（微生物学专业论文）产氢菌株阪崎肠杆菌的筛选及其产氢特性的研究.pdf

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f r e e ，h i g hh e a tv a l u ea n de a s i l ys t o r a g ea n dt r a n s p o r t a t i o n “h y d r o g e ne c o n o m y b e c o m e s a n i m p o r t a n tp a r t o fp r o g r a mf o re c o n o m i c d e v e l o p m e n to fm a n yc o u n t r i e st h e r e f o r e i nt h i ss t u d y , ah i g h - e f f i c i e n th y d r o g e np r o d u c i n gs t r a i nh a sb e e ni s o l a t e df r o m t h eh o ts p r i n g i tw a si d e n t i f i e da se n t e r b a c t e rs a k a z a k i ib ya n a l y s i so fm o r p h o l o g y , p h y s i o l o g ya n d16 sr r n ag e n es e q u e n c e v a r i e sf a c t o r s ( e g p h ，c a r b o ns o u r c e s ， g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n , t e m p e r a t u r e ，0 2p r o p o r t i o na n dc e l ld e n s i t y ) w h i c hi n f l u e n c e s t h eh e p r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d a f t e ro r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rh y d r o g e np r o d u c t i o nw e r ea c h i e v e da s i n i t i a lp hv a l u e8 0 ，l l s i i l g g l u c o s ea sc a r b o ns o u r c e s ，t e m p e r a t u r e3 5 。c ，o x y g e nc o n c e n t r a t i o no i nt h eb a t c h f e r m e n t a t i v eh y d r o g e np r o d u c t i o n , t h em a x i m a lh y d r o g e np r o d u c t i o nw a so b t a i n e da s 5 5 m o l h m gd w t h eo r g a n i ca c i dc o m p o n e n t so fw a s t e w a t e ra f t e rd a r k f e r m e n t a t i v eh y d r o g e n p r o d u c t i o nw e r ea n a l y s e di nt h i ss t u d y a f t e r3 6h o u r sf e r m e n t a t i o n , t h ew a s t e w a t e r 舶me n t e r b a c t e rs a k a z k i ih pm a i n l yc o n t a i n e da c e t i ca c i dw i t hac o n c e n t r a t i o no f 2 2 2 9 9 m la n db u t y r i ca c i dw i t hc o n c e n t r a t i o no f3 3 3 9 9 m l t h ew a s t e w a t e rf r o m k l e b s i e l l a o x y t o c ah p lm a i n l yc o n t a i n e d t h e a c e t i ca c i d sc o n c e n t r a t i o ni n k l e b s i e l l ao x y t o c ah p l sw a s t e w a t e rw a so 6 6 9 9 m la n dt h eb u t y r i ca c i d s c o n c e n t r a t i o ni ni tw a s11 7 9 9 9 m l t h eh y d r o g e nc a nb ep r o d u c e db yt h ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ( p s b ) u s i n ga c e t i c a c i da n db u t y r i ca c i di nt h ep r o c e s so fp h o t o f e r m e n t a t i o n i nt h i sr e s e a r c h , t h ep h v a l u eo ft h ef e r m e n t a t i v ew a s t e w a t e r0 te n t e r b a c t e rs a k a z k i ih pa n dk l e b s 记n n o x y t o c a h p1w a sa d u j s t e dt o7 t h ew a s t e w a t e rw a st h e ni n o c u l a t e dw i t h r h o d o p s e u d o m o n ac a p s u l a t ec n 1 a ne l e m e n t a r ye x p e r i m e n ta b o u tp s bw h i c hu s e d 3 产氡菌株阪崎肠杆菌的筛选及其产氢特性的研究 a n a e r o b i cf e r m e n t a t i v ew a s t e w a t e rt op r o d u c eh y d r o g e nw a sd o n e a sa r e s u l t ，t h e m a x i m u mv a l u eo fp h o t o f e r m e n t a t i v e h y d r o g e np r o d u c t i o nw a sf o u n dt ob e 0 12 m m o lh 2 m lw a s t e w a t e r t h i sr e s e a r c hp r o v e st h a tt h em e t h o di su s e f u lf o r h y d r o g e nt r a n s f o r m a t i o n k e yw o r d s ：e n t e r b a c t e rs a k a z a k i ih p ；i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n ；h y d r o g e n p r o d u c t i o n 4 前言 1 前言 能源的每次变革都对人类文明的进步起着巨大的推动作用，它是社会经济发 展的动力，是人类文明的物质基础，是人类社会存在的基石。化石能源是当前人 类消费的主要能源，但是由于人口的增长和人类物质、文化生活水平的不断提高， 化石能源由于被大量开采而面临枯竭。当化石能源危机向世人敲响警钟时，与其 相关的资源、环境、经济甚至政治、军事等方面都显现出f 1 益加剧的矛盾。建立 在能源消耗基础上的人类文明面临着前所未有的严峻挑战，开发可持续能源系统 成为世界各国发展的重要环节。 1 1 能源概述 1 9 8 2 - - 一1 9 9 0 年期间，世界能源需求总量年均增长率为2 6 。根据1 9 9 3 年b p 世界能源统计评论，1 9 9 2 年的全球一次能源消费量为1 11 3 亿吨标准煤，约为 7 4 亿吨石油当量。来自英国石油( b r i t i s hp e t r o l ，b p ) 公司最新的报告显示，2 0 0 2 年全球一次能源消费量为9 4 0 5 亿吨石油当量。国际能源署( i n t e r n a t i o n a le n e r g y a s s o c i a t i o n , i e a ) 在世界能源预测2 0 0 2 9 报告中预测，在未来3 0 年间，全球 一次性能源需求增幅为1 7 年，到2 0 3 0 年时，年需求量将达到1 5 3 亿吨石油 当量。 化石能源是当前的主要能源。2 0 0 1 年能源消费结构显示，石油消费量占世 界能源消费总量的3 8 5 ，天然气占2 3 7 ，煤炭占2 4 7 ，其次是核能和水电， 可再生能源所占比例很小，如图l 。 口石油 天然气 口煤炭 口核能和水电 图12 0 0 1 年世界能源的消费结构 f i g 1 c o n s u m es t r u c t u r eo fw o r l de n e r g yi n2 0 0 1 产氯菌株阪崎肠杆菌的筛选及其产氧特性的研究 中国是一个人口众多的发展中国家，经济的快速增长需要更多的能源。我国 的能源工业面临着经济发展和环境保护的巨大压力乜1 。与世界相比，我国的能源 资源更为紧张。以石油为例，我国2 0 0 1 年人均石油可采储量只有2 6 吨，仅为 世界平均值的1 1 。2 0 0 1 年原油产量1 6 5 亿吨，原油生产已进入高峰期，仍然 不能满足国内需要，2 0 0 2 年进口超过9 , 0 0 0 万吨，2 0 0 3 年我国石油进口量已经 超过同本，成为世界第二大石油进口国。据国家统计局2 0 0 6 年2 月2 8 同发布 的统计公报，中国2 0 0 5 年能源消费总量2 2 2 亿吨标准煤，比上年增长9 5 。其 中，煤炭消费量2 1 4 亿吨，增长1 0 6 ；原油3 0 亿吨，增长2 1 ；天然气5 0 0 亿立方米，增长2 0 6 ；水电4 ，0 1 0 亿千瓦小时，增长1 3 4 ；核电5 2 3 亿千瓦 小时，增长3 7 。 能源有多种分类方法，按形成方式可分为一次能源( 如煤炭、石油、天然气、 太阳能等) 和二次能源( 如电、煤气、蒸汽等) ；按循环方式可分为不可再生能 源( 如化石燃料) 和可再生能源( 如太阳能、水能、生物质能) ；按使用性质可 分为含能体能源( 如煤炭、石油等) 和过程能源( 如太阳能、电能等) ；按环境 保护的要求可分为清洁能源( 又称绿色能源，如太阳能、氢能、风能、潮汐能等) 和非清洁能源；按现阶段的成熟程度可分为常规能源和新能源n 1 。 随着世界经济的快速发展，必然导致能源消耗速度加快。在以化石能源为主 体的能源体系中，煤炭、石油和天然气等化石能源是不可再生能源，而其在地球 上的储量是十分有限的。据2 0 0 4 年世界能源统计年鉴的数据显示，世界石油总 储量为1 5 万亿桶，仅能够生产使用4 0 多年；全球煤炭储藏量l 万亿吨，仅够 开采2 0 0 多年。2 0 世纪7 0 年代以来经历两次石油危机，使石油价格不断攀升， 而石油的消耗量却丝毫不见减少的趋势。随着能源消耗的增加和能源供应的危机 感同益加重，能源问题已成为世界各国特别关注的一个问题。发达国家对世界能 源的争夺日趋激烈，甚至不惜采取军事手段达到控制他国能源资源的目的h 1 。同 时由于大量使用化石能源，对大气和环境也造成严重的污染，给生态系统和人类 本身带来极大的危害。化石燃料燃烧生成大量的二氧化碳、二氧化硫等给地球带 来了温室效应和酸雨等腼1 ，世界气候异常，酷热、严寒、洪水、海啸和地震肆虐 地球，人们正常的生产生活受到严重的干扰和损害。因而开发新能源尤其是可再 生的清洁能源已成为全世界的共识，成为确保人类正常生活的紧迫问题，成为保 6 前言 持世界经济可持续发展的必然选择旧3 。 新能源与常规能源是一个相对的概念，随着时代的发展，新能源的内涵不断 变化和更新。目前，新能源主要包括太阳能、氢能、核能、化学能、生物质能、 风能、地热能和海洋能等1 。可再生能源是指在自然界中可以不断再生、永续利 用、取之不尽、用之不竭的资源，它对环境无害或危害极小，而且资源分布广泛， 适宜就地开发利用。我国有大量的可再生能源资源。据报道，三分之二以上的大 陆地区平均太阳能辐射超过6 0 0k j l c m 2 ，每年吸收的太阳能相当于1 7 万亿吨煤 炭当量( t o n - c o a l - e q u i v a l e n t ，t c e ) ，利用太阳能的前景是非常可观的。风能总量 大约为1 6 亿k w ，可利用的风能大约为2 5 亿k w 。储备的地热能估计有1 , 3 4 5 亿t c e ，而已探明的储备大约为3 2 亿t c e 。生物能源资源储量也极为丰富，比 如年作物残渣相当于3 1 ，0 0 0 万t c e ，木材总量相当于1 3 ，0 0 0t c e ，再加上城市 垃圾、废水，生物资源的总量相当于6 5 ，0 0 0t c e 订1 。 1 2 氢能及其应用 氢是一种能源载体，是指在目前或者可以预见的将来，人类社会可以通过某 种途径获得的，并可以工业规模加以利用的储藏在氢中的能量n 1 。氢能作为理想 的清洁能源之一，已引起人们的广泛重视。科学家认为，氢能在二十一世纪能源 舞台上将成为一种举足轻重的能源。为什么氢能将是人类未来的能源? 因为氢具 备其他能源所没有的特点： ( 1 ) 氢的资源丰富。在地球上的氢主要以其化合物，如水和碳氢化合物：石油、 天然气等形式存在。水是地球的主要资源，地球表面的7 0 以上被水覆盖，水储 量为2 1 ，0 1 8 万吨；即使在大陆，也有丰富的地表和地下水。水就是地球上无处 不在的“氢矿 。 ( 2 ) 氢的来源多样性。可以通过各种一次能源( 可以是化石燃料，如天然气、煤、 煤层气；也可以是可再生能源，如太阳能、风能、生物质能、海洋能、地热能) 或者二次能源( 如电力) 来开采“氢矿 。地球各处都有可再生能源，而不像化 石燃料有很强的地域不均匀性。 ( 3 ) 氢能是最环保的能源。氢本身无色、无嗅、无毒。利用低温燃料电池，由电 化学反应将氢转化为电能和水，不排放二氧化碳和氮氧化合物，没有污染。使用 氢燃料内燃机，也是显著减少污染的有效方法。 7 产氧菌株阪崎肠杆菌的筛选及其产氢特性的研究 ( 4 ) 氢的能量密度高。每千克氢的热值为1 4 3m j ，约为石油热值的3 倍阿1 。其 燃烧性能好，点燃快，与空气混合时有广泛的可燃范围( 3 9 7 ) ，而且燃 点高，燃烧速度快。 ( 5 ) 氢具有可储存性。像天然气一样，氢气可以很容易地大规模储存。这是氢能 和电、热最大的不同。太阳能、风能等分散间歇发电装置及电网负荷的峰谷差或 其他大量廉价电能都可以转化为氢能储存。这样，在电力过剩的地方和时间，可 以用氢的形式将电或热储存起来。需要时再使用，这种储能方式分散灵活，适应 现代社会发展的需要。这也使氢在可再生能源的应用中起到其他能源载体所起不 到的作用。 ( 6 ) 氢的可再生性。氢通过化学反应产生电能( 或热) 并生成水，而水又可电解 转化为氢和氧。 ( 7 ) 氢是“和平”能源。化石能源分布极不均匀，常常引起激烈争端。例如，中 东是世界石油最大产地，也是各国列强必争之地。氢既可再生又来源广泛，每个 国家都有丰富的“氢矿”，不会因为来源问题而产生矛盾。 由于氢具有以上特点，可以同时满足资源、环境和可持续发展的要求，是其 它能源所不能比拟的，所以备受青睐。 氢作为理想的清洁能源，其用途主要有以下几个方面：目前，氢主要应用 于日用品市场，如石油化工、氨生产、甲醇生产。同时氢在其它市场如玻璃、食 品、电子和冶金等也扮演着越来越重要的角色旧1 。氢作为燃氢发动机的燃料， 可用于汽车、火车、轮船和飞机等，也可以像天然气一样用于加热设备。近几 年来，氢的用途又有新的发展，被广泛用于燃料电池中。燃料电池具有高效、可 靠、灵活、低污染、操作性能优良等优点，表现出广阔的应用前景。氢燃料电池 汽车因其减少了对汽油的依赖和温室气体的排放，而受到越来越多的关注n 。目 前，世界很多国家都制定了一系列的氢能发展计划，加大对氢能的开发投资力度， 以确保能源安全及可持续发展。 目前所采用的制氢方法有很多种，主要可分为水制氢、化石原料制氢、生物 制氢及其它方法制氢，如图2 。 ( 1 ) 电解水制氢：该过程是氢与氧燃烧生成水的逆过程，工艺简单，无污染，效 率一般在7 5 - 8 5 ，但消耗电量大，每立方米氢气电耗为4 5 - - 5 5k w h 左右。 前言 h y d r o g e np a t h w a y s h y d r o g e ni so n l ya ne n e r g yc a r d e r i ti sp r o d u c e df r o mo t h e re n e r g yl l , o u r c e $ 图2目前采用的制氢方法及氢的应用n 妇 f i g 2 t h ec u r r e n tp a t h w a y so fh y d r o g e n p r o d u c t i o na n da p p h c a f i o n 目前主要用于工业生产中要求纯度高、用量不多的工业企业。 ( 2 ) 水热化学制氢：是指在水系统中，在不同温度下，经历一系列不同但又互相 关联的化学反应，最终将水分解为氢气和氧气的过程。 ( 3 ) 高温热解水制氢：水直接加热到很高温度，例如3 , 0 0 0 以上，部分水或水 蒸气可以离解为氢和氧。但这种过程非常复杂，其中突出的技术问题是热源、材 料及氢氧的分离。 ( 4 ) 煤制氢：以煤为原料制取含氢气体的方法主要有两种，一是煤的焦化( 或称 高温干馏) ，二是煤的气化。焦化是指煤在隔绝空气条件下，在9 0 0 - - 1 , 0 0 0 制取焦炭，副产品为焦炉煤气。焦炉煤气组成中含氢气5 5 - - 6 0 ( 体积) 。煤 的气化是指煤在高温常压或加压下，与气化剂( 水蒸气或氧气、空气) 反应转化 成气体产物，该产物中含有氢气等组分。 ( 5 ) 气体原料制氢：天然气是重要的气体形态化石燃料，主要成分是甲烷。其制 氢的方法主要有天然气水蒸气重整制氢、天然气部分氧化重整制氢、天然气水蒸 气重整与部分氧化联合制氢和天然气( 催化) 裂解制氢。 ( 6 ) 液体化石能源制氢：液体化石能源包括石油、甲醇、乙醇、轻质油和重油等。 9 产氧菌株阪崎肠杆菌的筛选及其产氧特性的研究 其制氢方法包括甲醇裂解变压吸附制氢、甲醇重整、轻质油与水蒸气催化制氢 和石油部分氧化法制氢。 ( 7 ) 微生物转化制氢：包括光合生物产氢、发酵细菌产氢以及光合生物与发酵细 菌的混合培养产氢。 ( 8 ) 生物质热化工转化制氢：包括固体燃料的气化及生物质热解。固体燃料的气 化就是利用空气中的氧气或与水蒸气一起将固体燃料( 煤、木料或农业剩余物等 生物质) 中的碳氧化生成可燃气体的过程。生物质热解( 热分解) 过程是指在隔 绝空气或只通入少量空气的条件下使生物质( 植物质) 受热而发生分解的过程。 ( 9 ) 其他制氢方法：烃类热裂解法或等离子体法分解生成氢气；氨裂解制氢；新 型氧化物材料制氢；n a b i - h 的催化水解制氢；硫化氢分解制氢；太阳能直接光电 制氢；辐射性催化剂制氢；各种化工过程副产氢气的回收；电子共振裂解水；陶 瓷和水反应制取氢气。 以上各种制氢方法中，除微生物转化制氢外，都需要消耗大量的能量或化石 燃料，易造成二次污染，不能从根本上解决资源短缺和环境污染等问题。 1 3 生物制氢 生物制氢是利用微生物代谢产氢过程来制取氢的一项生物工程技术n 别，所用 原料可以是有机废水，城市生活垃圾或者其它生物质( b i o m a s s ) ，其来源丰富， 价格低廉。与传统的物理化学方法相比，生物制氢技术具有清洁环保、节约能源 和不消耗矿物资源等突出优点，在氢的制备及其应用技术研究开发领域中越来越 受到人们的关注。 利用微生物制取氢气这一课题已经研究了几十年。在2 0 世纪3 0 年代，第 一次报道了细菌暗发酵制取氢气。随后在1 9 4 2 年g a f f r o n 和r u b i n 报道了绿藻 利用光能产生氢气，1 9 4 9 年g e s t 和k a m e n 发现光营养产氢细菌。s p m i t 在1 9 5 8 年证实藻类可以通过直接光解过程产氢而不需要借助于二氧化碳的固定过程。 h e a l y ( 1 9 7 0 年) 的研究表明光照强度过高时由于氧气的产生c h l a m y d o m o n a s m o e w s u i i 的产氢过程将受到抑制n 。目前人们所研究的生物制氢主要包括光合 生物制氢n 钔n 朝和发酵细菌制氢n 6 儿1 8 3 。 利用阪崎肠杆菌产氢目前尚无人报道，阪崎肠杆菌属于肠杆菌科肠杆菌属。 兼性厌氧，营养要求不高，在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼) 旨( v i o l e tr o db i l eg l u c o s e 1 0 a g a r ，v r b g ) 平板上首次划线分离时，生长2 4h 后可生成2 种或2 种以上的菌 落形态，一种干燥或粘液样，周边呈放射状，用接种环触碰可发现茵落极富弹性： 另一种是典型的光滑型菌落，极易被接种环移动。目前，尚不清楚这两种不同的菌 落是否存在毒力和其它表型上的差别。阪崎肠杆菌q 一葡萄糖苷酶活性均为阳性， 其它肠杆菌均为阴性( 包括产气肠杆菌( e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) 、阴沟肠杆菌 ( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) 、成团肠杆菌( e n t e r o b a c t ea g g l o m e r a n s ) ，因此a 葡萄糖 苷酶是用来快速区分阪崎肠杆菌和其它肠杆菌的可靠方法。与大肠埃希茵、沙门 菌相比，阪崎肠杆菌对渗透压和干燥具有更高的耐受力，这很可能与细胞内大量 的海藻糖酶有关。阪崎肠杆菌之间的毒性存在明显不同，某些菌株可能是非致病 性的坞3 。 生物制氢按照微生物的种类、是否需要光照以及底物的不同等方面可以分为 以下几类： ( 1 ) 光合成生物制氢系统( 也称直接生物光解制氢系统) 植物和藻类通过光合作用生成有机化合物，而产氢藻类可通过相同的生物过 程按反应 2 h 2 0 颦2 h 2 + 0 2 生成氢气。这一过程涉及光吸收的两个不同系统：裂解水和释氧的光系统 ( p h o t o s y s t e m ，p si i ) 和生成还原剂还原二氧化碳的光系统i ( p h o t o s y s t e m ，p s i ) 。首先利用类囊体膜表面的捕光色素吸收光能，吸收的光能传递到光系统 ( p si i ) 的反应中心后将水分解为一( 质子) 和氧气，并释放电子( 太阳能被固定) 。 随后电子在类囊体膜电子传递链上按一定次序进行传递，在经过以细胞色素m 复合体( c y t b 6 f c o m p l e x ) 和光系统i ( p si ) 为主的一系列电子传递体后，传递给铁 氧还蛋t t ( f e r r e d o x i n ，f d ) 呦3 ，可逆氢化酶接受还原态铁氧还蛋白传递的电子并 释放出氢气n 钔，反应过程如下： h ，o p s p si f d 专氢化酶专h ， 上 0 2 产生的气体中氢气：氧气为2 ：1 。在这两个系统中，2 个光子( 每一系统一个光 子) 用来转移水中的1 个电子和还原二氧化碳或形成氢气。由于脱氢酶对氧很 产氢菌株阪崎肠杆菌的筛选及其产氢特性的研究 敏感，当环境中氧气浓度接近1 5 时，脱氢酶迅速失活，产氢反应立即停止， 所以光合过程产生的氢气和氧气必须及时进行分离瞰3 。为此，产生了两相工艺： 首先在第一相经普通的光合作用将二氧化碳固定到含氢化合物中，然后在第二相 中经光照、厌氧发酵产生分子氢。k o s o r o v 乜3 1 等进行了c h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i 持续产氢的研究，产氢速率为o 0 8m m o l h 2 l h 。 ( 2 ) 光分解生物制氢系统( 也称间接生物光解制氢系统) 蓝细菌可以通过光合作用经以下两个步骤合成并释放氢气。 6 h 2 0 + 6 c 0 2 与c 6 h 1 2 0 6 + 6 0 2 c 6 h 1 2 0 6 + 6 h 2 0 塑b 1 2 h 2 + 6 c 0 2 蓝细菌( 或称蓝藻) 属革兰氏阳性菌，具有和高等植物同一类型的光合系统及色 素，能够进行氧的合成。蓝细菌在形态上差异很大，有单细胞的、丝状的、也有 聚居的。所需的营养非常简单，空气( 氮气和氧气) 、水、矿物盐和光照即可。蓝 细菌的许多种属都含有能够进行氢代谢和氢合成的酶类，包括固氮酶和氢化酶。 己对蓝细菌的1 4 个属的众多菌种在不同条件下进行了研究，随菌种和条件不同 氢气产率差异很大，其中a n a b a e n a 菌氢的产率较高。p i n t o 等乜钉证明a v a r i a b i l i s 突变体p k 8 4 的产气量高于其野生型，可达6 9 1n m o l h z 一tgp r o t h 。 ( 3 ) 光合异养菌水气转化反应制氢系统 r h o d o s p i r i l l a c e a e 属的某些光能异养菌能够以一氧化碳为唯一碳源在无光 照中生长，在一氧化碳脱氢酶( 一种氧化还原酶) 的催化下产生a t p ，同时放出 氢气和二氧化碳。该反应是酶促反应，且只能在低温低压下进行。反应方程为 c o ( g ) + h 2 0 ( 1 ) 专c 0 2 ( 曲+ h 2 ( 曲 a g o = - 2 0 1 0 m o l r u b r i v i v a x g e l a t i n o s u sc b s 属紫色非硫细菌，它不仅可以在无光照环境中进 行一氧化碳水转化反应，将空气中的一氧化碳转化为接近理论产量的氢气，还 可以在光照及一氧化碳为唯一碳源条件下，通过二氧化碳固定过程同化一氧化碳 为细胞物质乜5 1 。在低浓度培养( o d 6 6 0 0 2 、高搅拌速率2 5 0r r a i n ) 、气相中2 0 为一氧化碳的条件下，一氧化碳氧化的比产氢速率为0 8r e t o o l r a i n gc e l l 。 ( 4 ) 光发酵生物制氢系统 光发酵的所有生物化学途径都可以表示为( c h 2 0 ) x 一铁氧还蛋白一固氮酶 一氢气，转化过程中需要a t p 提供能量。属光营养细菌的紫色非硫细菌可在厌 1 2 前言 氧且缺氮条件下以有机酸为底物生成氢气。以乙酸、乳酸、苹果酸和丁酸为底物 时的最大产氢量如下式所示： c 2 h 4 0 ：+ 2 h 2 0 与4 h 2 + 2 c 0 2 c 3 h 6 0 3 + 3 h 2 0 与6 h 2 + 3 c 0 2 c 4 h 6 0 5 + 3 h 2 0 与6 h 2 + 4 c 0 2 c 4 h 8 0 2 + 6 h 2 0 与1 0 h 2 + 4 c 0 2 除有机酸外，单糖( 如葡萄糖) 和多糖( 如淀粉) 也可以用来产氢，其反应 方程式为 c 6 h 1 2 0 6 + 1 2 h 2 0 与1 2 h 2 + 6 c 0 2 光营养细菌利用芳香族化合物产氢也已有研究n 朝。固氮酶是光营养细菌产氢的关 键酶。在有氮气存在的条件下，它催化分子氮还原为氨同时释放出少量氢气。在 缺氮但有光照的条件下，固氮酶催化有机酸反应生成氢气和二氧化碳，所以氮的 存在会抑制产氢过程。另外，铵可使固氮酶失活而抑制产氢乜司。 ( 5 ) 厌氧发酵生物制氢系统( 也称暗发酵生物制氢系统) 能够发酵产氢的细菌有很多，如梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 、类芽孢菌属 ( p a e n i b a c i l l u s ) 、肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 、巨型球菌属( m e g a s p h a e r a ) 、 韦荣氏球菌属( v e i l l o n e l l a ) 、互养球菌( s y n t r o p h o c o c c u s ) 、醋弧菌属( a c e t i v i b r i o ) 、 线形醋菌属( a c e t o f i l a m e n t u m ) 、醋微球菌属( a c e t o m i c r o b i u m ) 、拟杆菌属 ( b a c t e r o i d e s ) 、闪烁杆菌属( f e r v i d o b a c t - h u m ) 、盐厌氧菌属( h a l o m a e r o b a c t e r ) 、 拟盐杆菌属( h a l o b a c t e r o i d e s ) 、互营杆菌属( s y n t r o p h o b c t e r ) 、栖热袍茵属 ( t h e r m o t o g a ) 、栖热粪杆菌属( c o p r o t h e r m o b a c t e r ) 、盐胞菌属( h a l o c e l l a ) 、 盐厌氧杆菌属( h a l o n a e r o b i a c t e r ) 、嗜热盐丝菌属( h a l o t h e r m o t h r i x ) 、嗜热产氢 菌属( t h e r m o h y d r o g e n i u m ) 、科里氏杆菌属( c o r i b a c t e r i u m ) 、真杆菌属 ( e u b a c t e r i u m ) 、毛螺菌属( l a c h n o s p i r a ) 、热厌氧菌属( t h e r m o a n a e r o b i u m ) 、 粪球菌属( c o p r o c o c c u s ) 、瘤胃球菌属( r u m i n o c o c c u s ) 等嘲。 在厌氧发酵中，葡萄糖首先经糖酵解( e m p ) 等途径生成丙酮酸，合成a t p 和还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d h ) 。然后经厌氧发酵细菌将丙酮酸转 化为乙酰辅酶a ( c o a ) ，生成氢气和二氧化碳。丙酮酸还可以转化为乙酰c o a 和甲酸，而甲酸极易被e s c h e r i c h i ac o l i 等厌氧发酵细菌转化为氢气和二氧化碳。 产氢菌株阪崎肠杆菌的筛选及其产氢特性的研究 在不同条件下乙酰c o a 最终被不同微生物转化为乙酸、丁酸和乙醇。n a d h 用 于形成丁酸和乙醇，剩余的n a d h 被氧化为n a d + 并释放氢气。乙酰c o a 形成 丁酸和乙酸的过程伴随着a t p 合成，为微生物活动提供能量。大多数厌氧发酵 细菌需要在氢化酶的催化下产生氢气。在能量学上，异养型厌氧菌产氢十分有利， 它们能从产氢反应中获得比光营养菌更多的能量，而且由氢酶催化的产氢反应不 需a t p 。然而，它们分解有机物不彻底，分解速率缓慢，影响了氢气产率及产 氢速率。1m o l 葡萄糖理论上只能产生2 - 4t o o l 氢气。反应方程式如下： c 6 h 1 2 0 6 + 2 h 2 0 专2 c h 3 c o o h + 2 c 0 2 + 4 h 2 a g = 一18 4 灯t o o l - 1 c 6 h 1 2 0 6 专c h 3 c h 2 c h 2 c o o h + 2 c 0 2 + 2 h 2 a g = 一2 5 7 五y t o o l - 1 c 6 h 1 2 0 6 一2 c h 3 c h 2 0 h + 2 c 0 2 c 6 h 1 2 0 6 + 2 h 2 专2 c h 3 c h 2 c o o h + 2 h 2 0 虽然理论上末端产物为乙酸的发酵过程氢气产量最高，但实践中却发现末端产物 为乙酸和丁酸的混合酸发酵氢气产量较高，而较低的氢气产量与末端产物为丙酸 和还原态的乙醇、乳酸的代谢相关乜引。l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ，cb u t y r i c u m 、 cb e i j e r i n k i i c 产氢量较大，cp r o p i n i c u m 产氢量较小髓刀为提高其产氢能力，必 须使细菌代谢朝着产生挥发性有机酸而非乙醇、丁醇等醇类和乳酸等还原态酸的 方向进行。碳水化合物是较常见的厌氧发酵微生物的底物，尽管以蛋白胨为单一 碳源也可以产生氢气，但其产率和碳水化合物相比还是低很多。当碳水化合物和 蛋白质同时作为碳源产氢时，发现随着碳水化合物的快速消耗，氢气大量产生， 而溶解性蛋白质却很难被降解啪1 ，表明碳水化合物比蛋白质更适合于生物制氢。 各种产氢菌的产氢能力受操作条件影响很大，如p h 值、水力停留时间( h r t ) 、 氢分压等，发酵末端产物也因微生物生长的环境而异。p h 值对氢化酶活性及代 谢途径影响很大，是最关键的操作条件之一。已报道的最佳p h 值相差较大，l e e 等洲报道蔗糖间歇发酵的最佳p h 值为9 0 ，而任南琪等洲用蔗糖、l a y 口1 1 用淀粉 进行连续发酵的最佳p h 值分别为4 o 4 5 和4 7 5 7 。h w a n g 等口2 3 用葡萄糖间 歇发酵p h 值为5 o 时达到最大产气量。k _ h a n a l 等口3 1 用蔗糖和淀粉进行间歇发 酵，产气量均在p h 值5 5 5 7 时最大，分别为2 1 4 0m lh 2 gc o d ( c h e m i c a l o x y g e nd e m a n d ) 和1 2 5 0m lh 2 gc o d 。总的来说，p h 值必须在酸性范围以抑制 产甲烷菌等氢营养菌的生长，但p h 不能低于4 0 。已有的研究均表明p u 值低 1 4 前言 于4 0 时产氢菌的生长及产氢过程都受到明显的抑制。故p h 值为4 0 是生物制 氢工艺p h 值控制的一个下限。对连续产氢系统而言，氢分压是一个极为重要的 影响因素。产氢代谢途径对氢分压敏感且易受末端产物抑制。当氢分压升高时， 产氢量减少，代谢途径向还原态产物的生产转化。二氧化碳的浓度也会影响产氢 速率和产氢量。细胞可通过磷酸戊糖途径( p p 途径) 将二氧化碳、丙酮酸、n a d h 合成琥珀酸和甲酸，该途径与n a d h 氢化酶( 通过氧化n a d h 为n a d + 来产氢) 产氢反应相竞争。从发酵体系中有效地去除二氧化碳可以减少对n a d h 的竞争， 提高产氢量。1 v i z i i i l o 等b 町研究了向反应器中喷射氮气对氢分压的影响，结果表 明可使氢气产率提高6 8 而对末端产物无影响。t a n i s h o 等眵朝向反应器中吹入氩 气以去除二氧化碳和降低氢分压，使剩余n a d h 增加，氢气产率从0 5 2m o l h 2 m o l 葡萄糖提高到1 5 8m o lh 2 m o l 葡萄糖。细胞固定化生长系统与悬浮生长 系统相比具有很多优势，最明显的就是反应器内生物量高且可以重复使用。常用 的细胞固定化方法有添加活性炭等载体以形成生物膜，污泥颗粒化、自絮凝以形 成颗粒污泥等。k i m 等汹1 考察了用聚乙烯醇( p v a ) 形成生物膜和投加阳离子 聚丙烯酰胺( 甜心v i ) 形成颗粒污泥两种细胞固定化方法，发现颗粒污泥更适合于 连续流制氢工艺。c h a n g 等比较了向固定床生物反应器中投加膨胀黏土和活 性炭作为载体的性能，在h r t 为1h ，以蔗糖为底物( 2 0 班) 时后者产氢速率 较大，为1 3 2lh 2 l h 。当使用中空纤维微滤膜时，产氢速率增加到3 0l h 2 l h ，相当于1 2 1m m o lh 2 l h 。 ( 6 ) 光合发酵联合生物制氢系统 光合一发酵联合生物制氢系统包括非光合细菌和光合细菌，可以提高生物制 氢系统的产氢量。非光合细菌等不需光照就能够降解碳水化合物产生氢气，产生 的有机酸又可以被光合细菌利用。由于有机酸产氢反应的自由能是增加的，厌氧 细菌不能继续利用有机酸合成氢气，所以厌氧菌不可能完全降解葡萄糖合成更多 的氢气，而光合细菌可以利用光能使这一反应得以进行。非光合细菌和光合细菌 也可以在不同的反应器中分别进行产氢汹3 。非光合细菌首先在第一相( 暗反应器， 不需光照) 中将有机物降解为有机酸并生成氢气，出水进入第二相( 光反应器， 需光照) 后，光合细菌便彻底降解