（卫生毒理学专业论文）维生素d非经典作用的初步研究.pdf

维生素d 非经典作用的初步研究中文摘要 中文摘要 维生素d 的钙磷调节作用已被人们所熟知，维生素d 主要通过其活性形式与 维生素d 受体结合发挥作用。随着研究的深入，人们在许多与钙、磷代谢无关的 组织和细胞上发现有维生素d 受体。因此维生素d 的非经典作用引起了人们的重 视。目前认为维生素d 具有更广泛的生理作用，如调节细胞增殖、诱导细胞分化， 免疫增强，抗突变等。本文对维生素d 的非经典作用进行初步的研究。 目的：本课题主要从三个方面研究维生素d 的非经典作用：一、活性维生素d ( 1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 ) 对人卵巢癌细胞株( s k o v 3 ) 的单独及联合卡铂( c b p 后的增 殖抑制作用。二、维生素d 对丫射线照射引起的小鼠造血损伤和d n a 突变的保护 作用。三、活性维生素d 缺乏对脂多糖( l i p o p 0 1 y s a c c h 撕d e ，l p s ) 诱导的小鼠死亡 率及腹腔巨噬细胞炎性因子t n f 伐、n o 释放的影响。 方法：( 1 ) 用m t t 法测定不同浓度的1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 和c b p 单独作用于s k o v 3 细胞后细胞存活率和细胞周期的改变，以及不同顺序联合作用后细胞存活率的变 化情况；( 2 ) 以6 0 c oy 射线6 og y 一次性全身照射小鼠建立照射损伤模型，观察 维生素d 灌胃小鼠外周血细胞、骨髓细胞微核率及细胞周期的变化；( 3 ) 以1 也羟 化酶基因敲除小鼠( 1 a ( o h ) a s eg e n el ( i l o c ko u tm i c e ) 作为活性维生素d 缺乏的动 物模型，观察l p s 引起的小鼠死亡率和腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子t n f a 和一氧 化氮( n o ) 的释放情况。 结果：( 1 ) 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 作用于s k o v 3 ，使细胞存活率降低，1 0 。7 m1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 作用7 2 h 后细胞存活率为7 2 4 5 ，1 0 。8m1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 作用7 2h 后细胞存活率为 8 2 1 1 ；并使s k o v 3 细胞阻滞于g 2 期。当与c b p 联合作用时，效应取决于用药 顺序。同时给药时，1 0 7m1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 联合2 1 0 巧g lc b p 作用下细胞存活率为 1 1 7 7 ，1 0 喵m1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 联合2 1 0 巧g l c b p 作用时细胞存活率为1 4 1 3 。先 后给药时，抑制细胞增殖情况不及同时给药时。( 2 ) 维生素d 能够一定程度上恢 复照射损伤小鼠的外周血细胞，照射后第2 d ，白细胞升高至3 0 5 1 0 札，红细胞、 血小板计数也高于照射组；降低骨髓细胞微核率至1 0 3 4 ，使照射引起的骨髓细 胞g 1 期阻滞缩短，g 2 期阻滞延长。( 3 ) l p s 诱导10 【羟化酶基因敲除小鼠腹腔巨 噬细胞炎症因子t n f 0 、n o 的释放显著高于野生型小鼠。l p s 腹腔注射后2 4h ， 维生素d 非经典作用的初步研究中文摘要 基因敲除小鼠组和野生型小鼠组动物生存率分别为1 0 和4 0 。 结论：( 1 ) 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 对s k o v 3 细胞有增殖抑制作用，并呈现剂量效应关系。 1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 与c b p 联合作用于s k o v 3 时，具有双重作用，作用效果取决于用药 顺序，与c b p 同时加入时，表现为细胞增殖抑制。在c b p 前、后加入时，表现为 拮抗作用。 ( 2 ) 维生素d 对照射损伤的小鼠具有保护作用，可升高外周血白细胞，降低骨 髓细胞微核率。 ( 3 ) 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 对l p s 诱导巨噬细胞炎症因子的释放有抑制作用。 关键词：1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 ，s k o v 3 ，辐射，基因敲除小鼠，炎症因子 作者：王小慧 指导老师：童建教授 p r e l i m i n a r ys t u d y0 nn o n c l a l s s i ca c t i o n so f t 绷i nd a b s t r a c t p r e l i m i n a 巧s t u d yo n n o n c l a s s i ca c t i o n so f t 锄i nd a b s t r a c t v i t 锄i nd p l a y sac e i l 仃a lr o l ei nc a l c i u ma 1 1 dp h o s p h a t eh o m e o s t a s i sf o rn o 胁a l d e v e l o p m e n ta n dm 池e n a n c eo f b o n e 1 1 1 eb i 0 1 0 9 ：i c a le 疵c t so fa c t i v ef o 吼o fv i t 锄i n d ，l ，2 5 一d i h y d r o x y v i t a 】：i l i nd 3 【1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 】a r em e d i a t e db yal l i g h a 伍血哆r e c 印t o r 也a ta c t sa sal i g a l l d a c t i v a t e dt 啪s c r i p t i o nf a c t o r t h ev d rw a sf o u i l do r i g i 脚1 yi nt h e c l a s s i cv i t a i l l i nd t a 疆e to 培a n si n v o l v e di n1 1 1 i n e r a lh o m e o s t a s i s ：也e 缸e s t i n e ，b o l l e ， l 【i d l l e y ，a n dt 1 1 ep a r a 也y r o i dg l a n d s m o r er e c e n t l y ，m ev d rh a sb e e nd e t e c t e di nm a i l y o t h e rt i s s u e sa i l dc e l l 咖e s 懿w e l l t h e s ev i t 锄i ndt a 唱e t o 玛a i l s r e s p o n dt 0 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3w i t hd i v e r s eb i o l o g i c a la c t i o n sm c l u d i n gi m m u n o m o d u l a t i o n ，廿l ec o n 仃o l o fo t h e rh o m o n a l s y s t e m s ， i n h i b i t i o no fc e l l g w m ， a i l di n d u c t i o no fc e u d i 虢r e n t i a t i o n 1 h e s en o n c l a s s i ca c t i o l l sh a v er a i s e dal i u l l l b e ro fn e wt h e r a p e u t i c 印p l i c a t i o n so f1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3t oi m 删l n ed y s 丘m c t i o n ( a u t o i m m l m ed i s e a s e ) ；e n d o c i i n e d i s o r d e r s ( h y p e r p a r a t h ) ，r o i d i s m ) ，a i l dh ) ，p e 印r o l i f e r a t i v ed i s o r d e r s ( 1 e u k e m i a ，c a n c e r ， p s o r i a s i s ) o b j e c t i v e ：t be x p l o r et h en o n c l a s s i cr 0 1 eo fv i t 锄i nds u c ha s 也e 此r a p e u t i c p o t e n t i a lo f1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3i n 讹a t 玎n to fo v a r i a i lc a l l c e r ，t l l er a d i o p r o t e c t i v ea 1 1 d a n t i - i n n 黝a t o r ye f f e c t s m e t h o d s ：( 1 ) r n l eo v a r i a i lc 硼1 c e rc e l l 1 i n es k o v 3w a st r e a t e d 谢廿1d i 虢r e m c o n c e 嘶a t i o n so f1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3a n dc a r b o p l a t i n c e uv i a b i l n yw a sd e t e m i n e db ym t t a s s a y s k o v 3c e l lc y c l e 、a sa 1 1 a l y z e db yt h en o wc ”o m e t r y ( f c m ) f o l l o w i i l gs t a i l l i n g o fc e l l sw i t hp r o p i d i u mi o d i d e ( p i ) ( 2 ) m i c ew e r et r e a t e d 谢mv i t a m i nd ( a l f - a c a l c i d o l s o rc a p s u l e s ) b yg a v a g ea 1 1 dw e r ee x p o s e dt o6 0 c o7 r a y sa tt h ed o s eo f6 0 g y p e r i p h e r a l b l o o dc e nc o u 】吡w a s a n a l y z e db ya 1 i t o a n a l y z e r m i c r o n u c l e a t e d p o l y c h r o m a t i ce r y t l l r o c y t e s ( p c e ) i nb o n em a r r o ww e r ec o u n t e du i l d e ram i c r o s c o p e ( 3 ) 10 一h y d r o x y l a s eg e n ek n o c ko u tm i c ew e r e 仃e a t e dw i t hl i p o p 0 1 y s a c c h a r i d e ( l p s ) a n d t h ep e r i t o n e a lm a c r o p h a g e sw e r ec u l n 】r e d 砌1 ，以p d t h ei n n a m m a t o 巧c y t o k i n e sn oa n d i i i p r e l i m i n a r vs t u d vo nn o n c i a s s i ca c t i o n so f t a m i nd a b s r a c t 1 n f ，qp r o d u c e dw e r ed e t e c t e db yt h eg r e i s sa n de m 可m e - l i m ( e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) r e s u l t ：( 1 ) 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3i n m i t e ds k o v 3c e u 鲈o w t hw h i c ha 仃e s t e d i ng 2 m p h a s e 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3a n d c b p p r o d u c e daa g o m s t i ca c t i o no nc e l l 毋o w t hi n h i b i t i o nw h e n t r e a t e da tt h es 锄et i m e ，b u ts h o 、税da na n t a g o i l i s t i ca c t i o nw h e nt r e a t e di nd i 舒胃e n t o r d e r s ( 2 ) t a l n i l ld 仃e a t m e n tf a c i l i t a t e dt h er e c o v e r yo fw h n eb l o o dc e nc o u m i n g f o l l o w i n g r a d i a t i o ne x p o s u r e ， 锄d s i g l l i 矗c a n t l y d e c r e a s e db o n em 跚o wp c e m i c r o n u c l e u sr a t ei n d u c e d b yr 撕a t i o n f c ma i l a l y s i ss h o w e dt 1 1 a tt 1 1 eg 2a n dsp 1 1 a s e s o f b o n em a n d wc e l l s ( b m c ) i nv i t 锄i nd t r e a t e d 黟o u pi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y2 4 h 啦e r 戗1 ei m d i a t i o n ( 3 ) b o n ll p s i n d u c e dm a c r o p h a g ei n f l 纽蚰a t o r ) ，c 舛。姑n e s ( r n 师一0 【a i l d n 0 ) a n dm o r t a l i t yi i l1 仅一h y d r o x y l a s eg e n ek n o c k o u tm i c e w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d i nc o m p 撕s o nw i t h 也ew i d et ) ，p ei n i c e c o n c i u s i o n ： ( 1 )1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 c o u l di n h i b i t 廿1 cs k o v 3c e l lg r o w t hha d o s e r e s p o n s em 锄e r ，诚m a i la d d i t i v ej o i n ta c t i o nw h e nc o m b i n e dw i t hc b p ( 2 ) 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3w a s ap o t e n t i a lr a d i o p r o t e c t i v ea g e n t ( 3 ) 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3d i s p l a y e d a 1 1a n t i i n n a i i u i l a t o 巧e f f e c t k e yw o r d s ：1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 ，s k o v 3 ，r a d i a t i o n ，g e n ck n o c k o u tm i c e ，i i l n a m m a t o 猡 c y t o l ( i n e s i v w t i t t e d b y ：x i a o - h u iw 缸g s u r p e r v i s e db y ：p r 0 j i a l lt o n g 英文缩写 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 v d r e d l a m t t p b s d m s 0 p i c b p b m c 毋c r b c p 1 t 印m p c e n c e m n f c m d n a l p s 1 仅( o h ) 懿e _ - w t p c r n o 1 公f 0 【 中英文缩写词表 英文全称 1 ，2 5 - d e h y d r o x y v i t a i i l i i l d 3 t a m i nd 3r e c e p t o r 王啦! e n e d i l l i t r i l ot e 灯a a c e t i ca c i d 啦a z 0 1 y 1b l u e p h o s p h a _ t eb u 脆r e ds a l i n e d i l l l e t h y ls u l f o x i d e p r o p i d i u mi o d i d e c 扔0 p l a t i n b o n em ：a r r o wc e l l w k t eb l o o dc e n r e db l o o dc e l l p l a t e l e t r e 、，o l u t i o n sp e rm i m n e p 0 1 y c l l r 啪a ：t i ce r y t l l r o c y t e s n o 姗o c h r o m a t i ce r y t l l r o c y t e m i c r o n u c l e i f l o wc y t o m e t 哆 d e o x 皿b o n u c l e i ca c i d l i p o p o l y s a c c h a r i d e 1 却h ah y d r o x y l a s eg e n ek n o c k o u t w i d ct y p e p 0 1 y m e r a s ec h a i l li 沁a c t i o n n i t r i co x i d e t h m o rn e c r o s i sf a c t o r - q 中文全称 1 ，2 5 - 二羟基维生素d 3 维生素d 3 受体 乙二胺四乙酸 噻唑蓝 磷酸盐缓冲液 二甲基亚砜 碘化丙啶 卡铂 骨髓有核细胞 白细胞 红细胞 血小板 壤| 余铁 嗜多染红细胞 正染红细胞 微核 流式细胞仪 脱氧核苷酸 脂多糖 1 a 羟化酶基因敲除 野生型 多聚酶链反应 一氧化氮 肿瘤坏死因子 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名： 壹立霆2 日期翌丘生耋2 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名： 壹正：茎( 日期_ 型盘：垒：互 导师签名：日期：翟喧二型 维生素d 非经典作用的初步研究引言 引言 一个世纪以前，维生素d 作为一种营养物质被人们发现，是人体必需的一种营 养元素。天然的维生素d 有麦角固醇( d 2 ) 和胆固化醇( d 3 ) 。植物中含有的麦角 固醇以及人体皮肤内的7 一脱氢胆固醇经紫外线照射后，分别转化为d 2 和d 3 ，通过 肝脏的2 5 一羟基化和肾脏的l 仅一羟基化作用后合成1 ，2 5 二羟维生素d 3 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 】， 后者系维生素d 在体内的活性形式，又称为活性维生素d ，是目前已知唯一的维生 素d 的激素形式【l j 。许多肾外组织也具有10 【羟基化酶，能够在原位合成 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 ，并通过自分泌或旁分泌的方式发挥作用【2 】。 1 ，2 5 二羟基维生素d 3 的作用原理与经典类固醇激素一样，涉及遗传信息的表 达。存在1 ，2 5 二羟基维生素d 3 受体结合蛋白的靶组织除传统的小肠、骨和肾脏外， 还有胰、脑垂体、甲状旁腺、乳腺、胎盘、性腺、子宫、结肠、皮肤成纤维细胞、 胸腺和腮腺等多种组织【3 】。近来，发现1 ，2 5 二羟基维生素d 3 可抑制白血病细胞增生 并可将白血病细胞分化为单核细胞巨噬细胞【4 】。另外，它还可抑制一系列其它恶 性细胞增生，包括胸腺、前列腺和结肠癌细胞【5 8 】。1 ，2 5 二羟基维生素d 3 还影响甲 状旁腺和垂体腺激素分泌，增加胰岛素分泌【9 】。此外，它还影响免疫系统，抑制t 细胞增生和细胞分裂，因而可能具有更广泛的作用【1 0 1 。 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 通过与存在于细胞内的特异性维生素d 受体( v i t a m i ndr e c e p t o r ， v d r ) 结合而发挥生物效应。v d r 为类固醇激素甲状腺激素受体超基因家族的成 员，包括分子量为5 0k d a 的细胞核受体( n v d r ) 和分子量约为6 0k d a 的细胞膜受 体( n l v d r ) 。现有的研究报道大多是关于细胞核v d r 的。核受体家族的共同特征 是具有高度保守的d n a 结合区及一定保守性的配基结合区。1 ，2 5 ( o 均2 d 3 激素信 号分子在靶细胞与v d r 结合形成激素受体复合物，该复合物作用于特定的d n a 序列，从而对结构基因的表达产生调节作用。因此，v d r 本质上是一种配体依赖 的核转录因子【1 1 1 ，属于配体激活的受体超基因家族，与其它类固醇激素受体、甲 状旁腺激素及视黄酸受体具有高度的同源性。 虽然维生素d 被发现只有大约1 0 0 年的历史，但它早在5 亿年前就已存在， 其结构在长期的进化过程中保持了高度的恒定，对生命有重要的意义。对于目前 多种肿瘤和慢性病发生率的增加，除了与环境因素有关外，很多学者也认为与人 维生素d 非经典作用的初步研究引言 群中普遍存在维生素d 缺乏的现象有着联系。 为了在体内系统地研究维生素d 与生理功能的关系，加拿大m c g i l l 大学维多 利亚医院内分泌科研究室于2 0 0 1 年成功制作出1c 【( 0 h ) a s e 基因敲除小鼠模型【1 2 】。 这种小鼠体内没有1 羟化酶。1 a 羟化酶是无活性的维生素d 3 转化为有活性的维 生素d 3 的关键酶和限速酶，它主要存在于肾脏的近球小管处，在肾外尤其是角化 细胞、活性巨噬细胞、造骨细胞和软骨细胞等处有较高表达。1 仅羟化酶基因敲除 小鼠由于缺乏这种酶，维生素d 3 的活化受阻，体内活性维生素d 的含量极低，是 研究与维生素d 缺乏相关的病理生理改变的良好动物模型。 本课题主要探讨1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 钙磷调节以外的作用。第一部分以人卵巢癌肿瘤 细胞s k o v 3 为研究对象，首先通过m t t 法研究1 ，2 5 ( o 均2 d 3 、卡铂( c b p ) 不同 剂量水平下对s k o v 3 细胞的抑制作用，作为后续试验的剂量依据并探讨可能的机 制。其次观察1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 联合c b p 对s k o v 3 细胞的影响。第二部分观察维生素 d 对照射损伤小鼠的作用，制备照射损伤小鼠模型，给予维生素d 3 后观察其外周 血常规，骨髓细胞微核率，骨髓细胞周期的改变情况。第三部分以10 【( o h ) a s e 基 因敲除小鼠为模型，观察维生素d 缺乏条件下，对l p s 诱导小鼠死亡率及腹腔巨 噬细胞炎性因子释放的影响。 2 维生素d 非经典作用的初步研究第一部分 第一部分帚一鄙万 1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞的增殖抑制作用 近年来，关于维生素d 在一些恶性肿瘤发病和治疗中作用的研究越来越多。 治疗肿瘤有两种方法，其一是将患者体内的肿瘤细胞全部清除或至少消灭足够的 量，使患者在生存期内肿瘤不再复发；其二是改变癌细胞的特性，使病程减慢甚 至完全停止。化疗药物主要是d n a 合成抑制剂( 如5 一氟尿嘧啶) 或细胞分裂抑制 剂( 如长春新碱、紫杉醇) 之类的细胞毒制剂，在抑制肿瘤细胞的生长的同时对 所有分裂的细胞都具有杀伤作用。目前还有一些新的治疗措施正在研究之中，如 抑制血管生成、促进肿瘤细胞分化、免疫治疗、基因治疗等。 1 9 7 9 年，e i s m a n 首先报告人乳腺癌细胞中存在1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 受体，启示人们 探索维生素d 的抗肿瘤作用。同时，对肿瘤细胞增殖的抑制和诱导分化作用研究 的结果，提示维生素d 激素及其类似物有可能成为高活性、低毒性的抗肿瘤药物。 1 9 8 1 年，a b e 等发现维生素d 在体内的活性代谢产物1 ，2 5 ( o 均2 d 3 有诱导m 1 型 白血病细胞分化形成巨噬细胞的作用【4 】。1 ，2 5 ( o 田2 d 3 诱导分化的最低浓度是 o 1 2 n m ，1 2 n m 的1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 诱导分化的程度与1 p m 地塞米松诱导分化的程度几乎 等同。这第一次显示了它在抗肿瘤中的作用。近2 0 年来，在许多细胞株，如骨髓 瘤、骨肉瘤、乳腺癌及结肠癌等细胞株中都检测到v d r 的存在。在许多正常细胞 及乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、血液肿瘤、脑胶质细胞瘤等的体内外实验中，也 发现1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 有抗增殖和诱导分化的作用。 阳光照射是机体维生素d 3 的重要来源。流行病学调查显示，1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 的前 体维生素d 是预防肿瘤的因素之一。离赤道越近，一些癌症( 皮肤癌除外) 在人 群中也越不常见。很多学者都认为这与维生素d 有关。 临床上，维生素d 已广泛应用于内分泌相关的肿瘤治疗，如乳腺癌和一些妇 科肿瘤子宫内膜癌等，在预防复发、提高生存率等方面均有一定的作用。因此， 深入探讨1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 的抗肿瘤作用，以及有无增强铂类药物的抗肿瘤作用，对提 高肿瘤内分泌治疗的效果有较大的临床意义。 卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，早期诊断率低而死亡率高，其死 亡率位居妇科恶性肿瘤之首【1 3 】。手术和化疗是卵巢癌的基本治疗方式，但患者的5 3 维生素d 非经典作用的初步研究 第一部分 年生存率还不超过3 2 ，复发率也高。因此，探讨新的治疗方案，提高卵巢癌患 者的生存率和生活质量是一个重要的课题。目前认为9 0 的卵巢癌发生于卵巢表 面的上皮细胞 1 4 】，这是一层包围卵巢的鳞状单层细胞，在卵巢排卵修复过程中起 着重要作用。它兼具上皮细胞和间质细胞的特征【1 5 】。上皮细胞间质细胞的转化往 往是卵巢癌发生和转移的开始。因此，人们对卵巢表面上皮细胞的研究非常重视。 已发现它的细胞表面有许多受体，如雌激素a 受体、雌激素d 受体、孕激素受体、 内皮生长因子受体以及维生素d 受体等。对雌、孕激素受体的研究增加了人们对 雌、孕激素在卵巢癌发生过程中作用的理解。相对而言，卵巢表面上皮细胞上维 生素d 受体功能的研究较少。本部分以s k o v 3 细胞为对象，研究不同浓度、不同 时间作用下s k o v 3 细胞的存活率，并以此结果作为下一步实验的剂量依据。 m t t 法具有简便、快速、重复性好等优点。最早用于检测淋巴细胞的增殖活 性，是一种定量检测活细胞的新方法，广泛用于肿瘤细胞的化学敏感性检测。m t t 法与克隆法相比具有以下几个优点：( 1 ) 适用性广：悬浮生长细胞、贴壁生长细 胞、克隆生长细胞、克隆形成细胞及多细胞球体均可应用；( 2 ) 实验周期短：一 般一周左右即可出结果；( 3 ) 重复性好；( 4 ) 实验成本低。然而，要获得可靠的 实验结果，必须充分了解受试细胞m t t 还原产物吸光值的大小与细胞数量之间的 线性关系范围，选择适当的接种细胞密度及细胞培养时间。 一、1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞的单独作用 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 主要试剂及物品 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 ：s i g m a m i - l6 4 0 培养基：g i b c o 胎牛血清( f e t a lb o v i n es e m 【n ，f b s ) ：g i b c o 四甲基偶氮唑蓝( m t t ) ：s i g n l a 卡铂注射液( c b p ) ：齐鲁制药有限公司 碘化丙啶( p i ) ：s i g m a 胰酶( t r y p s i n ) 、h e p e s 、谷氨酰胺：b b i e d t a 、n a h c 0 3 ：上海国药 4 维生素d 非经典作用的初步研究 第一部分 青、链霉素( p 咖c i m i l s n 印t o m y c i n ) ：石药集团 二甲基亚砜( d m s o ) ( 分析纯) ：上海生工 1 1 2 仪器设备 恒温c 0 2 细胞培养箱( h e r a e u sb b l 6 型) ：上海力申科学仪器有限公司 倒置相差显微镜：o l m p u s 公司 酶联免疫检测仪：b i ot e k 公司 可调微量移液器：印p e n ( 1 0 r f 公司 电子天平( a y 2 2 0 ) ：s 瑚m a d z uc o r p o r a t i o nj a p a n 离心机：印p e n d o r f 公司 超净工作台：苏州安达净化工程技术有限公司 图像扫描仪：1 h y p h o n 9 4 l op h o s p h o i m g e r 9 6 孔培养板( 平底) ：c o s t a r 公司 1 1 3 常用溶液的配制 i 冲m i 1 6 4 0 培养液：将l 袋r p m i - 1 6 4 0 粉末溶于1 升新处理的三蒸水中，每 升加入o 6gh e p e s 、2gn a h c 0 3 及0 3g 谷氨酰胺，将p h 调至7 2 - 7 4 ，加入青、 链霉素至终浓度为1 0 0u 砌，o 2 2 岬微孔滤膜抽滤除菌。无菌试验后，4 保存。 胎牛血清：5 6 ，3 0n l i n 水浴灭活，无菌条件下分装，一2 0 保存备用。 m t t 溶液：称取2 5 0m gm t t ，放入小烧杯中，加5 0i i l lp b s ( o 0 1 m ，p h 7 。4 ) 在电磁力搅拌机上搅拌3 0i i l i n ，用o 2 2 斗m 的微孔滤器除菌，分装，4 保存。 l ，2 5 ( o h ) 2 d 3 ：溶于无水乙醇并配成1l i l 】m o 。和1 0m m o 垤。的储存液，一2 0 避光保存备用。 o 01m p b s ( p h 7 2 7 4 ) ：n a c l l 3 71 1 1 i n o 儿，k c l2 7m m o 扎，n a 2 邸0 44 3 m i n o 儿，k h 2 p 0 41 4m m o 儿，高压灭菌，4 保存备用。 o 2 5 胰蛋白酶( t r y p s i n ) ：称o 2 5g 粉状胰蛋白酶，溶于1 0 0i n lp b s 中，使 其溶解，过滤除菌，4 保存，备用。 o 0 2 e d t a ( v 酹s e n e ) ：称0 1gv 蕊e n e 溶解于5 0 0 l i l lp b s 中，1 2 0 、3 0 i i l i n 高压灭菌，4 保存，备用。 1 2 实验方法 1 2 1 细胞培养 ( 1 ) 细胞复苏：细胞为s k o v 3 细胞。从一8 0 低温冰箱中取出细胞冻存管 5 维生素d 非经典作用的初步研究第一部分 迅速放入3 8 水中，使其迅速融化，然后以1 0 0 0r p m 觚n 离心51 1 1 i n 。无菌操作， 弃去上清，将细胞转移至培养瓶中，加入r p m i 1 6 4 0 培养基( 含1 0 灭活f b s ) ， 置于3 7 恒温培养箱中培养。 ( 2 ) 细胞培养：s k o v 3 呈单层贴壁生长，在显微镜下观察细胞生长情况，一 般复苏的细胞需要2 周左右时间才能进入快速生长期，细胞长满瓶底时需进行传 代，2 3 天传代一次，倒掉原培养基，p b s 清洗两遍，以o 。2 5 胰蛋白酶o 5 i i l l 瓶 对细胞进行消化，显微镜下观察，细胞之间间隙变大、细胞大部分变圆时，加入 等量小牛血清中和胰酶活性，吹打混匀，1 0 0 0r p i i l r n i n 离心后弃去上清，p b s 清 洗2 次。再将细胞分为三瓶进行培养。本试验所采用细胞均为复苏后5 1 5 代以内 的细胞。 1 2 2m t t 法检测1 ，2 5 ( o 均2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞生长的影响 ( 1 ) 接种细胞：取对数生长期细胞，以2 1 0 3 个细胞孑l 接种于9 6 孔培养板 中，每孔体积1 0 0m 。分为实验组和对照组，实验组又分为1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 组、c b p 组和对照组。 ( 2 ) 加药：待细胞贴壁后2 4h ，实验组分别加入不同浓度1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 和c b p ， 其中1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 组设三个浓度，终浓度分别为1 1 0 7 ，1 1 0 8 ，1 1 0 。9l n o 儿，下 文中分别以d 7 、d 8 、d 9 表示；c b p 组设两个浓度，终浓度分别为2 1 0 5 ，2 1 0 。6 班，下文中分别以c 5 、c 6 表示。对照组加入等体积无水乙醇，终体积分数 o 1 。 每浓度设6 复孔。 ( 3 ) 呈色：分别培养2 4 、4 8 、7 2 、9 6h ，每孔加入m r r i 溶液( 5 m 鲈：1 1 1 ) 1 0 p l ， 3 7 ，继续孵育4h ，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入1 5 0 “ld m s o ， 震荡1 0i n i n ，使结晶物充分溶解。 ( 4 ) 比色：选择5 7 0n m 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值( o d 值) ，细胞存活率= 加药组o d 值对照组o d 值1 0 0 。 1 2 3 流式细胞仪检测1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞周期的影响 取对数生长期细胞，以1 0 5 个细胞皿接种于直径6 0i 姗的培养皿中，贴壁2 4 h 后，各皿分别加入不同浓度1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 和c b p ，其中1 ，2 5 ( 0 哪2 d 3 组，终浓度分 别为1 1 0 “一，1 1 0 墙i n o n 。，下文中以分别以d 7 、d 8 表示；c b p 组，终浓度分别 为2 1 0 巧，2 1 0 r 6 9 l ，下文中分别以c 5 、c 6 表示。对照组加入无水乙醇，终体积 分数 o 。1 。每浓度设3 个重复样。加药培养7 2 h 后，收集细胞，制成单细胞悬 6 维生素d 非经典作用的初步研究第一部分 液，1 0 0 0 印l i l ，恤n 离心5i i l i n ，去上清。加入7 0 冰乙醇固定，4 存放。染色前 去除固定液，p b s 洗2 次，加入1n l l 染色液( 含1 0 0p 酌mr n a s e a ，5 0 “咖1p i ) ， 混匀，4 避光3 0 血n ，3 0 0 目滤膜过滤，流式细胞仪计数1 0 0 0 0 个细胞，进行细 胞周期分析及凋亡检测。 2 统计处理 各组数据以均数士标准差( i 士s d ) 表示。两组间比较采用f 检验，多组间比 较采用统计软件s p s s1 3 o 的a n o v a 分析。 3 实验结果 3 11 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞增殖的影响 由表1 1 、图1 1 可看出随着l ，2 5 ( o h ) 2 d 3 浓度增加，时间延长，s k o v 3 细胞 存活率逐渐下降，呈现出时间和浓度依赖性，以7 2h 为其最佳作用时间。1 0 - 9m 1 ，2 5 ( o 均2 d 3 时抑制作用相对较弱，而1 0 刁m1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 抑制细胞增殖的作用最 强。由图1 2 可见，c b p 在2 1 0 。5 叽浓度时，s k o v 3 细胞生长抑制作用很明显， 且随时间延长细胞存活率逐步降低，到9 6h 时细胞存活率接近于零，而在2 1 0 。6g l 的浓度时，s k o v 3 细胞生长抑制作用比较平缓，抑制作用强度也相对较弱。各组 与对照组比较差异均有显著性，p o 0 5 。 表1 一lc b p 、1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 单独作用时s k o v 3 细胞存活率( i 士s d ，n = 6 ) 对照组细胞存活率为1 0 0 ，各组与对照组比较，p n 7 维生素d 非经典作用的初步研究第一部分 1 0 0 9 0 篓8 0 忙 誉7 0 斟、 6 0 5 0 图1 1 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 作用不同时间s k o v 3 存活率的变化 1 2 0 1 0 0 斟8 0 ! i g 姑6 0 翟 器4 0 2 0 0 圜 2 4 h4 8 h7 2 h9 6 h 作用时间 图1 2 c b p 作用不同时问下s l v 3 细胞存活率的变化 3 2l ，2 5 ( o 均2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞周期的影响 从表1 2 可以看出，不同浓度的1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 和c b p 都可以使s k o v 3 细胞g 1 期缩短，g 2 期延长，s 期缩短。提示细胞周期阻滞发生在g m 期，但未见有明 显的凋亡峰。c b p 的g 2 期阻滞率与浓度相关，而1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 则呈相反的变化。 8 维生素d 非经典作用的初步研究第一部分 表1 2l ，2 5 ( o h ) 2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞周期的影响( ，互士s d ，n = 6 ) 与对照组比较：a ：p d ，b ：p d 0 j 。 c o n t r o l c 5 d 7 r 、h tar ! n t n t d 8 图l 一31 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 、c b p 对s k o v 3 细胞周期的影响 9 维生素d 非经典作用的初步研究第一部分 4 讨论 肿瘤细胞的基本特征是细胞的失控性生长，其根本原因是细胞周期调控机制 的破坏。本次实验结果表明，1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 和c b p 均可有效抑制s k o v 3 细胞的增 殖，随浓度增加和时间延长，s k o v 3 细胞存活率呈梯度下降，呈现出时间和浓度 相关性。其中7 2h 为其最佳作用时间。 在1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 作用下，细胞阻滞于g 2 期，暂时性的阻断细胞周期进程，从 而抑制细胞增殖。在1 0 。8m 浓度下g 2 期阻滞、s 期缩短、g 1 期缩短情况更为明 显，提示1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 在高剂量时可能具有毒作用。 c b p 作为常用的细胞周期非特异性药物，主要引起靶细胞d n a 的交叉联结， 阻止d n a 复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。细胞周期结果表明，c b p 可导致洌g 1 期细胞数减少而g 2 期细胞数增多，s 期缩短。提示c b p 对s k o v 3 细胞d n a 损 伤较重，超出了细胞正常的修复能力。 以上实验结果提示，维生素d 抗肿瘤的作用机制之一可能是通过调控细胞周 期，使细胞停滞于特定细胞分裂阶段从而抑制细胞生长【1 6 】。 二、l ，2 5 ( o h ) 2 d 3 与c b p 对s k o v 3 的联合作用 铂类药物是恶性肿瘤最主要的抗癌药物之一，它在肿瘤治疗中起着越来越重 要的作用。作为临床治疗的主要药物，已被应用于卵巢癌的治疗，但骨髓抑制等 副作用明显。 1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 已被证实具有诱导肿瘤细胞分化的作用，其在治疗恶性肿瘤方面 的潜在作用也越来越被人们所重视。由于1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 易引起高钙血症等副作用， 其治疗恶性肿瘤的效果并不理想。因此，药物的联合应用已成为现今主要的研究 方向。药物联用可以降低用药浓度，减少毒副作用的产生，提高肿瘤细胞对药物 的敏感性以及降低肿瘤细胞的耐药性。 前述实验结果中，1 ，2 5 ( o h ) 2 d 3 、c b p 均可诱导细胞周期阻滞于g 2 期，提示 这两种药物之间可能存在着相互作用。c b p 是通过与d n a 交联、抑制d n a 合成 而杀死肿瘤细胞。有报道表明肿瘤细胞在g 2 期对c b p 较敏感，而且d n a 合成越 活跃的细