（微生物学专业论文）低高级醇啤酒酵母的选育及应用.pdf

中文摘要 中文摘要 高级醇是啤酒中主要的风味物质，适量的高级醇能赋予啤酒丰满的口感，增加 酒体的协调性，过量则会给啤酒带来异杂味，使人头晕、头痛，并引起人体某些 疾病。降低啤酒中高级醇的含量是现代啤酒企业所追求的主要目标之一，菌种改 良和发酵条件是控制高级醇的主要方法，淡雅、清香、低高级醇、绿色健康的啤 酒必将是2 l 世纪的发展方向。 本试验从实验室收藏的啤酒酵母菌株出发，利用紫外线和硫酸二乙酯对出发酵 母菌株进行复合诱变处理，根据酵母菌高级醇的合成代谢与乳酸代谢途径之间的 关系，采用乳酸培养基、碳酸钙培养基和t t c 上层培养基三重筛选获得优良菌株。 同时采用响应面分析方法对发酵条件进行优化，得到最优发酵参数。利用具有全 夹套制冷，c i p 自动清洗系统的1 0 0 0l 不锈钢发酵设备，进行中试啤酒发酵。 出发菌株经过紫外线- d e s ( 硫酸二乙酯) 复合诱变处理后，高级醇含量降低 了2 4 3 4 。响应面分析方法优化得到最佳发酵条件：发酵温度1 0 9 l ，氨基酸含 量为1 7 2 8 3 m g l ，接种量为3 4 4 ，高级醇含量为7 0 8m g l 。 中试1 2 0 p 啤酒发酵结果显示高级醇含量降低明显，总高级醇产量7 0 6 7 m g l ， 低于市售国内外知名大企业啤酒高级醇含量的平均值，达到了国际优质啤酒的标 准。对发酵啤酒其他成分进行分析检测显示，酒精度为4 、双乙酰0 0 7 1 m g l 、 总酯2 9 1 m g l 、总醛1 8 5 1 m g l 、总酸3 1 5 m l l 各项指标均达到国家标准，酒液 淡黄、清澈透明、富有光泽、酒质柔和、浓香醇厚、有明显酒花香和麦芽香，并 且具有啤酒特有的爽口苦味和杀口力。 关键词：高级醇啤酒酵母诱变啤酒发酵 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t h i g h e ra l c o h o l si st h em a i nf l a v o rs u b s t a n c ei nt h eb e e r , a d e q u a t eh i g h e ra l c o h o l s c a l lg i v eb e e rt h ef u l lt a s t ea n dc o o r d i n a t i o nb o d y , t h eb e e rw i l lh a v ed i f f e r e n ta n d m i s c e l l a n e o u sf l a v o ri fh i g h e ra l c o h o l sc o n t e n ti se x c e s sa n dm a k ep e o p l eh e a d a c h ea n d v e r t i g oa n dc a u s es o m eh u m a nd i s e a s e s r e d u c i n gt h ec o n t e n to fh i g h e ra l c o h o l si nb e e r i so n eo fm a i no b j e c t i v e st h a tt h em o d e r nb e e re n t e r p r i s ep u r s u e d t h em a i nm e t h o do f c o n t r o lh i g h e ra l c o h o l sa r es t r a i ni m p r o v e m e n ta n dc o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o n , q u i e t l y e l e g a n t , l i g h tf r a g r a n c e ，l o wc o n t e n to fh i g h e ra l c o h o l s ，g r e e na n dh e a l t h yo fb e e rw i l l b et h ed e v e l o p m e n td i r e c t i o no f21s tc e n t u r y a c c o r d i n gt ot h er e l a t i o nt h a tb e t w e e nc o n s t r u c t i v em e t a b o l i s mo fh i g h e ra l c o h o l s a n dl a c t i ca c i dm e t a b o l i cp a t h w a y ，t h eg o o ds t r a i nw a sg o tb yc o m p o u n dm u t a t i o no f u v - d e sw i t ht r i p l i c a t i o ns c r e e n i n go fl a c t i ca c i d ，c a l c i u mc a r b o n a t ea n dt t cu p p e r s t r a t u mm e d i u mo ft h ep r e s e r v e ds t r a i n t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d b yu s i n gr e p o n s es u r f a c ea n a l y t i c a l m e t h o da n dt h e o p t i m i z a t i o nf e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r sw e r eg o t 1 1 1 ep i l o tp r o d u c t i o no fb e e rf e r m e n t a t i o nw a sm a d eb yu s i n g 10 0 0 ls t a i n l e s ss t e e lf e r m e n t a t i o ne q u i p m e n tw i t hr e f r i g e r a t i o no f w h o l ej a c k e t , c i p a u t o m a t i cc l e a n i n gs y s t e m t h ec o n t e n to fh i g h e ra l c o h o l so ft h es t r a i n sw a sr e d u c e db y2 4 3 4 a f t e r c o m p o u n dm u t a t i o no fu v - d e s t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eg o tb yu s i n g r e p o n s es u r f a c ea n a l y t i c a lm e t h o d ，t h eo p t i m i z a t i o n f e r m e n t a t i o np a r a m e t e r sa r e ： f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e1 0 9 1 ，c o n t e n to fa m i n oa c i d s1 7 2 8 3 m g l ，i n o c u l u ms i z e 3 4 4 a n dt h ec o n t e n to fh i g h e ra l c o h o l si s7 0 8m g l t h ew h o l ec o n t e n to f h i g h e ra l c o h o l so f t h ep i l o tb e e ri s7 0 6 7 m g la n dl o w e rt h a n t h ea v e r a g ev a l u eo f h i g h e ra l c o h o l sc o n t e n to f t h eb e e rm a d ei nw e l l k n o w nd o m e s t i c a n do v e r s e a sb i ge n t e r p r i s e t h ep i l o tb e e rq u a l i t yc a ) m eu pt oa d v a n c e dw o r l ds t a n d a r d s a b s t r a c t t h ef e r m e n t a t i o np a r a m e t e r so f p i l o tb e e ra r e ：a l c o h o l i c i t y4 、b i a c e t y l0 0 7 1 r n g l 、 t o t a le s t e r2 9 1 m g l 、t o t a la l d e h y d e1 8 5 1 m g l 、t o t a la c i d3 1 5 m l l ，a l li n d e x e sm e e t t h en a t i o n a ls t a n d a r d s ，t h eb e e ri sy e l l o w i s h ，c l e a na n dc l e a r , l u s t r o u s ，b o d ys o f ta n dt h i c k a r o m aa n dh a so b v i o u s l yf r a g r a n c eo f h o pa n dm a l ta n dt y p i c a lr e f r e s h i n gb i t t e rt a s t e a n ds t i m u l a t i o np o w e r k e yw o r d s ：h i g h e ra l c o h o l s ；s a c c h a r o m g c e sc a r l s b e r g e n s i s ；b e e rf e r m e n t a t i o n ； m u t a g e n e s i s i i i 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位做储躲稍争 签字日期游多月日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉江太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部分或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉迤太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编 学位做储签，褓善 签字日期删年肖彦日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 万日 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 代谢副产物对啤酒风味的影响 啤酒发酵是一个复杂的生物变化过程，麦芽汁经啤酒酵母发酵逐渐积累相关 代谢产物，形成特定风味物质。麦芽汁具有浓厚的麦香风味，经过啤酒酵母的发 酵产生一系列的代谢副产物之后，形成啤酒特有的香气和口味。啤酒发酵的主要 代谢产物是乙醇、二氧化碳和水，代谢副产物主要包括挥发性酯类、醛类、酸类、 硫化物、双乙酰、高级醇等i l 】。 挥发性酯类主要包括醋酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯，其含量受发酵工 艺的影响，是构成啤酒香味的物质，过量的酯，会给啤酒带来不舒适的苦味和果 香味【2 】。醛类中主要是乙醛，是e m p 形成乙醇的中间代谢产物，是啤酒入口刺激 的主要原因【3 】。啤酒中的酸类物质主要包括乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸和苹果酸， 是在麦芽汁糖化和发酵过程中形成的，适量的酸会使啤酒口味柔和爽口【4 1 。硫化氢 是啤酒中主要的硫化物之一，在麦芽汁糖化时形成，会给啤酒带来异臭味、生酒 味和自溶味。双乙酰是衡量啤酒是否成熟的重要指标，在酵母代谢过程中由a 乙 酰乳酸经非酶氧化脱羧而来，与2 ，3 戊二酮共同被称为联二酮，过量会给啤酒带 来不愉快的风味。高级醇则是啤酒发酵的主要代谢副产物，它和双乙酰对啤酒风 味影响最大。 啤酒中的高级醇是酵母菌在主酵期经过糖代谢途径和e h r l i c h 途径形成的，其 种类包括异戊醇、异丁醇、活性异戊醇、1 3 苯乙醇、正丙醇等。形成机制比较复 杂，种类繁多，含量受酵母菌种类，接种量，发酵温度，氨基酸含量等多种因素 影响，比较难控制。 高级醇能赋予啤酒丰满的香味和口味【5 1 ，并增加酒体的协调性，但过量存在也 是啤酒异杂味的主要来源之一。其中对啤酒的风味影响较大的为正丙醇、异丁醇、 异戊醇和b 苯乙醇。它们和醋酸乙酯、醋酸异戊酯及醋酸苯乙酯一起构成啤酒香 黑龙江大学硕士学位论文 味的主要成分【6 】。为了满足市场要求，生产高质量的啤酒，我们有必要对啤酒生产 中高级醇的产生及控制有所了解，从而改进生产技术，酿造出适合消费者要求的 啤酒。 1 2 高级醇对啤酒风味的影响及对人体的危害 1 2 1 高级醇对啤酒风味的影响 啤酒风味是影响啤酒质量的重要因素，高级醇俗称杂醇油，是指三个碳原子 以上的醇类的总称，是啤酒的重要风味物质之一。主要有正丙醇、异丁醇、异戊 醇等。 啤酒需要适量的高级醇来构成酒体和风味，但含量不能太高，通常为6 0 - - - 9 0 m g l ，超过9 0m g l 时阴，啤酒口味和受欢迎程度明显下降。但人们对啤酒的风味 有不同爱好，如美国人对啤酒中1 3 苯乙醇的需要量就高于欧洲人。 适宜的高级醇含量及各种高级醇之间的比例可使酒体丰满圆润，口感柔和协 调，但高级醇含量过高时，则给人腐臭感并有刺激性口味，不仅会给啤酒带来异 杂味，还会使消费者饮后头痛、头晕、发坠。在饮酒量不多的情况下，也会“上 头 1 6 1 。醇、酯、酸等大分子在血液中停留的时间大大延长，浓度增大，而血液又 在不断循环流经大脑刺激脑神经，从而觉得口干上头。 异丁醇具有刺激性气味，对啤酒的气味影响较大，异丁醇含量偏低的啤酒酒 体香味不协调不柔和，不纯正；其含量偏高的啤酒会产生强烈的酒精刺激味。一 般认为含量为1 5 1 7 m g l 时【8 】，啤酒的风味较好。 异戊醇具有酒精味和水果香味，对啤酒的气味和口味均有较大影响，啤酒中 异戊醇含量过低，酒体香味不协调柔和，不纯正，口味清淡不爽口；其含量过高， 会产生异味，饮酒后有头痛的感觉。一般认为含量为3 5 - - , 6 0 m g l 时，啤酒的风味 较好网。 正丙醇具有酒精味，偏低正丙醇含量的啤酒气味不协调不柔和，口味清淡不 丰满；偏高正丙醇含量的啤酒会产生强烈的酒精刺激味。啤酒中正丙醇的含量在 2 第1 章绪论 1 0 1 5 m 叽【l o 1 1 】时，啤酒的风味最佳。 b 苯乙醇具有一种似玫瑰花的芳香，是影响啤酒风味的重要因素。1 3 苯乙醇 不仅能和别的风味物质成分结合构成啤酒协调的口味，其他的高级醇也能反过来 增强1 3 一苯乙醇的特殊芳香。但1 3 苯乙醇产生的花香味与酒花香味不协调，其含量 过高会给啤酒带来杂味【1 2 1 。 色醇和酪醇都具有苯酚味，含量过高会使啤酒产生不愉快的后苦味【1 3 】。除某 些特殊啤酒外，多数啤酒不希望高级醇过多。啤酒是酿造酒，发酵结束后，不能 像蒸馏酒那样进行蒸馏、贮存、调配等大的调整，因此通过酵母菌改造和发酵条 件控制来提高啤酒的质量。 1 2 2 高级醇对人体的危害 高级醇对机体是有毒性的，与乙醇相比，高级醇的毒性更大1 1 4 1 ，主要表现在 对大脑的麻醉和对细胞膜的溶解两个方面，而且以高级醇为主的脂肪醇的毒性随 碳链的增加而增大。其中正丙醇的毒性为乙醇的8 5 倍，异丁醇相当于乙醇的8 倍， 异戊醇的毒性则为乙醇的1 9 倍。科学研究证明毒性主要是抑制中枢神经，对交感 神经，视觉神经等产生作用，高级醇在体内分解氧化速度慢，作用时间长，因此 饮用高级醇含量过高的啤酒后常会引起剧烈头痛，头晕的感觉。 人们对高级醇毒性的研究起源于19 世纪6 0 年代，m u r p h r e e 等【1 5 】早在19 6 7 年 就报到了威士忌比伏特加更能引起头痛。g i b e l 等【1 6 】早在1 9 6 9 年就从肝病患者血 清中检测到了大量的杂醇油，其中包括醛、酯和大量的高级醇。p e n e d a 等( 1 9 9 4 ) 【1 7 1 证明了g i b e l 的研究结果，并认为酒精性肝中毒可能会因为醇和醇之间及醇和醛之 间相互反应而增强。m c k a m s 等( 1 9 9 7 ) | 1 3 1 小鼠体外试验表明高级醇对肝的毒性是 通过溶解细胞膜来实现的，并检测到了肝的完整性和高级醇的疏水性有关。s t r u b e l t 等( 1 9 9 9 ) t 1 明用甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇和异戊醇灌入小鼠内，检测到谷丙转氨 酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶的量与高级醇碳链的长度有很大的关联。h a r p e r ( 2 0 0 7 ) 报告高级醇能引起局部脑损伤以及认知障碍【2 0 1 。 3 黑龙江大学硕士学位论文 1 3 啤酒中高级醇阈值及高级醇的形成 1 3 1 啤酒中高级醇阈值 高级醇含量超过9 0m g l 会使啤酒口味变差，啤酒中的高级醇含量标准值为： 下面发酵啤酒：6 0 9 0 m g l ；上面发酵啤酒： 1 0 0m g l i 以下面发酵的淡色啤酒 为例，各种高级醇口味阈值及正常含量波动范围如表1 1 1 2 1 1 。 表1 1 高级醇阈值及正常含量 t a b l e 1 1t h r e s h o l da n dn o r m a lc o n t e n to f h i g h e ra l c o h o l s 啤酒中约8 0 的高级醇是主发酵期随酵母繁殖而形成的，即醇母在合成细胞 蛋白质时形成1 2 2 。研究表明形成高级醇的代谢途径有以下两方面：合成途径和分 解途径。 高级醇的生成途径与酵母的氨基酸代谢密切相关。这些醇可以通过氨基酸的异 化作用，经过e h r l i c h 机制形成1 2 3 ，也可以通过糖代谢，经由氨基酸的合成途径生 成。这两种合成过程a 一酮酸和醛都是关键性中间产物。 1 3 2 高级醇的形成 1 3 2 1 合成代谢途径 1 9 5 3 年，h a r r i s 研究提出高级醇由糖代谢通过丙酮酸的合成途径。大部 4 第1 章绪论 分低碳链高级醇通过合成代谢途径产生，合成途径是在葡萄糖经e m p 、t c a 等合 成氨基酸的途径中，中间体a 酮酸经进一步还原得到相应的高级醇1 2 4 ，大部分低 碳链高级醇是通过合成代谢途径产生的，高级醇中7 5 的异戊醇、异丁醇和活性 戊醇是由糖形成的【2 5 1 ，如图1 1 。 c l 鼍t弧c喝 1 l g p1 分子重撵 1 qf c 碣c h o 一7a g p - c h o c o o h 峥c h 3 c o r r j i i e 0 0 抒 c o c b c l i o h 丙酮酸：j e o a h c 晦 j 舒忙附 1 c r b o h 异丁醇 e 垮2 ，孓二羟基异戊酸 n a d + 一! l d 碣 i c o 奢 卜一c l c 玛一c 鸭 c h 3 li l c l i o c i c 墙 c h c bi i：d 司” c 酣地n a d 一n a d 飓 i i 一c o o 雌? c 0 0 h 氯基酸毋酮基异戊敲 图1 - 1 高级醇的合成代谢途径 f i g 1 1p a t hw a yo fb i o s y n t h e s i so f h i g h e ra l c o h o l sf r o mg l u c o s em e t a b o l i z i n g 1 3 2 2e h r l i c h 机制 所谓e h r l i c h 机制，是指氨基酸在酶作用下进行脱氨及脱羧，生成比原来碳链 少一个碳原子的醛，随后还原成醇类。 外源氨基酸被酵母利用时，首先转变为q 酮酸，在酮酸脱羧酶及酒精脱氢酶 的作用下部分被转化成醛类【2 o 】，再迸一步还原成高级醇。e h r l i c h 途径为特定的 氨基酸生成特定的高级醇。如： 亮氨酸一异戊醇( 3 甲基丁醇) 异亮氨酸一活性戊醇( 2 甲基丁醇) 缬氨酸( a - 氨基异戊酸) 一异丁醇 苯丙氨酸一苯乙醇；酪氨酸一酪醇；色氨酸一色醇 5 黑龙江大学硕士学位论文 高级醇中有2 5 来自氨基酸脱羧还劂3 1 1 。由于合成代谢途径的中间体丙酮酸 较易转变为低分子的a 酮酸【3 2 1 ，若麦汁中可利用的外源氨基酸不足，酵母体内就 要进行相应的氨基酸合成，碳水化合物代谢的中间产物在合成氨基酸的过程中衍 生出高级醇。产生途径如图1 2 。 ，r c h o o h ，研e ：o 转氨酶 i 1 一 n h 2 c o o h r - c + j嗣l i i h c c ! 嘶 ij c o o h ：n h 窭 c 0 2 悦缩爵 “ 图1 _ 2 高级醇的分解代谢途径 f i g 1 - 2p a t hw a yo f b i o s y n t h e s i so f h i g h e ra l c o h o l sf r o ma m i n oa c i dm e t a b o l i z i n g 1 3 2 3 高级醇的综合产生途径 g r o w a l l ( 1 9 6 1 ) 提出酵母在发酵中形成高级醇的综合途径，如图1 3 。 莆萄糖 l 正丙醇卜丙酮酸 卜氨基酸反馈抑制 a - m 基昼一甲基戍酸+ 一q _ 酷异戊酸_ 酮基乙酸 少上少- 0r 弋 异亮氨酸甲基丁醛缬氨酸异丁醛异戊醛亮氨酸 工i 上 活性异戊醇异丁醇异戊醇 图1 - 3 高级醇综合合成途径 f i g 1 - 2p a t hw a yo f b i o s y n t h e s i so f h i g h e ra l c o h o l sf r o mg l u c o s ea n da m i n oa c i dm e t a b o l i z i n g 由图可以看出形成高级醇的主要原因是糖代谢途径，高级醇的来源主要是葡 萄糖代谢，在此过程中形成高级醇是不可避免的，降低啤酒中高级醇的含量主要 的方法还是筛选优良的酵母菌株。氨基酸在高级醇形成过程中只起到辅助作用， 起主要作用的氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸。适量的氨基酸有利于啤酒中 高级醇的降低，通过条件优化可以得到最佳的氨基酸添加量。 6 第1 章绪论 1 4 影响高级醇含量的主要因素 高级醇主要产生在酵母繁殖阶段。当发酵度达3 0 0 0 , - - , 3 5 时，7 0 的高级醇已 经形成，当发酵度达6 0 - - 6 5 时，全部高级醇已基本形成。在啤酒发酵过程中高 级醇的形成受各种因素的影响。酵母菌株，发酵条件等不同，高级醇的产量就会 有所差别。 1 4 1 酵母菌株的影响 由于啤酒酵母菌种不同，高级醇生成量差异会高达5 0 0 o , , - 1 0 0 。粉末型酵母 高级醇生成量在6 9 - 9 0 m g l ，而絮状酵母高级醇生成量在4 9 - 1 2 2 m g l 。我国在实 际生产中发现，传统强凝聚型发酵菌种均比近几年引进的新菌种产生的高级醇要 低。另外，高发酵度菌种比一般的新菌种产生的高级醇要高。因此酿造不同类型 的啤酒，酵母品种的选择是很重要的。啤酒酵母各菌株之间高级醇的生成量差异 也很大，有些啤酒酵母能够产生5 倍于其他啤酒酵母所生成的高级醇3 4 1 。因此， 酵母菌株的选择上，应优选出产生高级醇适中的生产菌株。 啤酒中的高级醇是酵母合成细胞蛋白时的副产物。因此，若在发酵时，酵母 的增殖倍数越大，合成酵母细胞的副产物高级醇的含量就越高。 1 4 2 麦汁成份的影响 麦汁中a 氨基氮能促进酵母发酵力的提高，但当麦汁中a 氨基氮含量过高时， 会造成由氨基酸脱氨基脱羧生成的高级醇增加；反之，若麦汁中缺乏可同化的伍 氨基氮，酵母必须通过糖代谢走酮酸路线去合成必须的氨基酸，用于合成细胞的 蛋白质，当缺乏合成能力或氨不足时，就会导致由酮酸生成高级醇1 3 5 - - 3 7 1 。因此， 调整适宜的麦汁俚氨基氮是降低高级醇的重要工艺措施。如质量分数为1 1 * o - - 1 2 的麦汁中仅氨基氮应控制在1 6 0 - - q 8 0 m g l 的水平( 3 8 1 。 7 黑龙江大学硕士学位论文 1 4 3 发酵条件的影响 1 4 3 1 主发酵温度 发酵温度是影响啤酒酿造的最重要因素之一【3 9 1 ，它同样也影响到酵母所参与 的生化代谢反应。一般改变发酵温度，会改变啤酒中高级醇的含量和种类并影响 到各高级醇之间的平衡。发酵前期是酵母的繁殖阶段，直接关系到啤酒发酵的物 质变化。发酵温度提高，酵母的繁殖速度越快，相应也会增加高级醇的合成，影 响高级醇之间的平衡，同时也会给啤酒带来“生、辣、苦、涩、怪等异味。但 如果发酵温度过低，则发酵缓慢，生产周期延长，对啤酒发酵不利，一般主酵温 度控制1 2 c 以下。适宜的发酵温度，才能将其代谢产物控制到理想数值范围，才 能酿出纯正、醇厚的啤酒。 1 4 3 2 麦汁溶氧量 酵母菌属兼性厌氧微生物，在供氧和缺氧的条件下都能生存，但酵母细胞的 生命活动和能量转移是不同的。在有氧条件下，酵母进行有氧呼吸，糖被分解为 水和二氧化碳，获得大量a t p ，作为酵母生命活动的能源，能荷增加，有利于蛋 白质的合成和菌体生长。在无氧条件下，酵母对糖进行发酵，糖被发酵成乙醇和 二氧化碳，只能产生较少的a t p ，能荷低，不能维持菌体内合成细胞物质的需要。 因此麦汁中的氧溶解量越高，酵母繁殖量将越大，发酵过程中形成的高级醇量将 越多，反之则少。但溶解氧量过少时，不仅会降低酵母繁殖量，还会降低了酵母 的活力，氮的吸收和利用，不利于正常发酵的顺利进行。由于氧气在水中的溶解 度很低正常情况下麦芽汁中的溶解氧是远不够的，必须通风补给，酵母的培养容 器要留有足够的空间。般生产上认为麦芽汁中的溶解氧达6 - 8 m g l 时才能满足 需要，若大于9 m g l 则会增加高级醇的生成 4 0 1 。 1 4 3 3 麦汁p h 值 麦汁p h 值过高有利于啤酒中高级醇的生成，故发酵前控制麦汁p h 值显得十 & 第1 章绪论 分重要。一般糖化结束时应控制在p h i 5 5 。随着发酵过程的进行，麦汁p h 值逐 渐降低至4 4 【4 1 1 ，原因是发酵液中有机酸的形成和c 0 2 的溶解。麦汁p h 值在 糖化时就要加以控制，不能过高。这样既减少了啤酒中高级醇的生成，又有利于 麦汁中各种酶的活性。 生产中常采取低温发酵、增加接种量、严格控制供氧等多种措施，使优质啤 酒中高级醇含量控制在6 0 , - - 9 0m g l 4 2 1 。双乙酰含量则是啤酒重要的成熟指标，低 温发酵会使双乙酰的还原减慢，发酵周期延长。生产上为了加快双乙酰的还原， 往往采用提高发酵温度、加压发酵的方法，但发酵温度的提高又可能导致高级醇 含量的增加，因此往往不能两全。增加接种量使酵母制备周期延长，限制设备生 产能力，严格控氧则大大增加设备及运营成本，这些问题特别在夏天旺季生产中 更加突出，因此筛选低高级醇啤酒酵母和优化发酵条件是解决低高级醇问题首选 的两种方法。 1 5 降低啤酒中高级醇的研究进展 1 5 1 酵母菌种的选育技术 在啤酒酿造中，菌种的作用是十分重要的，酵母用于酒精饮料的制造已有几 个世纪。最初是自然发酵，直到1 8 世纪，人们才根据菌种的发酵性能将其分选， 从而大幅度地提高了啤酒质量及发酵控制技术。啤酒酵母为二倍体或多倍体，缺 少有性生殖，不易产生抱子，在一般状态下性能稳定，很少产生基因变异，因此 啤酒酵母的育种工作一直不易控制。基于同样原因，啤酒酵母的基因研究工作也 相对滞后。 降低高级醇产量啤酒酵母的育种报道非常少，仅有一些有关其育种思路的报 道。原因在于：其一，高级醇的种类达3 0 种之多，某一种高级醇含量降低时，其 他的高级醇含量有可能升高；其二，高级醇的代谢途径有两条，影响的因素相对 较多；其三，由于高级醇是酵母细胞生长代谢的副产物，酵母生长越快，发酵越 快，高级醇含量往往越高，这在生产上往往是一对矛盾；其四，育种思路设计不 9 黑龙江大学硕士学位论文 尽合理，对啤酒的品质产生了负面影响。现有的降低高级醇含量的酵母菌种选育 思路，是通过选育支链氨基酸( 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸) 营养缺陷型突变菌 株来实现啤酒高级醇含量的降低，但营养缺陷型菌株用于生产是有缺陷的。真正 优良的啤酒酵母应该能缩短发酵周期，提高啤酒质量。 在菌种选育中，通常采用的方法有筛选法和生物工程法。筛选法简便易行， 但具不定向性，工作量也较大。生物工程法定向性强，却需要较高的科学技术水 平。酵母育种工作经历了漫长的历程，大致可分为如下四个阶段：从自然界或 生产过程中分离菌种；用物理、化学因子诱变菌种；杂交、原生质体融合。 以上三种方法是在细胞水平上构建新菌株，均存在以下缺点：随机性大、间接、 费时、耗人工。分子遗传育种的研究，这是在分子、基因水平上构建的工程菌， 基因重组d n a 技术的基因工程育种弥补了上述缺点，可以定向、直接地将有用的 遗传信息输入微生物细胞，从而实现定向育种。微生物的基因工程育种一般采用 两种方式：一种是引入新的基因，使菌株获得新性状；另一种定向诱变，即在体 外使基因的特定区域有效地突变，置换受体茵该基因的野生型拷贝，改良菌种的 某一性状【4 3 】。近年来人们努力采用生物技术改造菌种，并取得了可喜成果。 1 5 1 1 双亲灭活的原生质体融合啤酒酵母 原生质体融合技术作为一项新的基因重组手段改建菌种是在1 9 7 8 年国际微生 物遗传研讨会上提出的。不通过细胞的有性生殖和孢子结合就能达到基因重组的 目的。应用于啤酒酵母遗传基因的控制和改造，具有杂交频率高、受接合和致育 性限制小、遗传物质传递更完整的优点。由于它的方法简便易行，已经受到国内 外厂家的重视。 应用于原生质体融合的啤酒酵母菌株，都要具有一定的遗传标记，以便作为 融合株检出的依据。在双亲灭活的原生质体融合法中，两个亲本的原生质体在融 合前都被失活，但它们失活的机制不同 4 4 1 。根据“致死损伤互补 的机理，双亲 灭活的原生质体如果发生融合，将能在再生培养基上生长形成融合新株。双亲灭 1 0 第1 章绪论 活原生质体融合法不但可省去亲株细胞的遗传标记，避免重组体失去亲本的优良 性状，而且可以用不含( 例如抗生素等) 抑制细胞生长的遗传标记物的培养基作 为融合子选择培养基，细胞生长较快，从而可提高筛选效率【4 5 1 。 近年来原生质体融合技术在酵母菌种的选育中得到了广泛的应用。王芬等 ( 2 0 0 7 ) 1 4 6 】对啤酒酵母菌株n w 7 - 4 5 与产高级醇少的菌株j w l 1 的原生质融合进 行了研究。菌株n w 7 - 4 5 发酵度高，乙醛产量低，但高级醇的产生量大，菌株j w l 1 高级醇产生量少，发酵度不高，首先对两个亲本进行灭活处理，菌株n w 7 - 4 5 紫 外线灭活，菌株j w l 1 进行热灭活，根据“致死损伤互补的机理，双亲灭活的 原生质体发生融合，在再生培养基上生长形成融合新株，选育出了发酵度为6 9 5 ， 高级醇含量为6 1 8 8 m g l 优良菌株d r 9 2 。蔡车国等( 2 0 0 6 ) h 7 】通过原生质体融 合技术选育出了优良菌株g r 5 ，总高级醇含量为7 4 4 m g l ，远低于高级醇含量要 求的下限。n o b u h i k om u k a i 等( 2 0 0 1 ) 【4 8 】将赖氨酸营养缺陷型菌株k 1 4 与呼吸缺 陷型n c y c l 3 3 3 融合，得到了酒精耐受力较高，絮凝性较低，产高级醇适中的优 良菌株f ，3 2 。 1 5 1 2 离子注入诱变选育低产高级醇啤酒酵母菌株 离子注入是一种新的工业微生物诱变育种技术，已运用于抗生素、酶制剂、 乳酸、维生素等高产菌种的诱变选育。离子注入在微生物体内所发生的作用很复 杂，从离子注入那一时刻起到终点生物学效应工作时间跨越1 0 。8 - - t 0 母s 【4 9 】，经历物 理、化学和生物学阶段，包括能量沉积、电荷中和与交换、动量传递、质量沉积 等4 个原初反应过程，由能量、电荷、动量、质量4 种作用共同作用引发生物学 效应【5 0 1 。所以，离子注入诱变是一种复合诱变方法，具有生理损伤小、突变谱广、 突变频率高的特点，并有一定的重复性和方向性的诱变效应。天津科技大学的王 鹏银【5 1 】等人根据e h r l i c h 代谢途径，采用1 0k e v 的矿离子注入酿酒酵母菌株，选 育出亮氨酸缺陷型菌株，从而降低高级醇的生成量，减少量均在3 0 以上。 1 5 1 3 紫外诱变选育低含量高级醇啤酒酵母菌株 黑龙江大学硕士学位论文 啤酒酵母在通常状态下，基因突变的机率很小，大约只有百万分之一。利用 物理或化学因素诱导酵母细胞，可促使其基因产生突变。常用的诱变剂有紫外线、 x 射线和亚硝基类化学药品。一般的诱变育种步骤为：出发菌株的选择( 包括菌 种纯化和性能选择测定) 一单细胞悬浮液的制备一诱变剂的处理一初筛( 变异株 的挑选) 一复筛( 生产性能的测定) 一中小型试验一投人生产实验。 诱变处理在工业生产上作为一种有效的育种方法，且简单，易操作，在低产 高级醇酵母选育上应用广泛。方维明等( 2 0 0 5 ) f 捌以酵母高级醇和乳酸代谢理论 为基础，建立了一套低含量高级醇和高活性乳酸脱氢酶啤酒酵母菌株选育方法。 将出发菌株经紫外诱变后，依次通过乳酸、麦芽汁碳酸钙和t t c 上层平板筛选， 分离获得一株高级醇产量下降2 8 7 的目标菌株，并且遗传性能稳定。由嫒( 2 0 0 6 ) 【5 3 】用h e - n e 激光辐照诱变啤酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ex b 0 5 ，筛选出了高 级醇产量为7 5 6 m g l 的优良菌株j y 2 - 2 ，比出发菌株下降了1 7 ，双乙酰、乙醛 含量无变化，遗传性能稳定。 1 5 1 4 微波技术选育啤酒酵母菌种 人们在微生物遗传育种的研究中，逐渐认识到微波作为一种物理诱变剂具有 显著的成效，已经形成微波诱变微生物技术。传统的诱变育种方法、紫外诱变、 钻6 0 诱变和化学诱变是获得高产微生物突变株、提高和保持微生物工业生产水平 的基本技术手段。但同一出发菌株多次反复使用相同方法诱变处理后，会出现钝 化现象，由于基因的诱变点位有限，导致正突变类型少，诱变效果不佳。微波诱 变所需的设备简单1 5 4 1 ，方法易行，操作安全，诱变效果较好，克服了紫外诱变容 易光修复、化学诱变毒性大等缺点，具有广阔的应用前景，在工业微生物菌种选 育中具有较大的推广价值【5 5 1 。 1 5 1 5 基因工程技术改造啤酒酵母 现代生物育种技术在啤酒酵母菌种的改造中已显示出很好的应用前景。在选 育菌种时，不论是为了改进工艺或是提高某一方面的质量，都应保证原啤酒酵母 第1 章绪论 的优良酿造特性不变，为了达到这个目的，采用基因工程是最有效的，也是最理 想的方法，而且在过去的几年中，用基因工程改进酵母的特性已取得了显著的效 益。基因工程是指把外源d n a 片断引进酵母细胞，改变受体细胞的遗传特性，以 达到生产上的要求，这就是基因克隆技术在啤酒酵母菌种改造上的应用【5 6 1 。供体 d n a 可以是从供体细胞中萃取纯化的天然d n a 或是重组d n a 。它的来源可以是 另一酵母菌株，另一种、属，或完全不相关的生物体。基因工程技术育种低高级 醇酵母是最理想的。 利用基因工程的方法选育低高级醇啤酒酵母开始于2 0 世纪9 0 年代中后期。 h i r o y u k iy o s h i m o t o 等( 2 0 0 1 ) 【5 刀对0 l 丙酮酸脱羧酶基因p d c i 进行了研究，构建 了p d c l 缺失突变株，结果发现异戊醇浓度下降3 1 。b e n v e n i s t y 等基于e h r l i c h 代 谢理论途径的研究【5 s 】构建了缺少两个编码支链氨基酸的氨基酸转氨酶( b c a t ) 基因 e c a a 3 9 和e c a a 4 0 的菌株。该菌株能够切断或减弱氨基酸转变成a _ 酮酸的能力。 发酵试验表明异丁醇的含量降低，而对酒精产量没有大影响。袁静( 2 0 0 4 ) 【5 9 】报 道酵母b a p 2 基因是一种氨基酸透性酶的基因，b a p 2 基因的表达能促进缬氨酸、 异亮氨酸和亮氨酸的同化率，运用酵母b a p 2 基因的表达对基本氨基酸同化和高 级醇产生的影响，将b a p 2 基因整合到菌株b h - 2 2 5 中形成菌株y k 0 1 5 ，结果异戊 醇增加，但异丁醇和活性戊醇不变。因此认为，可以通过对氨基酸的不同透性酶 基因进行修饰来降低高级醇的产量。b a r b a r ab e n d o n i 等( 1 9 9 9 ) t 6 0 将5 ，5 ，5 三f d l 亮氨酸( l 亮氨酸结构类似物) 抗性基因l e u 4 - 1 转化到酵母菌株，以异戊醇为检 测标准，发现异戊醇的产量比亲本菌株低。s h i g e t o s h iy o s h i k a w a 等( 1 9 9 5 ) 【6 1 1 对 三羧酸循环的苹果酸合成酶的反馈抑制进行了研究，解除了苹果酸合成酶的反馈 抑制作用，结果显示异戊醇的含量是野生型菌株的三倍。 1 5 2 发酵过程中高级醇的控制 1 5 2 1 麦汁控制 麦汁是形成啤酒的前体，为酵母菌株提供原料，保证菌株正常生长，但麦汁 1 3 黑龙江大学硕士学位论文 中a 氨基氮的含量，直接影响到高级醇的产生。韩涛等( 2 0 0 3 ) 6 2 】报道当麦汁中 小氨基氮总量为1 8 0 , 一2 0 0 m g l 时，高级醇的生成量最低。周爱国等( 2 0 0 0 ) 【6 3 】对 酵母营养盐控制啤酒中高级醇进行了探讨，发现在使用高辅料啤酒酿造过程中， 麦汁中酵母所需的某些营养盐含量不足，导致酵母活性降低，从而造成啤酒中副 产物含量增加，通过限量添加酵母营养盐，取得了一定的效果。余晓红等( 2 0 0 7 ) 晔】于1 l o p 富硒麦汁中接入啤酒酵母进行常规啤酒发酵。发现n a 2 s e 0 3 浓度为 2 0 0 m g c l 的麦芽汁经发酵1 4 天后，高级醇含量为6 3 2 m g l ，其他理化指标优良， 啤酒风味基本不变。 1 5 2 2 发酵条件的控制 在发酵过程中，如果发酵温度，充氧量等关键环节控制不当同样会造成高级 醇的含量增高。n m o r e i r a 等( 2 0 0 8 ) 6 s 】对葡萄酒发酵进行了研究，葡萄酒酵母与 啤酒酵母混合发酵高级醇的含量比单纯啤酒酵母发酵要低得多，且乙酸乙酯等不 良物质的含量比单纯葡萄酒酵母发酵要少得多。a n a g o n z d e z - m a r e o 等( 2 0 0 8 ) t 6 6 对葡萄酒发酵容器进行了研究，指出在橡木桶中发酵高级醇的含量是不锈钢罐中 发酵的四倍。闫淑芳等( 2 0 0 7 ) 【6 刀发现降低啤酒酵母发酵温度，保持一定的充氧 量，加大酵母接种量，可以降低酵母的增殖率，减少高级醇等挥发性风味物质的 形成。l f g u i d o 等( 2 0 0 4 ) 【6 8 1 对酵母生理条件进行了研究，发现用对数期生命力 比较强的菌株进行发酵所产生的高级醇等风味物质比较稳定。d i e g ot o r r e a 等 ( 2 0 0 3 ) 【删对酵母生长所需的可同化的氮量进行了研究，表明生长需氮多的酵母 菌株产生的高级醇含量要比需氮量少的菌株要低，而且能产生更多的酯类芳香化 合物。a k b r o w n 等( 2 0 0 3 ) 【7 0 】对啤酒发酵条件进行了模拟研究，较低的发酵温 度，较少的充氧量和高压条件下高级醇的产量比常规发酵要少。e v a l e r o 等( 2 0 0 2 ) 对葡萄酒发酵初期进行了充氧研究，结果表明初期充氧发酵比无氧发酵高级醇要 高出1 1 8 【7 1 1 。m i c h i k ok o b a y a s h i 等( 2 0 0 7 ) 7 2 1 对酵母发酵能力进行了研究，发 现发酵次数越多的酵母生长率越低，异戊醇生成量随之增加。d m o g r o v i 6 0 v f i 等 1 4 第1 章绪论 ( 1 9 9 9 ) 7 3 1 对啤酒发酵温度进行了研究，发现5 、2 0 c 高级醇的产量较少，而5 1 5 风味物质酯等的含量较低，所以比较适宜的发酵温度为1 6 2 0 之间。p h e r n f i n d e z o r t e 等( 2 0 0 5 ) 【7 4 】和eh e m f i n d e z o r t e ( 2 0 0 6 ) 7 5 】向啤酒发酵液中补充 氮源进行了研究，当氮源消耗殆尽时补充氮源会使异戊醇含量下降3 0 左右。 1