（动物遗传育种与繁殖专业论文）鸡ExFABP基因单核苷酸多态性及其与脂肪性状的相关研究.pdf

1 _ 。- j 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：杨霞z , o b 6 年占月f 矿同 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：杨霞 导师签名： 弘 。p 6 年6 月，矿日 年月日 j 1 i j 四川农业大学硕士学位论文 摘要 本研究以清远麻鸡、封开杏花鸡、惠阳三黄胡须鸡、广西霞烟鸡四个地方品种和 岭南黄鸡矮小型麻羽专门化品系、岭南黄快大i i 号配套系商品代、从自羽商品代肉 鸡这3 个品系共7 个品种( 品系) 作为试验材料。每个品种( 品系) 各随机抽取1 8 个个体，其中公母各半。设计了7 对引物，通过p c r s s c p 方法在试验群体中对鸡 e x - f a b p ( e x t r a - c e l l u l a rf a t t ya c i d - b i n d i n gp r o t e i n ，e x f a b p ) 基因的5 端凋 控区以及该基因的外显子4 进行了多态性筛选。对s s c p 分析结果中的每种纯合子基 因型各取2 个样品送上海英骏测序公司进行直接正反向测序从而进一步确定各多态 位点的存在及变异情况。同时，该试验还对各多态位点不同基因型与腹脂率、肌内脂 肪( i n t r a - m u s c u l a rf a t ，i m f ) 含量这两个性状问的关系进行了分析。各阶段的试 验结果如下： 7 对引物的p c r 扩增产物均为条带单一、清晰且特异性很强的目的片段。 引物p 1 、引物p 2 、引物p 3 和引物p 7 的p c r 产物在所选的七个鸡品种( 品系) 中均 检测到三种基因型( 从，b b 和a b ) 。引物p 2 扩增产物的s s c p 分析结果表明：从白羽商 品代肉鸡中未检测到a a 基因型的存在，其他的6 个品种( 品系) 中均同时检测到三种 基因型的存在；所选的7 个品种( 品系) 中均以纯合子b b 基因型居多。 引物p 3 扩增产物的s s c p 分析结果表明：岭南黄快大n 号配套系、惠阳三黄胡须鸡 和封开杏花鸡中只检测到杂合子a b 基因型：广西霞烟鸡中只检测到了从和a b 这两种基 因型；a a 白羽商品代肉鸡、岭南黄鸡矮小型麻羽专门化品系和清远麻鸡中同时检测到 三种基因型的存在，而且在岭南黄鸡矮小型麻羽专门化品系和清远麻鸡中这三种基因 型的分布情况是完全相同的。 引物p 7 扩增产物的s s c p 分析结果表明：每个品种( 品系) 中均同时检测到三种基 因型的存在；杂合子a b 基因型在岭南黄快大u 号配套系、惠阳三黄胡须鸡、清远麻鸡、 广西霞烟鸡和封开杏花鸡中居多。 引物p 5 扩增产物在所选的7 个品种( 品系) 中检测到四种不同的带型( i ，i i ， m 和i v ) ，其中带型m 未在岭南黄快大j i 号配套系，惠阳三黄胡须鸡和清远麻鸡三个 品种中检测到；带型未在惠阳三黄胡须鸡、广西霞烟鸡和封开杏花鸡中检测到。所 选的7 个品种c 品系) 中只有从白羽商品代肉鸡和岭南黄鸡矮小型麻羽专门化品系 中同时检测到四种带型的存在。 四川农业大学硕士学位论文 本研究对引物p 1 和引物p 2 的s s c p 结果中的每种纯合子基因型分别取2 个样品 进行了直接正反向纯化测序，所得序列与g e n b a n k 上的序列( 登陆号为a y 5 4 5 0 5 5 ) 进行比对，结果在e x f a b p 基因的5 端调控区的6 4 5 b p 处发现了个c a 的突变位 点，并且该位点同时位于引物p l 和引物p 2 的扩增产物中 利用s a s 8 1 软件包中的p r o cg l m ( g e n e r a ll i n e a rm o d e l ) 和最小二乘法拟合 线性模型，对引物p 2 、引物p 3 和引物p 7 扩增产物的s s c p 结果中各基因型之日ji m f 含量的差异进行统计分析，结果表明，不同的基因型之间i m f 含量差异不显著( p 0 0 5 ) ；对引物p 2 、引物p 3 和引物p 7 扩增产物的s s c p 结果中各基因型之问腹脂率 的差异进行统计分析，结果表明，腹脂率在不同的基因型之间差异也不显著( p 0 0 5 ) 。 关键词：鸡；e x - f a b p 基因；单核苷酸多态性；脂肪性状；相关分析 2 四川农业大学硕士学位论文 s t u d yo nt h es n p so fe x - f a b p g e n ea n di t sa s s o c i a t i o nw i t ht h ef a t t y 1 h i t si nc h i c k e n s a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , d n as a m p l ew e r ee x t r a c t e df r o m1 2 8c h i c k e n si n c l u d i n gf o u rc h i n e s e n a t i v ec h i c k e nb r e e d s ：q i n g y u a nm ac h i c k e n , h u i y a n gh u x uc h i c k e n , f e n g k a ix i n g h u a c h i c k e n , g u a n g x ix i a y a n c h i c k e na n dt h r e e s p e c i f i cs t r a i n s ：l i n g n a nh u a n g f a s t - g r o w i n g i ic h i c k e n , l i n g n a nh u a n gw i t hs p o t t i n gf e a t h e ra n dd r a wg e n ea n da r b o r a c r e s ( i m p o r t e dl i n e ) e x - f a b pg e n ew a ss t u d i e db yp c r - s s c pw i t hs e v e np a i r p r i m e r s e a c hh o m o z y g o t ef o u n di ns s c p o f e x f a b pg e n ew a ss e q u e n c e d m e a n w h i l e t h ee f f e c to f d i f f e r e n tg e n o t y p e so nt h er a t eo f a b d o m i n a lf a ta n di m f ( i n t r a - m u s c u l a rf a t ， l m f ) c o n t e n t sw e r ea n a l y z e d t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st od e t e r m i n et h em a j o rg e n e a f f e c t i n gt h er a t eo fa b d o m i n a lf a ta n di m f c o n t e n to rt h eg e n e t i cm a r k e r st i g h t l yl i n k e d w i t h i t t h ee x - f a b pg e n ei nt h es e v e nc h i c k e nb r e e d s ( s t a i n s ) d i d n ，tt e s to u tt h es n ps i t e s b yp c r - s s c pi nt h ep c rp r o d u c t so fp r i m e rp 4a n dp 6 t h es s c pr e s u l t so ft h ep c r p r o d u c t so f p r i m e rp i ，p 2 ，p 3a n d p 7s h o w e dt h a tt h e r ew f f f et h r e eg e n o t y p e s t h es s c pr e s u l t so f p r i m e rp 2s h o w e dt h a tt h ea ag e n o t y p ow a sn o tf o u n di na r b o r a c r e sa n dt h eb bg e n o t y p ew a st h em o s tc o m m o ng e n o t y p e t h es s c pr e s u l t so fp r i m e rp 3s h o w e dt h a tt h e r ew a so n l ya bg e n o t y p ef o u n di n l i n g n a nh n a n gf a s t g r o w i n g - i ic h i c k e n , h u i y a n gh u x uc h i c k e na n df e n g k a ix i n g h u a c h i c k e n , b u ta l lt h et h r e eg e n o t y p e s - a 九b ba n da bw e r ef o u n di na r b o ra c r e s ，l i n g n a n h n a n gw i t hs p o t t i n gf e a t h e ra n dd r a wg e n ea n dq i n g y u a nm ac h i c k e n a tt h es a m et i m e ， t h ef r q u e n c e so f t h r e eg e n o t y p e si nt h el i n g n a nh u a n gw i t hs p o t t i n gf e a t h e ra n dd r a wg e n e a n dq i n g y n a nm ac h i c k e nw e r et h es a m e t h es s c pr e s u l t so fp r i m e rp 7s h o w e dt h a tt h e r ew e r et h r e eg e n o t y p e s - a a a ba n d a bi nt h ea l lc h i c k e n ss t r a i t sw e r et e s t e di nt h i ss t u d y , a n dt h ea bg e n o t y p ew e r ec o m m o n i nc h i n e s en a t i v eb r e e d sa n dl i n g n a nh u a n gf a s t - g r o w i n g - i ic h i c k e m t h er e s u l to f p r i m e rp 5s h o w e dt h a tt h e r ew e r ef o u rb o n d t y p o s - i ，i i ，i i ia n di vi n 3 j 四川农业大学硕士学位论文 a l lt h es a m p l e s b u tt h ei i ib o n d - t y p ew a sn o tf o u n di nl i n g n a nh u a n gf a s t - g r o w i n g - i i c h i c k e n , h u i y a n gh u x vc h i c k e na n dq i n g y u a nm ac h i c k e n t h ei vb o n d - t y p ew a sn o t f o u n di nh u i y a n gh u x vc h i c k e n , g u a n g x ix i a y a nc h i c k e na n df e n g k a ix i n g h u ac h i c k e n t h e r ew e r ef o u rb o n d - t y p e sw e r ef o u n di na r b o ra e r e 烙 a l lt h ep e r p r o d u c t so f # m e rp ia n dp 2h o m o z y g o t e sw e r ed e r e e f l ys e q u e n c e da n d a l i g n e dt h e s es e q u e n c e sw i t hr e f e r e n c es e q u e n c ea y 5 4 5 0 5 5 ，o n es n ps i t e s w e r e d e t e m i n e d ：6 4 5 b pc a t h ed i f f e r e n c eo fi m fe o n t e n sb e t w e e nt h ed i f f e r e n tg e n o t y p e so fp r i m e rp 2 ，p 3 ，a n d p 7i ne a c hs t r a i nt e s t e d i nt h i ss t u d yw o l ea n a l y s i s e db yt h ep r o c e d u r eg l ma n d l a m e a no fs a s 8 1 t h er e s u l to ft h ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a te x - f a b pg e n o t y p e sd i d n t s i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c et h ei m fc o n t e n t 口 o 0 5 ) ，a n dt h es a l n et ot h er a t eo fa b d o m i n a l f a t 伊 0 0 5 ) !k e yw o r d s ：c h i c k e n ；e x - f a b pg e n e ；s n p ；f a t t yt r a i t s ；a s s o s i a t i o na n a l y s i s 4 四川农业大学硕士学位论文 前言 我国家禽品种资源非常丰富，除了列入中国家禽品种志“1 的2 7 个品种( 如广 西霞烟鸡、广东清远麻鸡等) 之外，还有多达7 2 个未列入的地方品种以及较多尚未开 发而呈原始状态的品种。1 。众所周知，我国的地方肉鸡品种与引进的商品化肉鸡相比， 不仅脂肪分布较均匀，而且肉嫩味美、香滑适口、风味尤佳1 。不同的地方肉鸡品 种不仅在肉质性状上存在一定的差异咖，而且脂肪蓄积的部位、数量及能力等方面也 存在较大的差异嗍。以上这些都是我们进行有目的的选择育种的基础。鸡的许多重要 经济性状如腹脂重，腹脂率和肌内脂肪含量等都是数量性状，其遗传是微效多基因控 制“”，同时这些性状早期难以进行度量。传统的选育方法对这类性状的选育效果不 明显，其改进的潜力越来越小。近年来，随着分子生物技术的迅速发展，分子遗传标 记和数量性状座位图谱为遗传选择和改良提供了新的方法，即标记辅助选择 ( m a r k e r a s s i s t e ds e l e c t i o n ，m a s ) ，而找到与这些数量性状相连锁的分子标记是 实现m a s 的先决条件。而p e r s s c p 技术可以快速、方便的筛选出目的片段中是否存 在变异位点，甚至能筛选出由单个碱基突变引起的s s c p 多态；通过测序就能准确的找 到这些突变位点( 分子标记) 及其变异情况，然后再结合统计学方法分别确定影响数 量性状的多个位点或基因的遗传效应，从而找到与目标性状相连锁的分子遗传标记或 其主效基因。并将其应用于 i a s 以提高品种改良的效率和我国畜牧生产的水平。 四川农业大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 脂肪与肉质相关研究进展 1 1 1 风味物质的种类 肉的风味包括滋味和香味两个方面。滋味主要包括咸味、酸味、甜味等，它们是 由肉中的无机盐，游离氨基酸、小肽和核酸代谢产物( 如肌苷酸、核糖) 等产生的， 这些物质主要是来源于肉中的蛋白质、核酸、矿物质等，而蛋白质、核酸等是肉的基 本成分，因此，种间无明显的滋味差异( s i n k ，1 9 7 3 ) “；香味则主要源于肌肉中的 风味前体物在受热过程中产生的挥发性物质如不饱和醛、酮、含硫化合物以及一些杂 环化合物等“”到目前为止，通过研究鉴定出熟肉中的挥发性化合物超过1 0 0 0 种【， 其中与肉品风味有关的化合物有4 0 0 多种。这些物质包括简单的化合物( 如烃、醇、 醛、酮、酯等) 以及含氧、硫、氮原子的杂环化合物( 如呋喃、噻吩及其衍生物等) “”。其中含硫化合物体现基本肉香，而碳酰化合物则体现不同肉的特有风味“”。 1 1 2 香味物质的产生及其种类 生肉无任何熟肉的香味，仅有血腥味、金属味和轻微的咸味，当受热时，肉中的 香味前体物发生分解，氧化、还原等化学反应，从而产生各种挥发性风味物质，这些 物质相互作用形成肉的特殊香味和风味。香味化合物的形成主要有以下三种途径： ( 1 ) 氨基酸和还原糖之间的美拉德( m a i l l a r d ) 反应，该反应是指在加热条件下， 氨基酸中的氨基和还原糖中的羰基发生的经氨缩合反应。该反应是一个非常复杂的体 系，不仅包括多种氨基酸( 来自肽或蛋白质) 与还原糖间的反应，而且也包括反应产 物之间以及与肉中其它成分的反应，产物主要有呋喃、噻吩、噻唑、氢化噻唑、吡嗪、 吡咯、吡啶、哑唑、咪唑等( s h i b a m o t o ，1 9 8 9 ) t o ! oz h a n g 等( 1 9 9 1 ) 在c y s i p 体系 中鉴定出4 7 种风味物，其中含硫化合物有4 1 种，包括噻吩、噻唑、硫代呋喃及多硫化 合物等n 钉。 ( 2 ) 蛋白质、糖类、含硫化合物和游离氨基酸等物质的热解。氨基酸除了本身 具有呈味作用外，还可经斯特雷克尔反应产生挥发性醛类，尤其是半胱氨酸和胱氨酸 热降解产生一些风味化合物；肽、蛋白质等含氮化合物也可经斯特雷克尔反应产生吡 嗪；糖类和羰基化合物降解可产生香味物质呋喃等；硫胺素在p h = 6 7 条件下加热可产 6 四川农业大学硕士学位论文 生香味物质甲基呋喃、噻吩、噻哇、呋喃以及含硫脂肪族化合物等“”。 ( 3 ) 脂肪的氧化作用。李建军等( 2 0 0 2 ) 研究结果表明：脂类的氧化是影响肉 香味的主要因素之一“”。肌肉中的脂肪本身及其部分热解产物都是风味物质。脂肪和 游离脂肪酸受热时可产生大量的风味物质。当脂肪分子含有几个游离基时，在6 0 c 就 会自动氧化，热解产生内酯、醇、酮和低级脂肪酸等挥发性物质。例如脂肪中的亚油 酸氧化产生顺- 4 - 癸烯酸、反- 2 - 十一碳二烯酸、顺一4 一三烯酸等香味物质此外，脂 肪还可与其它物质反应影响风味以及携带脂溶性的物质风味。例如脂肪加热产生的游 离脂肪酸、醛、酮等挥发性呈味物与肉熟化过程中生成的还原糖、肽类以及氨基酸等 肉香前体物有很好的亲和力，通过结合它们而在烹饪过程中起到增香、调香、甚至增 色作用“。 以上这些反应都是肉类香味物质的重要来源。肉类风味成分相当复杂，各种风味 化合物共同作用，构成肉类的特征风味。岳永生等( 1 9 9 6 ) 认为，土杂鸡的气味香与其 亚油酸和亚麻酸的含量有关，土杂鸡的亚油酸、亚麻酸及两者加在一起的多聚不饱和 脂肪酸的含量均极显著地高于快大型肉鸡( p 0 0 1 ) 【2 ”。刘秀荣等( 1 9 9 7 ) 研究发现 a a 鸡、京白鸡、新浦东鸡的肉质差异与肉中的亚油酸和亚麻酸的含量高有关。马 鸿胜等( 1 9 9 7 ) 的研究表明：鸡肉中的不饱和脂肪酸含量在其风味上起着非常重要的作 用【2 3 1 。陈国宏等( 1 9 9 9 ) 研究发现中国七个地方品种的肉质差异与其肉中脂肪酸组成 和含量差异有关汹1 。丁海标等( 2 0 0 0 ) 通过测定比较发现中国地方鸡与快的型肉鸡相 比，肌间脂肪和胶原含量均较高，同时发现不同的地方肉鸡品种之间脂肪酸含量存在 一定的差异嫡1 。舒希凡等( 2 0 0 1 ) 的研究也有类似的结论。李建军( 2 0 0 3 ) 的研究结 果表明：脂肪酸是鸡肉最主要的挥发性风味前体物，肉中脂肪酸的组成和含量差异是 形成石歧黄鸡和从肉鸡风味差异的主要原因瞌刀。杨红菊等( 2 0 0 4 ) 提出肉的香气来自 脂肪氧化和美拉德反应产物之间的平衡啪。黄梅南等( 1 9 9 6 ) 研究表明，鸡肉的风味物 质主要包括棕榈酸、十八醛、4 一乙基一卜辛炔- 3 - 醇、丁二酸二酯、反一2 一辛烯醛、卜 辛烯一3 一醇，乙酸一2 ，2 - - - 异氧基乙酯、十四烷、十五烷、十一醛、邻苯二甲酸二甲酯 等啪1 。宋焕禄等( 2 0 0 1 ) 对固始鸡和从鸡所进行的比较研究发现固始鸡鸡肉中主要的香 味物质反，反一2 ，4 一癸二烯醛的含量比从肉鸡中的高7 倍多，同时固始鸡鸡肉中含有从 肉鸡鸡肉中没有的卜十六醛、癸醛，反一2 一十三醛、反- 2 - 十二醛、1 4 一甲基一十五酸甲 酯、对丙烯茴香醚等芳香物质。 肌肉中的脂肪包括中性脂肪( 甘油三酯) 、磷脂、脂肪酸和脂溶性物质。肌肉中 7 四川农业大学硕士学位论文 的脂肪不仅对肉的风味有很大的影响，而且适当的脂肪含量还可以改善肉的嫩度、多 汁性和大理石纹等。这主要是因为肌肉中的脂肪切断了肌纤维束间的交联结构，并有 利于咀嚼过程中肌纤维的断裂。此外，肌肉内的脂肪酸在氧化时过程中有溶解肌纤维 束的作用，从而提高了肌肉的嫩度和多汁性1 。 表1 鸡肉香味成分中的主要化合物 t a b l e1t h em a j o rc o m p o u n do f a r o m ai nc h i c k e n 化合物类别化合物名称 内酯 呋哺 吡嗪 哑唑类 含硫化合物 n 一丁酸内酯，a 一戊酸内酯，a 一乙酸内酯，a 一庚酸内酯，y 一内酯类 2 一戊基呋哺。5 一硫甲基糖醛，4 一羟基一2 ，5 一二甲基一2 一二氢呋喃酮一( 3 ) 4 一羟基一5 一甲基一2 - - - - 氢呋喃酮一( 3 】 2 一甲基吡嗪，2 、5 - - - 甲基吡嗪，2 、3 、5 - - - 甲基毗嗪，2 、3 ，5 、6 一四甲基 吡嚷 2 ，4 ，5 一三甲基一3 一哑唑啉 甲硫醇，乙硫醇，硫化氢，甲硫醚，2 一甲基噻吩，四氢噻吩酮一( 3 ) ，2 一甲 基噻唑，苯丙噻唑 【3 2 1 ( 李康然和刘禄，2 0 0 2 ) 1 1 3 不同部位的脂肪对肉质影响的比较 肉质是一个综合性状，它包括一系列的评价指标。肉质包括感官特征、技术指标、 营养价值和食品安全性等方面啪1 ，影响鸡肉食用品质的指标主要有p h 值、系水力、肌 内脂肪含量、剪切力、嫩度等。肉质性状的研究又以腹脂率、肌内脂肪含量等为重点。 肌内脂肪( i n t r a m u s c u l a rf a t ，i m f ) 是指位于肌外膜、肌束膜以及肌内膜上的脂 肪，与肌肉的嫩度和风味等有关1 。磷脂约占肌肉鲜重的0 5 1 。，其主要成份是 磷脂。鸡胸肉中磷脂占总脂的比例分别是皮下脂肪和腹脂的2 4 和5 3 倍，腿肉分别是其 1 0 5 和2 3 倍。鸡肉磷脂中长链不饱和脂肪酸含量高于皮下脂肪和腹脂，尤其是花生四 烯酸，腿肉是腹脂的3 6 倍嘲肌肉脂肪是决定肉多汁性的最重要因素，因为脂肪具 疏水性和松散性，从而使得肉有松软与柔爽的感觉陈继兰( 2 0 0 4 ) 研究结果表明： 北京油鸡与从肉鸡i m f 含量的差异显著，并且这种差异对风味有一定的影响”1 。 0 朋川农业大学硕士学位论文 沉积在皮下或腹部的脂肪其主要成分是甘油三酯。m o t t r a m 等( 1 9 8 3 ) 研究表明， 含有甘油三酯的肌肉与不含有甘油三酯的肌肉相比较，两者的香气特征和挥发性化合 物的种类数量变化很小；但含有磷脂与不含有磷脂的肌肉香气特征和挥发性化合物的 种类数量变化很大嘲。这是因为磷脂中富含的多不饱和脂肪酸，如十四碳一烯酸、油 酸、亚油酸、亚麻酸等相对含量较高啪1 。陈宽维等( 2 0 0 3 ) 研究结果表明，十四碳一 烯酸和亚油酸是影响肌肉风味的主要物质啪1 。此外，磷脂中所含的亚油酸( c 1 8 ：2 ) 、 亚麻油酸( c 1 8 ：3 ) 和花生四烯酸( c 2 0 ：4 ) 等必需脂肪酸是人体大脑发育和神经功能完 善不可缺少的重要营养素。可见，与机体其它部位沉积脂肪相比，肌内脂肪含有更多 对人体健康有益的成分，对肉质的影响更大。李俊英等( 2 0 0 4 ) 研究发现肌内脂肪含 量与皮脂厚和腹脂率的存在一定的相关性h 0 1 。 c a m e r o n 等，1 9 9 1 等( 1 9 9 8 ) 认为最佳脂肪含量为2 5 3 “，然而也有学者认为， 为了保持肌肉的良好适口性，肌内脂肪含量应达n 3 5 4 5 “”。 1 2 脂肪酸结合蛋白( f a t t ya o i d b i n d i n gp r o t e i n s ，f a b p s ) 家族的研究进展 1 2 1f a b p s 概述 f b p s 是一族同源性为3 8 7 0 的小分子蛋白质，分子量为1 4 1 6 k d a ，含1 2 6 1 3 8 个氨基酸残基。它广泛分布于哺乳动物、鱼类、鸟类和昆虫的不同组织中。目前 已经确定的f a b p s 包括肝脏型( l - f a b p ) 、小肠型( i 卜f a b p ) 、心脏型( h - f a b p ) 、脂 肪细胞型( a f a b p ) 、表皮型( e f a b p ) 、回肠型( i f a b p ) ，脑型( b - f a b p ) 、睾丸 型( t - f a b p ) 和髓磷脂p 2 型( 肛f a b p ) ，另外还包括细胞视黄醇结合蛋白( c r b p ) 、 细胞视黄醇酸结合蛋白( c r a b p ) ( 表2 ) 以及细胞外脂肪酸结合蛋白( e x f a b p ) 。不 同类型的f a b p s 可被分成两个主要的群体：血浆结合蛋白( f a b p p m ) 和细胞内( 胞质) 蛋白( f a b p c ) 1 2 2f a b p s 的结构特点 分析f a b p s 一级结构，结果发现大多数f a b p s 的氨基酸组成中缺乏或极少含有半胱 氨酸和脯氨酸，而带疏水性侧链的氨基酸则较多；f a b p s 氨基末端( 1 2 5 ) 和中段( 9 0 ) 在不同类型之间的均一性较强，而羧基末端变异较大；哺乳动物不同种系的相同器官， 9 四j i l 农业大学硕士学位论文 如心脏、肝脏和髓鞘之间f a b p s 具有高度均一性( 8 0 9 0 ) ，而不同器官之间的均一 性仅为( 2 0 9 6 3 5 ) 。牛h - f a b p 与其泌乳期的乳腺细胞中的生长抑制因子之间只有6 个 位点的氨基酸残基不同( 均一性高达9 5 ) f a b p s 的二级结构主要由二个位于n 端附 近的右手a 螺旋和由9 2 个氨基酸组成的1 0 个反向平行的b 折叠构成( 1 3a - 1 3j ) ，这些 1 3 折叠形成二个几乎垂直的b 片层，第一个1 3 片层包括1 3a 、1 3b 、1 3c 、1 3d 、1 3e 和 bf 的n 端五分之一的氨基酸；第二个片层由剩下的1 3f 和1 3g 、1 3h 、8i 组成。1 3d 和b e 主链上的原子不是通过氢键直接相连，而是在两链之间有一个5 1 1 埃的缺口，缺口 被两链的氨基酸元件填满，可见bf 的功能是连接这两个片层“。 通过x 晶体衍射和核磁共振研究发现哺乳动物中的所有脂肪酸结合蛋白( 除 t f a b p 外) 、鸡l f a b p 的结晶水溶性结构【“】以及无脊椎动物( 如烟草天蛾幼虫的 i f a b p m l 和沙漠蝗虫中的h - f a b p m l ) 的三级结构，结果表明，尽管f a b p s 家族成员的 氨基酸序列有所不同，但其三维结构均为一个由两个1 3 片层构成的“壳形钳 夹”1 4 9 , 5 0 , 5 1 , s 2 1 。1 3a - 1 3f 构成此钳夹的一侧，bf 一j 则构成钳夹的另一侧，二者呈近似 的正交状态。( 图1 ) 图1f a b p s 的三级结构图 f i g lt h r e e - d i m i o n a ls t n l c t u r eo f h o l oe - f a b p ( w i t hp a l m i f i ca c i d ) 汹1 1 2 3 脂肪酸结合蛋白( f a t t ya c i d b i n d j n gp r o t e i n ，f a b p ) 在脂 肪代谢中的作用 动物机体内的脂肪代谢是一个复杂的生化过程，在多种调节因素的作用下，贮存 和动员处于一种动态平衡之中。f a b p 是机体脂肪代谢过程的重要调控因子之一f b a p s l o 四川农业大学硕士学位论文 广泛存在于许多类型的细胞溶质中，优先与长链不饱和脂肪酸结合，并可将其从细胞 膜上运送到脂肪酸氧化和甘油三酯以及磷脂的合成位置( y e e k a m p 等，1 9 9 1 ) 嘲1 ，同时 f a b p s 还是细胞内脂肪酸及其辅酶a 酯的贮存库，能够在较大范围内以调节脂肪酸浓度 的方式来调控机体内的脂类代谢过程。f a b p s 首先通过控制能量分配来调节脂肪代谢， 其机理是f a b p s 优先结合长链脂肪酸，使细胞对脂肪酸的吸收利用率增加( v e e r k a m p 等，1 9 9 3 ) 啪1 。其次，f a b p s 通过与脂肪酸结合使其在细胞质中的水溶性提高，从而调 节脂肪代谢在细胞内f a b p s 还通过影响酶的活性来调节脂肪代谢。例如，f a b p s 可以 通过调节长链不饱和脂肪酸或辅酶a 酯为底物的酶的活性来参与脂肪代谢的调控 ( v e e r k a m p 等，1 9 9 5 ) 。此外，f a b p 还通过介导激素的作用来调节脂肪代谢。 1 3e x - f a b p 及其基因的研究进展 1 3 1e x - f a b p 概述 e x f a b p 是由g e n t i l i 等( 1 9 9 8 ) 首次从鸡胚中分离出的，一种分子量为2 1 k d a 的分泌性蛋白。该蛋白在鸡胚发育早期新形成的肌管中、鸡胚发育期的肥大软骨组织、 肌肉纤维和血液中的粒性白细胞中均有表达，但其主要的表达部位是外周组织帆。 g i a n n o n i 等( 2 0 0 4 ) 报道e x f a b p 是一种由鸡的肥大性软骨细胞前体分泌的载脂蛋 白，首先出现在肥大性软骨细胞肥大部分核心的边缘部位嘲1 g e n t i l i 等( 2 0 0 5 ) 咖1 研究发现在鸡胚发育的早期，e x _ f a b p 散布于鸡胚的所有组织中，其中心脏中该基因 的转录水平和e x f a b p 含量最高。当机体受到外界刺激或处于病理状态产生应激时， e x - f a b p 基因的的表达水平急剧增加，例如注射了内毒素，脂多糖( l p s ) 的鸡胚中 检测到e x - f a b p 基因m r n a 含量显著增加，肝脏和心脏中e x f a b p 基因的表达达到其 各自的最高水平；此外，在骨性关节炎以及癌症患者的软骨细胞中也有该基因的表达。 与此相似的是，鼠乳腺癌细胞分泌的n r l 与炎症患者或恶性肿瘤患者的粒性白细胞以 及上皮细胞分泌的n g a l 在肥大性的软骨细胞、形成中的骨骼肌纤维细胞以及发育中 的心脏细胞中都有表达。此外，骨性关节炎患者和软骨肉瘤患者成熟的软骨细胞中也 有n r l n g a l 的合成，而且引起炎症的因子也能诱导体外培养的软骨细胞和成肌细胞 分泌n r l 眦】因此我们推断，e x f a b p 和n r l n g a l 这3 个种蛋白的组织表达能显示出 机体处于生理发育状态或者病理应激状态。 到目前为止，在鸡的组织中发现的软骨形成相关蛋白家族的成员有四个：软骨形 四川农业大学硕士学位论文 成相关载脂蛋白一b ( c h o n d r o g e n e s i s a s s o c i a t e dl i p o c a l i n sb ，c a l - 6 ) 、软骨 形成相关载脂蛋白一y ( c h o n d r o g e n e s i s a s s o c i a t e dl i p o c a l i n sy ，c a l - y ) 、 e x f a b p 基因以及g g a l c 8 g c 。它们的作用与载脂蛋白血球素a - 1 ( 1 i p o c a l i n s a l p h a - 1 一m i c r o g l o b u l i n ，a l m g ) 、y 链互补因子8 ( c o m p l e m e n tf a c t o r8g a m m ac h a i n ， c 8 g c ) 、前列腺素合成酶d ( p r o s t a g l a n d i nds y n t h a s e ，p g d s ) 以及嗜中性粒细胞 白明胶酶相关载脂蛋白( n e u t r o p h i - g e l a t i n a s e - a s s o c i a t e dli p o c a li n ，n g a l ) 的 作用互补“”。该家族成员的基因不仅具有相似的外显子内含子分界，而且具有相似 的外显子大小，所编码的蛋白质外形大小也相似。c a l - b 基因有一个可以编码约 1 9 k d a 多肽的开放阅读框，除了包含载脂蛋白家族的保守序列外，还包括3 个半胱氨 酸残基旧“1 ；e x f a b p 是一种分子量为2 1 k d a 的分泌蛋白；g g a i - c 8 g c 的分子量大 小为2 2 k d a 。在软骨形成后期的软骨细胞中c a l - b 、c a l - y 和e x - f a b p 基因进行大 量转录。此外，分化间期的软骨细胞在激素的刺激下或软骨细胞处于分化过程中都 会有这些基因的诱导性转录。 在细胞外的体液和血清中e x f a b p 优先结合长链不饱和脂肪酸( 亚麻酸、油酸、 花生四烯酸) 和长链饱和脂肪酸( 硬脂酸) ，并将其运送到靶器官上；对其他疏水性 分子，如视黄酸、黄体激素、前列腺素、长链的醇或醛以及短链脂肪酸等没有结合能 力。由此可见，e x - f a b p 对配体的选择具有很强的特异性。g e n t i l i 等( 2 0 0 5 ) 的 研究结果表明：经e x f a b p 基因c d n a 转染的软骨细胞和成肌细胞的增殖过程受阻， 并且出现细胞的周期性死亡；通过显微注射法给鸡胚注入e x - f a b p 抗体则有7 0 的试 验鸡胚出现死亡，靶器官为心脏，心脏中周期性死亡的细胞和脂肪酸的含量均显著增 加。由此可见，脂肪酸( 尤其是e x - f a b p 的配体脂肪酸) 的堆积导致了心脏细胞的死 亡，这表明了e x f a b p 在脂肪酸的转运、甘油三酯的合成和脂肪的代谢起着很重要的 作用( c a n c e d d a 等，1 9 9 6 ) 向处于增殖期的软骨细胞中导入e x f a b p 基因的c d n a 后其发育能力大大降低，增殖和分化均受到了抑制；程序化凋亡的细胞数目大大增加。 用成肌细胞做试验，结果也发现大量细胞的死亡和肌管形成的受阻。以上的研究表明， e x - f a b p 参与调控鸡胚的肌纤维、骨骼形成。 1 3 2e x - f a b p 基因作为影响禽肉质性状侯选基因的研究 g i a n n o n i 等( 1 9 9 9 ) 成功克隆并测序了鸡的e x f a b p 基因，其全序列长5 1 4 8 b p ， 四川农业大学硕士学位论文 包括2 9 6 9 b p 的5 端调控区、6 个外显子、5 个内含予以及1 5 7 b p 的3 端非翻译区， 共编码1 7 8 个氨基酸( 转引自王彦，2 0 0 5 ) 嗍。通过对该基因结构和功能的分析，发 现启动子序列同人类的p 2 0 z 存在较大差异，但该基因与其他种类载脂蛋白基因位于 染色体的同一区域( n t 一9 2 6 至n t 一6 2 9 的区间) ，尤其在肥大性软骨细胞中该染色体 区域表现出强大的活性洲。在软骨细胞分化过程中，启动子a p - l 参与了e x f a b p 基 因的表达调控。 王肩贵等( 2 0 0 1 ) 在明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的f 2 代鸡群中发现e x f a b p 基因5 端调控区的3 处碱基突变和1 处碱基插入、统计发现不同的基因型之间腹脂 重和腹脂率的差异显著( p o 0 5 ) ，并再次提出e x - f a b p 基因可能是影响肉鸡脂肪性状 的主效基因或与控制该性状的主效基因相连锁。李慧锋等( 2 0 0 4 ) 在北京油鸡中发 现了e x - f a b p 基因的3 个s n p 位点：1 5 4 2 b p 处6 - - a 、1 5 5 2 b p 处g a 和1 5 8 4 b p 处a g ，统计结果表明，陷基因型有较低的皮脂厚( p 0 0 5 ) ，a c 型有较低的i m f 含量， 并提出e x - f a b p 基因的变异可能是导致脂肪性状产生差异的原因。仇雪梅等( 2 0 0 1 ， 2 0 0 5 ) 在不同品种的杂交鸡中发现了e x f a b p 基因5 端调控区的3 个s n p s 位点。统 计结果表明，腹脂重在阴基因型与其他基因型之间存在极显著的差异( p o 5 为高度多态；0 2 5 p i c 0 5 为中度多念：p i c 0 2 5 为低度多态。 p i c = l 一( 只2 ) 一( 2 p , 2 巧) 其中i ，j 为第i ，j 个等位基因；p 。和 分别为第i 和第j 个等位基因的频率；n 为等位基因数。 2 2 5 4 不同品种( 品系) 肉鸡群体基因型分布的x 2 检验 独立性检验实际上是基于次数资料对因子间相关性的研究，研究因子之间是相 互独立的还是彼此相关的。检验的简化公式为； 办n c 参叫 t 总的观察次数，a i ，：实际观察次数，t “行总和，t j 列总和 2 2 5 5e x - f a b p 基因各多态位点基因型与i m f 含量、腹脂率的相关性分 析 根据影响各观测性状的因素，采用固定模型y m 产u + m a r k e r 。+ b j + s 。+ e i j k ，、利用 s a s 软件包p r 0 cg l m ( g e n e r a ll i n e a rm o d e l ) ，并用最小二乘法拟合线性模型，分 别对各标记基因型与i m f 含量和腹脂率这两个性状的关系进行了统计分析跚1 。 其中：y 小- 为个体表型记录；u 为群体平均值；m a r k e r 。为标记基因型效应；b j 品 种效应；s 。为性别效应；e t 且i ：随机误差 四川农业大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 基因组d n a 提取结果 按前述的方法对提取出的d n a 进行电泳检测，然后用t e 稀释到 1 0 0 n g u l 一2 0 0 n g u l 。 图2 基因组d n a 的部分电泳结果 f i g2p a no f r e s u l t so f g e le l e c t r o p h o r e s l so f g e n o m i cd n a 由图2 的电泳结果可见，本试验提取的d n a 完整性较好、纯度和浓度都较高，适 当稀释后可以用于p c r 反应。 3 2p c r 扩增结果 分别取3 u l 的p c r 产物与l u l 上样缓冲液混匀后进行电泳检测，从而确定高效、 特异的p c r 体系组成以及相应的反应程序，电泳检测在1 5 的琼脂糖凝胶上进行， 时间为4 5 m i n ，电压为1 0 0 v ；m a r k e r 为d l 2 0 0 0 ( 2 0 0 0 b p 、1 0 0 0b p 、7 5 0b p 、5 0 0b p 、 2 0 0b p 和1 0 0b p ) ，在电泳图上以m 表示m a r k e r 。 3 2 1 引物p 1 扩增产物的检测 引物p 1 在退火温度为5 8 的p c r 反应条件下，有较理想的扩增结果，电泳检测 结果如图3 所示： m 图3 引物p lp