（有机化学专业论文）南海海洋真菌多糖a2及两种微生物代谢产物的研究.pdf

南海海洋真菌多糖a 2 及两种 微生物代谢产物的研究 专业：有机化学 学位申请人：陈东淼 指导老师：林永成( 教授) 摘要 论文第一章对多糖的生物学意义、结构研究方法以及海洋真菌、细菌、海藻 多糖的研究进展做了综述。糖类的研究是生命大分子科学最后一个重大前言领 域。多糖在生物体内有重要的生物功能和良好的生物活性以及在生命科学和医学 中的巨大作用，使得多糖的研究成为具有吸引力的研究领域。海洋生物的生活环 境与陆地迥异，研究海洋生物多糖有其特殊意义。 第二章研究了从南海海洋红树林内生真菌2 5 6 0 # 的菌体中分离得到一种粗多 糖，粗多糖经凝胶色谱( g p c ) 纯化得到白色多糖如，a 2 经凝胶色谱以及醋酸纤 维薄膜电泳检验：怠为分子量分布均匀的多糖。用高效凝胶渗透色谱( h p g p c ) 测a 2 的分子量，其分子量为1 2 x1 0 4 ：用完全酸水解、糖腈乙酸酯衍生化咀及 g c m s 等方法测定单糖的组成，a 2 由m a n ，g l u ，g a l 按1 7 ：5 ：2 比例组成：通过 甲基化、g 伽s 、1 hn m r 以及”cn m r 等初步确定多糖如的结构，其结构如 下： + 2 ) - o - d - m a n ( 1 - - - - 6 扣_ d - m 柚( 6 ) - 口_ d - m a n 一( 1 - 6 扣i d 埘n ( 1 - - - 4 ) - a - d m a n 一0 - - - 4 ) ff f 口d - g l u ( 1 - - 4 。2 ) 4 - d - 0 l u ( 1 + 2 )m d - g l u ( 卜+ 2 ) d d - m a n ( 1 + b ”d 。等 1 2 一n 町“分柚埘“h n - d - g 娥1 + 论文第三章对海洋真菌、细菌的研究进展做了综述。第四、五章分别对真菌 2 5 4 9 # 、细菌h y 4 2 的次生代谢产物进行了研究。在实验室分别发酵1 5 0 l 后，培 养液经浓缩、萃取、拌样，反复柱层析，重结晶共得到1 2 个化合物，经一维1 h n m r ，n cn m r ，m s 等手段确定了它们的结构。在所分离到的化合物中， h y 4 2 一b ，c ，d ，2 5 4 9 a ，c ，d 为环二肷，2 5 4 9 e 为1 , 3 二甘油酯，其它五个 化合物为海洋微生物常见的代谢产物，其它化合物的结构鉴定还正在进行中。 关键词：多糖，糖腈乙酸酯衍生化，代谢产物 s t u d i e so nm a r i n ef u n g u sp o l y s a c c h a r i d ea 2 f r o ms o u t hc h i n as e a a n dm e t a b o l i t e so ft w o m i c r o o r g a n i s m s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y a u t h o r ：c h e nd o n g m i a o s u p e r v i s o r ：p r o f a dd r l i ny o n g c h e n g t h ef i r s to ft h i sp a p e rs u m m a r i z et h ea d v a n c ei np o l y s a c c h a r i d ef r o mm a r i n e m i c r o o r g a n i s m a n dm e t h o d si n s t u d y i n g t h es t r u c t u r eo f p o l y s a c c h a r i d e b i o m a c r o m o l c c u l a rp o l y s a c o h a r i d e sw h i c hs c i e n t i s t sh a v ep a i dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o nt oh a v em a n yi m p o r t a n tb i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n da r eh i g hb i o a c t i v e s t u d i e s o nt h ep r o p e r t i e sa n ds t r u c t u r eo fp o l y s a c o h a r i d e sh a v ei m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ei n f u r t h e re l u c i d a t i n gt h e i rb i o t i e a lf u n c t i o n s c o m p a r e dt on u c l e ia c i d sa n dp r o t e i n s , i n v e s t i g a t i n gc a r b o h y d r a t e sa r ev e r yd i f f i c u l tb e a l u s eo ft h e i rb r a n c h i n ga n d s t e r e o e h e m i s t r y t h es t u d y o f c a r b o h y d r a t e i sa n i m p o r t a n t f i c l da b o u t b i o m a c r o m o l e c u l e s t of i n dn e wm e t h o d so fs t u d y i n go ns t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so f p o l y s a e e h a r i d e si sa l la t t r a c t i v ea r e a i nt h es e c o n dp a r t ，an e wp o l y s a c c h a r i d ea 2w a si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o m m a r i n em a n g r o v ef u n g n s ( 2 5 6 0 # ) i ts h o w e dt ob eh o m o g e n e o u sb yg e lp e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h ya n de l e c t r o p h o r e s i s t h ev i s c i d r y a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h to fa 2i s a b o u t1 2x1 0 4b yi - i p g p c t h ec o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo fa 2w a ss t u d i e db y c o m p l e t ea c i dh y d r o l y s i s ，a l d o o n o n i t r i l ea c e t a t e ，g c m s ，m e t h y l a t i o na n a l y s i sa l o n g w i t h1 hn m ra n d1 3 cn m r ( 5 0 0 u h z ) a 2w a sf o u n dt oc o n s i s to fr e p e a t i n gu n i t s i ti sc o m p o s e do fd - m a n n o s e ， d - g l u c o s e ，d - g a l a t c o s e t h em o l er a t eo ft h e mw a s1 7 ：5 ：2 ，r e s p e c t i v e l y i t sp o s s i b l e i i i s t r u c t u r ei s 豁f o l l o w i n g ： + 2 卜“叫州h 6 扣。d - t i6 ) - a - d - a n 1 6 ) - a - d 。下4 卜0 州莩 咿 4 n g l u ( 1 + 2 ) 小d - g l u ( 1 + 2 ) 口- d g l u ( 1 + 2 ) 口- d m a n ( 1 + i ) a - d 。m a n ( 1 - 。妒4 d m a n ( 。分口d - m a n - ( 1 + t a - d g a l ( 1 + 2 ) i nt h el a s tp a r t ，i s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o no fm e t a b o l i t e so ff u n g u ss p 2 5 4 9a n db a c t e r i u m s p h y 4 2f r o ms o u t hs e ao fc h i n aw e r es t u d i e d p a r to ft h e i rs t r u c t u r e so fm e t a b o l i t c s o ff ：i l n g u ss p 2 5 4 9a n db a c t e r i u m 妒h y 4 2w e r ea c q u i r i n g b y1 dn m r ，m se t c k e y w o r d s ：p o l y s a c c h a r i d e s ，a l d o o n o n i t r g ea c e t a t e ，m e t a b o l i t e s i v 缩略语表 g l u c o s c g a l a c t o s c m a n n o s e x y l o s c a r a b i n o s e f u c o s c g a l a c t o p y r a n o s e g l u c o p y r a n o s c m a n n o s e p y a n o s e x y l o p y r a n o s c f u c o p y r a n o s c g a l a c t o p y r a n o s e g l u c o u r o n i ca c i d g a l a c t o f u r a n o s i d u r o n i ca c i d u r o n i ca c i d t r i m e t h y l s i l y l m e t h y l a c e t y l v 葡萄糖 半乳糖 甘露糖 木糖 阿拉伯糖 岩藻糖 吡喃半乳糖 毗睛葡萄糖 吡喃甘露糖 吡喃木糖 吡喃岩藻糖 呋喃半乳糖 葡萄糖醛酸 呋喃半乳糖醛酸 糖醛酸 三甲基硅醚基 甲基 乙酰基 执叫聊舰胁吣咖脚；耄=脚龇呲一姒|呈曼l觚 生出太堂硒望些监毫睦塞建直瀣瀣注熹匿墨掊色丑西弛煎生物逸生岱迸芒搬麴班筮 第一部分南海海洋红树林内生真菌2 5 6 0 # 多糖a 2 的研究 第一章前言 1 1 研究多糖的意义 自然界存在的多糖千姿万态，它们表现出复杂多样的生物功能和生物活性。 要阐释多糖的生物学功能，就必须弄清它的结构特征。与氨基酸、核酸不同单糖 具有多个可连接位点，以相同数目单体组成的多糖链的异构体数目远远大于多肽 和多聚核酸，而且，糖链还可以通过非链作用产生多变的构象。长期以来人们对 糖的生物学功能缺乏认识，只把多糖作为能量来源( 如淀粉、糖元) 和结构物质( 如 纤维素、甲壳素) 【1 一。然而近三十年来，随着分子生物学的发展及寡糖合成技术 日渐成熟，糖在生物体内功能不断被揭示，人们对糖的研究越来越重视。近年来， 糖链结构测定技术的发展，使多糖的研究成为最有吸引力的领域之一。 1 2 糖的生物功能 多糖作为能量来源( 如淀粉、糖元) 和结构物质( 如纤维素、甲壳素) 的作用， 早已为人们所熟知【3 t 舢。 在生物体内多( 寡) 糖不仅以游离的形式，而且以复合物的形式参与许多重要 的生命活动。糖蛋白和糖脂都是细胞膜的重要组成部分，作为生物信息的携带者 和传递者，在细胞的生长发育、分化、代谢、物质运输、识别反应和免疫反应的 调节方面起关键作用。有些糖复合物在发挥生物功能的过程中起决定作用的是多 ( 寡) 糖f 莲1 5 1 。 象生物体内其它物质一样，多( 寡) 糖的生物功能与生物体为适应各种内外部 环境的压力和变化而产生的一系列代谢机制有重要关系。这些功能不仅在正常细 胞中起作用，而且也被病变细胞所利用。因此研究多( 寡) 糖的结构与功能关系对 生物学界、医学界和药学界都有十分重要的意义。如今一门新的学科糖生物学 ( g l y c o b j o l o g y ) 雠，并已成为主流学科的一部分【5 1 。 1 3 糖的生物活性 植物生理学研究表明，许多游离的寡糖分子具有重要的生物功能，它们在极 生出态堂硒望些监塞睦苤鑫直显涯注基苴垒越色丞题韭丝生塑逸生拭进亡盟数班窀 微量( 1 0 9 d 水平上就可以表现出很强的生理活性，通过控制各类特种基因表达 来调节植物的生长、发育、器官形态和防御反应等【9 1 。近年来多( 寡) 糖的增强免 疫功能、抗癌、抗辐射、抗炎、降血糖等生理活性受到广泛的重视畔1 ，多糖的 应用如下所述： 1 3 1 抗肿瘤 多糖在肿瘤免疫治疗中最重要的是显示促胸腺体液反应，具“宿主中介作用” 刺激网状内皮系统，提高宿主对癌细胞的特异抗原免疫反应力，云芝多糖、猪苓 多糖、香菇多糖、地黄多糖对小鼠s 1 8 0 肉瘤及其它癌细胞都有明显的抑作用i 埘。 我们实验小组从杂色f 鼬r - l a l i o t i sd i v i s i c o l o rr e e v e 中提取分离的鲍鱼多糖p s h 对 体外培养的小鼠移植性肿瘤肉瘤s 1 8 0 、肝癌肉瘤琢l p 脚胞无细胞毒作用，但能 明显延长h e p a t j , , 鼠的生存时间，抑制小鼠移植性肉瘤s 1 8 0 的生长；在抑瘤的同 时，能明显提高免疫器官胸腺、脾脏的重量，降低荷瘤小鼠肝脏中过氧化脂质的 水平f l l l ：而且鲍鱼多糖对裸鼠移植人鼻咽癌具有明显得抑制作用【1 2 1 ：对环磷酰 胺有明显增效减毒作用f 1 3 i 。 1 3 2 抗病毒 2 0 0 2 年，杨刨1 4 】等综合报道了多糖硫酸醅具有抗病毒的作用，有的已经进 行了临床试用。有些本身不表现抗病毒活性的多糖，经化学修饰得到的硫酸酯化 多糖也具有了抗病毒活性，如硫酸化香菇多糖、硫酸化木聚糖、硫酸化地衣多糖 等等，都是其相应的多糖经硫酸酯化后而成的多糖类化合物【1 5 】。德国研制出治 疗艾滋病的木聚糖硫酸酯已经进入临床使用，获得了良好的效果。 1 3 3 抗衰老 多糖能从整体上提高机体免疫功能，从一定程度延缓衰老，防治老年病。枸 杞子多糖( u p ) 【1 6 1 、灵芝多糖f 1 7 1 、银耳多科1 7 】、甘蔗多糖【1 8 】、黄精多糖【1 叼具有明 显抗衰老作用。黄芳等从中药黄精中提取了一种小分子量的中性多糖，该多糖在 动物实验中可以显著地延长果蝇的寿命，促进老龄大鼠学习和记忆的能力【2 0 1 ， 明显地改善了老龄大鼠与衰老相关的十项生化指标，如降低肝脏脂褐质含量、降 2 生虫太堂亟望些监塞 睦丕垂 直捏捶注真菌垒篮岛建西弛熊生物i 筮生岱盥亡翅数班短 低心脏过氧化脂质含量等【2 1 】。 1 34 抗凝血作用 由六糖或八糖重复单位组成的肝素可抑制换蛋白酶原转变为凝血酶，有抗凝 血作用。从褐藻掌状昆布( l a m i n a r i a d i g i t a t a ) a 提的昆布多糖对狗及豚鼠血液的 研究证明，该多糖的硫酸化衍生物有肝素样作用。由l ，4 聚书d 甘露糖醛酸和 l 古罗糖醛酸组成的藻酸，硫酸化后也具抗凝血作用。海带多糖除抗肿瘤作用外， 在体内外均有抗凝斑作用【2 2 1 。 1 35 降血糖作用 现已经发现具有降血糖活性的多糖有灵芝多糖、虫草多糖、银耳多糖、毛头 儿多糖、猴头菇多糖和木耳多糖。从海带、紫菜、茶叶、甘蔗等食物中提取的多 糖以及从中草药提取的麻黄多糖、人参多糖、知母多糖、山药多糖等8 0 余种多糖 可以使四氧嘧啶诱发的高血糖实验动物的血糖浓度明显下降【2 3 1 。有资料表明多 糖具有以下的作用【2 4 、2 5 l ：( 1 ) 可以使动物的胰腺增大，胰蛋白酶和a 淀粉酶活性 升高，胆汁生成量和排出量增加；( 2 ) 可以使肝脏中与糖代谢有关的酶的活性上 升，肝细胞上胰岛素受体数目增多，多胰岛素亲和力增高；( 3 ) 可以延长胃的排 空时间。正是由于这些食物多糖的降糖作用以及预防肠肛病变和降酯作用，被营 养学家成为“膳食纤维”或“第七营养素”。 1 3 6 降血脂作用 类肝素结构与肝素类似，能促进脂蛋白脂肪酶释放，使血液中大分子的脂质 分解成小分子，因而对血脂过多引起的血清浑浊有澄清作用，也能明显降低血胆 固醇。硫酸软骨素a ( c h o u d r o r i ns u l f a t ea ) 也能使血清澄清，临床能较好降低高血 脂患者血清胆固醇、甘油三脂，减少冠心病患者发病率和死亡率。果胶也可使血 胆固醇降低，海带多糖多次喂灌高血脂鸡，能明显抑制其血清总胆固醇、甘油三 脂的上升，并能减少鸡主动脉粥样斑块的形成及发展【2 们。 1 3 7 阻抗放射性元素和毒素的吸收 3 虫出太堂硒望些j 垒塞睦塞垂直盥攫注县堇墨薤色逯西叠趣生塑达垒拄邋主塑曲受塞 食物中的纤维素也能阻抗人体对食品添加剂、农药、合成洗涤剂等有害物质 的吸收【8 1 。黑木耳多糖具有抗放射作用，对6 0 c 0 照射的动物可以提高存活率吲。 研究表明：螺旋藻水溶性多糖能够显著增强辐射引起的d n a 的切除修复活性和 程序外d n a 厶成，同时能够显著减轻小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖细胞的辐射遗传 损伤，大大降低辐射引起的突变频率。 1 3 8 增强免疫功能 香菇多糖( l e n t i n a n ) 能够增加d n a 的合成和外围单核细胞免疫球蛋白的产 生。猴头菌丝体水提多糖、人参多糖等均可以直接或者间接地激活巨噬细胞的吞 噬能力，从而增强免疫功能f 冽。黑木耳多糖可以有效的提高小鼠巨噬细胞的吞 噬指数和百分率f 2 9 】。同样从猪苓菌核中得到的一种水溶性多糖能显著提高小鼠 腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的形成，是一种良好的免疫调节剂1 3 0 1 。 1 4 丰富的海洋资源及海洋生物多糖 海洋是生命资源的宝库，其面积占地表面积的7 1 ，地球上的生物8 0 存在 于海洋。海洋生物物种比陆地生物丰富和复杂，动物界中2 8 个主要动物门有2 6 个生活在水中，其中8 f l 为完全永生，据估计海洋生物约有五十多万种。 生活在海洋的生物处于高盐、高压、低温、低营养和无光照的环境中。它们 的生活环境与陆地生活的生物完全不一样，所以使得各种海洋生物依靠特殊的结 构和功能维持其生命活动。海洋生物具有很强的再生能力、防御能力和识别能力， 以防范天敌的进攻及海洋共生菌的附着，并维持物种之间的信息传递，这些独特 的功能是与它们体内的生物成分分不开的。海洋生物的多样性、复杂性和特殊性 使源于其中的海洋天然产物也具有多样性、复杂性和特殊性，这正为寻找海洋生 物活性物质提供了丰富的物质来源p 1 、3 2 1 。 随着人们对化学药品毒副作用的逐渐认识，加之严重危害人的生命的常见 病、疑难症长期未能找到理想的治疗药物，传统的新药研究手段和方式又很难满 足社会需求，人们渴望从海洋生物中寻找新的高效低毒药物。这使当今国际上海 洋药物的研究成了一个热点，各国政府竞相投入巨资进行海洋天然产物和海洋药 物的研究，我国的8 6 3 计划海洋领域也在这方面投入了大量的资金。截止目前， 4 生出盘生耍生业监塞睦蠢垂 直篷连注县直墨薤星甄弛邀生物逸生岱逝亡塑鳇型塞 全世界范围内己从海洋动植物及微生物中分离得到新型化合物有1 0 0 0 0 余种，其 中申请专利的化合物有2 0 0 余种【3 扪。已发现的海洋生物活性物质种类繁多，包括 萜类、皂甙类、有机酸、多糖、蛋白质等等，而每类活性物质又包含着许多结构 不同的化合物。尤为重要的是有些海洋生物活性物质的结构与陆生化合物不同， 表现出独特的活性f 3 4 。6 】。 1 5 海洋微生物多糖概述 微生物是一切肉眼看不到或看不清楚的微小生物的总称。包括属于原核类的 细菌、放线菌、蓝藻，属于真核类的真菌和显微藻类。微生物具有分布广，种类 多的特点，是自然界的重要成员。 微生物多糖是细菌、真菌、蓝藻等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保 护作用的生物高聚物，是研究得较为广泛的一类多糖。按多耱在细胞中的存在位 置，把微生物多糖分为三种类型：细胞壁多糖，位于细胞壁层；细胞内多糖，位 于原生质膜内侧或作为原生质膜的组分；细胞外多糖，位于细胞壁外。 微生物多糖的广泛研究和应用主要局限于陆地。随海洋微物活性物质的研 究，从海洋微生物中发现多种有趣的有生物活性的化合物，这些在陆地却没有发 现。 海洋微生物多糖的研究主要集中在海洋微藻多糖和海洋细菌多糖，海洋真菌 多糖研究较少。下面就近几年来海洋微生物多糖的研究综述如下： 1 5 1 海洋细菌多糖 海洋细菌存在于的海洋各个角落存，在海水、海沙、海泥、海洋生物的表 面和体内广泛存在，而且海洋细菌种类繁多，尽管其大环境大致相同，但其微环 境却大不一样，因而海洋细菌的代谢产物的种类也较多，这也是人们逐渐重视对 海洋细菌多糖研究的原因。 2 0 0 4 年，o l i v i e rr o g c r 等【3 ”报道了从深海中分离到一种嗜温类的细菌h 如，d r a o n a si n f e r n u s ，该细菌在实验室经过人工培养后，能够产生一种酸性硫酸酯多 糖。该多糖主要成分为葡萄糖、半乳糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸以及组分不定的 鼠李糖组成。通过元素分析得知该多糖含有硫酸酯基，其含硫酸盐含量为1 0 。 虫出友堂甄望些监塞睦塞嚣 直盘握搓真琶墨萎色逸匦越塑! 哟这生拭谢主垫鲤叠窒 通过部分降解、甲基化分析、质谱以及n m r 等仪器得到该多糖的重复结构： s 0 3 n a 】 + 2 - 4 ) _ ，e - o i c p 1 卜4 h d - g a i p a - ( i 卜4 口d c , a l p ( 1 l 3 i 胁dg l c p - ( 1 4 - 6 ) m d 母柚p - ( 1 + 伽m - 6 1 尹。( 1 + 咿肿。g r q f 4 d * g l c p f l 4 - d - g l c p - 0 o i o n gd i n g 等p 8 由e r w i n i ac h r y s a n t h e m ii w ( 一种自然变异的细菌) 分离得 到一种胞外多糖( e p s ) ，它的结构由低压大小排除以及阴离子交换色谱、高p h 阳 离子交换色谱、糖基联接分析仪以及1 hn m r 确定。该多糖的分子量由超速离心 法( 沉降平衡) 和光散射法确定。 - - - 3 ) - p - d - g l c p - ( 1 - - - 4 ) q - m p _ ( 1 - 3 ) q l - p h a p - 1 - 3 f 1 4 - l - p h a p - ( 1 + 3 h - l 詹h 咿( 1 。4 ) q - g l c p a a i b as i l i l ，o 等1 3 9 1 报道了从太平洋k h r 溉岛的鼢a t c m a y ab 自咖采集到褐藻觚 删n 玎e 虻矾s 的叶状体中分离到了亲卤k m m3 5 4 9 类的海洋细菌p s e u d o a l t e r o m o n a s i s s a c h e n k o n i i ，该细菌的千细胞食有一种奇特的脂低聚糖。所有的糖都是d 吡喃 糖。其最终的结构是通过化学分析、2 dn m r 谱以及m a l d i 质谱确定的。它的结 果如下： p - g a l - ( 1 一) 噜h c p 3 p - ( 1 卜5 h - k d 0 4 p - ( 2 - - - - 6 ) - l i p i da 4 - g 1 c ( 1 - 4 ) 爹- g a l - ( 1 卜4 ) _ j 其中h e p 是l - g l y c e r o d - m a n n o h e p t o s e ( l 丙三基一胁甘露基- 庚糖) ，k d o 是 3 - d e o x y - d - m a n n o - o c t 2 - u l o s o n i ca c i d ( 3 去氧- d - 甘露基一葵2 u l o s o n i ca c i d ) ，p 是磷 酸盐。通过m a l d i 检测，u p i d 钺脂a ) 一部分为五、四、三已酰类。 x i a o j u a nx u 等【柏】报道了由细菌4 e r o 栅船n i c h i d e n i i5 7 9 7 分离得到一种胞外 6 生出太差匾坐些i 盆塞睦蠢盘亩篷遵注真苴墨越丛西弛熊生赞选垒岱虻翅盟篮塞 多t 镕l a e r o m o n a s a ，它是一种已酰化了的五多糖，由甘露糖、葡萄糖、木糖以及 葡萄糖醛酸组成。它在水溶液当中的粘度非常大，在日本被应用为食物增厚剂。 在去已酰化以及s m i t h 降解后，通过1 h 和1 3 c ( 2 dc o s y ，t o c s y ，1 h ，1 3 ch m q c ， h m b c 和r o e s y ) 得出t a e r o m o n a s a 的结构，其结构为： 0 a c 鼢 、 6 + 3 ) 咖d - m a n p 一( 1 + 3 ) 妒- d - x y l p - ( 1 + 3 ) 嵋。d g l 甲a - ( 1 + 44 ff 步d - g l 学- ( 1 a - d - m a n p - f l 匈牙利国家医学细菌收藏室提供了一种细菌胁此妇c f 4s m a r 疗i5 8 7 5 5 2 给 i v a ns b u s h m a r i n o v l 4 1 1 ，该细菌在有氧的条件下培养，能够产生一种脂多糖。通 过酸水解以及g c m s 分析出该多糖由不同构象的吡哺半乳糖组成。它含有三糖 的重复单元，结果如下： - 6 ) 印- d - g a l p ( 】- 3 ) 币- d g a l p n a c ( 1 - - - 4 ) 嵋- d g a 妖l 卜 a n d r e iv p e r c p e l o v 等【4 2 铡用苯酚水溶液从l 洲m2 3 1 号细菌i d i o m a r i n a z o b e l l i i 的干细胞中提取到了一种腊多糖，该细菌是由采集于西北太平洋的海水样 品中分离得到的。通过对脂多糖进行温和的酸降解，得到了一种低聚糖( o p o l y - s a c c h a r i d c ) 。低聚糖含有奇特的氮基糖，4 - 氨基- 4 , 6 一二去氧】d - 葡萄糖f d q u i 4 l o 以及2 一氨基- 2 - 去氧- l - g u l u r o n i ca c i d ( l - g u l n a ) 。通过一系列的化学以及波谱方法 得出了该脂多糖的结构，其结构如下： + 3 扣- d - q u i p 4 n o - - i - 4 卜曩_ d - a l 单a l 6 ) - a d - c a q , n a c - o - - b - 4 卜口4 晶印n 1 l 斗争n f t a ：p n a c - 1 - 其中连接2 已酰氨基2 ，6 - - - 去氧d 半乳糖( d f u c n a c ) 糖萤有想象不到的强酸不 稳定性，其原因可能与邻近连接到q u i 4 n 的f u c n a e 上存在的一个自由氨基有关 系。 m i c h e l l el ( i l c o y n e 等m 】用热苯酚水从干细菌细胞中分离到一种酸性的脂多 糖，并通过三氯乙酸纯化。通过实验分析，它的结构是重复的四糖。它水解后的 7 虫出盔堂亟生些：l 金塞睦丕莲直握攫注盛蘸墨麓曩茁弛塑生物逸生岱递芒物鲍班宜 残基为：2 已酰氨基2 去氧d 葡萄糖，2 已酰氨基2 去氧n 半乳糖以及两种半 乳糖醛酸。g l c n a c6 位的o - p , 酰化大约为5 0 ，芦- g a l a 4 位的0 - 已酰化大约为 6 0 。其结构为： 3 冲- d - g l 印n a c 6 a c - ( 1 - - - - 2 ) - b - d - o a l p a 4 a c - ( 1 - - - - 3 ) - a d - g a l p n a c - ( 1 - l 4 ) a - d g a l p a - ( 1 + u m e z a w ah 等f 删从海水、海泥和海草中分离出海洋细菌，经过人工海水培 养后，从培养液中分离出一些胞外多糖，并对这些多糖进行抗肿瘤活性筛选，有 6 的多糖有明显抗s 1 帅肿瘤活性。其中有一种新的杂多糖( m a r i n a c t a n ) ，是由葡 萄糖、甘露糖和岩藻糖按7 ：2 ：1 的比例组成，对s 1 的抑瘤率为7 9 - 9 0 。 e g u c h ih 等【4 5 】从一种海洋病原细菌和一种入海口处的鱼中分离了一种弧菌 v - 1 2 3 ( v a n g u i l a r u mv - 1 2 3 ) ，用l p s 的温和酸处理可获得一种多糖( p s - 1 ) ，该多糖 含有结构奇特的2 _ 氨基2 l 去氧右旋半乳糖醛酸，2 氨基- 2 ，6 - - - 去氧右旋葡萄 糖( 右旋异鼠李糖) ，4 氨基- 4 ，6 - - 去氧右旋葡萄糖( d v l c o s a m i n e ) 及其n 二乙酰化 的2 ，4 二羟基- 3 ，3 ，4 三甲基吡喃葡萄糖糖氨酸。通过强酸水解，h f t j ( 解和s m i t h 降解研究表明这个多糖的重复单元为： _ 3 ) - a s g a l n a c a ( a m i d o ) - ( 1 - - * 4 ) - a - g a l n f o a 一( 1 - 3 ) - a - q l l i n a c - ( 1 - 3 ) b - v i o n a c y l r 1 + 在这个结构单元中n - a c y l 是2 ，4 二羟基3 ，3 ，4 _ 三甲基焦谷氨酸，f o 是甲酰基1 。 1 5 2 海洋真菌多糖 从我国南海近海岸的红树林的叶子中分离到一些真菌，并在实验室中加以培 养，从其代谢产物中分离到多个结构新颖的化合物多糖阳。我们从红树林真菌 1 3 5 6 # 菌体中分离提取到两种新的杂多糖【7 1 ， 其中一种杂多糖的结构如下： 一4 ) 芦- g l u “1 川瑚- g l u p a - ( 1 叫) 尹- g l u p ( 1 一 另一种杂多糖的结构如下： + 3 扣- m a n p - ( 1 _ + 3 扣一g l u p - ( 1 _ 3 卜g a 蚺( 1 3 瑚- g a l p ( 1 _ 4 ) 巾- g l u p - ( 1 - * 3 ) - a - m a n p - ( 1 - - - , 3 ) - a 一 菌核葡聚糖【档1 也是一类与伊d g l u c a n s 相关的多糖，是由s c l e r o h u mr o l f s i 和腐木b a s i d i o m y c e t es c h i z o p h y l h mc o m m u n e 等几类真菌产生。菌核葡聚糖的主 8 生出盔堂堑土生些监塞睦丕瑶厦旌龌注县苴墨精色丛盟拙邀生塑这皇垡i 盎【芒塑曲堑窭 链是由1 3 ：伊d 连接葡萄糖残基组成，1 6 毋d 葡萄糖残基可能有规律或随意 的连在主链上。这种葡聚糖参与了各种主体保护反应，包括主体调节的抗肿瘤和 凝聚素的激活，但是其确切的作用机制还在探索之中。菌核葡聚糖和凝乳糖都是 两种有生物反应的调节剂，是通过免疫系统调节机制而产生作用的。 1 5 3 海洋海藻多糖 海藻是生活在海水中的一大类光合植物，按其所含的色素的不同可把海藻分 为黄藻、金藻、蓝藻、绿藻、褐藻和红藻等，其中以藻体大、数量多、生长于近 海较易采集而又有工业价值是褐藻体红藻。海藻多糖是海洋生物多糖中研究得最 早的一类海洋多糖，如褐藻就具有近百年的研究历史。在海洋微藻的研究中以对 蓝藻和螺旋藻的研究最为广泛。 角叉( 菜) 胶是半乳糖体硫酸盐，它存在于海洋红海藻的细胞壁当中。角叉( 菜) 胶是细胞壁的主要成分，并组成了象矩阵一样的细胞壁。a r i s t o t e l i sa n t o n o p o u l o s 等 4 9 1 从海藻的细胞壁中分离到一种多糖，该多糖的骨架是直链的3 毋d 半乳糖以 及4 a 半乳糖，其结构如下： o h m a r i ae r d u a n e 等【刈报道了从红海藻4 珈咎， o r 口印咖分离到一种用 水提取到的硫酸酯多糖( a g a r a n ) 。该多糖由几个片断组成，a ：在c - 2 有高度硫酸 酯基取代( 2 8 3 0 ) ，在c - 2 的硫酸酯基以及4 ，6 0 一( 1 - c a r b o x y - c t h y l i d e n c ) 基团 ( 9 - 1 5 ) ，以及c - 2 的硫酸酯基( 5 - 8 ) 以及少量的c - 6 硫酸酯基，6 - 0 m c t h y l 以及少 量没有取代的残基：b ：主要由3 ，6 一a n h y d r o 嵋l - g a l a c t o s e ( 1 5 - 1 6 ) ，4 l - g a l a c t o s e - 6 - s u l f a t e ( 1 0 - 1 7 ) n 及少量的3 ，6 - a n h y d m 嵋- l - g a l a c t o s e2 - s u l f a t e ，口l - g a l a c t o s e 2 , 6 - d i s u l f a t e ，口- l - g a l a c t o s e2 , 3 ，6 薛s a l f a t c ，口- l - g a l a c t o s e2 ，6 - d i s u l f a t e3 - x y l o s e ， 2 - 0 - m e t h y l - a - l - g a l a c t o s e 以及还没有取代的口l - g a l a c t o s e 。有意思的是在该多糖中 发现了伊d - x y l o s e 以及少量的d g l u c o s e ，一些含有以上两种单糖的多糖具有抗滤 9 生些盔堂亟生些j 金塞睦盔盎 直攫握注真苴垒撞色厘西弛塑生物选生岱遄亡堑的登窒 过性病原体的活性。它对h s v 1 以及h s v - 2 具有药理活性，其i c s o 分别是0 8 和 0 g v m l 。其水解后熏复单元的结构如下： 1 6 糖的分离纯化、纯度鉴定以及分子量的测定 1 6 1 多糖的分离 因为多糖中羟基较多，极性大，通常用不同温度的水、稀碱溶液或稀盐溶液 提取，有时也用稀弱酸( 醋酸) 或苯酚溶液提取。用碱或稀酸提取多糖，一般在较 低的温度下进行，以防破坏糖苷键及水解多糖链上的基团，如硫酸酯基、磷酸酯 基等。早期用稀碱提取动物中的粘多糖，碱可分解肽键，并且通过卢消除反应除 去多糖中m 连接肽链。目前多用酶解方法，蛋白酶水解法是动物粘多糖较理想的 方法，使用蛋白水解酶作用的肽键应该广泛，以便使蛋白质充分酶解，通常采用 多种水解酶相结合或用复合水解酶，如胃蛋白酶和胰蛋白酶结合；胰匀浆复合酶。 由于水或碱提取多糖的糖链上常连有蛋白质或多肽链，因此可将水或碱提取的粗 制品再用蛋白酶水解。 1 6 2 多糖的纯化 粗提物含杂质较多，主要为多肽、蛋白质、氨基酸以及极性大的小分予和色 素。多肽和蛋白质通常用蛋白酶水解成氨基酸或者小肽，然后再用s c r a g 法，三 氟三氯乙烷法和三氯乙酸法除掉。前两种方法多用与微生物多糖的提取，后一种 方法多用于植物多糖的提取，三种方法均不适合糖肽，糖肷也会沉淀出来。由于 粗提物中含有多酚类化合物的色素，所以需要在碱性条件下用过氧化氢氧化法进 行脱色。如果含有其它小的极性分子的话，可以通过透析法将它们除去。 除去蛋白和色素的粗多糖是分子量极不均匀的混合物，需要进一步分级和纯 化。纯化的方法很多，常用的方法有分步沉淀法，金属离子络合法，离子交换层 吸法，凝胶过滤法等。色谱技术也在糖的分离中得到应用，亲和色谱技术及制备 型的高效液相色谱已应用于糖的分离吐 l o 虫出去堂亟望丝监塞 睦壅蠢直莲蓬注直蓝墨楚霆西挫熊生塑这生拭盛主塑曲毯塞 分步沉淀法包括有机溶剂分步沉淀法和盐析法。有机溶剂分步沉淀法是利用 不同多糖在不同浓度的有机溶剂( 常用醇或酮) 中溶解度差异，破坏多糖溶剂化水 膜，降低溶液介电常数，使不同分子量多糖沉淀出来。常用的有机溶剂是甲醇、 乙醇、丙酮。乙醇是应用最广泛的分部沉淀剂，无毒，成本低。加入低浓度的乙 醇，分子量大的多糖先沉淀出来，依次增加乙醇的浓度得到分子量由大到小的多 糖组分。因此乙醇沉淀法也用于多糖的分级。沉淀往往在p h = 7 0 左右进行，在 此条件下多糖较稳定。 盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度的性质，加入盐析剂使多糖逐 步沉淀出来，常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，其中硫酸铵最常用。 季铵盐沉淀法利用季铵盐与酸性多糖生成不溶于水的多糖化合物的特性，分离酸 性多糖与中性多糖。常用的季铵盐有溴代十六烷基三甲铵( c r a b ) ，十六烷基盐 酸吡啶( c p q 。多糖季铵盐复合物可溶于盐溶液或有机溶剂中，季铵盐可用透析 法除去。多糖季铵盐化合物在不同盐溶液中溶解度不同，可以利用这一性质对多 糖进行分级。若用此方法沉淀中性多糖，多糖应转化为负离子，才能与季铵盐生 成沉淀，一般可使多糖形成硼酸盐复合物或在很高的p i t 值( 至少大于9 ) 条件下进 行沉淀。 用于分离多糖的现代色谱方法包括离子交换层析法，凝胶过滤法，亲和色谱 法。离子交换柱层析法主要用于带电荷的糖的分离，如含有糖醛酸多糖的分离等： 凝胶过滤法适合于各种多糖的分离，它主要是起分子筛的作用，使得分子量分布 均匀的多糖分子集中在一起，同时流出层析柱，从而与大于或者小于该多糖分子 量的多糖分开，起到分离的作用；而亲和层析是利用抗原抗体，激素受体，酶 底物等特异性反应来让糖得到有效的分离。 1 6 3 多糖的纯度鉴定 经过纯化的多糖需要进行纯度检验证明是否为均一组份多糖。多糖表现为微 观不均一性，其纯度只代表相似链长的平均分布，所谓多糖纯品实际上是一定分 子量范围的均一组分。要肯定某种多糖的均一性，需要几种方法相互应证。常用 纯度检验方法有比旋光度法、超离心法、电泳法和高效液相( 凝胶) 层析法。比旋 光度是物质固有性质，根据不同的多糖有不同的比旋光度，把多糖样品别成半饱 1 l 史出鑫兰蕴望业i 幺塞 睦苤壅 直盎握注墨蓬墨錾丛匿弛邀垒塑这生岱盥芒垫毂殛窥 和水溶液，用不同浓度的乙醇把多糖沉淀出，分别测其比旋光度，若两次比旋光 度有相同的值，证明该多糖为均一组分。 超离心法是利用物质微粒在离心力场中沉降的速度与微粒的密度、大小和形 状的关系测定多糖分子纯度。如果某一多糖在离心力场的作用，形成单一区带， 说明多糖分子有相同的沉度速度，说明多糖是均一组分的。 电泳法是根据多糖在电场作用下，按分子大小、形状、及所带电荷不同而移 动不同的距离的原理进行的，均一组分多糖有相同泳动速度，染色后成一个区带， 中性多糖不带电荷，可以与硼砂结合形成带电荷的复合物进行电泳。电泳法有多 种：醋酸纤维薄膜电泳法、聚丙烯酸胺凝胶电泳法和高压电泳法。 醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜作支持介质的区带电泳方法，设备简 单，操作方便，重现性好，比纸电泳分辨率高，但分辨率不及凝胶电泳高。聚丙 烯酸胺凝胶电泳法利用人工合成的凝胶作支持介质的区带电泳法，和纸电泳相 比，凝胶支持物不仅起对抗对流作用，而具有分子筛效应，有许多优点，如样品 不易扩散；可控制凝胶浓度，按照所需制成不同孔径的凝胶；把分子筛效应和电 荷效应结合在同一方法中，提高分辨能力等，因而应用广泛。 聚丙烯酸胺凝胶电泳的方式有两种：圆盘电泳和平板电泳，这两种方法各有 自己的特点和用途。高压电泳法是用玻璃纤维纸作为支持物介质的电泳法，玻璃 纤维纸作载体电渗作用较大，常采用较高电压才能达到较好的效果。由于高压生 热多，必须有较好的冷却系统。 凝胶过滤法不仅可纯化多糖，也可以用于纯度鉴定。由于凝胶具有一定大小 的孔径，故不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱移动速度亦不同，较大分子 移动快，小分子移动慢，流出液经示差检测或硫酸苯酚法检验，如为一对称峰， 则为均一组分。 1 6 4 多糖的分子量测定 多糖分子量测定是研究多糖性质一项重要工作，但至今仍是一个复杂的问 题。多糖是高分子物质，有高分子物质的共性，常用测定高分子分子量的方法测 定多糖分子量，如粘度法、渗透压法、蒸气压法、光散射法、超离心法，因组成 不同也有其特性，如端基法，凝胶过滤法。现代质谱技术的发展，使多糖分子量 主出太堂亟望些论裹睦丕蠢西海燕注真菌墨撞曩西挫煎生塑选生岱煎芒塑曲壁塞 的测定交为快捷，方便。质谱方法快速、灵敏、样品用量少，基质辅助的激光解 吸电离飞行时间