（动物学专业论文）稀有鮈鲫性别分化相关基因的克隆与分析.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 稀有绚鲫为我国特有的实验动物，其性别分化机制亦不清楚。为了了解稀有绚 鲫的性别决定模式和性别分化的分子基础，本研究进行了稀有绚鲫激素处理及其后 代分析，克隆和分析了与性别分化紧密相关的部分基因如卵巢型与脑型芳香化酶基 因及d m r t l 。初步研究了芳香化酶基因和d m r t l 在稀有绚鲫性别决定及分化过程中 的作用，对稀有绚鲫性别决定模式进行了初步探讨。 一、采用r t - p c r 和r a c e 方法，获得稀有筋鲫性腺型芳香化酶基因( c y p l 9 a ) ， 其长度为2 2 4 6 b p ，编码5 2 0 个氨基酸残基，具有典型的芳香化酶结构域。r t p c r 分析发现该基因特异表达于性腺，且卵巢中表达量高于精巢中。胚胎发育不同时期 检测发现，c y p l 9 a 的表达从囊胚期开始，至出苗5 天均维持在稳定的低表达水平， 出苗1 0 天后有所增强并维持在该水平。说明c y p l 9 a 特异表达于性腺，推测其直接 参与性腺中雌激素的合成过程，对性腺的发育和分化起重要作用。 二、采用r t p c r 和r a c e 的方法，获得稀有绚鲫脑型芳香化酶基因( c y p l 9 b ) 全序列，其长度为2 1 9 1b p ，编码5 0 7 个氨基酸残基，具有典型的芳香化酶结构域。 r t p c r 分析发现该基因主要在稀有觞鲫的脑中表达，在性腺、肠、肾中也有表达。 在胚胎发育阶段，c y p l 9 b 的表达从囊胚期开始，至神经胚期达到较高水平，随后下 降，孵化期又有所增强，孵化1 0 天后维持在高水平。这些结果说明c y p l 9 b 主要在 脑中表达，可能在稀有觞鲫神经系统发育和脑的性别分化中起重要作用。 三、采用r t p c r 和r a c e 方法，获得稀有绚鲫d m r t l 基因全长，其长度为 2 0 9 8 b p ，编码2 6 6 个氨基酸残基，具有典型的d m 结构域。r t p c r 分析发现该基 因特异表达于性腺，但精巢中表达量高于卵巢。胚胎发育不同时期检测发现，d m r t l 为一母源性基因，其表达从合子期开始，并且维持较稳定的高水平表达。表明d m r t l 可能参与早期性别决定的发生和发育调控过程。 四、对3 个基因在幼鱼不同发育阶段单个个体的表达情况的研究表明，出苗2 5 天，c y p l 9 a 出现第一个表达高峰，此时c y p l 9 b 表达水平也有所上升，但不显著。 4 0 天时d m r t l 出现第一个表达高峰。3 个基因在第2 5 天、4 5 天、5 0 天时出现较强 的个体差异性，且芳香化酶基因与d m r t l 在个体中的表达呈现相反趋势。出苗后1 0 天，芳香化酶基因表达量较之出苗之前各发育时期显著升高，且c y p l 9 a d m r t l 的相 对表达出现个体差异。推测稀有胸鲫的性别分化关键时期为孵化后的1 0 2 5 天，从 出苗后4 5 天5 0 天可能是性别分化的完成时期。而且推断稀有筋鲫在性别未分化 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 前，可能以卵巢的形态出现。性腺的分化从1 0 天左右开始，而向卵巢方向的快速 分化可能从2 5 天开始，向精巢的分化发育从4 0 天开始。 五、利用性逆转的方法，通过激素处理成功获得性反转个体，与j 下常个体交配 后，得到全雄子代。推测稀有绚鲫的性别遗传决定型为雄性同配型( 冱呢w 型) 。 六、通过胚胎显微注射的方法，成功获得转c y p l 9 a 一觎p 稀有晌鲫，为进一步 研究c y p l 9 a 在稀有觞鲫性别分化过程中的作用奠定基础。 关键词：稀有觞鲫；c y p l 9 a ；c y p l 9 b ；d m r t l 克隆；表达模式；性别决定模 式；性别分化；转基因 i i 硕士学位论文 m _ a s t e r st h e s i s a b s t r a c t g o b i o c y p r i sr a r u s ，at i n yf i s hs p e c i f i ct oc h i n a , h a sn or e p o r to ni t sm e c h a n i s mo f s e xd e t e r m i n a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n p 4 5 0a r o m a t a s e ( p 4 5 0 a r o m ) ，a ne n z y m ec a t a l y z i n g t h es y n t h e s i so fe s t r o g e n s ，i st h o u g h tt op l a yak e yr o l ei ns e xd i f f e r e n t i a t i o no fn e u r a l a n dr e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n ti nv e r t e b r a t e s m o s to ft h em a m m a l sh a v eo n l yo n e a r o m a t a s e ，b u tf i s hh a v et w oi s o f o r m so fa r o m a t a s ee n c o d e db yt w od i s t i n c tg e n e s ， c y p l 9 aa n dc y p l 9 b d m r t l ，am e m b e ro fd ms u p e r f a m i l y ，i sac o n s e r v e dg e n eo ft h e s e xd e t e r m i n a t i o nc a s c a d ei nv e r t e b r a t e s ，e s p e c i a l l ym a l es e xd e t e r m i n a t i o n t ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m so fs e xd i f f e r e n t i a t i o no fg o b i o c y p r i sr a r u s ，w e c h o s ec y p l 9 a ，c y p l 9 ba n dd m r t lg e n ea st h es u b j e c t st os t u d yt h e i rr o l ei nt h ep r o c e s s w ec l o n e dt h et r a n s c r i p t so fc y p l 9 a ，c y p l 9 ba n dd m r t lo fg o b i o c y p r 括r a r u sb yr e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n ds m a r t - r a c e w ea l s o s t u d i e dt h e i r e x p r e s s i o np a t t e r ni nt h et i s s u e so fa d u l tf i s h ，i nt h ed e v e l o p m e n t a lp r o c e s so fe m b r y o s a n di na s i n g l ef i s hf r o mld a ht o5 0 d a bb yr t - p c r b yt h es a m et i m e ，w ea n a l y z e di t s s e x d e t e r m i n a t i o ns y s t e mb ys e xr e v e r s a lm e t h o d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w ： 1 t h ec d n ao fc y p l9 ao fg o b i o c y p r i sr a r u sc o n s i s t so f 2 2 4 6b a s ep a i r sw h i c h e n c o d e s5 2 0a m i n oa c i d s s t r u c t u r a la n a l y s i si n d i c a t e dt h a ti tc o n t a i n e df i v eo ft h e s p e c i f i cd o m a i n so fa r o m a t a s e s ，n l et i s s u ee x p r e s s i o np a t t e ma n a l y s i sb yr t p c r 、枷t h s p e c i f i cp r i m e r ss h o w e dt h a tc y p l 9 aw a se x p r e s s e d i nt h eg o n a d so f b o t hs e x e s ，a n dt h e e x p r e s s i o ni n t h eo v a r yw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a ti nt h et e s t e s i ns t a t i s t i c s o n t o g e n i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eo n s e to fe x p r e s s i o no fc y p l 9 aw a sf r o mb l a s t u l a , t h e nt h ee x p r e s s i o nh e l dal o wl e v e lt i l lar i s ei n5 d a h f r o m10 d a hi tk e p ti nav e r yh i g h l e v e lt i l l3 0d a h t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tc y p l 9 ai se x p r e s s e ds p e c i f i c l yi nt h eg o n a d s o fa d u l tf i s h ，a n di ti sa l s oe x p r e s s e dh i g h l yf r o m10 d a b ，p u tt o g e t h e rc y p l 9 am a yp l a y i m p o r t a n t r o l e si nt h ed e v e l o p m e n to ft h es e x u a ld i f f e r e n t i a t i o no ft h eg o n a d s 2 t h ec d n ao fc y p l 9 bo fg o b i o c y p r i sr a r u sc o n s i s t so f2 1 9 1b a s ep a i r sw h i c h e n c o d e s5 0 7a m i n oa c i d s i tc o n t a i n e dt h es p e c i f i cd o m a i n so fa r o m a t a s e s c y p l9 bw a s p r e d o m i n a n t l ye x p r e s s e di nt h eb r a i ni nb o t hs e x e s ，a n dt h ee x p r e s s i o ni nt h eb r a i no f f e m a l ew a ss l i g h t l yh i g h e ri nf e m a l eb u tn o to b v i o u s l ys t r o n g e rt h a nt h a ti nt h em a l ei n s t a t i s t i c s i tw a sa l s oe x p r e s s e di ne y e ，g i l l ，k i d n e y ，i n t e s t i n eo fb o t hs e x e s o n t o g e n i c i 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eo n s e to fe x p r e s s i o no fc y p l 9 bw a sf r o mb l a s t u l a , t h e nt h e e x p r e s s i o nr e a c h e dah i g h e rl e v e li nn e u r u l a , a f t e r t h a ti td e c l i n e d i tb u r s ta g a i ni n10d a h a n dk e ：p ti na v e r yh i g hl e v e lt i l l3 0d a h t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tc y p l 9 bi se x p r e s s e d p r e d o m i n a n t l yi nt h eb r a i no f a d u l tf i s h , a n di se x p r e s s e dh i g h l yi nt h es t a g eo fn e u r u l a a n d10 d a b p u tt o g e t h e r , c y p l 9 bm a yp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ed e v e l o p m e n to fc e n t r a l n e u r a ls y s t e ma n dt h es e x u a ld i f f e r e n t i a t i o no ft h eb r a i n 3 ，n l ee d n ao fd m r t lo fg o b i o c y p r i sr a r u si s2 0 9 8b a s ep a i r si nl e n g t hw h i c h e n c o d e s2 6 6a m i n oa c i d s i tc o n t a i n e dt h et y p i c a ld md o m a i n 砀et i s s u ee x p r e s s i o n p a t t e ms h o w e dt h a td m r t lw a se x p r e s s e do n l yi nt h eg o d a do fb o t hs e x e s ，a n dt h e e x p r e s s i o ni nt h et e s t e sw a ss l i g h t l yh i g h e rt h a nt h a ti nt h eo v a r y o n t o g e n i ca n a l y s i s s h o w e dt h a td m r t lw a sd e t e c t e di nt h ez y g o t e ，a n dh e l das t e a d yh i g he x p r e s s i o na f t e r t h a t t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a td m r t li se x p r e s s e ds p e c i f i c l yi nt h eg o n a d so fa d u l tf i s h , a n di ti sam a t e r n a lf a c t o rf o rt h ee m b r y o so fg o b i o c y p r i sr a r u s i tm a yp l a yi m p o r t a n t r o l e si nt h ee a r l yp e r i o do fs e xd e t e r m i n a t i o no ft h eg o n a d s 4 ，n l ea n l y s i so ft h ee x p r e s s i o no fa l lt h et h r e eg e n e si nt h es a m ei n d i v i d u a lf i s h d u r i n gs e xd e t e r m i n a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o np e r i o ds h o w e dt h a tt h ef i r s tp e a ko fc y p l 9 a e x p r e s s i o nw a si n2 5 d a hw h i l ec y p l 9 bw e n tu pt o o ，b u tn o ts i g n i f i c a n t l yi ns t a t i s t i c s d m r t ls h o w e dt h ef i r s tp e a ki n4 0 d a h t h ee x p r e s s i o no ft h e3g e n e ss h o w e ds t r o n g i n d i v i d u a ld i f f e r e n c e si n2 5 d a h ，4 5 d a ha n d5 0 d a hr e s p e c t i v e l y w ea l s of o u n dt h a tc y p l 9 a n dd m r t lh a da l l o p p o s i t ee x p r e s s i o np a t t e r n 1 h ec o m p a r a t i v ee x p r e s s i o no f c y p l 9 a d m r t lw a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ta m o n gi n d i v i d u a l sf r o m1 0 d a b a n di n1 0 d a h c y p l 9 aa n dc y p l 9 be x p r e s s i o ni so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h ep e r i o d sb e f o r eh a t c h i n g s o w es u p p o s et h a tt h ec r i t i c a lp e r i o df o rt h es e xd i f f e r e n t i a t i o no fg o b i o c y p r i sr a r u si s 10 d a ht o2 5 d a h ，w h i l ei tf i n i s h e si n4 5 d a ht o5 0 d a h a n dw ec a na l s oc o n f e rt h a tb e f o r e s e xd i f f e r e n t i a t i o nt h eg o d a d se x i s ti nt h ef o r mo fo v a r y i ti s10 d a ht h a ti n i t i a t e st h e d i f f e r e n t i a t i o no fg o n a d s ，b u ti t sr a p i dd e v e l o p m e n tt ot h eo v a r y d i r e c t i o ni sp r o b a b l y f r o m2 5 d a b , i tg o e st h et e s t i s d i r e c t i o nf r o m4 0 d a h 5 b yt r e a t i n gt h ee m b r y o sw i t hh o r m o n e ，w es u c c e s s f u l l yo b t a i n e ds e x r e v e r s a l f e m a l ei n d i v i d u a l s ，a n di nc r o s sw i t hn o m a lm a l ei n d i v i d u a l sp r o d u c e da l l m a l ep r o g e n y w h i c hs u g g e s t e dt h ez z z ws e x d e t e r m i n a t i o ns y s t e mi ng o b i o c y p r i sr a r u s i v 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 6 b ye m b 巧。一m i c r o i n j e c t i o n , w es u c c e s s f u l l yo b t a i n e dt h et r a n s c y p l 9 a - g f p i n d i v i d u a l s i ts e tam o d e lf o rt h es t u d yo nt h ef u n c t i o no fc y p l9 ad u r i n gs e x d i f f e r e n t i a t i o ni ng o b i o c y p r i sr a r u s k e yw o r d s ：g o b i o c y p r i sr a r u s ；c y p l 9 a ；c y p l 9 b ；d m r t l ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n p a t t e r n ；s e x d e t e r m i n es y s t e m ；s e xd i f f e r e n t i a t i o n ；g e n et r a n s f e r v 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：营萝两 日期：矽夕年多月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者签名：营如导师张俐附 嘲：沙p 9 年多月7 日 呐：妒月1 7 日 作者虢l 将面 吼砷年6 月7 日 糊张砌舅秒 日期：刀年f 月7 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 前言 性别的形成是生物有性生殖的前提，即有性生殖生物繁衍的基础，一直被广泛 关注，是生物学界研究的热点问题之一。性别的形成包括性别决定和性别分化两个 过程。性别决定是确定性别分化的方向，即决定未分化性腺向精巢方向发育还是向 卵巢方向发育( 王德寿等，2 0 0 0 ) ，该过程协同之后的性别分化共同决定生物的性 别。人类对于性别决定和性别分化的认识，经历了漫长的过程。从亚里士多德的温 度说，演变为温度、营养和环境因素共同作用，到性染色体的发现，人们逐渐认识 到遗传物质在性别决定中的作用。近年来，人类中睾丸决定因子( t d f ) 、小鼠s r y 以及青鳊中d m y 的发现更将人们对脊椎动物性别决定的研究引领到分子层面。综 合已有的研究成果，人们发现性别决定是一个复杂的多因素调控过程，根据物种进 化的差异而有所不同。 1 1 鱼类的性别决定与分化 1 1 1 性别决定与分化概述 动物的性别决定包括遗传型性别决定( g e n e t i cs e xd e t e r m i n a t i o n ，g s d ) 和环境 型性别决定( e n v i r o n m e n t a ls e xd e t e r m i n a t i o n , e s d ) 两种类型。g s d 指子代的性别 主要由遗传基因来决定，在受精后其胚胎发育成雌性或雄性取决于其染色体上性别 决定的基因或性染色体的组成。比如果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 、秀丽线虫 ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 、鸟类、哺乳类等。其中果蝇和线虫的性别是由x 染色体 和常染色体的比例决定的。x x 成为雌雄同体( 线虫) 或雌性( 果蝇) ，x y 和x o 型发育为雄性；鸟类性别决定为z w 型，z z 型个体发育为雄性，z w 型个体发育为雌 性；哺乳类为x y 型性别决定，x x 型个体发育为雌性，x y 型个体发育为雄性。e s d 指子代的性别主要由环境因素决定，温度、湿度、p h 值、种群密度等因素均可影 响子代的性别。在鱼类、两栖类以及爬行类动物中，大多数种类为e s d ( p i e a u 等， 1 9 9 4 ；v i e s 等，1 9 9 4 ) ，比如乌龟和蜥蜴等爬行类动物，胚胎发育时的温度决定其 性别。虽然在这一类群中也存在少数一些种类有异型或同型性染色体，但是其性腺 发育也会受到外界环境影响。 那么，在g s d 过程中，决定性别的遗传因子有哪些? 他们是单独作用的吗? 近 年来的研究已表明：性别决定和性别分化的过程是一个多基因作用的时空网络调控 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 体系。1 9 9 0 年s i n c l a i r 等首次克隆到s r y 基因，并通过转基因小鼠的突变研究及性 别逆转证明它是y 染色体相关的哺乳动物睾丸决定基因( s i n c l a i r 等，1 9 9 0 ) 。哺 乳动物胚胎在发育过程中由s r y 启动一系列分子，包括d m r t l 、s o x 9 、w t l 、s y 7 、 m i s 、g a t a 、d a x l 等基因的表达，它们协调控制性别的决定以及之后的性别分化过 程，使性腺发育为睾丸( m a l d o n a d o 等，2 0 0 2 ；s i n c l a i r 等，1 9 9 0 ；j o r g e n s e n 等， 2 0 0 8 ) 。在鱼类中，也发现了类似于睾丸决定因子的雄性决定基因d m y , 是由 m a s t s u d a 等在2 0 0 2 年首次在青鳝( o r y z i a sl a t i p e s ) 中分离出来，定位于青鲻y 染 色体上( m a t s u d a 等，2 0 0 2 ) 。d m y 基因与d m r t l 基因同源，近期的研究表明它是 由d m r t l 最近在分子进化过程中发生的一个重复产生的( k o n d o 等，2 0 0 3 ；l u t f a l l a 等，2 0 0 3 ) 。虽然在除了青鲻以外的其他鱼类中还没有鉴定出d m y 的存在，但是 在其他脊椎动物的研究已经证实d m r t l 在性别决定中起关键作用( n a n d a 等，1 9 9 9 ； m a r s h a l lg r a v e s 等，2 0 0 1 ) 。除上述两个性别决定基因之外，还存在许多与性别决 定和分化相关的基因，包括影响性腺分化的较直接因素- p 4 5 0 芳香化酶基因 ( c y p l 9 ) 、激素受体基因( a r ，e r ) 等等。但是，任何一个基因的作用都不是单独 发生的，他们可能形成一个信号网络来控制性别特异的性腺的发育。 大多数鱼类和哺乳动物一样，为雌雄异体生物，并且存在遗传决定机制。但是， 鱼类进化地位相对较低，其性别决定以及分化机制容易受到外界环境因素的影响， 包括温度、种群结构及密度等( d e v l i n & n a g a h a m a ，2 0 0 2 ) 。因此，鱼类性别决定 与分化受到遗传和环境的双重控制，还没有一个通用的普遍模式。 1 1 2 鱼类性别决定模式及其研究方法 鱼类是现存脊椎动物中种类最多，分布最广的类群，现存在5 7 目、4 8 2 科、4 2 5 8 属、2 4 6 1 8 种，具有广泛的生物学特性和重要的经济价值。然而，由于鱼类是较低 等的脊椎动物，其进化地位也极其特殊，在脊椎动物系统进化中承前启后，表现出 各种趋同性、趋异性、保守性，物种进化活跃，其性别决定也表现为多种形式( 余 先觉等，1 9 8 9 ；b a r o i l l e r 等，2 0 0 1 ) 。尽管鱼类的性别决定方式最为丰富多样，但 其性别决定的基础仍然是遗传基因，只是在大多数鱼类中，检测不到性染色体的存 在，即使存在性染色体，这些遗传基因也不是集中于性染色体上，而是分散于常染 色体上参与到性别决定中。加上在胚胎发育早期外部环境会对性别分化产生影响， 使得鱼类性别决定机制更显复杂( 王德寿等，2 0 0 0 ) 。但是追其根本，仍然应从基 因入手，环境的影响也是会体现在基因表达差异上。简言之，基因决定性状。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 研究鱼类性别决定机制应该首先从其是否存在异型性染色体开始，如果存在异 型性染色体，那么它的性别决定机制就确定为遗传决定型( d e v l i n & n a g a h a m a ， 2 0 0 2 ) ；如果不存在异型性染色体，其性别决定就受到多种因素影响控制。y a m a m o t o 等( 1 9 6 8 ) 提出了鱼类性别决定的多基因模型( p o l y g e n i cm o d e l ) 。 多基因模型认为雄性因子( m ) 和雌性因子( f ) 的累积剂量决定生物的性别。 存在异型性染色体的种类，其遗传因子便主要存在于y 和x 染色体上；不存在异 型性染色体的就以同义因子的形式存在于常染色体上。不论是哪种情况，当体内雌 性因子z f 雄性因子y m 时，导致雌性决定因素多于雄性决定因素，那么就会促使 未分化性腺发育为卵巢；反之同理。例如，如果一个雄性( 有足够的产生雄性发育 的遗传因子) 和一个雌性( 有过量雌性决定因子) 交配，那么其后代就可能会获得 相对较多的雌性决定因子，产生的雄性就会少些( d e v l i n & n a g a h a m a ，2 0 0 2 ) 。在 多基因模型的体系下，位于不同染色体上的性别决定因子可以随机的分配到后代 中，那么它对后代性别的决定过程产生的影响就是广泛的。在这种情况下，b u l l 等 提出性别的决定过程是一个所有性别决定因子的遗传累加效应( b u l l 等，1 9 8 3 ； d e v l i n 等，2 0 0 2 ) 。这种多基因性别决定模式会一直存在下去，直到进化出一个严 格绝对的性别决定单因子( 如罗非鱼( o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) ) ( 董在杰，2 0 0 4 ) ， 这个单独的基因位点会暂时的或者长久的控制性别决定的过程。此时，单个的基因 位点( 某一条染色体) 对于性别决定的控制就是严格的，其他任何一条染色体上的 遗传因子对性别的最终形成都影响甚微。这种性别控制模式的转变在生物体内应该 是一个动态的过程，o t a 等提出多基因模式是由有性染色体的单因子模式演化而来， 表明鱼类中参与性别决定的基因位点的种类和数量的演变很频繁( o t a 等，2 0 0 0 ) 。 基于多基因模型，人们常通过以下手段来识别鱼类性染色体、判别鱼类性别决 定系统。1 ) 采用细胞遗传学方法鉴定异型性染色体以判断性别决定体系。某些鱼 类存在异形性染色体，可通过普通的染色制片方法，在显微镜下观察。2 ) 依据染 色体带型差异判断性别决定体系。一些鱼类虽然存在性染色体，但由于进化地位比 较原始，性染色体分化程度不明显，普通的染色体制片不能区分。可以通过染色体 分带技术检测染色体上细微的结构差别，从而识别性染色体。3 ) 通过性连锁性状 的遗传研究，判断性别决定体系( d e v l i n & n a g a h a m a ，2 0 0 2 ) 。根据与性别相联系 的一些表型性状推断其性别体系，比如在x y 性别决定体系，父本传递给雌性子代 的连锁遗传性状是位于x 染色体，传递给雄性子代的连锁性状是位在y 染色体。 而母本的性状会同时传递给雌性子代和雄性子代。相反的，如果母本的连锁性状仅 仅传给了雌性子代，就表明其性别决定体系为z w 型。比如青鳝的体色就是由一个 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 性别连锁基因决定的，为x y 型。4 ) 人为诱导鱼类性反转，来判断其性别决定体 系。鱼类中性逆转现象普遍存在，温度、激素水平、养殖密度等环境因素都可以诱 发鱼类发生性逆转。目前多通过人工饲以激素或在水中加入激素来获得性反转鱼类 ( 1 w a m a t s ut ，1 9 9 9 ) 。由于性反转个体的后代其性决定仍由遗传因素决定，所以 可以通过杂交实验推测其异配类型。如果雄性为异配类型即为x x x y 决定型，那 么用雄激素处理反转成功的雄性的个体与正常雌性杂交，其后代应该为全雌性组 成；如果雌性为异配性别，经杂交后其后代中应同时出现雌雄个性( 杨永铨等， 1 9 8 0 ) 。5 ) 人工诱导鱼类单性发育，来判断性别决定体系。根据单性生殖子一代 的性别表现，可以推测其亲本性决定的机制。采用射线照射使精子失活诱导雌核发 育，雌核发育成活的子一代，如果为全雌，那么该种类雄性为异型配子( x y ) ； 如果雌核发育成活的子一代既有雌性个体又有雄性个体，则其亲本雌性则为异型配 子( z w ) 。 据报道，目前已经对超过1 7 0 0 多种鱼类进行过细胞遗传学鉴定，大约只有不 到1 0 可以鉴定到存在异型性染色体( a r k h i p c h u k ，1 9 9 5 ) 。结合其他方法，到现 在已经鉴定出大约1 4 0 多种鱼类的性别决定类型( d e v l i n & n a g a h a m a ，2 0 0 2 ) ，其 中x x x y 的类型有鲫( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 、胡子鲇( c l a r i a s f u s c u s ) 、刺鳅 ( m a s t a c e m b e l u sa c u l e a t u s ) ( 余先觉等，1 9 8 9 ) 、虹鳟( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) ( t h o r g a a r d ，1 9 7 7 ) 等；z z z w 的类型有蟾胡子鲇( c l a r i a sb a t r a c h u s ) ( p a n d e y 等，1 9 9 7 ) 、大鳞副泥鳅( m i c r o l e p i d o g a s t e rl e u c o f r e n a t u s ) ( a n d r e a t a 等，1 9 9 3 ) 等；x o 的有短吻三刺纯( t r i a c a n t h u sb r e v i r o s t r i s ) ( c h o u d h u r y 等，1 9 8 2 ) 等。 1 1 3 性别分化相关基因研究进展 1 c y p l 9 a 、c y p l 9 b 基因 在脊椎动物性别决定及分化通路的起始开关下游，性激素作为主要效应子，对 早期性腺的分化起着关键作用( e n d o 等，2 0 0 8 ；n a k a m u r a 等，1 9 9 8 ) 。芳香化酶 ( p 4 5 0 a r o m ) 属于细胞色素p 4 5 0 家族中的一员，是性激素代谢中的关键酶，可以 催化动物体内的雄激素( 主要为睾丸激素和雄烯二酮) 转化为雌激素，协调雌雄激 素的比例。因此，其适量表达对于脊椎动物的性别分化和生殖是至关重要的 ( c h a r d a r d 等，1 9 9 5 ；d e s v a g e s 等，1 9 9 2 ；s i m p s o n 等，1 9 9 4 ；d o n g 等，2 0 0 8 ) 。 目前的研究发现，除猪科动物外，绝大多数哺乳动物以及鸟类中，p 4 5 0 a r o m 只有 一种，由c y p l 9 a 单基因编码( c o r b i n 等，2 0 0 7 ) 。鱼类芳香化酶存在性腺型 ( p 4 5 0 a r o m a ) 和脑型( p 4 5 0 a r o m b ) 两种不同的形式：其中p 4 5 0 a r o m a 由c y p l 9 a 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 基因编码，主要在卵巢中表达；p 4 5 0 a r o m b 则由c y p l 9 b 基因编码，主要在中枢神 经系统表达( s i m p s o n 等，2 0 0 2 ；k i s h i d a 等，2 0 0 1 ；v a l l e 等，2 0 0 2 ) 。大量研究 结果已经证实，c y p l g a 参与了雌激素生物合成和卵巢分化的过程( d e v l i n 等，2 0 0 2 ； t r a n t 等，2 0 0 1 ；p a t t i 等，2 0 0 8 ) 。 一些研究也发现，硬骨鱼脑内雌激素的合成量远远高出其他脊椎动物的脑或者 卵巢的雌激素合成量( c a l l a r d ，1 9 9 3 ) 。经过进一步检测，发现p 4 5 0 a r o m b 在鱼类 脑中的活性是p 4 5 0 a r o m 在哺乳动物脑中的1 0 0 1 0 0 0 倍( l e p h a r t ，1 9 9 6 ) ，一般认 为其参与了神经系统的性别分化。然而，大多数硬骨鱼的性腺中也有p 4 5 0 a r o m b 的 表达，可能它也参与了性腺分化的调节( d e v l i n & n a g a h a m a ，2 0 0 2 ) 。k i t a n o 等发 现在牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 中，芳香化酶基因的表达会受到温度的影响，对 于这个现象产生的机制，目前还不清楚( k i t a n o 等，1 9 9 9 ) 。我们知道鱼类的性别 决定和分化在很大程度上会受到外界环境的影响，温度及种群结构对其后代性别的 影响普遍存在。综上，可以推测芳香化酶活性的改变可能是温度等影响性别分化的 一条路径。芳香化酶基因作为影响性腺分化的较直接因素，研究该基因表达的调控 应该是鱼类性别决定分子机制的重要部分。 2 d m r t l 基因 d m r t l 基因是参与性别决定与分化发育的一个保守基因，其翻译产物d m r t l 含有一个保守的锌指结构的d n a 结合基序，称为d m 结构域。d m 结构域最初在 果蝇( 面柏es e x ) 和线虫( m a b 一3 ) 中发现，研究表明，d o u b l es e x 、m a b 一3 基因作为 性别调控基因在其两性发育过程中发挥重要作用( b u r t i s 等，1 9 8 9 ；s h e n 等，1 9 8 8 ) 。 之后，在其他物种中陆续发现很多基因对应的氨基酸序列含有d m 结构域，所以把 这类基因统称为d m 结构域基因家族成员。d m 结构域以调控目的基因转录的方式 来调节发育过程，广泛存在于哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类中。经过研究 发现，d m 结构域基因家族通过编码与性别调控因子相关的转录因子参与到性别决 定的过程中。 在人类中发现了至少8 个d m r t 家族成员，其中d m r t l 、d m r t 2 、d m r t 3 等成员 都位于9 p 2 4 ，与性反转密切相关( 程汉华等，2 0 0 7 ；o g a t a 等，1 9 9 7 ；o t t o l e n g h i 等，2 0 0 0 ) 。在小鼠( m u sm u s c u l u s ) 中，已经鉴定出7 个该家族成员，其中3 种 d m r t 基因在胚胎时期的性腺中表达( k i m 等，2 0 0 3 ) 。近几年在青鲻中陆续发现了 d m r t l 、d m y 等d m 结构域基因，它们直接参与雄性的性别决定，尤其是d m y 已 经被确定为是青鳞的性别决定基因。对青鲻d m y 敲降后的x y 雄性会产生遗传型 雌性个体的雌性决定路径。相反，d m y 过量表达则导致精巢的发育( p a u l p r a s a n t h 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e