得到9 9 0 b p 的特异性条带，此方法 能够快速检测出环境样本中的目标菌属，最低检测限为3o n 2 d n a 。 2 环境洛藻细菌r t q p c r 定量检测法的建立 本研究应用s y b rg r e e ni 标记技术，与上章的最佳p c r 条什相结合，建立了实时荧光 定量检测假单胞菌届在环境中的相对丰度的r t q p c r 方法。该方法对总细菌的检测范同为 1 0 3 1 0 8 个基因拷贝“l ( r 2 = 0 9 9 7 ) ，假单胞菌属的检测范同为1 1 0 5 个基因拷贝m l ( r 2 = o 9 9 4 ) 。总细菌与假单胞街属初始拷贝数与c t 值之间的线性关系曲线表达式分别为：c t ( u s u ) = 3 ，9 0 8 l l g c o p yn u m b e r 卜4 60 7 4 1 ，c t ( p s e ) = - 3 2 6 5 l g c o p yn u m b e r + 2 26 7 8 9 。应阳 东南大学硕= b 学位论_ 义 该方法定量检测太湖水样及南京市污水处理厂活性污泥等环境样本中假单胞苗属的丰度，证 明此方法在检测环境样本中假单胞菌属丰度的可行性。 3 溶藻细菌p c r 检测法在太湖水除藻研究中的应用 应j = ；| 以上建立的常规p c r 技术以及r t o p c r 技术，分别对悬= | 丰丁太湖梅粱湾水域的除 藻中试装置中三种人一f 介质富集的总细菌基因组d n a 进行定性、定量分析。常规p c r 技术 对8 月份二种介质定性分析发现，捌利上寓集人量的假单胞凶属i 实时荧光定量p c r 对5 一l o 月问三种介质定量分析发现，j 种介质上目标细菌丰度分别为组合填料：o8 4 、无纺布填 料：o5 8 、弹性填料：o3 5 ，其对假单胞茁的富集能力由强至弱为组台填料 无纺布填料 ，弹性填料。在o = o0 5 的水平上各个装置叶1 间纵面的细甜丰度高丁进水及出水纵面，斤两 者在统计学上无明显的差异。每个纵面上表面采样点及底部采样点上细菌的丰度低于中部 采样点。 4 溶藻细菌的分离及其评价 从太湖蓝藻水华爆发时分离获得了铜绿微囊藻，并经高效液相色谱对其产毒量进行分 析。结果表明，当藻细胞起始浓度为7 8 1 0 。个m l ，采样问隔为8 小刚，四个时间点每1 0 6 个藻细胞的m c l r 产毒索量分别为0 3 5 2 3 卧o3 0 4 7 “卧o 2 8 1 5 p g 、o 2 2 7 l g 。于梅梁湾 水域放置的除藻中试装置的人一r 介质上分离山一株溶藻细菌，经形态学、生理与生化特性 以及1 6 sr r n a 特异性引物扩增综合分析，初步鉴定该株苗属丁假单胞菌属：该茁对源自太 湖的铜绿微囊藻具有较强的溶藻作用。其最低溶藻浓度为1 0 5 个m l 。在太湖水、p b s 以及 b g l l 培养基等不同反应体系内，当藻细胞初始浓度为7 8 1 0 6 个m l 投加菌液浓度为1 0 6 个m l 时，该菌2 4 小时藻细胞溶解率分别为8 5 9 6 79 平l _ j9 1 0 ，完全溶藻时问为4 8 小时：该株细菌在去除微囊藻细胞的同时，对m c l r 具有较强的降解作用。在微囊藻毒索 l r 起始浓度为2 6 4 2 3 g ，l 的条件下，该细菌对m c l r 在作用1 8 、3 6 和7 2 小时后的降解 率分别为1 4 2 ，5 l _ 3 和1 0 0 o 。由此为今后将该菌廊州丁太湖或其他水系的藻类污染治 理提供了科学依据。 关键词：聚合酶链反应实时荧光定量聚合酶链反应溶藻细菌 假单胞菌属藻毒索 人r 介质 i i 英文摘要 d e t e c t i o na n de v a l u a t l 0 no fa l g i c i d a lb a c t e r i a i ne n v i r o n m e n t z ii a oc 1 1 u a n p e n g s “p e r v i s e db yp r o f e s s o rp uy u e - p u s c h 0 0 io fp u b l i ch e a l t h ，s o u t h e a s tu n j v e r s i t y a b s t r a c t t h ee n r i c h m e n lp r o p o n i o no 九h ec h i n e s el a k e si s l i pt o6 0 i nr e c c n ty e a r st 1 1 ea l g a eb l o o m e 。p l 。s i v e sw e r eh a p p e n e df r 。q u e n i l yi ns l l c hi m p o 九a n ts o u r c eo fd r j n k i n gw a t e ra st a ih l ll a k e ， d i a n c h il a k ea n ds oo ni ns u n l m e ra n da u t u m n u n d e rt h ef a c t st h a tv a r i o u sk i n d so fp h y s j c sa n d c h e m i s t r ym e t h 。d sh a v ef e we h 奄c t so nc o n t r o l i i “gi t ，m o r ea n e n t i o nw e r ep a i dt oa i g a er e m o v a l t e c h n i q u eb yi m m o b i i i z e dm i c r o o 喧a n i s ma n dt h ea l g i c j d a i b a c t e r ；aa r eo n eo f t h ek e yf a c t o r si n t h et e c h n i o u e t h em a i np u r p o s eo ft h j s s t u d yj st oe s t a b l i s hm o i c c u 】a rb i o i o g ym e t h o dt 。d e t e c tt h e e n v i r o n m e n t a la c i d a l b a c t e r i a ，t os e p a r a t et h ea b o r i g i n ea i g i c i d a 【b a c t e r i ai nt a i h ul a k ea n dt o e v a l u a t ej t se n 色c to na l g a er e m o v a l ，w h i c hs h o u l do 仟b rt h es c i e n t m cb a s i sf o rt h ec o n s t r u c t i o n a n da p p l j c a t i o no fr e m o v a la l g a et e c h n j q u eo fm i c r o o 唱a n i s m t h ep a p e rc o n t a i n e df o u rp a n sa sf o l l o w s lt h ee s t a b l i s h m e n to fp c ro nq u a l i t a t i v ed e t e c t i o no re n v i r o n m e n t a la i g i c i d a i b a c t e r i a a e “幽， o 硼s pw a sr e p o r t e dt ob eo n eo ff a m i l ym e m b e r so fa l g i c i d a l b a c t e r i ai nt h i ss t u d y t h ep c r a m p i l 行c a t i o n m e t h o dw a se s t a b i i s h e dt o q u a i i t a t i v e l y d e t e c le x j s t e n c eo ft h e a e “出删m 椰3 pi ne n v i r o n m e n t b yc h o o s i n gt h e s e l e c t i v ep r i i n e ro fl6 sr r n ag e n eo ft h e b a c t e 氘t h eo p t l m a ic o n d i i i o n so ft h e d c t e c t i o nw e r ec o n a r m e dt h r o u g ht h e o n h o g o n a i o p t i m i z a t i o ne 。p e r i m e n ta sf o l l o w s ：p c rc o c k t a j l s f o r2 0 儿lr e a c t i o nm i x t u r ec o n t a i n e dd n a 7 0 1 0 0 n g ，d n t p 3 0 0 m ，p m e r l 0 p m o l ，a n dm g c l 21o m m 、t a qe n z y m e1 5 ut h ea m p l i c a t i o n m i x t u f ew a sa d d e dd i s 州l e dw a t e rt oan n a lv o l u m et h et h e r m a lc y c i i n gc o n d i t i o n so fp c rw e r e i n i t a ld e n a t u r a t i o na t9 5 。cf o r5m j n ，3 0c y c i e so fd e n a t u r a t l o na t9 2 。cf o r l m i n ，a n n e a i i n ga i 6 4 1 。cf o r1 m j n ，a n de x t e n s l o na i7 2 。cf o r1 0 m i n ，w i t han n a le l o n g a t i o ns t e po f1 0m j na t 7 2 。c ， 东南大学硕士学位论文 t h ep c rp r o d u c t sw a s9 9 0 b p t h em e t h o dc a nd e t e r m i n a t eq u a l i t a t i v e l yt h et a 唱e tb a c t e r i ai n e n v i r o n m e n t a ls a m p l e sq u i c k l ya n dj t sd e t e c “o nl i m i tj s3 n go fd n a 2t h ee s t a b i i s h m e n to fr t q p c ro nq u a n t i t a t j v ed e t e c t i o no fe n v i m n m e n 妇la l g i c i d a i b a c t e r i a t h er e a i t j m 。q u a n t i t a t i v ep c r ( r t q - p c r ) a m p l i 矗c a t j o nm e t h o dw a se s t a b l i s h e dt o q u a n t i t a t i v e l yd e t e c ir e l a t i v ea b u n d a n c eo ft 1 en p z 痂州o n 甜s pi ne n v i r o n m e n tw i ht h e c o m b i n a t i o no fs y b rg r e e ni i a b e 】i n gt e c h n i q u ea n dt h eo p t i m a lp c re 。p e r i m e n t a ic o n d i t i o n s d e s c r j b e da b o v e t h ed e t e r m i n a t i o nr a n g e so ft o t a lb a c t e r i aa n d 几p “幽州册口ss pb yr t q p c r w e r e1 0 3 1 0 8 9 e n ec o p i e s m l ( r 2 = 09 9 7 ) a n dl 1 0 5g e n ec o p i e s m l ( r 2 = 0 9 9 4 ) ，r e 5 p e c t i v e i y t h ee q u a t j o n so fi n j t i a lc o p j e sa n dc tw e r ec t ( u s u ) = 一3 9 0 81l gc o p yn u m b e r + 4 6 0 7 41f b rt o t a i b a c t e r i aa n dc t ( p s e ) = 一3 2 6 5 l gc 叩yn u m b e r + 2 2 6 7 8 9f o rn p h 如，”d h 删s p ，r e s p e c t i v e i y t h e r e l a t i v ea b u n d a n c en p 耐。2 0 n 哪s pi ne n v j r o n m e n t a ls a m p l e sf r o mt a j h ul a k ea n dt h ea c t i v a t e d s l u d g eo f n a n j i n gs e w a g et r e a t m e n tp l a l l tw e r ed e t e c t e dq u a n t i t a t i v e i yb yt h em e t h o d 3t h ea p p l i c a t i o no ft h ep c rm e t h o do nt h er e m o v a la l g a es t u d yo f 7 r a i h ul a k e i ni h i ss t ud y ，t h eg e n o m ed n ao f 愚p “幽卅d 甜s pf o r3k i n d so fa f t i n c i a im e d i u m si nt a i h u l a k er e m o v a la i g a ee q u i p m e n tw a sd e t e c t e da n dc o m p a r e dq u a i i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l yb y p c ra n d 【玎q p c rm e t h o d sd e s c r i b e da b o v e ，r e 3 p e c t i v e i y t h er e s u l ts h o w st h a tt h c r ew a sl o t so f r e “咖肌。 日ss po n3k i n d so fa r t i 行c i a im e d i u m sr z ，r 、v 1r ri na u g u s t 1 、h ea v e r a g ea b u n d a n c e o f 风e “d o m 佣d ss po nt h e mf f o mm a yt o0 c t o b e rw a sr z ：o 8 4 ，r w ：o5 8 ，r t ：0 _ 3 5 ， r e s p e c t i v e 】y t h ea r t i 矗c i a lm e d i u i nr zo fr e a c t o rh a dt h es t r o n g e s ta c c u m u l a t i o n c a p a c j t yo n n e z 幽埘。h s pt h a nm e d i u mr wa n dr rt h ea b u n d a n c eo f 舟e 。出m 铆娜s do ft h er e a c t o rj n t a i h ul a k er e a c h e dt h eh i g h e s td “g 川ya n d a u g u s t ，a n dj nt h em i d d l ep r o 行l ea n d “p p e r s u r f a c ep i a n eo f r e m o v a la l g a ee q u i p m e n t ( ft e s t ， p o 0 5 ) 4 t h ei s o l a t i o na n de v a l u a t i o no fa l g i c i d a ib a c t e r i af r o mt a i h ul a k e ak n do f 卉c r o c ”f 曲口g r 呼h d s 口w a si s o i a t e df r o mt h 1 ul a k eb l o o m ，a n di t sd r o d l l c t i o no f m i c r o c y s t i nw a sa n a l y z e db yh p l ct h er e s u hs h o w sw h e nt h ej n i t i a ic o n c e n t r a i i o n 。fa i g a ec e l l i s78 1 0 6 m l ，t h em i c r o c y s 咖p r o d u c t i o ni s03 5 2 3 g ，03 0 4 7 ”g ，o2 8 1 5 昌02 2 7 l p g 1 0 6 v 英文摘要 a l g a ec e l | i ne v e r yo i h e r8h o u r s a na i g i c i d a ib a c t e r i u mw a si s o i a t e d ，i d e n t i e da n d e v a l u a t e df r o ma r t j n c i a lm e d i u m so f r e m o v a la l g a ee q u i p m e n ti nm e i l i a n gb a yo f t a _ h ul a k et h er e s u l t ss h o wt h a h eb a c t e r u mw a s i d cn f j 秆e da s 凡e 础m 佣口s pb yt 1 1 e a n a i y s i so fm o 。p h o l o g i c a i ，p h y s i o l o g i ca i ，b i o c h e m i c a l p r o p e 九ya n d l6 sr r n as e l e c t i v cp c rt h el e a s t a i g a e i y s i n gc o n c e n t r a t i o nf o r 删c r o 母口n ， 日g 增! ”。s 口f r o mt a i h ul a k ew a s10 5c e l l m lt h e2 4h o u r sa l g a e i y s i n gr a t e si np b s ，w a t e rf r o m t a i h ul a k ea n db g l1 a l g a em e d i u mw e r c8 5 9 ，6 79 ，9 1 o ，r e s p e c t i v e l ya n dt h ec o n l p l e t e d i s s o i v i n gt j m ew a s4 8h o u r sw i n i t i a lc e l lc o n c e n t r a t i o no f7 _ 8 10 6 n 1 i 。 t h es u b s t a n c e s r e l e a s e d b yi h eb a c l e r i u mw e r ep o s s i b l yr e s p o n s i b l ef o rt h ea l g a e l y s i n ge t f e c t sw i t l lt 1 1 ei 1 1 j t i a 】 c o n c e n t r a t i o no f2 6 4 2 3 g l ，t h em i c r o c y s t i n l rd e g r a d a t i o nr a t e sa n e r l8 ，3 6a n d7 2h o u r sw e r e 1 42 ，5l3 a n d1 0 0 0 ，r e s p e c t i v e l ys ot h ei s o i a t e d b a c 矧u mw j t hs i g n i n c a n ia i g a c i y s i ”g a n dm i c m c y s t i n - d e g r a d i n ge 何色c tm a yb eu s e f u li nc o n t 呻lo ft h ea i g a 。p 。i lu t i o no ft a i h ul a k e a n do t l l e rw a t e rs y s t e r n k e yw o r d s ：p o i y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e a l t i m eq u a n t i t a t j v cp c r a f g i c i d a l b a c t e r i a l 纷e 出埘d n 船s pm i c r o c y s t i n ar t i f i c i a lm e d i u m v 主要缩略词表 p c r r 1 o - p c r p s e u s u m c l r m c r r e m c t m c i m c f l s h r z r t r w h p l c 1 6 sr r n a c t 主要缩略词表 a b b r e v i a t 工0 n p o l y m e r a s ec 】1 a i nr e a c t i o n r e a i t i m ea u a n t i t a t i v ep c r p s p “d o o h 娜s p u s u a lb a c t e r i a l m i c r o c y s t i n l r m i c r o c y s t j n r r e x t r a c e l l u l a rm i c r o c y s t i n t o t a i 】n ；c m c y s t i n i n t e r c e l l u l a 卜l n i c r o c y s t i n n u o r e s c e n c ei ns i t uh y b d j z a t i o n h i g hp e r f b n n a n c el j q u i dc h r o m a t o g r a p h y 1 6 sr b o s o m ar n a c y c l et h r e s h o l d v 聚合酶链反廊 实时荧光定量聚合酶链反应 假单胞菌属 总细菌 微囊藻毒素一l r 微囊藻毒素一r r 胞外微囊藻毒素 总微囊藻毒素 胞内微囊藻毒素 荧光原位杂交 组合填料 弹性填料 无纺布填荆 高效液相色谱 循环阈值 东南大学学位论文独创性声明 本人声暖耩鏊交静学位论文是我个人崧嚣颓指导下遂雩亍豹研究羔终及取褥静研究成采。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表戚撰写 过静研究成果，也不包含为获褥东南大学溅其它教育机梅的学位或诚书面使用过敕材料。 与我一嗣工捧的间志对本磷究所骰静任秘烫献均己在论文串终了瞬确的说瞬著表示了谢 意。 研究生签名扇连! 墨曰期：盈2 b 知。 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、网家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 律靼瞧子文档，可鹾采用影印、缱印或其德复利手段像存论文。本人瞧子文档的凑察程纸 磺论文的内容栩一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包 括刊登) 论文的企部或部分内容。论文的公布( 包括刊髓) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名筮堡红导师签名； 日期：沙竹。岳。也 前言 月 舌 当前，我国水体的富营养化已日益成为影响我国湖泊发展的土要问题之一，并成为影响 我国水资源环境，制约我国经济与社会可持续发展的重要因素。目前我国寓营养化湖泊的比 例达到6 0 【| l ，寓营养化的湖泊由于藻类大量繁殖引起的水质恶化，尤其是当湖泊作为城市 集中饮用水源时，藻类的孳生繁殖可以使滤池堵塞，破坏净水装置正常运行b j ；藻类产生的 微量有机物使水带有强烈异味i 藻类分泌出的有机物经分解生成雉以降解的腐殖酸即“三卤 甲烷前驱物”( t h m 的前驱物) 。若用氯消毒即生成具有致癌、致嘀和致突变作用的总二卤 甲烷ft t h m ) ，水质更加恶化i 。有资料显示，1 9 9 0 年我国2 4 个主要湖泊中，除洱海和邛海 尚处丁贫营养状态外，其他湖泊均已达到中营养状态或富营养状态。其中，富营养化问题最 为突出的就是三大湖：滇池、巢湖和太湖i ”。太湖流域作为我国经济最发达的地区之一其 富营养状况更是令人堪忧【5 】。 针对我国湖泊目前面l 临的严重寓营养化及其灾害问题，在湖内污染源、流域点源与面源 污染控制需要投入巨大资金且短期内难以取得成效的情况下，探索浮游藻类生物量的控制、 抑制“水华”发生、改善湖泊水质的有效途径是非常必要的。藻类的控制技术可归结为物理 方法、化学方法和生物方法。物理方法主要是电磁场、机械除藻、以浮游生物网作为过滤器 除藻等j ，但1 作量较大、时间周期较陡。可作为蓝藻水华控制的辅助性措施，但处理能力 有限，局限于水处理： 程应用”。化学除藻的方法主要包括使用絮凝剂类，如聚氯化铝和酪 蛋白絮凝泡沫分离法同收去除微细藻类”：抑制剂类，如纳米级t i 0 2 表观上可吸附并抑制 单细胞原核蓝藻铜绿微囊藻大型变种的生长以及一些除草剂、杀藻剂及金属盐等【“”】。化学 药剂方法除藻技术虽有快速高效的优点，但会带来水体的二次污染问题。生物学控藻技术是 利用藻类的天敌及其产生的生艮冲制物质对藻类的生k 、繁殖进行抑制，从而达到控制藻类 数量、防治富营养化带来的各种危害，目前正处在研究发展的初期阶段。生物除藻方面主要 有鱼类如滤食性鲢、鳙、鲫鱼等；微小动物类，如，草履虫等；应用溶藻细菌，通过赢接 或间接方式，抑制藻类生长或杀死藻类，从而溶解藻细胞，降解藻毒索的除藻潜力较大， 已越来越受到重视“】。 部分相关研究提示水华耵l 赤潮的突然消亡可能就与溶藻细菌有关，有关溶藻细苗报道最 甲的是黏细菌属。1 9 2 4 年，g e i t l e r 报道了一种寄生在刚毛藻上、可使之死亡的黏细菌； s h i l o 用几种从水塘中分离小来的黏细菌做溶藻试验测试的1 0 种蓝藻中有8 种被溶解。 东南大学硕士学位论文 d a r 从废水中分离出9 种黏细菌，可溶解鱼腥藻、束丝藻、微囊藻以及多种颤藻l “”1 。李 勤生和黎尚豪也报道了黏细菌同蓝藻细胞相互接触，导致藻细胞溶解【”】。假单胞菌属也是 研究较多的一种溶藻细菌。1 9 7 8 年，b a k e r k 发现假单胞菌t 8 2 7 2 b 分泌一种高分子量的热 稳定化合物能够杀灭硅藻1 ”】。s h i l l s a k u 则发现施氏假单胞菌卅释放一些高活性溶藻物质， 能够选择性地杀死绿胞藻；d a k h a m a 报道了铜绿假单胞菌产生一些低分子量的抗生素类物 质可以强烈溶解某些蓝藻和绿藻。t 酞e n a k a 等在日本洲泊中分离出铜绿假单胞菌，其分 泌的绿脓杆菌素以及碱性蛋白酶，可能是溶解微囊藻的主要物质 2 。近年来，国内外文献 中陆续也报道了一些其他相关的溶藻细菌，主要有：黄杆菌屈、噬胞茁属、交替假单胞菌、 鞘氨醇单胞菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、节杆菌属、欧文氏菌、纤维弧菌属、交替单 胞菌、蛭弧菌属、弧苗、届挠细菌属、产气单胞菌、腐生螺旋体属等卧2 “。 然而，应用细菌治理“水化”同样也面临着诸多问题，如准确评估溶凛细菌在自然环境 中的时空分布：士著高效溶藻菌的分离、驯化、安全性评价和在天然水体中的适应性研究： 如何维持原水体的生物多样性及微生态平衡：溶藻菌载体、富集方式冉勺研究等问题都将是以 菌治藻的： 释实施之前，所必须要开展的研究内容。 本课题旨在建立分子生物学方法评测目标溶藻苗在自然水体中的存在及时空分布情况， 并与东南大学环境工程系台作，对放置于梅梁湾水域的生物除藻中试反应器进行除藻机理研 究及除藻效果评价：同时从太湖中分离土著溶藻细菌，并对其溶藻效果及生存能力进行初步 研究。为溶藻细菌应用于实际除藻工程提供科学依据。 本课题从以r 四个方面进行研究： 1 假单胞苗属是较为常见的环境溶藻细菌。本研究根据假单胞菌属1 6 sr r n a 基因序列 设计特异性引物，应用p c r 技术扩增目标细菌。建立假单胞菌属p c r 定性检测技术。进而 验证该技术应用于多种环境样本，如不同天然水体、活性污泥等的可行性。 2 应用s y b r g r e e ni 为标记，通过目标细菌在总细菌中的丰度检测的方法，建立假单 胞菌属r t q p c r 定量检测技术。进而验证该技术应用于多种环境样本如不同天然水体、 活性污泥等的可行性。 3 应用上述两种技术，分别定性与定量检测、评价放置于太湖梅梁湾水域的中试除藻 装置中假单胞菌属的寓集效果。对：l 程的优化及除藻机理的探讨提供科学依据。 4 从太湖梅梁湾水域放置的除藻中试反应器的人l 介质上分离出溶藻细苗，并进行形态 学、生理与生化特性、以及1 6 sr r n a 特异性引物扩增综合分析，对细菌进行鉴定，并对其 除藻效果进行评价，对可能的除藻机制进行初步研究。 前 言 本研究的主要技术路线如f 东南大学硕士学位论文 第一章环境溶藻细菌p c r 定性检测法的建立 微生物的多样性机能以及丰寓的现存量是生态系统的基础，它起到维持环境平衔及物质 循环的作用。许多细菌对传统方法难以处理的藻类有着强烈的降解功能，检测自然水体中是 否存在此类细菌，及其空间分布，对于治理藻类爆发所引起的“水华”有着积极的意义。 传统的检测方法需要对样l 强进行富集培养，往往要花上几天乃至数周的时问，给检测带 来了一定的困难，基丁核精体1 6 sr r n a 基冈的p c r 技术，克服了上述缺陷，一般在j l 个 小时内即可完成。其中1 6 sr r n a 的结构十分保守，其序列相对稳定而义高度保守，可以为 细菌浆定提供相对稳定可靠的信息”1 。从环境样品中提取微生物总d n a ，经过p c r 扩增某 细菌属的特异性1 6 sr r n a 基因斤，对扩增产物进行观察即可快速判断出其是否存在于环 境中。本文母句建了假单胞菌属定性检测的p c r 扩增法，并采用止交殴计分析法优化了p c r 的实验条件”1 。 1 材料与方法 1 1 试验器材 g e n e a m p 2 4 0 0 型p c r 仪( 美国p e k j ne l e m e r 公司) m a s t e r c y c l e rg r a d i e n tp c r 议( 德国e p p e n d o r f 公司) g e n e q u a n tr n a d n a 测定仪( 美国p h a r m a c j ab i o t e c h 公司) c h e m i j m a g e r t m5 5 0 0 凝胶成像处理系统( 美国a l p h a 公司) h e r a e s u 低温高速离心机( 德国b i o 血g es t r a t a s 公司) l d 一5 - 2 a 低速离心机( 北京医用离心机厂) m a | 1 0 电子分析天平( 上海第二天平仪器厂) z f 一4 紫外透射反射分析仪( 上海康禾光电仪器有限公司) 超低温冰箱( 日本二洋公司) e c p 3 0 0 0 型三恒电泳仪( 北京六一仪器厂) 微型水平板电泳梢( 北京尔方仪器厂) t g l 一1 6 高速台式离心机( 上海医用分析仪器厂) 电热恒温水浴锅( 江苏南通竹行电热恒温器厂) 移液器( 国产金花牌2 0 1 0 0 儿) 1 2 相关试剂 l 磷酸盐缓冲溶液 4 第一章环境溶藻列茁p c r 定性榆测法的建立 细胞裂解液 2 0 0 m m o l lt r i s ( p h80 ) 2 5 m m o l 几e d t a ( p h80 ) 2 5 0 m m o l ln a c l 05 s d s 溶菌酶工作液浓度2 0 m g 佃l 异丙醇 7 5 乙醇 t r i s 一饱雨l 酚 氯仿一异戊醇混合液2 4 ：l ( v v ) 酚一氯仿一异戊醇混合液2 5 ：2 4 ：l ( v ，v ，v ) t e 缓冲液 lo m m o i ，lt r i s ( p h8 0 ) lm m o i le d t a ( p h8 o ) 1o o b pd n as t e pl a d d e r t 细d n a 聚合酶( 5 u 此，附带1 0 b u 脯r 、2 5 m mm g c l 2 ) d n t p s( 4 0 m m ，含d a t p 、d c t p 、d g t p 、d t t p 各1 0 m m ) 引物( 上海g e n e b a s e 生物公司合成) 溴酚蓝上样缓冲液：o2 5 溴酚蓝+ 4 0 蔗糖水溶液 琼脂糖( s d a n i s h 进口分装，购自南京创瑞生物公司) 溴乙啶( e b ，t 作液浓度为o 5 l g m l ) 1 0 t b e 电泳缓冲液 t r i s 1 0 8 9 硼酸 5 5 9 e d l - a 2 0 m m ( p h = 80 ) 加水至 l l ( 注：所有试剂均阻无菌双蒸水配制，所用国产试剂均为分析纯) 1 3 标准菌株 铜绿假单胞苗( 东南大学基础医学院微生物教研室赠) 1 4 方法 5 东南大学颂：l ：学位论文 1 41 铜绿假单胞苗基因组d n a 提取 ( 1 ) 取1 5 20 m l 培养2 4 小时的菌液4 0 0 0 r p m ，1 0 i n i n 离心，弃上清。 ( 2 ) 在沉淀中加入1 m l 细胞裂解液，3 此2 0 m m l 溶菌酶，充分悬浮沉淀。3 7 振荡过 夜。 ( 3 ) 转移液体至l5 m l 小离心管中，加入氯仿一异戊醇混合液5 0 0 儿，充分混匀，冰水浴 5 一1 0 分钟，随时摇动，使蛋白质能更蚶的沉淀析出。离心，1 2 0 0 0 r p m ，1 0 m i n 转移上清至 干净离心管中。 ( 4 ) 加入i 、r i s 一饱和酚和氯仿异戊醇混合液各2 5 0 l l l ，充分混匀，再次抽提。离心， 1 2 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ，转移上清至干净离心管中。 ( 5 ) 加入等体积异丙醇、室温f 混匀1 0 m j l l 沉淀d n a 。1 2 0 0 0 r p m ，1 0 m i n 离心，弃上清， 取沉淀。 ( 6 ) 加入7 5 乙醇5 0 0 u l ，1 0 0 0 0r p m ，1 0 m i n 离心，弃上清取沉淀。 ( 7 ) 3 7 将d n a 烘至半干，加适量t e 溶解，即用或2 0 保存，备用。 l4 2 环境样本基冈组d n a 的提取 本试验环境样本来源于太湖白然水体及南京市污水处理厂的活性底泥。采集样本当天即用 或4 保存。 ( 1 ) 将采集的自然水体样本，约2 0 m l ；活性污泥约5 m l ，放置于无菌试管内，离心，4 0 0 0 r d m ， 1 0 m i n ，弃上清。 ( 2 ) 在沉淀中加入i m l 细胞裂解液， 3 此2 0 m m l 溶菌酶，充分悬浮沉淀。3 7 振荡过 夜。 ( 3 ) 转移液体至1 5 m l 小离心管中，加入氯仿一异戊醇混合液5 0 0 乩，充分混匀，冰水浴 5 - l o 分钟，随时摇动，使蛋白质能更好的沉淀析出。离心，1 2 0 0 0 r p m ，l o m i n ，转移上消至 干净离心管中。 ( 4 ) 加入t r i s 一饱和酚和氯仿一异戊醇混台液各2 5 0 儿，充分混匀，再次抽提。离心， 1 2 0 0 0 r p m ，1 0 m i l l 转移上清至干净离心管中。 ( 5 ) 加入等体积异丙醇，室温卜混匀1 0 m j n ，沉淀d n a 。1 2 0 0 0 r p m ，l o m i n 离心，弃上清， 取沉淀。 ( 6 ) 加入7 5 乙醇5 0 0 皿，1 0 0 0 0 r p m ，l o m i n 离心，弃上清，取沉淀。 ( 7 ) 3 7 将d n a 烘至半干加适量t e 溶解。 ( 8 ) 加入等体积的t r i s 饱平酚，离心，1 2 0 0 0 r p m ，1 0 m j n ，转移上清至干净离心管中。 6 第一章环境溶藻訇茁p c r 定性检测泫的建立 ( 9 ) 重复步骤( 5 ) ( 7 ) ，即用或一2 0 保存，备用。 143 基因组d n a 的定性与定量 ( 1 ) 待d n a 完全溶于t e 后，用d n a 测定仪测定d n a 的纯度和浓度，并记录。纯度为 o d 2 6 0 o d 2 8 0 = l6 l8 之问为值，浓度要求大f5 0 岭m l 。 ( 2 ) 取3 5 乩d n a 经08 琼脂糖凝胶电泳观测基冈组d n a 的完整性。 15 聚合酶联反应的条件优化 l5 1 原理：采用针列假单胞苗属1 6 sr r n a 基冈殴计的特异性引物序列对环境样本进行p c r 扩增，通过其是否产生特异性条带，以检测环境样本中是否含有目标苗属。采用正交试验设 计，研究再冈素、水平对试验的影响。 1 5 2 引杉j 序列：5 一g g t c t g a g a g ga r l ga r r c a g t - 3 5 一i 、1 a g c t c c a c c t c g c g g c 一3 1 5 _ 3 正交试验殴计 选用l 9 ( 3 4 ) 正交表，设计包括各反应成分、循环条什的因素水平等选刚止交试验 表2b ( 3 4 ) 安排试验，试验方案如f ： 表lp c r 因素一水、卜表 表2 正交试验方案f l 9 ( 3 4 ) 吲豢 堕堕姿塑坚曼：! 竺竺! 堕! ! ! ! 坚! ! ! ! ! 旦! b 竺!旦9 堕! 竺1 15 4p c r 反应 ”旧吣 ；i 7 i 5 i 5 7渤湖m圳瑚瑚姗 0 0 o 2 2 2；5 查堕查堂堡主兰竺堡兰 按照上述试验方案进行扩增，反应总体积为2 0 止，热循环条件为：9 5 ，5 m i n ：3 0 个 循环9 2 ，l m i n ；6 41 ，1 m i n ：7 2 ，l m i n i7 2 ，延伸l o m i n 。 l5 5 琼脂糖凝胶电泳 将扩增产物进行2 的琼脂糖凝胶( 含o5 p m l e b ) 电泳，电泳缓冲液为o 5