（微生物学专业论文）关于串联式压电生物传感器快速检测病原细菌的研究.pdf

行了检测，得到了它们的典型曲线。对不同浓度的各种细菌进行了检 测，并用常规的平板计数法进行校正，找出了各种细菌接种浓度和 f d t 的关系，这样就可以通过实验得到的f d t 求出细菌的接种浓度 了。实验证明，f d t 法和平板计数法得到的检测结果在9 5 的置信 区间内无显著差异 5 模拟血液样品的检测 对加入铜绿假单胞菌的血液模拟样品进行了检测，发现在现有仪 器和培养基的情况下，每1 0 m l 培养基加入o 5 m l 血液检测样本是比 较合适的。实验结果显示该仪器可以灵敏地检测出血液中含有的细 菌，可以进行下一步的临床标本的检测。 关键词：串联式压电传感器，微生物检测，f d t 法，y c 肉汤，模拟 血液样品 a b s t r a c ts e “e s p i e z o e l e c t r cc 叮s t a i s e n s o r k n o w n a sak i n d ofn o n e m e s s r e s p o n s i v e s e n s o r c a nr e s p o n dt h ec h a l l g eo f c o n d u c t i v i t y o fs o l u t i o n w h e nm i c r o o r g a n i s m s w e r e c u l t u r e di nthe m e d i u m ，t h e metabolism o f t h e i n c o u l dc h a n g et h ei n g r e d i e n t so ft h em e d i u i n ，a n dc h a n g e itse l e c t r o c h e m i c a lc h a 阳c t e r s s e r - e s p i e z o e i e c t r c c 科s t a l s e n s o rc o u i d d e t e c tt h i s c h a n g e n s i t i v e i y 。o n t h e o t h e f h a n d ，h o wt od e t e c tt h em i c r o o r g a n i s m si nf o o da n dm e d i c a l specimens q u i c k l ya n d a c c u m t e l y w a sa h o t 巾o i n to fs c i e n t i s t ss t u d y i ns e v e r a i decadesan a u t o i n a l e d d e t e c t i o ni n s t f u m e n tb a s e d o ns e r i e s piezoelectric c 哆s t a i s e n s o rw a sc o n s t m c t e d 1 1 1 em a i nw o r koft h et h e s i s couidb e s u m m a r i z e da s f o i l o w s 1 d e t e r m i n a t i o no ft h e sens“ivi时intervai晟c d ，fw a sd e t e c t e da ss a m p l eu n d e r d i f 氛m e n t c e l l constants，and t h e v a l u e so f s i g n a lt on o i s ew e r ed i f r e r e n tt o o w h e nt h ec e l lc o i 堑鱼囊垂龆；| 薹季萼l 矗薹耋蚕墓；霉i i c ；拙争i 雾善萋蒜i 霪? | i 塞1l ；莹誊霎耋纂耋t 主；妻妻i ! 蓥- 塞l | 薹蠹i ：墼塞薹垒l 笔墨竖望囊；薹荤l i 墓建菇至塑| ! 萋塞鬻孽照季! 蟊i 篓童薹嵩；面薹轻重芦彳差茎；! 等l 曩善量 鬟妻舆! 妻 l 序l i 擎厶垂l l 垡霸重i 蝗h j a 彗止u m e n t i t w a so p t i m u mt h a t0 5m lb l o o ds p e c i m e na d d e d i n t oe v e r y1 0m la a b t h er e s u l t ss h o w nt h a tt h ei n s t r um e n tc o u l dd e t e c t t h eb a c t e r i ai nt h eb l o o ds a m p l e t h i si n s t r u m e n tw o ul db ea p p l i e di n t h e n e x t s t e pe x p e r i m e n t ， k e y w o r d s ：s e r i e sp i e z o e l e c t r i c c r y s t a l s e n s o rd e t e c t i o no f m i c r o o r g a n i s m f d tm e t h o dy cb x ak i n do fn o v e lm e d i u m ，a m i n oa c i db r o t hw a sd e v e l o p e db a s e do n n u t r i e n tb r o t ha n dg l u c o s eb r o t h i tw a sn u t r i e n ta n dl o wc o n d u c t i v i t y , s a t i s f i e dt h e r e q u i r e m e n t o fs e r i e s p i e z o e l e c t r i cc r y s t a l s e n s o r t h e f r e q u e n c y s h i f tw a st w i c ea st h er e s u l to fn oa m i n oa c i ds o l u t i o na d d e d 4 d e t e c t i o no fs e v e r a ic o m m o nb a c t e r i a f o u r s p e c i e s o f b a c t e r i a ，e c o l i , s c i l v f e l l g , s d y s e n t e r i a e , a n d p a e r u g i n o s aw e r e d e t e c t e dw i t ht h ed e t e c t i o ni n s t r u m e n tb a s e do ns e r i e s p i e z o e l e c t r i cc r y s t a l s e n s o r t h e i rt y p i c a l f r e q u e n c ys h i f t c u t w e sw e r e g a i n e d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h ef r e q u e n c yd e t e c t i o nt i m e ( f d t ) a n d t h e l o g a r i t h m o ft h ei n i t i a ln u m b e ro fb a c t e r i aw a sl i n e a r t h e c o r r e s p o n d i n ge q u a t i o n s w e r ed e r i v e da n d a p p l i e d t od e t e r m i n et h e n u m b e ro fc e l l si nc u l t u r e t h ed e t e c t i o nr a n g e sw e r ef r o m10 0t o10 6 c e l l sm l 一r e s u l t sw e r ei n g o o da g r e e m e n tw i t h t h o s eo b m i n e d b y s t a n d a r dp o u r p l a t em e t h o d 5 d e t e c t i o no fm o d e lb l o o d s p e c i m e n m o d e lb l o o ds p e c i m e nw h i c hw a sa d d e dp a e r u g i n o s aw a sd e t e c t e d w i t ho u ri n s t r u m e n t i tw a so p t i m u mt h a t0 5m lb l o o ds p e c i m e na d d e d i n t oe v e r y1 0m la a b t h er e s u l t ss h o w nt h a tt h ei n s t r u m e n tc o u l dd e t e c t t h eb a c t e r i ai nt h eb l o o ds a m p l e t h i si n s t r u m e n tw o u l db e a p p l i e di n t h e n e x t s t e pe x p e r i m e n t ， k e y w o r d s ：s e r i e sp i e z o e l e c t r i cc r y s t a l s e n s o rd e t e c t i o no f m i c r o o r g a n i s m f d tm e t h o dy cb r o t hm o d e lb l o o ds a m p l e 前言 压电生物传感技术是一门新兴的交叉学科，涉及生物、化学、固 体物理学、微电子学等学科。它融合了信息技术和生物技术，在l 临床 诊断、工业控制、食品和药物分析、环境保护以及生物技术等领域有 着广泛的应用前景。压电传感器的种类很多，可以有不同的分类方法。 按照工作环境的不同，可以分为：气相压电传感器和液相压电传感器。 按照检测的物质分类，可以分为：微生物压电传感器、免疫压电传感 器、酶压电传感器和d n a 压电传感器等。按照传感器器件的响应因 素分类，可以分为：质量响应压电传感器和非质量响应的压电传感器 等。按照压电传感器的结构类型分类，可以分为：串联式压电传感器、 液隔式压电传感器、脱开式压电传感器和单面触液压电传感器等等。 本研究的对象就是在以串联式压电石英晶体传感器为基础的压电微 生物传感器。 压电材料如石英晶体等，受到外界机械压力的作用，其表面产生 电荷的现象，称为压电效应( p i e z o e l e c t r i ce f f e c t ) 。相反，如果晶体 受到电场作用时，可以产生正比于电场强度的机械形变，称为逆压电 效应或电致伸缩效应【l l 。基于这个理论，以压电材料为基底的体声波 器件，在厚度剪切模式振荡过程中与周边环境相互作用，当环境介质 的质量、粘密度、电导、或流变特性等物理、化学性质发生变化时， 做出相应的应答，并转换成相应的传感检测信号，这就是压电石英晶 体传感器( p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ，p q c ) 的基本工作原理。 1 压电石英传感器的工作原理 最初的压电石英晶体传感器只能在气相中工作，压电晶体在气相 中振荡时，其性能受到表面涂层的质量、物质形态( 固态或液态) 、 性质( 刚性、粘度) 及分布、体声波由晶体向涂层的传播等因素的影 响。1 9 5 9 年德国物理学家s a u e r b r e y 首先根据单层无穷大薄板模型建 立了厚度剪切晶体频率变化与晶体表面沉积物质量的关烈2 | ： a f ：一2 露a m a 伽) 只( 1 ) 式中f 为频移，m 为质量变化，f 0 压电石英晶体谐振频率，a 为 液体中成功地进行了双面触液的稳定振荡，提出了保证其稳定振荡的 方法 f 7 l 。他们还用机电耦合模型提出了姚一周公式( 1 8 i ： i i ，= c i d 7 2 + c 2 q 7 2 一c 3 s c 4 z + c 5( 4 ) 其中，d 为密度，n 为粘度，e 为介电常数，x 为电导率，c 。一c 5 是 晶体及实验电路的相关常数。目前，液相压电传感器已经成为压电传 感器应用的主要形式。 2 基于质量响应的压电生物传惑嚣 压电石英传感器在传统上主要用于响应晶体上附着物的质量的 变化，从而改变石英晶体振动的频率，按照这种原理工作的压电石英 传感器可以检测出非常微小的质量变化，所以称为石英晶体微天平 ( q u a r t z c r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，p q c ) 。根据石英晶体上附着物的不同， 质最响应的压电传感器可以分为压电酶传感器、压电免疫传感器和其 它生物大分子传感器。 2 1 压电麓传暮器 压电酶传感器的石英晶体的表面固定物为酶，当酶与样液中的底 物作用时，压电晶体表面质量或者压电晶体物理化学环境的改变会引 起晶体频率或动态阻抗参数的变化。压电酶传感器主要用于测定酶与 底物反应的产物，或者测定酶的活性。a n z a 等用p q c 研究了层一层结 构饷葡萄糖和乳酸传感器中酶多层的形成过程【。9 j ；h o 2 0 l 等利用p q c 研究了血清中脲和肌肝酸在酶催化聚合物转化体系中聚合物转化的 机理：c a v i c v a l a s a k l 2 1 l 研究了固定于晶体表面蛋白质的水解以及旺一淀 粉酶对淀粉的催化水解的动态过程：姚守拙1 2 2 1 4 , 组测定了植物种子中 。脲酶的活性及动力学响应；监测了羧甲基纤维素对纤维素的水解，并 对其动力学性质进行了监测【2 3 j ：还对其他的一些酶促反应进行了详细 的动力学性质分析 2 4 - 2 6 l ：e b e r s o i e 等用夹心酶免疫吸附法测定t 5 n g m i _ 的5 腺苷磷酸硫酸盐还原酶1 2 ”。 2 2 压电免疫传感器 压电免疫传感器是压电石英晶体生物传感器应用最广的一种类 型。它是利用石英晶体微天平对表面质量负载的高度敏感性和抗体特 海水中浓度在l 1 0 2 1 1 0 5c e l l s d m l 的a l e x a n d r i u ma f f i n e ；在1 9 9 2 年g u i l b a u l t l 4 ”等利用压电免疫传感器对环境污染物阿特拉津 ( a t r a z i n e ) 进行了检测；1 9 9 7 年s t e e g b o r n 4 8 l 等也研制了一种检测除 草剂阿特拉津的压电免疫传感器；ky o k o y a m a t 4 9 1 等监测了环境中的 三偶氮( t r i a z i n e ) 衍生物：m i n u n n im1 5 0 l 等报道了一种检测除草剂2 ， 4 d ( 2 , 4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d ) 的压电免疫传感器【5 ，检测水 中2 ，4 d 的水平达到p p b 级：p e n g t 跎l 等也检测了2 ，4 一d ：最近，有 人1 5 3 i 报道利用压电免疫传感器检测二嗯英( d i o x i n ) ，检测范围为 o 0 l 1 3n g m l 。 2 3 压电d n a 传感器 压电d n a 传感器的设计原理是在传感器表面固定单链d n a ，通 过d n a 分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的d n a 进行识别，结 合成双链d n a 。杂交过程的质量增加可以通过频率的改变来检测。 与传统的d n a 检测方法相比，压电传感器不需要标记，具有快速、 操作简便的特点。 压电d n a 传感器可以通过检测小分子与核酸的作用来发现新药 ：t i a n f 5 5 i 等研究了争光霉素与d n a 的相互作用，并对其反应的最优 条件进行了研究。1 9 8 8 年f a w c e t t 拍1 发现固定于石英晶体表面的5 一多 聚腺苷酸与靶核苷酸5 多聚尿苷酸杂交后会引起频率显著变化，并利 用晶体振荡频率的变化测定靶核酸的量；i t a m a r 晰l i n e 一 j 等用三种不 同的方法检测了单链d n a ，其灵敏度可达到3 1 0 6m o l d ：w a n g 【5 8 j 等提出的基于肽核算硫酸衍生物的d n a 杂交传感器可区分单个碱基 的不匹配，且杂交时间缩短为3 5 分钟，使压电基因传感器的特异性 明显提高。n i i k u m l 6 0 i 等用生物素亲和素固定方法，将模扳和引物固 定在2 7m h z 压电石英晶片上，在电极上直接进行p c r 反应，可以 在液相中实时监测p c r 的每一个反应步骤。这两年，d n a 压电传感 器的研究又取得了一些显著的成果。 3 非质量响应的压电生物传感器 在液相中，压电传感除了质量响应以外，还存在粘度、密度、电 导率、介电率以及流变特性等很多方面的响应。这些响应因素的研究， 海水中浓度在l 1 0 2 1 1 0 5c e l l s d m l 的a l e x a n d r i u ma f f i n e ；在1 9 9 2 年g u i l b a u l t l 4 ”等利用压电免疫传感器对环境污染物阿特拉津 ( a t r a z i n e ) 进行了检测；1 9 9 7 年s t e e g b o r n 4 8 l 等也研制了一种检测除 草剂阿特拉津的压电免疫传感器；ky o k o y a m a t 4 9 1 等监测了环境中的 三偶氮( t r i a z i n e ) 衍生物：m i n u n n im1 5 0 l 等报道了一种检测除草剂2 ， 4 d ( 2 , 4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d ) 的压电免疫传感器【5 ，检测水 中2 ，4 d 的水平达到p p b 级：p e n g t 跎l 等也检测了2 ，4 一d ：最近，有 人1 5 3 i 报道利用压电免疫传感器检测二嗯英( d i o x i n ) ，检测范围为 o 0 l 1 3n g m l 。 2 3 压电d n a 传感器 压电d n a 传感器的设计原理是在传感器表面固定单链d n a ，通 过d n a 分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的d n a 进行识别，结 合成双链d n a 。杂交过程的质量增加可以通过频率的改变来检测。 与传统的d n a 检测方法相比，压电传感器不需要标记，具有快速、 操作简便的特点。 压电d n a 传感器可以通过检测小分子与核酸的作用来发现新药 ：t i a n f 5 5 i 等研究了争光霉素与d n a 的相互作用，并对其反应的最优 条件进行了研究。1 9 8 8 年f a w c e t t 拍1 发现固定于石英晶体表面的5 一多 聚腺苷酸与靶核苷酸5 多聚尿苷酸杂交后会引起频率显著变化，并利 用晶体振荡频率的变化测定靶核酸的量；i t a m a r 晰l i n e 一 j 等用三种不 同的方法检测了单链d n a ，其灵敏度可达到3 1 0 6m o l d ：w a n g 【5 8 j 等提出的基于肽核算硫酸衍生物的d n a 杂交传感器可区分单个碱基 的不匹配，且杂交时间缩短为3 5 分钟，使压电基因传感器的特异性 明显提高。n i i k u m l 6 0 i 等用生物素亲和素固定方法，将模扳和引物固 定在2 7m h z 压电石英晶蓍在；雾豢量臣菪篓篮蓁p c r 鐾m j 鎏鏊 使| | 萋苎篓刚竖堕薹p c r 匪f 一氯蓼幺匿这剐譬薹；d n a 器萋蓖篓 竖霪妥叉蛰蔓蔫薹一照夏鋈导率、介 x 生化需氧量，发现s o d 值与频移之间存在着线性关系以及突变物对 营养型菌株t a 9 8 的作用；根据普通变形杆菌在生长过程中产生n h 3 的原理，【7 卜7 4 1 等用b a w 氨传感器对普通变形杆菌的生长特征进行 分析检测，温度对奇异变形杆菌的影响，推导了其成长的动力学参数 和动力学模型还测定细菌对抗生素的敏感性和抗生素的最低有效限 制浓度，测定了不同种类的茶叶的抗菌性。 3 2 其它非质量响应压电传薯器 其它非质量响应的压电传感器的响应因素主要有溶液的粘度、密 度、以及粘弹性的变化。h e 7 $ j 6 等基于培养基溶液的电化学性质的改 变，用串联和单脱开电极压电传感器测定了大肠杆菌，并且测定了该 细菌的生长速度。z h a l a g f 7 l 7 8 1 等应用压电阻抗粘度传感器研究了溶菌 酶对微球菌的溶菌过程，导出了反映溶菌过程的阻抗响应模型，并检 测了氧化亚铁杆菌存在下的生物氧化过程，并结合g o m p e r t z 细菌生 长模型获得了频移与细菌生长参数的关系；h e l l a sc my a u 【7 9 j 等根据 粘度变化检测了新药与d n a 的相互作用。 最近几年，压电传感器的研究主要集中在质量响应的压电传感器 上。免疫传感器仍然是研究的重点，在生物大分子的亲和力测定以及 微生物检测中发挥了重要作用f 8 0 8 2 1 。在d n a 压电传感器的研究方面， 研究者进行了关于d n a 的突变、错配和杂交等方面的研究，均取得 令人满意的结果 8 3 - 8 6 1 。另外，其他的一些基础性的研究工作也在继续 进行8 7 - 8 9 1 。 4 微生物检测技术的研究进展 微生物的检测是一项非常重要的工作，不论是在临床诊断、食品 卫生还是在工业生产、环境监测工作中，都占有举足轻重的地位。传 统意义上的微生物检测技术主要是显微镜检，增菌培养，平板计数和 生理生化反应等方法。但是众所周之的是传统的微生物检测技术有着 劳动量大，耗时长，准确性差等缺陷。为了克服这些缺点，几十年以 来广大的科研工作者一直在寻求一种省时省力，经济简便的微生物检 测方法。 电导测定法是采用比较早的一种微生物检测方法，根据微生物生 长对培养基性质的改变进行检测。m s g a r r o 9 9 i 第燮盟喜曼裂弘副 彬星l a c t o b a c 篓鬟f e r m e n t m 霎羹霉d o b a c t e r i u m j o r g u n l 基萧墼磐； 茹萋蠹雾裂北飘燮醒羹掣”；型芋羹鬈纠即喜曼! 髦薹6 0 0 、8 0 0 u s 墓 垮；譬薹万颦幂鲤需；n a n c yc ；b a y - n e s 9 1 ；蜷驾蓁豁薹疆趟嘲泛啤 奠礓m 殉埋疆骅哺强咽吁臻蛸翮。娣鸦孽瞪型鬣萋燃世挲羹篓魏；慕 墨雾理翼纂型j 篓诤磺州塑随一黍鬻登萋岬蹿翊弘；翼霎1 9 7 5 薹j m o r e l l 0 1 9 2 1 羹l 垂。菌血症趔蓑蓑耋。验方案鲷5 j 有牵攀耋考意薹 藉； f r a n k 8 ；行萋萎屎舜羹霎操诱簖翼；r o w l e y i i ；囊瑟薹塞萎操罪酣 叫翥伯稻臻瞻薹，摹一礴疆捧强酾j 鞭誓孺的强襁赫徜为聂谱醛淘 囊蠹并j 睇一毫薯麓萋囊醛孺臻瑁邓赫；了强“酾评羹囊调穗罐鏊 囊习皤镯瑶蹒舔嚏萎荔囊霎p c r 薹i 三三一译强噶：涵瀑i 哇玮靠碴 篓囊：憾吁1 i 着；饽均羹墓镰篓i i ；j ；畴睡涵酒夔蓁弼讳漕羹琵嚣酬 矾霎霪笺萋p c r 埠醵臻甏菲奏译瑾一季k 萋竭酒莲佰婚7 玮囊冀二毪 弦一得与：4 桶螳一毒讯j 篓d n a 陲缝l l i ! ；斧斧囊睡蛇；他藿涵脚墓骊 羹麓1 1 0 i i 舌呻冲裤篓l 摹强浯臻楚铺蠢博豫i 碗确i i 笨萌7 靠囊墓； 篱墓“阮强槲裱i 蒴赫醵一诲莓：褒磋鐾b a c t e c 鎏溪；萋 b a c t e c9 6 0 自；b i t e k 。a m s 羹饼霪v i d a s 霎弹纵! ! 。= i 2 1 ib a c t e c 囊鍪薰赫r - ，蠡叁蠡蔗蓥囊箨缅胥答扬桶霪羹槎锤巢琏季至! 耄蒹咎曩 哆囊梓赫举宾参冀弦：蕊鏊簪攀孵固硅! ：羹潲话第箅筷j 葡藉霪碰 蚕霎攀。b i t e k 。a m s 委馨耩糖籍军殇年巍年存萎荔羹蓦鸯萋；歼 蕊员薹帝芤餐蠢菲群纂摒荇格滴篓iv i d a s 囊酬黛翥楚妻磋萎霪 囊硕涛交豺；楚囊薛带蒋箱捂箅符莱粪鋈蠡冀缍磊滴蒜蓉囊篓车砺签 攀豢鋈：槎翔蔷妥鍪搠稀警；延霎妻移符肇朔播滴符纂魏鐾囊甄警囊 鎏羹萋蘩融靠酱娄爝曝羹；稚荐亢午方k 嬖而参看誊： 茎。 吾鸯囊彭菩童萎 董诔菲娶彗薹席雾塞囊磁熊鎏薹= 瑟羹藿蠢鲁而尚霪噍羹幕薹刑 鼙墓提鍪奔葛薹羲j 蓑薹薹萋旁鏊蓉搽薹攀屣慕稻；阜器：羹顶羹 舞 = j ；i 囊享盘强罄墨塌 程复杂等缺点限制了其推广应用，所以只局限于 实验室的研究使用。而串联式压电传感器是非质量响应的，其响应因 x 操作简单、灵敏度高、成本低廉、经久耐用等优点。基于串联式压电 微生物传感器的以上特点，本实验室和湖南大学化工学院以及长沙英 才科技公司合作，旨在开发一种基于串联式压电传感器的自动化微生 物检测仪，并试图使这种仪器达到实际应用的要求，可以走出实验室， 推广到临床细菌学检测，食品安全检测以及环境监测等领域，以达到 科学技术产业化的目的。基于上述目的，本文主要进行了以下一些研 究工作： 筛选建立了一种全新的，适合串联式压电微生物传感器使用的培 养基，y c 肉汤培养基：利用课题组组装的微生物检测仪，成功地检 测了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、致贺氏痢疾杆菌和铜绿假单胞菌， 得到了它们的典型曲线，并找出了各种细菌接种浓度和检出时间 ( f d t ) 的关系；通过数学方法对检出时间( f d t ) 进行了重新定义， 使f d t 翮丽西更加准确；完成了临床血液样品检测的前期工作，成 功的检测了模拟的血液样本，为下一步的临床血液样品的检测实验做 准备。 材料与方法 1 实验菌株 本实验所用细菌有：大肠杆菌( 西拍p r f c 妇c d ，以金黄色葡萄球 菌( & 印砂f d c d c c 淞口舭淞) 、致贺氏痢疾杆菌( 肼秘如咖f g 打脚妇已) 和铜绿假单胞菌( n p “如_ ，i 。门琊础馏加d j 口) ，以上菌种均来自湖南师 范大学生命科学院微生物系。 2 培养基 营养肉汤：牛肉浸膏4 9 ：蛋白胨l o g ：n a c i5 9 ； 蒸馏水1 0 0 0 m l ：p h 7 4 葡萄糖肉汤：酵母浸膏3 9 ；牛肉浸膏4 9 ；蛋白胨1 0 9 ： n a c l 5 9 ：葡萄糖3 9 ；磷酸氢二钾2 9 ； 柠檬酸钠3 9 ；蒸馏水l o o o m l ；p h 7 4 操作简单、灵敏度高、成本低廉、经久耐用等优点。基于串联式压电 微生物传感器的以上特点，本实验室和湖南大学化工学院以及长沙英 才科技公司合作，旨在开发一种基于串联式压电传感器的自动化微生 物检测仪，并试图使这种仪器达到实际应用的要求，可以走出实验室， 推广到临床细菌学检测，食品安全检测以及环境监测等领域，以达到 科学技术产业化的目的。基于上述目的，本文主要进行了以下一些研 究工作： 筛选建立了一种全新的，适合串联式压电微生物传感器使用的培 养基，y c 肉汤培养基：利用课题组组装的微生物检测仪，成功地检 测了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、致贺氏痢疾杆菌和铜绿假单胞菌， 得到了它们的典型曲线，并找出了各种细菌接种浓度和检出时间 ( f d t ) 的关系；通过数学方法对检出时间( f d t ) 进行了重新定义， 使f d t 的确定更加准确；完成了临床血液样品检测的前期工作，成 功的检测了模拟的血液样本，为下一步的临床血液样品的检测实验做 准备。 材料与方法 1 实验菌株 本实验所用细菌有：大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、金黄色葡萄球 菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、致贺氏痢疾杆菌( s h i g e h ad y s e n t e r i a e ) 和铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) ，以上菌种均来自湖南师 范大学生命科学院微生物系。 2 培养基 营养肉汤：牛肉浸膏4 9 ；蛋白胨1 0 9 ：n a c i5 9 ； 蒸馏水1 0 0 0 m l ：p h 7 4 葡萄糖肉汤：酵母浸膏3 9 ：牛肉浸膏4 9 ：蛋白胨1 0 9 - n a c i 5 9 ：葡萄糖3 9 ；磷酸氢二钾2 9 ； 柠檬酸钠3 9 ；蒸馏水1 0 0 0 m l ；p h 7 4 营养琼脂： 牛肉浸膏4 9 ；蛋白胨1 0 9 ：n a c l5 9 ： 琼脂2 5 9 ：蒸馏水1 0 0 0 m l ；p h 7 4 y c 肉汤：牛肉浸膏2 9 ；酵母浸膏l g ；葡萄糖1 0 9 ： y c 溶液1 6 m l ：蒸馏水1 0 0 0 m lrp h7 4 3 仪器设备 3 1 基于串联式压电传感嚣的自动化微生物检测仪 实验装置如图1 所示，振荡器为9 m h z 的a t 切石英晶片( j a 一5 型，北京7 0 7 厂) ，两边为银电极。在自制的i c t t l 型振荡电路中 振荡，振荡器工作电压由d f l 7 3 l s d z a 型直流稳压电源( 宁波中策 电子有限公司) 提供，其振荡频率由s s 7 2 0 1 通用智能计数器( 石家 庄无线电四厂) 采集，电极为不锈钢材料。整台仪器由8 组独立的串 联式压电传感器并联构成。 f i 9 1 s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ea u t o m a t e di n s t r u m e n t ：( 1 ) p l u g ，( 2 ) t e s t i n gc e l l ，( 3 ) w a t e rb a t h ( 4 ) c u l t u r em e d i a , ( 5 ) b a c t e r i a ( 6 ) e l e c t r o d e ，( 7 ) f r e q u e n c ys h i f tc u r v e 3 2 其它实验设备 超级恒温槽 t h2 8 1 6 型数字电桥 l r h 2 5 0 a 型生化培养箱 重庆实验设备厂 江苏腾飞电子厂 广东省医疗器械厂 手提式电压力蒸汽消毒器 z h n - 4 型蒸气恒温箱 超净工作台 p h s 3 c 型p h 计 m g i t9 6 0 型微生物检测仪 4 实验方法 4 1 传感器灵敏度的测定 宁波市镇海医疗器械厂 中国原子能科学研究院 上海医疗器械厂 上海精密科学仪器厂 美国b a c t e c 公司 恒温3 7 c ，向检测池中加入n a c i 溶液，开机检测待其读数稳定， 记录此时频率，然后将池中c l 溶液倒出，换成另外浓度的n a c i 溶液，继续上述测定。按照n a c i 溶液的由低到高的循序进行加样检 测，以消除不同浓度n a c l 溶液的相互影响。最后作出传感器的灵敏 度曲线。 4 2 平板计数( p o n l p l a t ec o u n tm e t h o d ) 取o 5 m l 培养物，加入4 5 m l 无菌水中，做梯度稀释，选取合适 浓度的菌悬液，用无菌吸管吸取l m l ，加入经过灭菌的培养皿中，倒 入1 5 m l 营养琼脂培养基，混匀待冷却后倒置培养，3 7 ，1 8 2 4 h 后取出，对平板上的菌落进 亍计数，计数范围为3 0 3 0 0c f u 。 4 3 细菌培养物的检测 菌种从斜面培养基上接种到营养肉汤培养基中，培养箱中3 7 培养1 8 h 取出，进行梯度稀释，以得到不同浓度的菌液。检测池经过 7 5 酒精浸泡，无菌水冲洗，紫外灯照射2 0 m i n ，加入5 m l y c 肉汤 培养基。检测池插入检测仪，待温度达到3 7 恒温，用无菌注射器 向检测池中注射不同浓度的细菌悬液0 1 m l ，开机检测。同时进行平 板计数实验作为参比。 4 4 血液样品的检测 由中心血站购买的健康人的新鲜血液，取5 m l ，加入经过稀释的 细菌悬液，振荡混匀，取o 5 m l 加入已经装有1 0 m ly c b 培养基的检 测池中，插入仪器，待恒温后开机检测。 结果与分析 1 检测池池常数的选择 检测池的池常数是影响串联式压电传感器稳定性和灵敏度的一 个很重要的参数，是指电极面积和电极间距离的比值。随着池常数的 改变，灵敏度和稳定性有很大的差异，只有在池常数最佳时，才会在 非常稳定的状态下得到最大的频移，即信噪比最大。我们在不同的池 常数下，以大肠杆菌为例进行了检测，同时做了空白对照，结果列在 表1 中。 t a b l e1 e f f e c to f s p q c w h e nt h ed i f f e r e n tc e l lc o n s t a n t sa r e d i f f e r e m c e l lc o n s t a n t f r e q u e n c ys h i f t ( h z ) n o ( c m )m a x m u mb l a n k s i g n a lt on o i s e 10 1 5 3 2 1 5 7 72 5 66 1 6 20 3 5 2 91 0 4 i 1 6 46 3 4 30 5 0 9 0 7 2 l3 12 3 2 6 40 6 2 3 14 2 5 2 81 5 1 8 5 0 8 5 6 52 7 3 2 41 1 7 5 61 0 4 2 1 2 1 22 7 7 8 5 71 7 4 5 6 1 7 82 l 8 4 8 为了更加直观的考查，表1 中的数据作图如图2 ： 霄 毛 差 矗 暑 量 f i g2 e f f e c ta b o u ts p q c w h e nt h ec e l lc o n s t a n t sa r ed i f f e r e n t ( a ) s i g n a lt on o i s e ， ( b ) m a x i m u mf r e q u e n c ys h i r ，( c ) n o i s e 在图2 中，如曲线b 所示，池常数越小，s p q c 的最大频移越大： o o c j m c g * 私垃如侣博住伸 曲线c 中，随着池常数的减小，空白样的漂移也越大，也就是说池常 数减小，传感器的灵敏度增加，稳定性减小。曲线a 显示的是信噪比 随池常数的变化，从图中可以看出，如果池常数过小，或者过大，s p q c 的信噪比都不理想，结果显示，池常数为o 5 0 9 0c m 时，传感器的信 噪比最大，所以，在以后的实验中就选择这个数值作为最佳池常数。 2 传感器灵敏区间的测定 我们向随机抽取的四个检测池中加入不同浓度n a c ! 溶液，测定 压电传感器频率改变的大小，得以找出该传感器的灵敏度区间。所用 浓度n a c i 溶液分别是5 m m ，7 m m ，8 m m ，9 m m 和1 0 m m ，而它们所 对应的电导值如表2 所示。 1 a b l e2 c o n d u c t i v i t i e so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sn a c is o l u t i o n s 根据实验结果，作出频移随电导变化的灵敏度曲线如图3 。 f i 9 3 f r e q u e n c y s h i f tc u i w ew h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fn a c is o l u t i o nw e r e d i f f e r e n ti n4t e s tc e l l s 在图3 中，当加入n a c l 溶液的浓度越大，即电导越高时，传感 器频率是下降的，但是变化的速率不同，当所加n a c i 溶液从7 m m 变成8 m m 时，频率变化最快。所以，溶液电导在5 4 4 0 5 6 0 7 3 5 耻s 之间变化时，传感器的响应最为灵敏，这个区闫就是该压电传感器的 灵敏区间。在该灵敏区间内4 个检测池的灵敏度相差不大，有较好的 一致性。 3 。 传藩器专用培养基的筛选 分别接种相同浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、致贺氏痢疾杆 菌和铜绿假单胞菌到5 m l 营养肉汤培养基( n b ) 、葡萄糖肉汤培养基 ( g b ) 、y c 肉汤培养基( y c b ) 以及没有加入y c 的y c 肉汤培养 基中，然后进行检测，每种细菌在不同的培养基中生长，得到的频移 见表3 。 t a b l e j ：! 竺l 坚登兰墅垒垡墼堡垒呈兰竺! 坚坐坐璺! 呈璺! 壁! ! 唑坚坚! ! 坚 兰塑! 坚芝! 堂f 生2 里竺堡d ! 墅生一垒里! 塑! 曼璺f 翌! 曼! = 曼堡 e s c h e r i c h i ac o l i s h i g e l l ad y s e n t e r i a e 1 31 1 1 5l o 1 71 5 1 51 7 1 21 4 1 91 3 1 51 2 1 l1 3 1 79 1 81 4 p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 1 91 8 1 31 7 2 7 6 2 5 4 2 3 l 2 1 3 2 2 9 2 5 4 2 7 3 2 8 6 3 1 2 3 1 5 3 8 2 3 7 6 7 1 5 7 4 3 7 3 9 4 t h i sm e d i u mw a sn o ta d d e dy cs o l u t i o n 四种细菌在营养肉汤和葡萄糖肉汤中生长的得到的频移都小于 2 0 h z ，检测不到明显的频率的变化。在没有加入y c 溶液的y c 肉汤 中，细菌生长引起的频移比较大，在2 0 0 4 0 0 1 4 _ z 之间，但是还是不 够理想。当检测池中加入的培养基为含有y c 的y c 肉汤时，四种细 菌得到的频移均有大幅度的提高，是不加y c 时的2 3 倍。在2 0 。c 时，测得营养肉汤培养基和葡萄糖肉汤培养基的电导均在6 m s 左右， 5 2 9 2 5 9 ：增，一 ；呈仡渤 写| 掰m 眦啪吣 器频率是下降的，但是变化的速率不同，当所加n a c l 溶液从7 m m 变成8 i n m 时，频率变化最快。所以，溶液电导在5 4 4 0 5 6 0 7 3 5 耻s 之间变化时，传感器的响应最为灵敏，这个区闫就是该压电传感器的 灵敏区间。在该灵敏区间内4 个检测池的灵敏度相差不大，有较好的 一致性。 3 。 传藩器专用培养基的筛选 分别接种相同浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、致贺氏痢疾杆 菌和铜绿假单胞菌到5 m l 营养肉汤培养基( n b ) 、葡萄糖肉汤培养基 ( g b ) 、y c 肉汤培养基( y c b ) 以及没有加入y c 的y c 肉汤培养 基中，然后进行检测，每种细菌在不同的培养基中生长，得到的频移 见表3 。 t a b l e j ：坠s 坚登业i 垒坐墼堡垒呈竺! 坚坐坐璺! 呈璺! 壁塑生竖! 堂 兰塑! 坚芝! 堂f 生2 里竺堡d ! 墅生一垒里! 塑! 曼璺f 翌! 曼! = 曼堡 e s c h e r i c h i 口c o l i s h i 粤e n o 由s e n | e r t d e 1 31 1 1 5l o 1 71 5 1 51 7 1 21 4 1 91 3 1 51 2 1 l1 3 1 79 1 81 4 p f p h d b m o ，l 口5 口日厂t 倡f 门d j 口 1 91 8 1 31 7 2 7 6 2 5 4 2 3 l 2 1 3 2 2 9 2 5 4 2 7 3 2 8 6 3 1 2 3 1 5 3 8 2 3 7 6 7 1 5 7 4 3 7 3 9 4 1 1 1 i sm e d i u r nw a sn o ta d d e dy cs o l u t l o n 四种细菌在营养肉汤和葡萄糖肉汤中生长的得到的频移都小于 2 0 h z ，检测不到明显的频率的变化。在没有加入y c 溶液的y c 肉汤 中，细菌生长引起的频移比较大，在2 0 0 4 0 0 h 之之间，但是还是不 够理想。当检测池中加入的培养基为含有y c 的y c 肉汤时，四种细 菌得到的频移均有大幅度的提高，是不加y c 时的2 3 倍。在2 0 时，测得营养肉汤培养基和葡萄糖肉汤培养基的电导均在6 m s 左右， 5 2 9 2 5 9 ：增，一 ；呈仡渤 写| 掰m 眦啪吣 其背景电导实在太大，传感器很难检测到细菌生长所引起的电导的变 化，所以它们对b a w 传感器的检测来说是不合适的。当y c 肉汤中 没有y c 加入的时候，培养基的电导虽然很低，但是营养比较匮乏的， 不够均衡，所以也限制了细菌的生长；当加入定量的y c 后，就得到 了更大的频移，也就是得到了更为强烈的检测信号，可见y c 的加入 对于提高培养基的品质，提高b a w 传感器的检测灵敏度是至关重要 的。与其它培养基相比，y c 肉汤在四种细菌的检测中都得到了理想