（微生物学专业论文）高cxfpa酶菌株的选育及产酶特性研究.pdf

_ 海帅范人学硕上 学位论文 高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 摘要 水洗纤维素酶组分不平衡，具有高c x 酶活，低f p a酶活的特性，应用于 纺织品后整理时，可使棉针织物表面部分水解。处理适当可使整理后的针织物 有精细的外观和手感， 织物变得光洁柔软，服装穿着舒适、自 然， . 且具有污染 少的优点。 但我国水洗纤维素酶仍然存在着酶产量及酶比 活力低、发酵优化条 件 不 清 楚 ， 难 实 现 大 规 模 生 产 、 水 洗 效 果 重 演 性 差 等 问 题 。 因 此 ， 选 育 高 产 菌 株， 探索发酵条件，对其所产纤维素酶特征有一定的研究和掌握， 有着非常重 要的意义。 本文以一株具有高c x / f p a酶生产菌的m菌株出发，通过多种诱变方法选 育出 二 株 高 产 菌 株m - 1 8 , c x 酶比 活 力 提高2 .5 6 倍， 达3 9 8 .o o u / m l ， 而 其f p a 酶活力提高不多。 进行发酵优化试验， 确定了合适的碳源、 氮源以及发酵条件: 以2 %的甜高粱渣为碳源，以。 .2 % n a n 0 3 为氮源，其余蛋白 膝 0 . 3 %,酵母 t 0 .0 5 ， k 2 h p 0 4 0 .4 %， c a c 1 2 0 . 0 3 ， mg s 0 4 0 .0 3 ， c mc - n a 1 %， 5 0 m l / 瓶装液，3 0 0 c , 1 8 0 r / m i n摇瓶培养 5 d 。经优化后 c x酶比活力比优化前提高 9 0 .5 5 u / m l 间歇补料流加实 验表明: 在m - 1 8 发酵过程中流加复 合氮源( 蛋白 陈 1 %, 1 .0 m i / 瓶+ 牛肉 浸出膏 1 %, 0 .6 m l/ 瓶) ; k h 2 p o 4 1 %, 1 .o m 1 / 瓶; c mc - n a 0 .5 %, 1 . 0 m l / 瓶能够进一步提高 m- 1 8产酶水平，使 c x酶比活力提高了 7 8 . 9 5 u / ml a 研究m - 1 8 c x 酶的 作用条件， 结果表明酶促反应最适条件为: 温度5 0 0c , p h值4 .6 。 当 底物 浓 度 远 远大 于 酶 浓 度时， 酶 促 反 应 速 度与 底 物 浓 度 成正比， 应以不同的效果要求来选择酶浓度。 对牛仔布进行整理时，处理时间要 3 0 m i n 以 上。 酶 促反 应时 添加 微 量 的z n 2 + , f e e + , c u 2 + 有 促 进 作 用。 对c x 酶 进 行分 离 纯化，得到纯的 c x 酶，分子量 5 6 . 8 5 k d o 以m - 1 民 菌 种的 发 酵 液 处 理 牛 仔 布， 可 使 布 样 柔 软， 表 面 光 滑 。 该 菌 种 在 纺织品后整理中将有一定的应用前景。 关键词:高c x / f p a酶， 诱 变 选育， 发酵条件优化， 补 料流 加， 酶学性质 上海师范大学硕士学位论文高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 ab s t r a c t t h e c o m p o n e n t s o f w a s h in g c e l l u l a s e a r e i m b a l a n c e t h a t h a s h i g h e r c x a c t i v i t y , b u t l o w e r f p a a c t i v i t y . t h e s u r f a c e o f d ry g o o d s c a n b e h y d r o l y z e d p a rt l y b y t h e w a s h i n g c e l l u l a s e .wh e n i t i s c o n t r o l l e d i n c e r ta i n r a n g e , t h e t e x t i l e h a s e l a b o r a t e a p p e a r a n c e a n d g o o d h a n d l e . f u rt h e r m o r e , w a s h i n g c e l l u l a s e h a s l it t l e p o l l u t i o n t o s u r r o u n d i n g s . b u t t h e r e a r e a ls o p r o b l e m s s u c h a s lo w e n z y m e o u t p u t , l o w e n z y m e a c t i v i t y , a n d u n c l e a r f e r m e n t a t io n c o n d i t i o n o n t h e a p p l i c a t i o n o f w a s h i n g c e l l u l a s e , s o i t c a n n o t a c h i e v e t o p r o d u c e o n a l a r g e s c a l e a n d t h e re p l a y o f d i s p o s e d e ff e c t i s n o t g o o d . t h e r e f o r e , t o s c r e e n t h e h i g h - a c t iv i t y s t r a i n , e x p l o r e t h e f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n , a n d s t u d y o n c h a r a c t e r i s t i c o f c e l l u l o s e w h i c h f r o m h i g h - y i e l d s t r a i n , h a s t h e g r e a t s i g n i fi c a n c e . a h i g h - y ie l d m- 1 8 w a s o b t a i n e d f r o m t h e o r i g i n a l s t r a i n ( m w h i c h c e l l u l o s e h a s t h e c h a r a c t e r s o f h i g h c x / f p a ) b y m u t a t i o n a n d s c r e e n i n g . i t s c x a c t i v i t y w a s 2 . 5 6 h i g h e r t h a n t h e o r i g i n a l o n e , b u t t h e f p a a c t i v i t y g r o w s n o h i g h . i t s f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s w e r e o p t i m i z e d b y t h e a u t h o r . t h e o p t i m i z e d r e s u l t i s d e s c r i b e d as b e l o w , 2 % s w e e t s o r g h u m d r e g s a s t h e c a r b o n s o u r c e , 2 % n a n 0 3 a s t h e n i t r o g e n s o u r c e , 5 0 m l f o r m e d i u m v o l u m e , 3 0 0c , 1 8 0 r / m i n t o f e r m e n t f o r 1 2 0 h o u r s . t h e c e l l u l o s e a c t i v i t y i s 9 0 .5 5 u / m l h i g h e r t h a n b e f o r e t h r o u g h o p t i m i z a t i o n . f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n w a s s t u d i e d t o o ; t h e r e s u l t s h o w s t h a t , i n t h e f e r me n t a t i o n p r o c e s s o f m - 1 8 , t h e f e d - b a t c h o f c o m p l e x n i t r o g e n s o u r c e w h i c h , c o m p o s e d o f 1 % p e p t o n e w i t h f e d - b a t c h i n g 1 m l / b o tt l e a n d 1 % b e e f e x t r a c t w it h f e d - b a l c h i n g 0 . 6 m l / b o tt l e w i l l s t i m u l a t e t h e c x a c t i v i t y . a n d t h e f e d - b a t c h o f 1 % k 2 h p o 4 , a n d 1 . 5 m l 1 .0 % c mc - n a p r o m o t e d t h e a c t i v i t y o f c x e n z y m e t o o . u n d e r t h e o p t i m u m f e d - b a t c h c u l t u r e , t h e p r o d u c t i o n o f m- 1 8 c x w as i m p r o v e d 7 8 .9 5 u / m l . s o m e b a s i c s p e c i a l i t i e s o f t h e c r u d e e n z y m e fr o m m- 1 8 w e r e s t u d i e d . t h e o p t i m a l c o n d i t i o n s f o r e n z y m a t i c r e a c t i o n w e r e t e m p e r a t u r e 5 0 0c , a n d p h v a l u e 4 .6 . a n d i ts h e a t - s t a b i l it y is g o o d . l o w - c o n c e n tr a t i o n o f z n 2 + , c u , f e e w e r e th e a c t i v a t o r s . c x t h a t fr o m m- 1 8 was i s o l a t e d a n d i t s mo l e c u l a r ma s s i s 5 6 . 8 5 kd. t h i s c e l l u l a s e p r e p a r a t i o n h a d a g o o d a p p l ic a t io n i n t h e w e a v e i n d u s t r y . k e y w o r d s : h i g h e r c x a c t iv it y , l o w e r f p a a c t iv i ty , m u t a t io n a n d s c r e e n in g , f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s , o p t i m i z a t i o n , f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n , s p e c i a l it i e s 上海师范大学硕士学位论文 高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 第一部分文献综述 在过去的1 0 年中，利用纤维素酶对织物进行处理已成为染整加工的重要方 面。 具体地说， 利用纤维素酶处理有以 下几个优点: ( 1 ) 酶的使用很安全，不 像化学药品 对操作工人有危害;( 2 ) 酶的 专一性， 特定的酶只能水解特定的化 学 键; ( 3 ) 酶在温和的温度、 p h和压力下使用; ( 4 ) 酶处理后的废液容易处理; ( 5 ) 酶的生产对污染少， 其副产品 和废液可以 作为肥料， 对环境无害。因 此， 引起国内外学者越来越多的关注及研究。 本章对目 前国内 外关于纤维素酶在纺织品 加工上的 研究及应用进行较详细 综述。 1 . 纤维素酶概述 使任 能即 1 . 1 纤维素酶的组成 纤维素酶是生物产生的一种多组分的混合蛋白质，在适当的条件下， 不溶性纤维素材料水解成可溶性的生物催化剂的总称。 根据纤维素分子p - 1 , 4 - 糖昔键的 作用方式， 约可分成三个主要组成。 意 切 断 纤 维 素 分 子 中 p - 1 , 4 一 糖 昔 键 的 内 切 葡 萄 糖 昔 酶( e n d o - 1 , 4 - 民 d - g l u c a n a s e ， e c 3 . 2 . 1 .4 , e g 或 c x ) ; 从非还原 性 端切断 卜 1 , 4 一 糖 昔键或纤维素二糖 及其寡 糖 类 水 解 成 葡 萄 糖 的 葡 萄 糖 昔 酶( c b h 或 c , ) ; 将 纤 维 素 二 糖 及 其 寡 糖 类 水 解 成 葡萄 糖的 葡萄 糖 营酶 ( b g ) 等 11 . 2 1 。 通 常 纤 维 素 酶至 少 含有 e g , c b h 和 b g 等组分， 有时甚至含 1 0 2 0 种组分。 对纤维素酶中各组分的作用机理尚未查明 ，但上述三种组分单独存在时，对纤维素的水解作用是及其微弱的，而其混合 体系会 呈现出 水解活 性。 纤维素酶的蛋白质是由1 7 - 1 8 种氨基酸按一定顺序精细构成的立体结构。 据称，来源于绿色木霉的纤维素酶分子量一般为6 万左右，其外切组分酶的分 子量为7 . 6 万，内 切组分酶和内切葡萄糖昔酶的分子量大约为5 万左右。有文 献报道称，由 康氏 木霉白色变异菌株a s 3 . 4 0 0 1获得的酶，经提纯分离的c 1 酶 组分， 其氨基酸分 析结果如表 1 - 1 所示 ( 3 1 。 纤 维素酶 分子 普遍具有类 似的 结 构 ，由 球状的催化结构域 ( c a t a l y t i c d o m a i n s , c d ) 、 连接桥 ( l i n k e r ) 和纤维素结 合结构域 ( c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a in s , c b d ) 三部分 组成。 连接桥的 主要作用 可能是保持c d 和c b d 之间的距离， 也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的 上海师范大学硕士学位论文 高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 第一部分文献综述 在过去的1 0 年中，利用纤维素酶对织物进行处理已成为染整加工的重要方 面。 具体地说， 利用纤维素酶处理有以 下几个优点: ( 1 ) 酶的使用很安全，不 像化学药品 对操作工人有危害;( 2 ) 酶的 专一性， 特定的酶只能水解特定的化 学 键; ( 3 ) 酶在温和的温度、 p h和压力下使用; ( 4 ) 酶处理后的废液容易处理; ( 5 ) 酶的生产对污染少， 其副产品 和废液可以 作为肥料， 对环境无害。因 此， 引起国内外学者越来越多的关注及研究。 本章对目 前国内 外关于纤维素酶在纺织品 加工上的 研究及应用进行较详细 综述。 1 . 纤维素酶概述 使任 能即 1 . 1 纤维素酶的组成 纤维素酶是生物产生的一种多组分的混合蛋白质，在适当的条件下， 不溶性纤维素材料水解成可溶性的生物催化剂的总称。 根据纤维素分子p - 1 , 4 - 糖昔键的 作用方式， 约可分成三个主要组成。 意 切 断 纤 维 素 分 子 中 p - 1 , 4 一 糖 昔 键 的 内 切 葡 萄 糖 昔 酶( e n d o - 1 , 4 - 民 d - g l u c a n a s e ， e c 3 . 2 . 1 .4 , e g 或 c x ) ; 从非还原 性 端切断 卜 1 , 4 一 糖 昔键或纤维素二糖 及其寡 糖 类 水 解 成 葡 萄 糖 的 葡 萄 糖 昔 酶( c b h 或 c , ) ; 将 纤 维 素 二 糖 及 其 寡 糖 类 水 解 成 葡萄 糖的 葡萄 糖 营酶 ( b g ) 等 11 . 2 1 。 通 常 纤 维 素 酶至 少 含有 e g , c b h 和 b g 等组分， 有时甚至含 1 0 2 0 种组分。 对纤维素酶中各组分的作用机理尚未查明 ，但上述三种组分单独存在时，对纤维素的水解作用是及其微弱的，而其混合 体系会 呈现出 水解活 性。 纤维素酶的蛋白质是由1 7 - 1 8 种氨基酸按一定顺序精细构成的立体结构。 据称，来源于绿色木霉的纤维素酶分子量一般为6 万左右，其外切组分酶的分 子量为7 . 6 万，内 切组分酶和内切葡萄糖昔酶的分子量大约为5 万左右。有文 献报道称，由 康氏 木霉白色变异菌株a s 3 . 4 0 0 1获得的酶，经提纯分离的c 1 酶 组分， 其氨基酸分 析结果如表 1 - 1 所示 ( 3 1 。 纤 维素酶 分子 普遍具有类 似的 结 构 ，由 球状的催化结构域 ( c a t a l y t i c d o m a i n s , c d ) 、 连接桥 ( l i n k e r ) 和纤维素结 合结构域 ( c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a in s , c b d ) 三部分 组成。 连接桥的 主要作用 可能是保持c d 和c b d 之间的距离， 也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的 海师范大 学硕士学位论文高c x / f p a n菌株的选育a产酶特性研究 聚集体: 纤维素结合结构域对酶的 催化活力是非常必需的， 但它执行调节酶对 可溶性和非可溶性底物专一性活力的 作用机理尚 不清楚。 催化结构域体现酶的 催化活性及对若定水溶性底物的 特异性。尽管不同 来源纤维素酶的分子量大小 差别很大， 但它们催化区的大小却基本一致a 1 表1 一 1康氏 木霉 a s 3 a 0 0 1 c , 酶的 氨基酸分析结果 氨基酸 残基数/l m o l氨基酸残基数h n o l 8222012二4，8 天冬氨 酸 ( a s p ) 5 0 苏氨酸 ( t h r ) 4 4 丝氨酸 ( s e ! ) 4 4 谷氨酸 ( g l u ) 3 7 脯氨酸 ( p r o ) 2 0 甘 氨 酸( g ly ) 5 1 + (m a rk ( g y s l/2 ) $ r 氨酸 ( v a l ) 1 8 甲硫氨酸 ( me t ) 5 异亮氨 酸 ( l ie ) 亮氨酸 ( l e u ) 酪氨酸 ( t y r ) 苯丙氨酸 ( p h e ) 赖氨酸 ( l y s ) 组氨酸 ( h i s ) 色氨酸 ( t r p ) 精 氨 酸( a r g ) 1 .2纤维 素酶的来源 纤维素酶的来源非常广泛。真菌、放线菌及细菌等在一定条件下均可产生 纤维素酶。原生动物、软体动物和昆 虫也能 产生纤维素酶1 5 1 。至今已 有很多关 于 纤 维素 酶生 产菌 株的 研 究 报导 6 . 7 1 。 目 前 研 究 较多 的 是 霉 菌 和热纤 梭 菌 is . 9 , 10 i i i 。 近几十年来， 科学工作者从自 然界中筛选出许多产纤维素酶的菌株， 并对 创门 进行了卓有成效的诱变、育种， 从而获得高 产菌株， 其中有些己 实现产业 化生产.目 煎国际上作为纤维素酶生产菌株的有曲 霉 a s p e r g il l u s n ig e r , a s p e r g i ll u s o r y z a e ; 木霉 如t r ic h o d e r m a v ir id e , t r ic h o d e r m a k o n in g i , 担 子 菌 如 f u s a r r i u m m o n i l ij o r m e , i r p e x l a c t e u s ， 细菌如b a c i l l u s s p . . 不同的菌株所产生的纤维素酶不同。有酸性、中 性和碱性。不同的纤维素 酶有不同的用途。 有的用于纤维素酒精发酵、 有的用于医药和食品加工等等。 用于纺织品加工的纤维素酶是由霉菌产生的酸性或中性纤维素酶。日本洛东化 成公司生产的l头口c m- 1 0 , n o v o公司生产的c e l l u c l a s t 1 . 5 l , d e n i m a x a c i d b l 均为霉菌产生的酸性纤维素酶， 其最适反应p h为4 . 0 5 . 0 。 而n o v o公司 生 产的d e n i m a x a c i d b t 则为 偏 酸 性的 中 性 纤 维 素 酶， p h 6 时能 保 持 较高 的 酶 4 仁 海帅范大学顿 i s 学位论文高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 活 性 121 不同 来 源的 纤维素酶分子特征和 催化活性都不尽 相同。 细菌产生的 纤 维素 酶量少，主要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，多数不能分泌到细菌 细胞外，常常聚集形成多酶复合体。真菌产生大量的纤维素酶， 酶系全面，能 分泌到菌体外，一般不聚集成多酶复合体，但相互发生强烈的协同作用。 1 .3 纤维素酶的水解机理 1 . 3 . 1 纤维素酶的作用机制 纤维素酶的作用机制非常复杂， 现在为止还没有完全弄清楚。除了 各组分 对纤维素分子的分解作用，目 前越来越多的研究显示纤维素酶各组分之间有协 同作用。 不过， 大体上它的 水解作用可以 分为以 下几步: ( 1 ) 酶分子从水相转移 到纤维的 表面; ( z ) 酶 分子与纤维表面 结合， 形 成e + s的复 合 物; ( 3 ) 把 水分子 转 移 到 酶 与 底 物 复 合 物的 激 活 位点 ; ( 4 ) 在 酶 与 底 物 的 复 合 物 催 化 下， 水 与 纤 维 的 接触 表面发生发 应; ( 5 ) 产生的 产物转 移到水 相中 1 3 1 1 9 5 0 年， r e e s e 等提出了c 1 - c x 假说。 这个假说认为:当纤维素酶作用 时 ， 首 先 对纤 维 素c ， 组 分 起 作 用， 继 而 使c x 组 分 变成 纤 维 低聚 糖， 再由p 一 葡 萄糖普酶分解成葡萄糖1 14 3 o w o o d在研究木霉 ( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) , 青霉 ( p e n i c i l l i u m f u n i c u l o s u m d e ) 的 纤 维素酶水解纤维素时， 发 现培养液中 的 两种 外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维素时具有协同作用。 f a t e r s t a m也发现两种外 切酶 ( c b h i 和c b h 1 1 ) 具有协同 作用。 k a n d a 等还发现了 对可溶性纤维素进 攻方式不同的两种内 切葡萄 糖酶在微晶 纤维素的水解过程中也具有协同作用。 协同作用一般认为是内切葡聚糖首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素 酶需要的新的 游离末端， 然后外切纤维素酶从多糖链的非还原末端切下纤维二 糖单位，p 一 葡萄糖昔酶再水解纤维二糖单位， 形成葡萄搪.一般来说， 协同 作 用与酶解底物的结晶度成正比。 此外，不同菌源的内 切和外切酶之间也具有协 同作用。 还有人认为，天然纤维素首先在一种非水解性质的解链因子或解氢键酶作 用下，使纤维素链间和链内氢键打开，形成无序的非结晶纤维素， 然后在三种 酶的协同作用下水解为纤维糊精和葡萄搪日 。 最近提出的连续性( 或非连续性) 观点是， e g和c b h的 水解特性的不同， 而是 各自 的 活 性中 心 上 覆 盖 有 肤 链， 一 旦 纤 维 素 分 子 链 被 捕 捉 到 活 性中 心 ， 则 上海师范大学硕士学位论文高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 水解后纤维分子链不易脱离， 而活性中 心会逐渐移动， 依次切断出 纤维素二糖 ( 见图1 - 1 ) 。纤维素分子链的这种水解过程称谓连续性水解。对e g来说，其 活性中心覆盖的肤链很少.e g每次水解纤维素分子链后，纤维素分子链容易 脱落离开e g的活性中 心， 这样的水解方式称为非连续性水解 1 6 1 + . .s. 嘴 e - 丫 “ 绘 抽a m ax 移动 一 一喃汾 一 些 i ， 一i 盼 0 . 4 0 .1 ti jr a 值 祝 / 移幼 ， 喇砂、 ， 崛卜 一 悦 愁 尸户 图1 一 1纤维素酶连续水解机制 近年来， 人们应用凝胶过滤、 离子交换层析、凝胶电 泳以 及电 聚焦等生化 分 离 分 析 手 咬 ， 发 现 纤 维 素 酶 非 常 复 杂 。 内 切 葡 萄 糖 酶 、 纤 维 二 糖 水 解 酶 以 及 p 一 葡 萄 糖 昔 酶 均 存 在2 - 4 个同 工 酶， 对 于 这 些 同 工 酶的 功 能， 目 前 仍 未 见 又明 确的阐述。因此酶解机理还有待进一步研究。 1 . 3 . 2纺织用纤维素酶的作用机理 当 纤维素 酶用于 纺织品后整理时， 纤维素 酶 首先 接触织物或纱线表 面的 纤 维、织物运转时发生较大位移的纱线交织处的纤维以 及突出在织物或纱线上的 茸毛， 然后才逐渐进入到纱线内部的纤维. 也就是说纤维素酶的分子在这些突 出于织物或纱线表面的茸毛根部和纱线交织处的纤维根部扩散最快、受酶的作 用最强，这些部位在织物运动中受力也最强，因而此处的纤维也最易断裂。 纤维素纤维织物经前处理后，纤维发生一定程度的膨化，有利于纤维素酶 的 扩散及作用， 酶对纤维表面接触发生一定的 剥蚀作用， 也侵蚀到纤维的孔隙 和毛细管中， 经水解使得微纤之间的连接松懈， 无定形区增加， 纤维变得疏松， 因而酶处理时，除了要达到改善织物的外观风格和手感的效果，还要注意保持 上海师范大学硕士学位论文高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 织物或纱线的强力。 市售的纤维素酶制剂通常是多种酶的混合物，主要由e g . c b h和b g等 组 成， 不 同 莱 源的 纤 维 素 酶 的 活 性 又 可 分 成 多 种 类 别， 有 人曾 测 过1 0 种 市 售 纤 维素 酶 对 不同 基 质的 活 性 ( 表1 - 2 ) i s . 表1 - 2各种纤维素酶对不同基质的活性 酶来源木聚糖微晶纤维素水杨昔l c o s c m c滤纸崩溃活性值* 4529020070063 a s p e r g i l l u s t r i c h o d e r ma 0 . 5 1 0 . 0 0 1 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 9 7 1 . 5 0 . 0 0 6 0 . 0 2 0 . 0 5 6 0 . 3 2 a s p e r g i l l u s t r i c h o d e r ma 0. 2 2 0 . 0 0 50 . 1 4 0 . 7 80 . 0 1 7 0 . 0 2 0 . 0 9 9 1 . 9 0 . 0 6 3 0 . 2 8 0 . 0 4 2 0 . 21 n曰on n勺万6 r八石户、 5 a s p e r g i l l u s 0 .0 0 7 0 . 0 0 1 0 .0 2 6不t c l v d d e r i n a 0 . 0 3 6 0 . 0 1 9 0 . 0 2 7 t r i c h o d e r ma 0 . 0 3 9 0 . 0 2 4 0 . 0 2 0 . 1 5 0 . 3 2 0 . 21 0 . 6 7 8 t r i c h o d e r ma 0 . 0 4 3 0 . 0 0 8 0 . 0 2 0 . 1 6 0 . 6 0 9 t r i c h o d e r ma 0 . 4 0 0 . 0 8 2 0 . 0 2 0 . 2 6 1 . 9 1 0 - t r i c h o d e r m a 0 . 0 6 2 0 . 0 1 5 0 . 0 4 4 0 . 1 0 0 . 2 9 注: 为被测定试样在5 m g / m l 时， 仍未显示出 活性， * 为在5 m g / m l 浓度时测定， 可能计算出的活性偏低. 1 . 4纤维素酶的诱导调控机理 纤维素酶是多酶体系，受着复杂的 代谢调控。在众多纤维素降解菌中，木 霉尤其是绿色木霉、里氏木霉是人们研究最多，了 解最多的一个领域。 人们在 木霉纤维素酶的分子特征、基因克隆及酶的应用方面都有了详细报道。 然而， 对于纤维素酶合成的调节机制却了解不够.近年来，随着生物化学和分子生物 学的发展，再加上纤维素酶在新领域的广泛应用，纤维素酶合成的调节机制再 次引起了人们的兴趣，成为当今纤维素酶研究的一个新的研究焦点。随着研究 的深入，人们在纤维素酶的诱导、阻遏方面的认识有了一定的进展。 组成型的纤维素酶主要由外切葡聚糖纤维二糖水解酶 i . i f c c b h i . c b h 1 1 ) 组成。 人们所支持的纤维素诱导 模式是: 组成型纤维降解酶主要由 外 切葡聚糖纤维二糖水解酶通过外切一外切协同作用对纤维素进行最初的降解， 所产生的双糖 ( 纤维二糖、 6 一纤维二糖-1 - 5 一内脂) 被菌丝吸收， 诱导纤维 素 酶的 进一 步合成。 朱雨生 等则 认为， 不 受诱导剂影响的 组成酶， 它们可能 是 上海师范大学硕士学位论文高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 纤维素分解菌固有的遗传特性， 分布在细胞表面或分泌到介质中去， 它们识别 环境中的纤维素，从而在将信息传递给细胞以合成纤维素酶时，起“ 信号受体” 的 重 要 角 色 t7 一般而言， 真菌纤维素酶是诱导酶， 诱导物是调控纤维素酶合成的主要因 素。严格来说诱导物应该是某种特异代谢物，它能够结合于某一蛋白，该蛋白 然 后 直 接 或闻 接影 响 某 种d n a 结 合蛋白 ， 从 而 启 动 纤维 素 酶基因 的 转 录 表 达。 目 前人们对什么是纤维素酶基因的 转录表达。目 前人们对什么是纤维素酶合成 的真正诱导物仍然存有争议。 大多数人认为纤维素酶的形成受特殊的诱导剂诱导。 但h u l m e 等在研究漆 斑 霉 纤 维 素 酶 合 成 时 ， 认 为 该 菌 的 纤 维 素 酶 不 是 诱 导 酶 ， 各 种 碳 源， 只 要 控 制 利用速度，解除降解物阻遏，都能产生纤维素酶。所以，比较漆斑霉与其他纤 维素酶诱导产生菌基因表达的差异将可能为纤维素酶合成调控机理方面的研究 提供线索。 1 . 5 纤维素酶活力的测定方法 纤维素酶是多组分复合酶， 不同 来源的纤维素酶其组分及各组分比 例都有 较大差异。 同时纤维素酶作用的底物也很复杂。 因此， 测定酶活的方法有很多， 如表1 - 3 所示。 常用的方法有: c m c 糖化方法、 c m c液化方法、 滤纸糖化法、 滤 纸 崩溃 法 和棉 花 糖 化 力 法等 p 8 1 此外， 纤维素酶作用效果受到底物浓度， 酶浓度、 反 应系统p h和温度等 因素的影响，所以酶活力测定时需统一条件。 1 .6纤维素酶的理化性质 纤维素酶系拥有庞大的家族成员， 尤其在理化性质上具有多型性， 体现在 不同的纤维素酶组分具有不同的分子量、等电点和酶学活性等， 这一点在内切 酶中尤为突出。 ( 1 ) 分子量 纤维素酶分子大小范围很广， 不同 物种来源的酶其分子差异很大， 即使同一酶系中的三类酶也有较大差异.大部分报道的内切型酶分子量介于 2 3 -1 4 6 k d之间， 一 般低于5 0 k d t9 . 2 0 ， 外切 型酶为3 8 -1 1 8 k d ， 一 般在5 0 6 0 k d左右: 通常p 一 葡萄糖昔酶的分子量在三种酶组分里最大， 为9 0 -1 0 0 k d ( 胞内酶) 和4 7 -7 6 k d ( 胞外酶) ， 大部分大于7 0 k d ， 但有的甚至于 超过 4 0 0 k d 2 t 。 有一些例外的 报道， 如纤维粘菌的内 切型酶的分子量小至6 .3 k d , 上 海 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文高c x / f p a 醉 菌 株 的 选育 及 产 酶 特 性 研 究 ， 而 蚕 豆 腐 皮 镰 抱的p 一 葡 萄糖 昔酶 竟高 达4 0 0 k d 。 有 记 载的 最 小的 纤 维素 酶 分子 量为5 .3 k d ,属于内切型酶。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，所 含碳水化合物的比率不同在很大程度上决定了酶的多形性，根本上表现为分子 量 的 差 别 12 2 1 表1 - 3纤维素酶活力测定的方法 测定的酶活力 纤维素酶 产物或参数 葡萄糖 纤维二糖水解酶和内切葡聚糖的协 同作用 p 一 葡萄糖营酶 纤维二糖水解酶 底物 不溶解的结晶纤维素棉花，微晶粉 末纤维素滤纸 棉花 结晶粉末纤维素 水解纤维素 纤维二糖 对 一 硝基 苯一 p - d葡萄 糖普 水杨营 棉花 还原糖 重量减少 光密度降低 葡萄糖 对. 硝基酚 水杨醇 还原糖 内切葡聚糖酶 结晶粉末纤维素 无定型纤维素 cmc 滤纸纤维素酶 he c 滤纸 棉线 着色纤维素 粘度 卜 降 还原糖 浸渍作用 断裂强度 染料的释放 ( 2 ) 等电 点 纤维素酶 系中 各 组分的 等电 点， 随着菌种来源、 培养条件的 变化 而差别较大。 一 般真菌产生的纤维素酶等电 点偏酸性， 在3 - 6 之间。 培养条件 同样对酶的 等电点 有影响。以 棘胞曲 霉为例，液体培养时各酶组分的等电点在 3 .5 - 5 .0 之 问 12 31 ， 但 固 体 鼓 皮 培 养 产 生 的 酶 组 分 ， 在 影 电 聚 焦 电 泳 时 ， 甚 至 可 以 散布 在两性电 解质载体3 .5 -1 0 的 整个p h 跨度上。 ( 3 ) 最适作用p h环境 在早期常见的纤维素酶产生菌中， 如曲 霉、 青霉及木霉， 土海师范大学硕士学位论文高c x / f p a 酶菌株的 选育及产酶 特性研究 产生的酶蛋白一般为酸性酶，在酸性环境中有较高酶活。大多数纤维素酶组分 的 最 适 p h 在 p h 4 - 5 之 间 ， 且 其 最 适 p h 与 温 度 有 关 近 几 年 来 ， . 随 着 造 纸 和 洗 涤 剂 工 业 对 纤 维 素 酶的 进 一 步 要 求 ， 人 们 陆 续 筛 选 到 一 些 嗜 碱 性 的 细 菌 和 真 菌， 如b a c i l l u s 属中的 某些种， 可以 在碱性条件下保持较高活性的纤维素酶。 ( 4 ) 最适反 应温度 大部分纤维素酶在 较高 温 度下都 表现出 较强活性， 尤其是 来自 霉菌属的种类， 其最适的反应温度变化范围一般在4 0. 6 0 之间， 而在较 低的温度下对于纤维素的降解需要花上更长的时间。同时，纤维素酶具有一定 的热稳定性，但各组分对温度的敏感性不同，如康氏 木霉的外切型酶的稳定性 强 而内 切 酶 和p 一 葡 萄 糖 昔酶的 热 稳 定 性 相 对 较 差。 ( 5 ) 抑制剂与活化剂 纤维素酶可由 酶促反 应的 产物和类似底物的某些 物质引 起竞争性抑制，常见的竞争性抑制剂有纤维二糖、葡萄糖等。还有一些金属离 子也能够使纤维素酶失活。而另一些物质能够使纤维素酶活化，一一般为一些 金 属 离子 ， 酬+ ， f e e + 等。 2 . 纤维素酶的生产 纤维素酶的生产中主要有两个关键因素影响酶的产量:一是菌株的本身的 产酶活性，二是发酵条件的优化程度;目前，国内外已经有许多有价值的关于 这方面的报道。 2 . 1 菌株选育 常规理化诱变研究较早，虽然存在着偶然性大，不能定向及工作量大等不 足，但在纤维素酶微生物的遗传改造上依然不失为一种有效手段。 尤其是在目 前 通 过 基 因 克 隆的 方 法 提 高 酶 活 力 的 手 段尚 未 完 善 阶 段， 毫 无 疑问 ， 诱 变 育 种 是 一 种 必 不 苛 少 的 有 效 方 法 。 兰 时 乐 等 2 4 1 以 野 生 绿 色 木 霉 t p o i 出 发 ， 经 过 紫 外 线、 亚硝酸肌紫外线、 亚硝基肌、 硫酸二乙醋和l i c l 等物理化学诱变处理， 最 后得 到1 株高 产 突 变 株 t p 1 2 0 ， 固 体 发 酵 c m c 酶 活 达 2 8 9 0 0 u / g 干曲 。 王 水 顺2 5 1 等以黑曲 霉f j o 0 8 为出发菌株， 经紫外线、 紫外线和亚硝酸孤复合诱变获得一株 复 合 酶高 产 菌 株s l 2 1 1 1 ， 固 体 发 酵纤 维 素酶 活 达 4 4 9 7 u / g ， 比 出 发 菌株 提高 9 7 .9 % 。 朱 知 难、 吴军 2 6 使 用 秋 水酞 碱 对长 梗 木 霉 a n u 3 - 9 5 8 菌 株原 生 质 体 进 行了 诱变， 筛选出三株酶活较高的菌株，最高的比出 发菌株f p 酶活提高7 7 .2 。 乌 敏辰等以 里氏木霉wx r - 8 为出发菌株， 经紫外诱变和亚硝基肌诱变处理后， 得 到一株抗纤维二糖阻遏突变株r m - 2 7 a 0 土海师范大学硕士学位论文高c x / f p a 酶菌株的 选育及产酶 特性研究 产生的酶蛋白一般为酸性酶，在酸性环境中有较高酶活。大多数纤维素酶组分 的 最 适 p h 在 p h 4 - 5 之 间 ， 且 其 最 适 p h 与 温 度 有 关 近 几 年 来 ， . 随 着 造 纸 和 洗 涤 剂 工 业 对 纤 维 素 酶的 进 一 步 要 求 ， 人 们 陆 续 筛 选 到 一 些 嗜 碱 性 的 细 菌 和 真 菌， 如b a c i l l u s 属中的 某些种， 可以 在碱性条件下保持较高活性的纤维素酶。 ( 4 ) 最适反 应温度 大部分纤维素酶在 较高 温 度下都 表现出 较强活性， 尤其是 来自 霉菌属的种类， 其最适的反应温度变化范围一般在4 0. 6 0 之间， 而在较 低的温度下对于纤维素的降解需要花上更长的时间。同时，纤维素酶具有一定 的热稳定性，但各组分对温度的敏感性不同，如康氏 木霉的外切型酶的稳定性 强 而内 切 酶 和p 一 葡 萄 糖 昔酶的 热 稳 定 性 相 对 较 差。 ( 5 ) 抑制剂与活化剂 纤维素酶可由 酶促反 应的 产物和类似底物的某些 物质引 起竞争性抑制，常见的竞争性抑制剂有纤维二糖、葡萄糖等。还有一些金属离 子也能够使纤维素酶失活。而另一些物质能够使纤维素酶活化，一一般为一些 金 属 离子 ， 酬+ ， f e e + 等。 2 . 纤维素酶的生产 纤维素酶的生产中主要有两个关键因素影响酶的产量:一是菌株的本身的 产酶活性，二是发酵条件的优化程度;目前，国内外已经有许多有价值的关于 这方面的报道。 2 . 1 菌株选育 常规理化诱变研究较早，虽然存在着偶然性大，不能定向及工作量大等不 足，但在纤维素酶微生物的遗传改造上依然不失为一种有效手段。 尤其是在目 前 通 过 基 因 克 隆的 方 法 提 高 酶 活 力 的 手 段尚 未 完 善 阶 段， 毫 无 疑问 ， 诱 变 育 种 是 一 种 必 不 苛 少 的 有 效 方 法 。 兰 时 乐 等 2 4 1 以 野 生 绿 色 木 霉 t p o i 出 发 ， 经 过 紫 外 线、 亚硝酸肌紫外线、 亚硝基肌、 硫酸二乙醋和l i c l 等物理化学诱变处理， 最 后得 到1 株高 产 突 变 株 t p 1 2 0 ， 固 体 发 酵 c m c 酶 活 达 2 8 9 0 0 u / g 干曲 。 王 水 顺2 5 1 等以黑曲 霉f j o 0 8 为出发菌株， 经紫外线、 紫外线和亚硝酸孤复合诱变获得一株 复 合 酶高 产 菌 株s l 2 1 1 1 ， 固 体 发 酵纤 维 素酶 活 达 4 4 9 7 u / g ， 比 出 发 菌株 提高 9 7 .9 % 。 朱 知 难、 吴军 2 6 使 用 秋 水酞 碱 对长 梗 木 霉 a n u 3 - 9 5 8 菌 株原 生 质 体 进 行了 诱变， 筛选出三株酶活较高的菌株，最高的比出 发菌株f p 酶活提高7 7 .2 。 乌 敏辰等以 里氏木霉wx r - 8 为出发菌株， 经紫外诱变和亚硝基肌诱变处理后， 得 到一株抗纤维二糖阻遏突变株r m - 2 7 a 0 p , k 师范大学硕士学位论文 高c x / f p a 酶菌株的选育及产酶特性研究 随着实验技术的进步，采用较先进的诱变手段对菌株进行选育的 研究也有 了 报道。 王景林等2 7 1 对突