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中山大学硕士学位论文 b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 专业：有机化学 作者：李秀玲 指导老师：宋化灿教授 摘要 鱼腥草因具清热解毒，消痈排脓，利尿通淋等功能，可用于痰热喘咳、热痢、 热淋、痈肿疮毒等症。鱼腥草中含有癸醛，月桂醛及甲壬酮等成分，但这些化合 物都没有抗病原微生物的活性。起着抗菌活性作用的是一种名为癸酰乙醛( c h 3 ( c h 2 ) 8 c o c h 2 c h o ) 的成分，基于其游离状态易于聚合失效，成品必须制成性质 较稳定的加成物形式。 针对“合成鱼腥草素”、“新鱼腥草素”、“水溶性鱼腥草素”、“高效鱼腥草素 的生物活性还不够高以及合成鱼腥草素和新鱼腥草素的生产成本也偏高的问题， 在保持鱼腥草素的活性结构基本不变的条件下，我们对天然的鱼腥草素进行了结 构改造，合成了一系列p 一二酮衍生物。体外抗菌活性测试结果表明：所合成的 b 一二酮衍生物对白色葡萄球菌具有较强的抗菌活性，有望用于制备抗菌药物。 本课题研究的目的是探讨1 3 一二酮衍生物的合成及其生物活性构效关系研 究。通过引入一些活性基团，来对1 3 一二酮类化合物进行结构修饰、改造，共设 计合成1 3 个新型的1 3 一二酮类衍生物和5 个中间体。通过1 hn m r ，旧cn m r 、i r 、 m s 及熔点确定了化合物的结构，其中1 3 个是未见文献报道的化合物。 在该类化合物的活性研究中，对1 3 个化合物进行了抗菌活性测试，测试结果 表明这些化合物对白色葡萄球菌均表现出良好的抗菌活性，依据测试结果，我们 得出了初步的构效关系。 关键词：鱼腥草，1 3 一二酮衍生物，生物活性，抑菌作用 1 1 i 中山大学硕士学位论文 b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 s t u d i e so ns y n t h e s i sa n db i o l o g i c a la c t i v i t yo f p - d i k e t o n ed e r i v a t i v e s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y a u t h o r ：x i u l i n gl i s u p e r v i s o r ：p r o h u a c a ns o n g a bs t r a c t b e c a u s eo fi t sh e a tc l e a r i n ga n dt o x i nr e s o l v i n g ，d e t u m e s c e n c ea n da p o c e n o s i s ， d i u r e t i ca n dt o n g l i n , a n do t h e rf u n c t i o n s ，h o u t t u y n i ac o u l db eu s e f u lf o rt h e t r e a t m e n to fp h l e g m - h e a ta n dc o u g h i n g ，d y s e n t e r yo fh e a tt y p ea n ds oo n h o u t t u y n i a c o n t a i n e d c a p r i c a l d e h y d e ，l a u r i c a l d e h y d e a n d m e t h y l n o n y l k e t o n e ，a n d o t h e r i n g r e d i e n t s ，b u tt h e s ec o m p o u n d sh a d n tt h eo r i g i n a l m i c r o b i a lr e s i s t a n c ea c t i v i t y s o m es t u d i e sr e p o r t e dt h a tt h ei s ol a t e de l e m e n t se x t r a c t i o nf r o mh o u t t u y n i ah a d e x h i b i t e dp o t e n ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t y , w h i c hw a sk n o w na sd e c a n o y l a c e t a l d e h y d e ( c h 3 ( c h 2 ) 8 c o c h 2 c h o ) i tw a se a s yt op o l y m e r i z eb e c a u s eo fi t s f l e es t a t e ，s t ) f i n i s h e dp r o d u c t sm u s tb em a d eo ft h ea d d i t i o no fam o r es t a b l ef o r m t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo f ”s y n t h e s i sh o u t t u y f o n a t e ”，。n e wh o u t t u y f o n a t e ”， ”w a t e r - s o l u b l eh o u t t u y f o n a t e ”a n d e f f i c i e n th o u t t u y f o n a t e ”w a sn o th i g he n o u g h , a s w e l la sh i g hc o s to fp r o d u c t i o np r o b l e m so fs y n t h e s i sh o u t t u y f o n a t ea n dn e w h o u t t u y n i a b a s e do nt h e s ec a s e s ，as e r i e so f1 3 - d i k e t o n ed e r i v a t i v e sw e r es y n t h e s i z e da n d t h e i ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t yi nv i t r ow a se v a l u a t e d t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e y s h o w e dp o t e n t i a la n t i - v i r u sa c t i v i t ya n dm i g h tb e u s e df o rm a k h a ga n t i v i r u s m e d i c i n e t h er e s e a r c ho b j e c t i v ew a st oi d e n t i f y1 3 - d i k e t o n ed e r i v a t i v e sa n ds t u d ys t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p s ( q s a r ) w i t ht h ea i m t oi n t r o d u c ean u m b e ro fa c t i v eg r o u p s ，t o 1 v 中山大学硕十学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 t h e1 3 - d i k e t o n es t r u c t u r a lm o d i f i c a t i o n , as e r i e so f13n o v e l1 3 - d i k e t o n ed e r i v a t i v e sa n d f i v ei n t e r m e d i a t e sw e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db y 1 h n m r , 13 cn m r , i r , m s a n dt h em e l t i n gp o i n t n o t a b l y , 13n o v e l1 3 - d i k e t o n ed e r i v a t i v e sw e r en o tr e p o r t e di n t h el i t e r a t u r e m e a n w h i l e ，t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f13 c o m p o u n d sw e r et e s t e d ，i tw a s f o u n dt h a tt h e ye x h i b i t e dh i g ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ns t a p h y l o c o c c u sa l b u s w ea l s o e x p l o r e dq s a ro ft h e s ec o m p o u n d st of i n do u tp o s s i b l el e a dm o l e c u l ef o rt h e t r e a t m e n to fs e v e r a lb a c t e r i a r e l a t e dd i s o r d e r s k e yw o r d s ：h o u t t u y n i a ，1 3 - d i k e t o n ed e r i v a t i v e s ， b i o l o g i c a la c t i v i t y ， b a c t e r i o s t a t i ce f f e c t v v 工12 9358 5 b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 成果。对本人的研究做出重要贡献的个人或集体，均已在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：芩秀捡 日 期：硝年口6 月舡e l 1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论 文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复 制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位 论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：鸯秀捡 日 期：刎i 年“月嘶日 导师签名：私 日期：驴( ) 月v 日 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 第一章前言 1 1 鱼腥草研究概况 鱼腥草具有长期的药用历史，现仍被收载于 2 0 0 8 年中国药典一部( 1 5 5 页) ， 为三白草科植物蕺菜( h o u t t u y n i ac o r d a t at h u n b ) 的新鲜全草或干燥地上部分， 亦属药食兼用物种。因其具有清热解毒、消痛排脓、利尿通淋之功效，中医应用 于肺痛吐脓，痰热喘咳，热痢，热淋，痛肿疮毒等病症。但同抗生素相比，其抗 菌活性较弱，在体外试验中，用测定抗生素抗菌活性的常规方法往往难以测出， 所以常采用增加用药量的方法。 鱼腥草产地分布于我国中部、东南及西南各省区，尤以湖南、湖北、四川、 江苏等省居多。其含有多种成分【2 】，如挥发油、阿福豆甙、金丝桃甙及蕺菜碱等； 挥发油为其主要有效部分，其主要成分有癸酰乙醛、甲基正壬酮、月桂烯、葵醛； 黄酮类成分有斛皮素、斛皮苷、芦丁等；有机酸类成分有棕榈酸、亚油酸、天门 冬氨酸、马兜铃酸等；氨基酸成分有谷氨酸、天冬氨酸等。其中以癸酰乙醛的含 量最高。 1 1 1 抗菌作用 体外抑菌实验表明【3 4 】，鱼腥草对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、 白喉杆菌、分枝杆菌及枯草杆菌均有较强抑制作用，对耐伤寒杆菌、钩端螺旋体 也有较强的抑制作用【5 ，6 】。研究表明鱼腥草鲜汁对强毒人型结核分枝杆菌、堪萨 斯分枝杆菌等有明显抑制作用【7 】。 让科学家特别感兴趣的是鱼腥草素对幽门螺杆菌的抑制作用。幽门螺杆菌 ( h e l i c o b a c t e rp y l o r i ) 简称, t i p 8 1 ，自1 9 8 3 年被成功的从胃镜活检标本中培养 出以来【9 1 ，关于消化性溃疡存在的意义引起国内外专家的重视，相继在细菌学和 免疫学等方面【1 0 1 作了大量工作，结果发现与消化道疾病及胃癌有密切关系【】， 为给临床治疗和新药的研制提供了科学依据。目前已确认h p 感染为消化性溃疡先 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 决条件，9 0 9 5 的十二指肠溃疡患者及6 0 8 0 的胃溃疡患者存在h p 感 染。有研究证实根除h p 后可明显降低或防止消化性溃疡的复发。刘小英与洪彰 福等1 1 2 , 1 3 】通过临床试验研究发现鱼腥草可治疗胃十二指肠溃疡，且体外试验也表 明鱼腥草具有抑制和杀灭h p 的作用。由此推测鱼腥草对胃十二指肠溃疡的治疗 作用主要是基于鱼腥草抗幽门螺旋杆菌，抑制和杀灭了幽门螺旋杆菌。同时可能 与其增强白细胞吞噬能力，增强机体特异与非特异免疫能力与促进组织再生和伤 口愈合有关。 近年来，随着广谱抗生素、皮质类固醇以及免疫抑制剂的广泛应用，先进诊 疗技术如器官移植等的推广，a i d s 的流行，以及肿瘤放、化疗的影响，真菌感 染无论在发生频率还是在致病菌种方面都在不断增加。然而临床所应用的抗真菌 药物种类较少，不良反应大，而且多数仅具抑菌作用，难以满足临床治疗的需要。 研究已发现中药鱼腥草乙醚提取物抗串珠镰孢菌、茄病镰孢菌和黄曲霉菌的抗菌 效果较好【l4 1 。同时研究发现从鱼腥草中提出一中油状物，对许多微生物生长都 有抑制作用，特别是酵母菌和霉菌t 1 5 】。用鱼腥草注射液作预防性抗真菌用药， 可起到抗真菌感染的作用。鱼腥草还可用于临床治疗老年人医院获得性真菌性肺 炎和腹膜透析并发真菌性腹膜炎等等。 1 1 2 抗病毒作用 药理研究表明鱼腥草具有抗病毒作用。能延缓孤儿病毒( e c h o ) 的致细胞 病变的作用【协1 ；朱氏等【1 7 】人观察经流感病毒( f m ) 感染过的小鼠，发现鱼腥草 的非挥发部分提取物对其有明显保护作用；郑氏【1 8 】研究证明，鱼腥草对出血热 病毒( e h f v ) 也有一定的抑制作用。另外鱼腥草对单纯疱疹病毒1 型( h s v 一1 ) 、 流感病毒、人体免疫缺乏病毒( r h v 1 ) 有直接抑制活性的作用；对流感亚洲甲型 京科6 8 1 株病毒，甲、乙型流感病毒和腮腺炎病毒均呈现一定的抑制效果【1 9 ，2 0 1 。 而且鱼腥草水蒸气蒸馏液对h s v 1 流感病毒和h i v ( 艾滋病毒) 有直接抑制活性， 但不显示细胞毒性【2 1 1 。 2 巾山大学硕+ 学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 1 1 3 抗炎作用 鱼腥草对多种致炎剂引起的炎症渗出和组织水肿均有明显的抑制作用，能显 著降低小鼠耳肿胀和大鼠足肿胀程度，有效降低小鼠腹腔毛细血管通透性。鱼腥 草煎剂对大鼠甲醛性足肿胀有较显著的抑制作用，能够抑制浆液渗出，促进组织 再生和伤口愈合。同时，鱼腥草可抑制醋酸所致的小鼠扭体反应，延长热痛反应 潜伏期，拮抗甲醛致痛作用，这揭示鱼腥草对炎症性疼痛反应也有较强的抑制作 用【2 2 1 。 1 1 4 增强机体免疫功能 鱼腥草可以增强白细胞的吞噬能力，提高血清备解素水平，以增强机体非特 异免疫能。同时也有报道鱼腥草能够显著提高外周血t 淋巴细胞的比例，增强小 鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促进绵羊红细胞免疫所致的i g m 的生成，从而可提高 机体的特异性免疫功能。用x 一射线照射每只口服鱼腥草营养液0 4 和0 2 m l d 的 小鼠及对照1 个月后发现，试验小鼠血清溶血素含量，巨噬细胞吞噬百分率和吞噬 指数明显高于对照组【2 3 1 。合成鱼腥草素对脾切除致免疫功能低下小鼠的特异性、 非特异性免疫功能均有明显增强作用【2 4 1 。雾化吸入鱼腥草提取液，可使试验鼠肺 泡巨噬细胞吞噬率、肺泡冲洗液和外周血中a n a e j b 性细胞的比例显著提高，而外 周血白细胞移性指数明显降低【2 5 】。 鱼腥草还有明显的利尿作用，以及轻度镇静、抗惊作用。 1 1 5 其他作用 研究表明，鱼腥草油能明显拮抗慢反应物质( s r s a ) 对豚鼠离体回肠和离 体肺条的作用，静注能拮抗s r s a 增加豚鼠肺溢流的作用，并能明显抑制致敏豚 鼠回肠痉挛性收缩和对抗组胺，表现有良好的抗过敏作用【2 6 ，2 7 1 。另一方面，鱼腥 草油能咳嗽次数减少，排痰量增加，明显拮抗乙酰胆碱对呼吸道平滑肌作用，对 支气管平滑肌有缓慢持久的舒张作用【2 8 1 。 n i s h i y a 等【2 9 】采用高效液相色谱法和其他技术的联合运用，从鱼腥草的氯仿 中山大学硕十学位论文1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 提取物中分离出两种血小板凝集抑制物，经光子核磁共振光谱分析法鉴定为顺式 和反式n - 4 - 羟苯乙烯基苯甲酰胺。这两种血小板凝集抑制物，可能对肾病综合 征的高凝状态有益。 鱼腥草还可以起到镇静抗惊、缓解冠脉痉挛、预防血管血栓的形成、促进血 液循环、止血、促进组织再生等【3 0 】。 1 1 6 临床应用 鱼腥草可清痰热，平咳喘，运湿滞，止泻痢，渗湿热，解热毒，治疮痛，宣肺气， 疗瘾疹。目前，广泛应用于内、外、妇及儿科等疾病的治疗【3 1 1 。 鱼腥草注射液是鱼腥草以水蒸气蒸馏法制备的中药注射剂，主要有抗菌、消 炎、解热的作用。临床主要用于治疗上呼吸道感染、慢性支气管炎、支气管扩张、 小儿肺炎、慢性鼻炎鼻窦炎、萎缩性鼻炎、单纯疱疹性角膜炎和难治性肾盂肾 炎等症。 1 1 7 研究趋势 鱼腥草资源丰富，药用价值极高。一些地区民间食用相当普遍，对其药理作 用研究及临床应用更是不断深入。一方面，加强鱼腥草育种、栽培的研究，提高产 量和品质，特别是提高其香味质量和挥发油含量是鱼腥草生产中研究的重点。另 一方面，加工研究、药品开发研究领域仍方兴未艾。鱼腥草食品加工的丌发，正 从传统的半成品( 凉拌、干品) 及饮料、酒、茶等轻工食品，向航空食品、减肥品 和戒烟食品等方向发展。鱼腥草为天然野蔬，绿色无污染，保健功能受到消费者 好评；其保健食品开发具有极大的价值和广阔市场前景。在药品的开发中，经验 证表明，从鱼腥草中提取的挥发油及结晶物能抑$ 1 h s v 1 、流感病毒和h i v ( 艾滋病 毒) 的活性和癌细胞的有丝分裂。这一结果加速了鱼腥草药品的开发。正是由于 鱼腥草生物活性较高，具有特殊功用，加之它既克服了西药弊端，又具有抗菌和抗 病毒的持久性，同时资源丰富，使用安全，药品的开发研究前景十分乐观。 随着药理研究和临床应用的深入，鱼腥草药用保健产品的开发研制也r 益 受到重视。鱼腥草茶、鱼腥草饮料、鱼腥草营养液、鱼腥草袋装方便食品和鱼腥 4 巾山大学硕士学位论文1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 草蜜酒等许多新产品也先后问世。 1 2 鱼腥草素研究背景 鱼腥草素是鱼腥草挥发油中含量最高的单一活性成分，化学命为癸酰乙醛 ( h o u t t u y n i n ) ，即鱼腥草素( f i g u r e1 - 1 ) ，具有正式的药用标准，在临床使用的 注射剂是其亚硫酸氢钠加成物。鱼腥草素钠具有广谱抗菌、利尿消肿、快速退热， 以及良好的抗病毒、抗肿瘤、增加机体免疫力等广泛的药理作用【3 2 1 。合成鱼腥 草素( f i g u r e1 - 2 ) 是鱼腥草素和饱和亚硫酸氢钠溶液反应得到癸酰乙醛的亚硫 酸氢钠加成物，新鱼腥草素( f i g u r e1 - 3 ) 与鱼腥草素相比，脂肪链增长了两个 碳原子。 oo h ，c 叭、一v 儿 f i g u r e1 - 1 鱼腥草素结构式 oo h h ，c 八儿人s 。3 n a f i g u r e1 - 2 鱼腥草素钠结构式 oo h 儿人s o ，n a f i g u r e1 - 3 新鱼腥草素钠结构式 合成鱼腥草素可以明显拮抗炎症早期的炎症渗出和组织水肿，对炎症性疼痛 反应也有较强的抑制作用。另外，合成鱼腥草素和新鱼腥草素也可以用来治疗腮 腺炎、肺炎、支气管炎、扁桃体炎感染性腹泻等 3 3 - 3 5 】。 1 2 1 抗肿瘤活性 ， 研究表明，鱼腥草素具有抗肿瘤活性。早在1 9 8 4 年中山大学核医学教研室 吴乃允发现f 3 6 】新鱼腥草素体外对3 h t d r 及3 h u r 参入小鼠肝癌细胞有明显的 抑制作用，同时表明新鱼腥草素体外可能有直接杀死小鼠肝癌细胞的作用。随后 潘启超研究证明【3 7 1 新鱼腥草素对小鼠移植性肿瘤s 1 8 0 ，肝癌，l 2 和e s c 有边 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 缘抗瘤活性，抗肿瘤作用与剂量不成正比关系。同时发现鱼腥草素有可能作为其 他抗瘤药物的辅助药物，以提高疗效、减少剂量和毒性。 辽宁省中医研究院的赵小青于2 0 0 1 年对鱼腥草素在治疗晚期肺癌中的疗效 进行了研究【3 8 l 。随机择取原发肺癌i i i b 病例4 8 例。分为对照1 组，对照2 组和 观察组。对照1 组予西药小牛胸腺肽，对照2 组予西药小牛胸腺肽加服十全大补 汤，观察组给予鱼腥草注射液同时口服十全大补汤。结果发现，鱼腥草素注射液 同时口服十全大补汤加减治疗，可以使带瘤生存生活质量明显提高，延长生存期。 1 2 2 抗炎镇痛作用 药理研究表明，消炎作用是鱼腥草素生物活性的一个重要方面f 3 9 1 。1 9 9 8 年 沈阳药科大学中药系李爽 4 0 , 4 1 】证明了h o u 对多种致炎剂引起的炎症渗出和组织 水肿均有明显的抑制作用，显著降低小鼠耳肿胀和大鼠足肿胀程度，降低小鼠腹 腔毛细血管通透性。同时，h o u 可以抑制醋酸所致的小鼠扭体反应，延长热痛 反应潜伏期，拮抗甲醛致痛作用，提示h o u 对炎症性疼痛反应也有较强的抑制 作用，其抗炎镇痛作用基本接近阿斯匹林和消炎痛。 其抗炎作用与抑制炎症介质p g e 、s r s a 有关，通过抑制前列腺素合成酶、 炎症毛细血管通透增加和浆液渗出而达到抗炎镇痛作用。 1 9 9 7 年杭州动植物检疫局蔡渭明等【4 2 】用吖啶橙法测定了合成鱼腥草素对牛 奶中性白细胞的吞噬活性。结果表明：0 0 2 m g m l 合成鱼腥草素在体外能显著 提高牛奶中性白细胞的吞噬指数和杀伤百分率( p o + r n h 2 n h - r 产n - r + h 2 0 ( 2 - 1 ) 1 0 中山大学硕士学位论文 1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 2 1 1 1 胺类物质的亲核性 胺类物质中氮原子的电子云密度越大，试剂的亲核性就越强，化学反应速度 就越快；反之就越慢。如对芳香性的胺，其苯坏上氨基的邻、对位采用供电子的 烷基、羟基等基团，则有利于氮原子电子云密度增加；反之，苯环上氨基的邻、 对位采用吸电子的基团如硝基、卤素等，则不利于氮原子电子云密度增加，其亲 核性下降，反应速度下降。 2 112 羰基碳原子亲电性 碳原子电荷越少，越有利于亲核试剂的进攻，化学反应速度越快。对于醛类 化合物，如芳醛类化合物，其芳环上有吸电子的取代基，通过诱导与共轭效应， 使得醛基上的碳原子正电荷加强，有利于s c h i f fb a s e 的形成，对于酮类化合物， 与羰基碳相连的基团，如是吸电子的基团，则有利于亲核加成化学反应的进行， 有利于s c h i f f b a s e 的形成；反之，则不利于s c h i f f b a s e 的形成。 2 1 1 3 脱水性 对此反应体系来讲，从反应平衡中去掉产物中的水，有利于s c h i f f b a s e 的生 成，则产率提高。我们可以用以下方法除去反应中的水：( 1 ) 硫酸镁、硫酸钠 等是通常采用的脱水剂，由于无水硫酸镁与反应中的水结合，形成固体结晶体， 从而使水脱离液相反应体系，平衡有利于向生成s c h i f f b a s e 的方向移动。( 2 ) 使 用d e a ns t a r k 仪器，使反应生成的水脱离反应体系。 2 1 1 4 空间效应 当氮原子或羰基碳原子直接连有大的基团时，由于大基团的空间位阻，不利 于亲核加成反应的进行。一般情况下，对于底物来讲，同类的醛要比酮易于进行 化学反应，因为酮羰基碳上连有两个相对大的基团，而醛羰基碳由于连有一个体 积相对小的氢，所以醛类物质比酮类物质易于发生亲核加成反应。对于进攻的亲 核试剂胺类化合物，氮原子连有的基团越大，越不利于化学反应的进行。 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 2 1 1 5 溶剂的极性 胺类化合物对底物羰基类化合物的亲核加成反应，反应物的电荷分散，当反 应形成过渡态时，过渡态的电荷相对于反应物的增大、集中，选择极性比较大的 溶剂有利于过渡念的稳定，从而降低反应的活化能，有利于产物的生成。因此， 选择极性比较大的溶剂会加速化学反应的进行。 2 1 2 席夫碱的合成方法 2 1 2 1 液相合成方法 氨基硫脲和氨基脲的活性较大，所以这两类席夫碱的合成较为容易，一般是 直接在无水乙醇中回流或常温搅拌即可得到目标化合物，并且产率较高，后处理 也较为容易。s h a h n s 等以苯甲醛和氨基硫脲为原料，水和乙醇的混合物为溶 剂，冰醋酸催化下合成氨基硫脲希夫碱，最终产率达至j j 9 4 6 3 1 。 夕 s 由+ 州儿叱 e t o h h 2 0 h 2 j a i n s a n m a t i k 等以同样的原料，溶剂，只是没有用乙酸作催化剂的情况下 得至i j t 9 2 的产物【6 4 】。 b a s u l i f a l g u n i 等以苯甲醛和氨基脲盐酸盐为原料，用乙酸钠调p h 为中性， 以水和乙醇化合物为溶剂，得到了目标化合物【6 5 1 。 ，艿+ 俐”o 2 。 h c i e t o h ，h 2 0 hh ( 2 - 3 ) 羟胺，甲氧基胺相对活性较小，合成起来相对来说就比较困难，所以文献报 道相对就较少。f a n g l e i 等以盐酸羟胺和苯甲醛为原料用氢氧化钾调p h 值在水 溶液中7 0 。c 搅拌两个小时得到目标化合物【6 6 】。 1 2 nn s几乓彩 ， ， 、 川6 n n o 几f 太彩。川6 2 中山大学硕士学位论文 p 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 艿+ h 2 n o h 。h c i 百h 2 0 h ( 2 卅 j a i n n i d h i 等以苯甲醛和盐酸羟胺为原料，在乙醇和吡啶中回流两个小时， 最后得到目标化合物，产率可达9 5 1 6 7 1 。 b e a k p e t e r 等以盐酸甲氧基胺和苯甲醛为原料，碳酸钠调p h 值，在水和乙醇 的混合液中反应，最后产率达到7 l 纠6 8 1 。 艿+ h 2 n o c h 3 。h c ii e t o h , h 2 0 2 1 2 2 固相合成 ( 2 - 5 ) d e w a n 等在z n s o 。催化下，用微波法合成了苯甲醛的甲氧基胺席夫碱，且产 率高达9 9 【6 9 1 。 艿+ h 2 n o h h c i z n s 0 4 h ( 2 - 6 ) n i k n a m ，k h o d a b a k h s h 等以对羟基苯甲醛和盐酸羟胺为原料，在无溶剂条件 下，以三氧化二铝为负载物，8 0 c 搅拌3 0 m i n ，产率可达9 0 【7 0 1 。 小删- 旦毋乃 h a j i p o u r ，a b d 0 1 r e z a 等以苯甲醛和氨基脲为原料，在无溶剂条件下和硅胶、 氢氧化钠于研钵中研磨约】0 分钟，产率达9 2 ，在此反应中硅胶起催化作用f 7 l 】。 on 。=6 o n 1 j 、川6 o n 1 y：p岭 中山大学硕士学位论文1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 o o 由+ 州儿心 2 1 3 席夫碱的顺反异构 n a o h h 2 s i l i c ag e l 席夫碱槲e c = n 双键，它有顺反两种异构体【7 2 】： r 1 = nr 1 = n ，r 3 r 声n r 。f n c u r t i n 年1 h a u s s e r 得到了亚胺中异构体异构化的速度。在环己烷中，室温或更 高温度下，这些纯物质异构化为顺式和反式异构体的平衡混合物，异构的速度很 快。但是由芳香胺得到的亚胺只以一种异构体存在。d eg a o u c k v 对p h c h = n p h 取代衍生物的偶极距的研究表明，该物质仅以反式异构体存在。 2 2 实验内容 2 2 1 试剂和仪器 主要测试仪器： 核磁共振仪 质谱仪 熔点仪 红外光谱分析仪 m e r c u r y - - p l u s3 0 0 ( 美国v a r i e d , r ) l c m s - - 2 0 1 0 a ( 日本岛津) 、脓s 一1 b 数字熔点仪( 上海精密科学仪器有限公司物 理光学仪器厂) ，未校正 v e c t o r2 2 ( 德国b r u k e r 公司) 主要试剂： 对氟苯乙酮，苯乙酮，对甲氧基苯乙酮，草酸二乙酯，甲氧胺盐酸盐，乙氧 胺盐酸盐，苄氧胺盐酸盐，金属钠，石油醚( 6 0 - 一9 0 c ) ，乙酸乙酯，甲醇，乙 1 4 n n o儿乓彤儿 中山大学硕十学位论文1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 醇，二氯甲烷，氢氧化钠，浓盐酸，无水硫酸镁，柱层析硅胶( 1 0 0 2 0 0e 1 ) ，以 上试剂均为市售分析纯。 2 2 2 实验方法和结构表征 本论文是以取代的苯乙酮和草酸二乙酯为原料合成了一系列的2 ，4 一 二氧代羧酸和2 ，4 一二氧代羧酸乙酯中间体，然后将中问体再分别与三种烷氧 基胺盐酸盐缩合生成b 一二酮衍生物，其中中间体5 个，目标化合物1 3 个，共 计1 8 个化合物，其中1 3 个未见文献报道，合成路线如下： oo r r r o oo oo 其中： ( c o o c h 2 c h 3 ) 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 一i h ( 1 ) c h 3 c h 2 0 n ar ( 2 ) h c i h 2 0 r 2 0 n h 2 1 - 1 c i c o o r - 二= 2 一 。c h 3 c h 2 0 h n a o h 。 一 r n h 2 n h 2 h 2 0 c o o h 弋瓦丽c h ，c o o h r = f ，h ，o c h 3 ； r 2 = c h 3 ，c 2 h 5 ，c h 2 p h ； r 4 = c h 3 ，c 2 h 5 ，c h 2 p h r c o o r l ( 2 9 ) h n n c o o r l ( 2 10 ) c o o h ( 2 - 1 1 ) r l = h ，c 2 h 5 ； r 3 = o c h 3 ，c 2 h 5 ，c h 2 p h ； 中山大学硕士学位论文1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 所合成化合物结构及编号： f b l o f 2 - l 。 o o r 、 占、n 占、n f 肜、。一1 f 2 2 国 oo 、n c 肜姒c 0 0 h f i 2 、7 o 、 n ，on - o f d 从f i - 3 一 f 2 - 3 7 5 1 2 n 双取代产率 2 7 0 中山大学硕士学位论文 p 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 由上表可知，当l n 1 2 时，主要生成b 一二酮酸衍生物的单缩合物，当 1 2 n 2 时，生成单缩物和双缩物的混合物，其中以单缩物为主，当2 n 时， 主要生成双缩合物。 2 3 2 2 21 3 二酮羧酸酯衍生物合成 h 3 c o o c h 3 c h 2 0 n h 2 h c i c h 3 c h 2 0 h ，n a o h h 3 保持其他条件不变，探究温度、时间、催化剂对反应的影响： 表2 3 温度、时间、催化剂与产率的关系 o 1 3 二酮羧酸酯衍生物的合成是在回流条件下进行的，约2 0 小时反应完成， 为了考查反应温度和时间对该反应的影响，我们分别选取室温、4 0 。c 、6 0 。c 条件 作为对比，结果表明在室温、4 0 。c 和6 0 条件下反应产率较低，且有副产物产 生，后处理较为麻烦。 为了考查催化剂对该反应的影响，根据相关文献，我们分别以固体氢氧化钠、 5 m 氢氧化钠、三乙胺为催化剂进行对比试验，结果证明以固体氢氧化钠为催化 剂效果最好，它可以使该反应在回流条件下2 0 小时完成；采用三乙胺和5 m 氢氧 化钠为催化剂时，产率较低，且副产物多，给后处理带来很大麻烦。 中山大学硕士学位论文1 3 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 f 2 3 2 2 3b 二酮吡唑衍生物的合成条件摸索 oo c o o h n h 2 n h ih 2 0 c h s c o o h f h n n c o o h ( 2 2 0 ) 为了摸索1 3 二酮吡唑衍生物的较优合成条件，根据相关文献，我们尝试了三 种方法，e t o h h 2 s 0 4 ( 催化量) 法和2 0 ( 质量分数) n a c i 法，c h 3 c o o h 法， 结果表明前两种方法均可行，但产率较c h 3 c o o h 法低，且后处理较为麻烦。 2 3 2 3 二酮衍生物合成条件的确定 在这一章的前一部分我们提到，席夫碱的合成有五个方面的影响因素：胺的 亲核性、羰基的亲电性、空间效应、脱水性和溶剂的影响。因此在确定了所选化 合物的种类，即前三个影响因素不变的前提下，应着重考虑后面的两个因素的影 响。首先，可以选择乙醇或者甲醇等强极性溶剂作为反应溶剂，以增加溶剂的极 性：其次，尽量减少水的引入，溶剂最好是经过无水处理。 ( 1 ) 烷氧基胺主要都是以盐酸盐的形式存在，在这几类反应中因为要中和其中 的盐酸就不可避免的要引入一些水，常用的方法就是以5 mn a o h 和三乙胺为中 和剂，结果证明该方法虽然可行，但存在副产物较多，反应时间长等缺点。我们采 用的办法是直接用固体n a o h 作为中和剂，取得了良好的效果，反应在室温下搅拌 6 个小时即可完成。 ( 2 ) 二酮类衍生物的后处理：本实验的处理方法与常规的合成席夫碱类化合 物后处理有所不同，因本文合成的席夫碱类化合物部分含有羧酸基团，因此可采 用反应后加酸析出的办法得到纯净的产物。 2 4 小结 本章是本论文的实验部分。我们参考相关文献成功的摸索出了一个适合1 3 二酮酸( 酯) 和烷氧基胺盐酸盐反应的反应条件，在对天然鱼腥草素改造的基础 上合成了1 8 个化合物，其中5 个有机酸( 酯) 中间体，1 3 个目标化合物均未见文 2 8 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 献报道。并通过1 hn m r 、1 3 cn m r 、i r 、e s i m s 等手段对所合成化合物的结 构进行了确证。 2 9 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 第3 章抗菌药物筛选与构效关系初探 一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证 实，首先采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用，体外 实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度， 为深入体外实验和体内药效研究提供数据。 体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢 的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或 部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。体外实验是细菌 与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一 致，需两方面综合分析进行评价。 3 1 抗菌药物筛选方法 3 1 1 微生物培养基的配制、灭菌与培养 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖成积累代谢产物的各种营 养物质混合配制而成的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种 保藏等方面。培养基一般应含打微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无 帆船、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足有微生物生长繁殖或积累代谢 产物的要求，还必须控制培养基的p h 。一般细菌、放线菌适于生长在中性或微 碱性的环境中，而酵母菌和霉菌则适于生长在偏酸性的环境中。因此，在配制培 养基时，须将培养基调节在一定p h 的范围内。迄今为止，培养基的种类极其繁 多。 按培养基的成分，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。 天然培养基是指利用动物、植物、微生物或其他天然有机成分配制而成培养基。 其优点是营养丰富、价格便宜。缺点是成分不能准确确定且不稳定。实验室常用 的牛肉汁或麦芽汁培养基即为天然培养基。合成培养基是指完全利用已知种类和 3 0 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 成分的化学试剂配制而成培养基。优点是各成分均为已知且含量稳定，缺点是价 格较贵。实验室常用的高氏一号培养基即为合成培养基，半合成培养基是指由天 然有机成分和已知化学试剂混合组成的培养基。实验室常用的马铃薯葡萄糖培养 基即为半合成培养基。 按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培 养基。固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂( 常加1 5 一2 的琼脂) 经融化冷凝而成。半固体培养基是指在液体培养基中加入0 8 一1 左右的琼脂，经融化冷凝而成。液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养 基呈液体状态。 3 1 1 1 基本原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生 物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的 配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的 准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以 及接菌等基本环节大致相同。 3 112 实验材料 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、胰蛋白胨、琼脂等。l m o l ln a o h 、l m o l l h c l 溶液。 材料与仪器：天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、 移液器、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、p h 试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸等。 3 1 1 3 实验过程 3 1 1 3 1 液体培养基的配制和灭菌过程 液体培养基的配制组成成分及比例如下： 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 牛肉膏 0 5 9 牛肉膏0 5 9 蛋白胨1 9 蛋白胨 1 9 n a c l 0 5 9 n a c l 0 5 9 琼脂1 5 2 9 水1 0 0 m l水 1 0 0 m l p h 7 2 p h 7 2 ( 1 ) 称量及溶化分别称取蛋白胨相n a c i 的所需量，置于烧杯中，加入所 需水量的2 3 左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另- 4 , 烧杯中，进 行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。 将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 ( 2 ) 调p h 待溶液冷至室温时，用i m o i l n a o h 溶液调p h 至7 2 。 ( 3 ) 定容特溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 ( 4 ) 固体培养基加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。 ( 5 ) 分装、加塞、包扎。 ( 6 ) 高压蒸汽灭菌1 0 0 p a 灭菌2 0 m i n 。 液体培养基装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为 1 5 1 5 0i n t o 时，液体培养基可分装至试管高度i 4 左右为宜；如分装团体或半 固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体 培养基的分装量为管高i 5 ( 约3 - 4 m l ) 。 3 1 1 3 2 培养基的灭菌 培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，1 0 0 p a 灭菌2 0 m i n 。如 因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。 高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面最 常用的一种灭菌方法。一般培养基：玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、金属用具、 接种室的实验服及传染性标本等都可采用此法灭菌。 高压蒸汽灭菌是把待灭菌物品放在一个密闭的高压蒸汽灭菌锅中，当锅内压 人为1 0 0 p a 时，温度可达到1 2 ，一般维持2 0 m i n ，即可杀死一切微生物的营 养体及其孢子。高压蒸汽灭菌是依据水的佛点随水蒸汽压的增加而上升，加压是 中山大学硕士学位论文b 一二酮衍生物的合成及生物活性研究 为了提高水蒸汽的温度。 ( 1 ) 打开灭菌锅盖，向锅内加适量水。水量不足，灭菌锅易蒸干。 ( 2 ) 将待灭菌物品放入灭菌桶内，物品不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响 蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。 ( 3 ) 将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，有利于罐内冷空气