（植物学专业论文）东亚七筋姑分子系统发育地理学研究—基于cpdna+pcrrflp标记及序列分析.pdf

东亚七筋姑分子系统发育地理学研究基于c p d n a p c r r f l p 标记及序列分析 摘要 东亚七筋姑( c 说扎幻，z 缸础瑚如t r a u t 、，e tm e y ) 隶属于百合科七筋姑属，为多年 生森林草本植物。七筋姑属包括五个种，其中四个种分布在北美，一个种分布在 东亚，是典型的东亚一北美间断分布。东亚七筋姑被认为是该属中的原始类群， 其分布区内不同的细胞型共存( 2 n - 1 4 和2 n = 2 8 ) ，因此，研究居群的遗传变异和 遗传结构对于探讨七筋姑属的多倍体起源、分化及系统演化有重要意义。 本研究采集了1 9 个居群( 其中5 个四倍体居群) 进行分子系统发育地理学研 究。我们采用叶绿体d n a 分子标记探究东亚七筋姑种间的系统发育类型，研究 结果显示在所有3 5 种p c r r f l p 标记酶组合中，共检测到9 6 条扩增片段，其 中3 6 条( 占3 7 5 ) 具有多态性；s h a i l n o n 多样性指数慨，= o 8 7 3 9 ) 、n e i s 信息多 样性指数( g ，= 0 9 6 8 8 ) 以及a m o v a 分析结果( 蛾f _ 0 9 4 2 7 ) 均显示七筋姑居群具 有类似的遗传结构：遗传变异主要存在于居群间，居群内的遗传变异很小。遗传 多样性水平与七筋姑植物广泛的地理分布及其进化历史有关。该种植物的生物学 特征、有限的基因流以及遗传漂变可能是造成居群间遗传变异水平较高的原因。 另外，通过研究单倍型的多样性，构建它们的地理分布式样，揭示了c p d n a 变 异的系统发育关系。我们在所有东亚七筋姑居群中共检测到2 6 种单倍型，它们 分属5 个不同的系统发育分支。测序结果表明，p 恐o 掣1 2 序列在所有1 9 个居 群中变异显著，除丽江、西藏和中甸居群外，七筋姑的二倍体和四倍体居群之间 能够有效分辨；而f m l - f 序列的变异未达到显著水平。此外，在我们的研究基 础上，综合前人的细胞学、叶绿体基因分子标记以及序列分析的结果暗示，东亚 七筋姑多倍体可能是同源多倍体，其起源方式也许是异地多起源的，推测东亚七 筋姑至少存在三个起源分化中心，在第四纪气候环境的影响下，东亚七筋姑随后 向东北和西南两个方向迁移扩散，最终形成了现今的分布格局。本研究拓展了可 用于该种植物分子系统学研究的遗传信息，为进一步探讨七筋姑属植物的起源、 演化提供科学依据。 关键词：东亚七筋姑，分子系统发育地理学，叶绿体d n a ，p c r - i 强l p ，序列分 析 第一部分前言 1 分子系统发育地理学简介 随着系统发育地理学研究方法的不断拓展和分子生物学实验技术的渗透，出 现了门新的交叉学科分子系统发育地理学( m o l e c u l a rp h y l o g e o 鲫h y ) 。分 子系统发育地理学采用先进的分子生物学技术，从分子水平上探讨种内的系统地 理格局的形成机制，对等位基因在空间上的分布进行分析，考虑它们之间的系统 发育关系( 黄原，1 9 9 8 ) 。分子系统发育地理学具有很强的综合性，融入了分子遗 传学、种群遗传学、系统发育学、统计学、行为学、古地理学和历史生物地理学 等众多学科的精髓，将种内水平上的微进化( m i c r o e v o l u t i o l l ) 和种及种上水平的大 进化( m a c r o e v 0 1 u t i o n ) 有机的结合起来( 王静等，2 0 0 1 ) 。 分子系统发育地理学早期的研究主要是应用线粒体( m t d n a ) 限制性酶切技 术，通过对限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a 舯e n tl e n g mp o l y m o 印h i s m ， r f l p ) 的比较分析，探讨种群之间的系统发育关系及其系统地理模式。有关这方 面的第一篇报道是a v i s e 等关于囊鼠( g e o m y sp i n e t i s ) 地理种群间系统发育关系的 研究，该研究表明在囊鼠种内可以明显分成东部、西部两个种群，并且指出两个 种群内存在着数个单倍型以及这些单倍型系统发育的关系。这个研究被认为是分 子系统发育地理学研究的雏型，从此，这方面的研究逐渐发展起来。1 9 8 7 年， a i v i s e 等根据实验室中多种动物种内群体间的i n t d n a 的研究结果，对分子系统 发育地理学的理论提出了如下的3 点假说：( 1 ) 大多数物种都是由地理种群组成 的，这些地理种群在系统树上都占有不同的分枝，这种系统分支的地理分隔格局 可称为系统地理种群结构。( 2 ) 有一定系统地理种群结构的物种在其历史发展过 程当中发生过扩散，而且所占有的分布区不存在基因交流的障碍。( 3 ) 单系群之 间系统发育隔离较大，这是由于基因流的长期中断而引起的( a v i s ej c ，1 9 8 9 ) 。 这3 点假说的提出，进一步丰富了分子系统发育地理学的内容。这些研究还具有 更加重要的意义( a v i s e ，2 0 0 0 ) ：( 1 ) 将个体作为研究单元，而不是像等位酶等方法 研究种内遗传结构时以种群为研究单元。这样就不需要事先通过地理分布等标准 定义种群，等位基因频率也将不再扮演种群遗传结构研究中唯一基本数据的角色 了；并且，每个个体都有各自完整的m t d n a 单倍型、母系遗传、不发生分子内 基因重组。( 2 ) 将系统发生的概念引入种内进化的研究中，而在这之前，系统发 生被认为在种内水平不具有研究意义( 樊晓霞，2 0 0 5 ) 。 2 0 世纪9 0 年代以来，分子系统发育地理学的发展更为迅速。首先在实验技 术方面，传统的盯l p 由于工作量大、信息含量低、特异性不强等因素，逐渐被 操作简便、结果直观的d n a 测序技术所取代( d es i l v a ，1 9 9 3 ；1 a l b o t ，1 9 9 6 ) ，其 中p c r 技术的广泛应用，可以从微量的d n a 模板中获得大量的拷贝，使d n a 多态性分析更加精确，有助于系统发育地理学家广泛进行不同物种之间的比较。 其次，分子系统发育地理学在进化遗传学等相关学科中的应用日益广泛，特别是 在保护生物学中的应用使其不再停留在理论阶段，而是具有一定的应用价值，如 为保护单元的确定和保护政策的制定提供有力的理论根据。p a d d n s o n 等( 2 0 0 0 ) 分析了墨西哥蝮蛇a t a y l o r i1 1 个个体的i n t d n a 3 个基因区段和两个t r n a 的序 列，着重研究了蝮蛇亚种之间的分子系统地理格局，结果发现位于墨西哥东北区 的一个亚种目前只占有较小的地理范围，为保护这一亚种的基因多样性，作者对 其保护提出了6 点建议。此外，谱系学理论和分子数据在分子系统发育地理学领 域中的应用也越来越广泛，其中包括合生理论( c o a l e s c e n tt l l e o 呦在动态种群中的 应用和发展( h u d s o n ，1 9 9 0 ；s l 砌血，1 9 9 1 ；n e e ，1 9 9 5 ) 以及改进了的统计学方 法和支序法用于分析从遗传标记中获得的实验数据( n e i g e l ，1 9 9 1 ；t 锄p l e t o n ， 1 9 9 6 ；f l e i s c h e r ，1 9 9 8 ；t e ：i l l p l e t o n ，1 9 9 8 ) ，这些理论和方法都大大推动了分子 系统地理学的发展，使其日臻完善( 王静等，2 0 0 1 ) 。 目前，分子系统发育地理学研究已成为国际上相当活跃的研究领域，近年来， 研究进展十分迅速。然而我国分子系统发育地理学研究还相当滞后，仅见零星报 道，在植物界，几乎是空白。 2 分子系统发育地理学研究中应用的基因片段 单系遗传的基因组是系统发育地理学研究中的首选遗传标记，因为：首先， 在同一种群内，单系遗传的基因组比双系遗传的核基因组受遗传漂变的影响更 大、更有可能产生程度较大的分化而具有显著的独特性( h e w i t t ，g m 1 9 9 6 ) 。第二， 母系遗传的线粒体d n a ( 加t d n a ) 或叶绿体d n a ( c p d n a ) 仅通过种子遗传，比既 6 一 有种子流又有花粉流的核d n a 更能长久的保持遗传多样性格局，特别是对于第 四纪冰期避难所、冰期后扩散方面的研究更有意义( p e t i t ，鲥口，1 9 9 3 ；e 皿o s ，1 9 9 4 ) 。 在高等动物体内，m t d n a 由于具有相对快的碱基置换率( 约是单拷贝核基因 的1 1 0 倍) 、不发生重组现象以及显著的母性遗传等特性，使得m t d n a 在动物 系统地理研究中越来越来受到青睐。通过m t d n a 可以构建物种单倍型之间的系 统发育、检测遗传变异在地理分布上的格局、了解动物广布种种内变异模式的进 化历史。如t a b e r l e t 和b o u v e t ( 1 9 9 4 ) 对欧洲棕熊的研究表明，欧洲大陆棕熊各种 群可以分为东西欧两大类群，两大类群是在冰期后不同的避难所保存下来，并通 过不同的扩散和迁移途径形成今天这个分布格局。r o d 甜c k 和g i l l e s p i e ( 1 9 9 8 ) 在 对夏威夷群岛上节肢动物进行分子系统地理研究时，认为该岛上物种的形成有3 种模式：( 1 ) 单个种广泛分布于整个岛屿；( 2 ) 由分布于不同岛屿上的单个种辐射 形成或由分布于每个岛屿上的多个种辐射形成；( 3 ) 由聚集在一特定区域的种辐 射形成广布种。同时，还发现夏威夷群岛上的大多数类群都具有一个共同的系统 地理模式：沿着群岛的形成链从最古老的岛屿不断辐射和建群，一直发展到最年 青的岛屿上。形成这种模式可能与遗传因素( 如奠基者效应、杂交等) 和生态因素 ( 如栖息地的迁移) 的影响有关。 植物m t d n a 具有相对低的核苷酸置换率并且在结构上具有重组的倾向，因 而，m t d n a 一般很少用在植物的分子系统发育地理学研究上。但植物m t d n a 在有性生殖中是母系( 单亲) 遗传，为典型的细胞质遗传( m o g e i l s e i lh l 1 9 9 6 ) ，在 某些植物的分子系统发育地理学研究中也具有相当的应用价值。s i n c l a i r ( 1 9 9 8 ， 1 9 9 9 ) 等以m t d n a 为标记对分布于苏格兰的欧洲赤松( p h m ss y l v e s t r i sl ) 进行研 究后认为，欧洲赤松在第四纪冰期时的避难所可能是在爱尔兰岛或者在法国的西 部，冰期结束后从避难所扩张进入爱尔兰的西部，形成如今的格局。相关的研究 还有d e s p l a i l q u e ( 2 0 0 0 ) 以m t d n a 为标记对甜菜但e 勉如y 廊s s p m 碰t i i n a ) 进行 的种群遗传学研究以及m i t t o n ( 2 0 0 0 ) 通过对软松( p i n l l sn e x i l s ) 遗传结构的研究 来推测软松的冰期避难所。 植物c p d n a 较大，大小范围为2 0 0 2 5 0 0 k b ，通常呈环状、双链结构，在长 度和结构上高度保守。其结构上最突出的特点是，包含两个2 2 k b 的反向重复区 ( i n v e n e dr 印e a ts e q u e i l c e ，瓜) ，这两个重复区把环状叶绿体分成了一个大拷贝区 ( l a r g es i n 酉ec o p yr e 西o n ，l s c ) 和一个小拷贝区( s m a l ls i n 酉ec o p yr e g i o n ，s s c ) 。 两个取s 和l s c 连接的区域分别称为j l a 和j l b 。由于植物基因排列的保守性， 得以让研究者们设计出在各种植物中通用性很强的引物，有目的地选择扩增不同 碱基置换速率的区域，进行种间、种内水平的研究。目前，研究者们已经设计出 了多条这样的通用引物( t a b 甜e t ，1 9 9 1 ；d e m e r s u r e ，1 9 9 5 ；d u m o l i n ，1 9 9 7 ；h a m i l t o n ， 1 9 9 9 ：g r i v e t ，2 0 0 1 ) ，在不同植物中，这些通用引物的“通用”程度有所不同。植物 c p d n a 遗传的形式和机制多种多样，大多数植物具有单亲遗传特征，w b l f e 甜 口z ( 1 9 9 2 ) 发现植物c p d n a 的进化并不像从前认为的那么保守，而具有较高的种 内多样性，因此植物c p d n a 同动物m t d n a 一样可以用于分子系统发育地理学 的研究。 在最初的对分布于欧洲的栎属( q p 彤淞) 植物研究中，发现根据c p d n a 类型 栎属植物可以分为东西两大生态群( c l i n e ) 。这个分布模式被后来的研究所证实， d u m o l i n - l a p e g u es 等( 1 9 9 7 ) 发现该属八个种间一共存在有2 3 个c p d n a 单倍型， 大量的c p d n a 单倍型揭示出在不同的栎属物种间存在有广泛的杂交 ( h y b r i z i d a t i o n ) 和基因渗入( i i l 仃。黟e s s i o n ) 。此外，分子系统发育地理研究分析显示 在相邻的地理区域内，栎属植物的c p d n a 单倍型属于同一个进化谱系 ( e v o i u t i o n a r yl i i l e a g e ) 。整个栎属植物中存在着三种主要的c p d n a 单倍型，推测 栎属植物是从不同的冰期避难所巴尔干半岛、伊比利亚岛和意大利亚半岛经过冰 期后的迁移形成现今的分布格局，这个格局与花粉分析结果相一致。栎属植物三 种明显区域分布的c p d n a 单倍型也被后来f e m sc 等( 1 9 9 8 ) 的研究迸一步证实， f e f r i sc 等也认为芬兰南部栎属植物种群是从欧洲东部和西部独立迁移形成的， 同时栎属植物印d n a 单倍型的地理分布与栎属植物间的系统发育关系存在着相 关性。 欧洲桤木口觑埘咖砌傩口) 种群中c p d n a 单倍型也形成了其地理分布格局。 g 和f e m s ( 1 9 9 3 ) 共调查了几乎遍布欧洲整个范围的1 0 1 个欧洲桤木种群，发 现共存在有1 3 个印d n a 单倍型类型，其中两个c p d n a 单倍型类型广泛分布于 欧洲的北部和中部，其它的c p d n a 单倍型类型局限在相应的分布区内。他们推 测欧洲北部的大部分欧洲桤木种群是从喀尔巴阡山脉这个冰期避难所迁移形成 的，而不是从欧洲东南部、意大利和西班牙这些地方的避难所迁移形成的，因为 性，亦可分析多个酶切位点的多态性。与传统的r f l p 分析技术比较，此技术使 少量的目的d n a 的i u l p 分析成为可能，且操作简便快速，分型简单，被广泛 应用于a b 0 、h l a 、g p t 、p g m l 、m t d n a 等序列多态性的分析( 王廷华等，2 0 0 5 ) 。 这项技术根据研究目的不同一般采取两种思路，一种是选择少数基因，用尽可能 多的酶进行酶切，即在单一基因上获得丰富的信息；另一种思路是选择较多的基 因，用少量的酶进行分析即可得到足够的信息量。在分子系统发育地理学研究中， 多数学者采用后一种思路进行研究。 s e w e l l 等( 1 9 9 6 ) 利用r f l p 技术对北美东部的三f d 如咒d 阳hm 幼塘m 种群进 行了遗传变异分析，在三m 助咖加种群存在两种c p d n a 单倍型，一种遍及整 个阿巴拉契亚山高地，而另一种局限于佛罗里达州中部的三个三砒幼掘m 种群 中，推测l t u l i p i f 孤在更新世冰期时期分别在两个相互隔离的避难所躲避。磁n g 等( 瞄n g f e m s ，1 9 9 8 ) 用9 对c p d n a 通用引物对1 0 1 个欧洲桤木似觑郴础打咒d 册) 居群共2 1 7 个个体进行p c r i 江l p 分析，检测到1 3 个c p d n a 单倍型，从这些 单倍型的分布模式确定了欧洲桤木冰期后的迁居路线。t r e m b l a y & s c h o e n ( 1 9 9 9 ) 运用p c r r f l p 技术分析了仙女木( d 时嬲妣面f 0 1 i a ) 的c p d n a ，结合化石、孢 粉等资料，发现仙女木的冰期避难所主要是白令地区和北极高纬地区，但这两个 避难所在冰期结束后所起的作用不同，白令避难所是现今北极大部分地区、落基 山脉以及北美西北部大陆架部分仙女木的主要扩散源；北极高纬地区虽然也是重 要的避难所，但在仙女木冰期后重新扩散中的作用不大。 p c r r f l p 作为反映生物系统地理的一种方法，越来越显示出它的优越性。 i v a l l a ( 2 0 0 2 ) 曾分别用a f l p 、p c r i 心l p 和嵌套分支分析方法，对阿尔卑斯药草 雪地典酸模进行了研究，发现p c r r f l p 能精确地揭示出分配模式，c p d n a 遗 传变异较低，根据单倍型残遗地的支持，能更好地反映冰期历史变迁和系统地理 学情况。张颖等( 2 0 0 6 ) 用p c r i 江l p 标记，探讨了鹅观草属、披碱草属、猥草属 和仲彬草属2 1 个物种和1 份外类群的属间变异和亲缘关系，结果表明，鹅观草 属、披碱草属和猥草属存在属间和中间的多态性，遗传相似系数高，仲彬草属单 独聚为一类，该结果与通过醇溶蛋白和随机扩增微卫星多态性( 洲p ) 两种生化 和分子标记的分析结果一致。 但由于p c r i 讧l p 分析只能检测到某些己知与限制性内切酶酶切位点相关 的碱基变异而不能检出一些未知的碱基突变，故其检测视野很窄。此外，其还有 很多不足，如操作繁琐、费时、影响因素多、费用高等因素，限制了其在检测 d n a 多态性和基因突变中更广泛的应用。 3 2d n a 测序技术在分子系统发育地理学中的应用 d n a 序列分析是在d n a 一级结构水平上检测遗传多样性的分子标记技术， 即采用某种策略测定核苷酸在基因组d n a 特定区域的排列顺序，它是最能充分 揭示d n a 多样性的方法。d n a 序列分析是区分个体间遗传差异最彻底准确的分 析方法，可提供基因组特异区的完全遗传信息。在解决种群学和系统学问题中都 是可靠的，它可以避免等位酶在电泳中由于相似的迁移率和相同的遗传密码而无 法检测到信息的情况。但d n a 测序仅能观察到单基因的多态性，只揭示该基因 的变化情况，而且分析费用高，因此对所有生物基因组d n a 都进行测序不是轻 易能做到的事。一般而言，比较保守的基因进化速度较慢，它的序列分析适用于 亲缘关系较远的物种间的遗传研究，而进化较快的基因适合于群体遗传研究。随 着p c r 技术的发展，基因组特殊区域或特异基因的序列测定正逐渐使用。目前 应用最多的是用“通用”引物扩增m t e i n a 、印d n a 或核d n a 某些基因以及d n a 片段，然后对这些p c r 产物进行测序。其中单拷贝基因测序是一个很有潜力的 分子标记技术，已被用于系统发育地理学、分子系统学、遗传学等研究领域当中。 4 七筋姑植物及其研究现状 4 1 七筋姑属植物的背景资料 七筋姑属植物为多年生草本。根状茎短，叶基生，全缘，花葶直立；花通常 几朵，排成顶生的总状花序或伞形花序，较少只具单花；花序轴和花梗在后期显 著伸长；花被片6 ，离生；雄蕊6 ，着生于花被片基部；花丝丝状，花药背着， 半外向开裂；子房3 室，每室有多颗胚珠；花柱明显，柱头浅3 裂。果实为浆果 或多少作蒴果状开裂。种子棕褐色，胚细小( 中国植物志，1 9 8 5 ) 。 全属共5 种，其中2 种( c 锄幻n 妇堋朋( s c h u l t ) k u 玎t b 和c 口，z d 绷 ，缸，l 口 t o m ) 分布于北美西部，2 种( e6 d 坨口船c a j t ) r a 和c “，z 6 e 玩肠缸( m i c h x ) m o r o n g ) 分布于北美东部，东亚只有1 种( c 幻玎地“比珊妇t r a u 仉e tm e y ) ，均为 多年生草本。呈典型的东亚一北美西部北美东部间断分布。 本属的染色体基数为x = 7 。东亚七筋姑具有2 n = 1 4 和2 n = 2 8 两种细胞型， 其它北美四种七筋姑植物的细胞型均为2 n = 2 8 ( “a 1 1 dc h a n g ，1 9 9 6 ；“甜口正， 1 9 9 6 ) 。东亚七筋姑的核型属2 a ( - 2 b ) 核型；东亚七筋姑分布区两端的四倍体的 核型属于2 a ( _ 2 b ) ，而化龙山四倍体的核型为2 a 核型，与北美四个种的核型相 当一致，差别仅仅在于一对染色体属v ”还是属j ”型。东亚七筋姑的花序为总状 花序，叶片光滑无毛，柱头3 裂，浆果后期作蒴果状开裂，具有百合科植物典型 的三心皮子房和芽苞状花粉( 1 狄a l l a s l l ia i l ds o h m a ，1 9 8 2 ；k d s e n k o ，1 9 9 1 ) ；北美四 个种的七筋姑花序为伞形花序，叶缘具毛，柱头合生成头状，浆果后期不作蒴果 状开裂，具有简化的双心皮子房和网状花粉( u t e c h ，1 9 7 3 ) 。七筋姑属植物的大孢 子发生属于独特的七筋姑类型( c 1 m o i l i a - t y p e ) ( p a h u j aa n dk 1 n 甄1 9 7 1 ；s l l l i t h ， 1 9 4 3 ；s m i m ，1 9 1 1 ；w a l k 1 9 4 4 ) ，在双受精之前通过异型或同型分裂，其基因组 有选择性的消除，最后形成二倍体的胚核和二倍体的胚乳核。这种大孢子发生方 式相当于自花受精( 或者是假受精) ( 王棉玲，2 0 0 6 ) 。 h a y a s l l i l 等学者( 2 0 0 1 ) 对七筋姑属植物叶绿体d n ar b c l 和m 砌 两个基 因的序列进行测序分析，来探讨七筋姑属不同种间的亲缘系统关系，结果表明， 五个种形成了两个单源群，东亚的七筋姑单独组成一个单源群，北美四个种组成 一个单源群。在北美单源群中又可以分为东西两支。虽然形态学上七筋姑属具有 很大的多样性，但被测的r b c l 和m 根序列只有少数的碱基替换。用m a 做基 因序列构建氨基酸系统进化树时，发现北美四种七筋姑m a t k 基因序列差异主要 体现在同义密码子的差异上。并且认为七筋姑属植物独特的大孢子发生类型 七筋姑类型，在其多倍体形成过程中，来源于同一母系的二倍体合子和二倍体胚 乳降低了七筋姑植物在其进化过程中的变异性。 根据细胞学、形态学、分子生物学数据资料，东亚七筋姑应为七筋姑属中原 始的植物类型，北美其它四种七筋姑为其衍生类型。 4 2 东亚七筋姑及其研究现状 根状茎较硬，粗约5 毫米，有撕裂成纤维状的残存鞘叶。叶3 4 枚，纸质或 厚纸质，椭圆形、倒卵状矩圆形或披针形，长8 2 5 厘米，宽3 1 6 厘米，无毛或 幼时边缘有柔毛，先端骤尖，基部成鞘状抱茎或后期伸长成柄状。花葶密生白色 短柔毛，长1 0 2 0 厘米，果期伸长可达6 0 厘米；总状花序有花3 1 2 朵，花梗密 生柔毛，早落；花白色，少有淡蓝色；花被片矩圆形，长7 1 2 毫米，宽3 4 毫 米，先端钝圆，外面有微毛，具5 7 脉；花药长1 5 2 毫米，花丝长3 5 ( 7 ) 毫米； 子房长约3 毫米，花柱连同浅3 裂的柱头长3 5 毫米。果实球形至矩圆形，长 7 1 2 ( 1 4 ) 毫米，宽7 1 0 毫米，自顶端至中部沿背缝线作蒴果状开裂，每室有种 子6 1 2 颗。种子卵形或棱形，长3 4 2 毫米，宽约2 毫米。花期5 6 月，果期7 1 0 月( 中国植物志，2 0 0 5 ) 。 分布区大约在北纬2 5 0 5 0 。，东经7 9 0 1 4 5 0 范围之内，自喜马拉雅，经中国 的云南、四川、陕西、甘肃、湖北、河南、山西、河北、内蒙古、辽宁、吉林、 黑龙江到朝鲜、日本和俄罗斯的远东地区。常常生长在高山疏林下或阴坡疏林下， 海拔9 0 0 4 0 0 0 米( 王神玲，2 0 0 6 ) 。 从细胞学角度看，七筋姑植物c “如珊西具有两种倍性二倍体( 2 n = 1 4 ) 和四倍体( 2 n = 2 8 ) ( 李思锋和常朝阳，1 9 9 6 ；王丽等，1 9 9 3 ) ，无论是二倍体还是 四倍体，其染色体数目均非常稳定，在同一居群内没有发现不同倍性个体的混生 现象，也没有发现非整倍体变异。二倍体分布于云南俄罗斯远东海滨边区，核 型相当一致；四倍体除出现在东亚的两端云南及其以西的喜马拉雅山地区和 日本外，在陕西南部化龙山北坡一带较狭的范围内也被发现。研究还发现，东亚 七筋姑种子的大小与植物的倍性有关，其颜色与地理分布有关。二倍体种子大小 为2 6 3 5m m 1 3 1 7m m ，四倍体种子大小为3 5 5 5n 吼1 7 2 5m m ，成熟 期的种子随着多倍化而增大；在种子颜色上，从喜马拉雅山经云南、四川直至秦 岭东部为淡褐色，从山西吕梁经河北、辽宁、吉林到西伯利亚和日本一带均为深 褐色，但其颜色与植物的倍性无关。花序类型上，一般为总状花序，但其变异也 较大，一株植物上花的数目可以从1 到多数，最多可达2 3 朵，且花序靠近顶部 的花有呈伞形花序的趋势，即使在同一种群内这种变化也非常明显，无规律可循。 c 砒珊西花粉外壁纹饰具有三种类型：芽孢型，即外壁密布芽孢状突起； 拟网状芽孢型，外壁呈不规则网状，网脊由大小不等的小芽孢相互融合或连接而 成；具穿孔芽孢型，芽孢部分连接或融合，并有穿孔形成。花粉外壁纹饰演化的 分析，得出以下结论：七筋姑四倍体至少存在3 个起源地：一个位于日本附近， 一个位于中国境内的秦巴山区，另一个则位于横断山脉。 5 本研究的内容、目的及意义 5 1 研究内容 本文采用p c r i 江l p 技术，对分布于我国的1 9 个七筋姑居群进行了系统发 育地理学研究，根据七筋姑植物单倍型的地理分布格局推测他们可能的起源演 化、冰期避难所及冰期后迁移路线，同时，结合d n a 序列分析结果探讨东亚七 筋姑多倍体的起源及扩散。 5 2 研究目的和意义 一般认为，染色体倍性由低到高，即由二倍体向四倍体，再向更高的多倍体 发展是进化的趋势，本质是不可逆的( 洪德元，1 9 9 0 ) 。七筋姑属中二倍体植物仅 存在于东亚，是属中比较原始的类群，四倍体在东亚和北美两大陆均有分布( 李 思锋和常朝阳，1 9 9 6 ；l i 甜口正，1 9 9 6 ) ，比较进化。而北美4 种七筋姑不管是在外 部形态、核型还是花粉形态上，都非常相似或一致，并与东亚的种类不同( l i 酊口z ， 1 9 9 6 ；u t e c h ，1 9 7 5 ；t 狄出a s l l ia n ds o h m a ，1 9 8 2 ) 。但东亚的七筋姑不仅在细胞学， 花粉外壁纹饰和种皮形态特征上与北美种密切相关，而且具有与北美种接近的过 渡类型( 李思锋等，1 9 9 7 ；l i 刃口z ，1 9 9 6 ) 。由此可见，该属的原始类型在东亚， 东亚是七筋姑属起源和演化的关键地区，东亚的七筋姑是七筋姑属起源和演化的 关键类群。 东亚七筋姑以两种细胞型的形式存在，在我国川西南滇西北以及陕西化龙 山地区，两种细胞型的分布区相邻或重叠，为我们探讨七筋姑种群的遗传结构和 遗传分化，多倍体的起源、扩散和演化，及其迁移路线提供了理想的天然研究场 所。本文试图采用叶绿体基因组( c p d n a ) p c r i 江l p 分子标记和测序技术研究东 亚七筋姑种群的分子系统发育地理学。根据单倍型分布格局，结合生物地理学以 及地质学等证据，探求东亚七筋姑的起源、可能的冰期避难所和冰期后居群的迁 居路线，研究结果将从理论上丰富七筋姑属植物系统发育地理学的研究，有助于 1 材料 第二部分材料与方法 本研究所用的材料均采集于5 8 月，分别采自黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、 河北、湖北、陕西、甘肃、四川、云南、西藏等1 0 个省份，基本上覆盖七筋姑 在中国的分布区，此外还包括日本北海道的一个居群( 详见表1 和图1 ) 。采集新 鲜、完整的植物幼嫩叶片，用硅胶迅速干燥，直到叶子完全变干后，置于- 8 0 超低温冰箱中保存备用。参照其它相关研究方法( r a n d r e w 鼬n g & c 0 1 i nf e r r i s ， 2 0 0 0 1 ，本研究从每个居群中随机选取4 个个体对七筋姑c p d n a 的变异进行研究。 表1 材料来源和采样数 t a b l ell o c a l i t i e sa n d 肌m b e ro fs a m p l e so fc 如n 曲t r a u 仉甜m e 弘 种群产地采样数经度 纬度海拔 p o p u l a t i o n s l o c a l i t ) r s 锄p l e s l o n g i t i l d e l a t i t l l d e a l t i t u d e ( m ) 北海道( j a p ( 4 x ) ) 日本 161 4 1 0 0 8 4 3 。0 4 8 7 0 黑龙江佳木斯 大亮子河( d l z h ( 2 x ) ) ( 小兴安岭南麓) 1 91 2 9 。4 5 4 6 。4 7 6 0 0 长白山( c b s ( 2 x ) ) 吉林抚松l o 1 2 8 。1 1 4 2 。0 7 1 2 9 8 老秃顶子( u d z ( 2 x ) ) 辽宁桓仁 2 01 2 4 。5 2 4 2 。2 0 7 8 6 6 雾灵山( w l s ( 2 x ) ) 河北兴隆 l81 1 7 。2 7 4 0 。3 5 7 1 4 3 6 黑里河( h l h ( 2 x ) ) 内蒙古赤峰 2 01 1 8 。1 6 4 l 。2 7 1 5 5 3 太白山( r b s ( 2 x ) ) 陕谣眉县 1 41 0 7 。4 2 3 4 。0 2 2 8 4 0 佛坪( f p ( 2 x ) ) 陕西佛坪 51 0 7 。4 9 3 3 。4 l 7 1 2 5 0 化龙山( h l s ( 2 x ) ) 陕西化龙山北坡 1 51 0 9 。2 l 3 2 。o o 2 4 1 8 化龙山( h l s ( 4 x ) ) 陕西化龙山南坡 2 01 0 8 。2 0 3 3 。2 l 2 3 0 0 寨科桥( z k q ( 2 x ) ) 甘肃文县 1 61 0 4 0 2 3 3 2 。5 l 2 2 0 0 木林子( m l 乙( 4 x ) ) 湖北木林子 1 6l l 0 0 1 2 3 0 。0 2 2 0 8 5 金猴岭( j h u 2 x ) ) 湖北神农架 2 01 1 0 。1 6 3 l 。2 6 2 8 4 6 神农架( s n j ( 2 x ) )湖北天生桥( 老君山) 61 1 0 0 2 3 3 l 。4 7 1 1 6 6 玉龙雪山( u ( 4 x ) ) 云南丽江 1 51 0 0 0 6 72 7 。o o 3 1 0 8 中甸( z d ( 2 x ) )云南迪庆( 属都岗湖) 2 09 9 。4 1 2 7 。4 8 3 7 0 5 峨眉山( e m s ( 2 x ) ) 四川乐山 51 0 3 。1 9 2 9 。3 l 7 2 8 1 0 九寨沟( j z g ( 2 x ) )四川九寨沟 6 1 0 3 0 5 l 3 3 。0 4 2 9 7 0 西藏( x z ( 4 x ) ) 西藏 59 5 。4 2 51 22 9 。4 9 3 2 23 2 5 0 1 7 图1东亚七筋姑的野外采样地点及分布 f i g 1l o c a h 6 e so fs a m p l e sa n dd i s 仃i b u 6 0 n s o fch d 阴s 话 1 8 2 实验方法 2 1 东亚七筋姑植物基因组d n a 提取 快速提取高质量的d n a 是对植物基因组进行研究的基础，也是分子生物学 后继试验的基础。本实验采用了改良配方的c t a b 法，具体步骤如下： 1 1 取适量硅胶干燥叶片置于预冷研钵中，加入适量聚乙烯吡咯啉酮 ( p o l y v i n y lp y n 0 l i d o n e ，p ) 、抗坏血酸( l - a s c o r b i ca c i d v c ) 及石英砂研磨成粉 末； 2 ) 将干粉装于2i i l l 离心管中( 约占管内总体积的1 5 ) ，加入1m l 预处理液 ( 其中含0 2m s h c l ，0 0 5m e d t a ，o 2 5m n a c l 以及1 巯基乙醇) ，置于冰 浴中1 0m i n ，6 0 0 0 印m 离心1m i i l ，弃去上清液，并重复以上操作一次； 3 ) 加入c t a b ( 2 5m 1 的提取液中2 c t a b ，1 0m m 碱s - h c lp h 8 0 ，6 0m m e d t a p h 8 o ，1 4mn a c l ，6 5 。c 预热) 8 0 0p l ，6 5 水浴1h ，在此期间轻微振荡 几次； 4 ) 取出离心管稍冷却接着加入8 0 0 山的氯仿一异戊醇( 2 4 ：1 ) ，抽提1 0m 证， 然后8 0 0 0 印m 离心5m i n ，取上清液，再用氯仿异戊醇重复抽提1 次； 5 ) 小心吸取上清液，加入l 1 0 体积的3m o 儿的n 啦c ( p h 5 2 ) ，并加入2 倍 体积的预冷的无水乙醇，置于2 0 。c 约1h ，以沉淀d n a ； 6 ) 4 。c1 2 0 0 0 印m 离心1 0m i n ，小心倒掉乙醇，收集沉淀； 7 ) 将沉淀用7 0 乙醇洗涤两遍，室温风干后溶解于o 1 t e 中，4 0 c 保存待 用或2 0 。c 长期保存。 2 2 东亚七筋姑植物基因组d n a 纯度和浓度检测 2 2 1 电泳检测 采用琼脂糖凝胶电泳法检测基因组d n a 纯度，取d n a 样品6 山，加样缓 冲液2 山( o 2 5 溴酚兰、4 0 蔗糖水溶液) 混合均匀，点样至o 6 琼脂糖凝胶 上( 含0 5 e b ) ，电泳缓冲液为1 t b e ，电压3 0v ，电泳3 0m i n 。电泳结束后用 口一巨o一 u l 巨o nc!|暑on盘一g o n u l 暑o n口一骞on p 0 9 p 旨p n 口p np ”np 器 co一墨卜9一卜一)o基)口口h c-oo舌u1口工vuo口ou卜on c-工。巴1)h_oo堇_)ouo-ih n-v01)vl口oqouou卜g-l毫oh ic卜09一苦uo口口hh)口o“ c-卜00工ou_10一蔓r一一0uuoh n口9一ur工u工vu昌uooun c-uo口一uuu工vo工工uu0工ulvn cuh圣uuou一卜一口1)uv上hv-tn )huo-口uo hvvuhu轨 s 专 i i ! 昌o n u日b0量， u i 暑o h 由的氲。墨鼍 i i ! 暑o n r l - 工e 口一gon p np 器p n p n 口p gp n n co苫。口usvhuf)害oo。nc-d工vooun孑，工u001)uu” nj5司919ioll口huo一誓一uo。h cooovv卜h穿10buur上un n昌u-lu卜譬uuuii=乏ou工工oo轨 cuuu051uuo卜ou卜oonciopllooou苣ov工u口uu。hnvuououuuo一vooouh noouu气口i工。毫o h h h 毽n cousouo00uhouh 冒)i毛 口_ _ e 】l - 白置专 u 尝摹s 色 ) i 1 i 鼍 ，广i 五 。呈_葺。口一呻叠o_柚p-善-e臣_皇_h叠暑曩。置皇 ou葺。摹，io量i1 i_昌|j厶jo p 蓦一z 廿暑翟葺暑童呻茸。一日 暑芒a暑掌崔皇葺一。葺目 u罨暑fo衍i舢暑 -o量t臣，o u 量露z 霉示旺赠z盆堆嚼舌g妖窿恃*匠n僻 2 3 2p c r 反应体系及扩增程序 p c r 扩增反应的总体积为5 0 “l ，经过优化后，最终确定的p c r 反应体系如 下：1 0 p c rb u r ，3u1 a qd n a 聚合酶，0 2 “m 引物，3 0 0 md n t p s 以及 1 0 5 0n g 模板d n a ，扩增时加入3 0p l 石蜡油，防止蒸发损失。扩增反应在m j r e s e 砌li n c 生产的p t c 2 0 0 型热循环仪上按下列程序进行：9 4 0 c 预变性6m i i l 3 0s e c ，每循环中9 4 。c 变性1m i n1 0s e c ，按引物的退火温度退火1m i n ，7 2 。c 延伸2m i n ，共3 5 个循环，完成最后一个循环后，再7 2 0 c 延伸1 0m i n 。 p c r 反应结束后，其扩增产物用含有0 5 e b 的1 2 低熔点琼脂糖凝胶 ( p r o m e g a ) 电泳检测，电泳缓冲液为lx t b e ，电压为3 0 v 。如果检测出明亮的扩 增条带，即可用于下一步的酶切及测序反应。 2 3 3 限制性内切酶的筛选 在酶切反应中，首先要选择合适的限制性内切酶，选定内切酶的原则是切出 的多态性要好( 吕志堂& 刘志恒，2 0 0 0 ) 。扩增产物一般用单酶切，可采用四碱基 限制性内切酶和六碱基限制性内切酶；也可以采用四碱基酶和六碱基酶的组合进 行双酶切。本研究中选用胁p 、协口i 、胁矿i 、肱驴i 、风fi 、船口i 、死gi 共7 种限制性内切酶对p c r 扩增的d n a 片段进行酶切。酶切反应之后一般不再有后 继实验，所以一般情况下，选用1 0 山酶切体系。每5mp c r 产物用5u 酶酶切 3 4h 。酶解产物用含有o 5 e b 的2 0 的低熔点琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓 冲液为1 t b e ，以d l 2 0 0 0 ( 广州东盛生物科技有限公司) 作为d n a 分子量标准， 电压为3 0v 。并在g e ld o c2 0 0 0 1 m ( b i o r e d ) 凝胶成像仪上观察、成像、记录。 2 4 扩增产物的序列分析 p c r 产物在电泳检测后送到上海生工进行测序。测序所得的序列数据用 b i o e d i t 软件( t o mh a l l ，2 0 0 4 ) 进行序列比对，并进行适当的人工校正。借助 m e g a 4 0 软件( 砌n u r a ，d u d l e y ，n e i ，a i l dn l i l l a r2 0 0 7 ) ，采用距离法进行聚类分 析，并构建聚类图。 2 5 谱带记录及数据处理 根据实验获得的图谱，将酶切产物每个条带视为1 个位点，按条带有或无分 别赋值，有带记为1 ，无带记为o 。根据p c r 扩增产物的限制性内切酶酶谱，统 计各引物酶组合在东亚七筋姑居群中检测到的位点总数、多态位点数及c p d n a 单倍型数( h a p l o t ) ，p e ) 。 利用p o p g e n ev 打s i o n1 3 2 软件( y r e h 鲥口z ，1 9 9 9 ) 分析东亚七筋姑植物种群 的多态位点比率( p p b ) 、s h 锄o n 信息指数和n e i s 基因多样性指数q ) ，并估算 各亚种群间的n e i s 遗传距离( g d ) 、基因流胁) 及基因分化系数( 白力。在以上分 析得到的n e i s 遗传距离矩阵的基础上，借助m e g a 4 0 软件( t a m u r a ，d u d l e y ，n e i ， a n d 融1 i l l a r2 0 0 7 ) ，构建系统进化树。借助a m o 、後一p r e p 软件( e x c o m e rl ，s m o u s e p e ，q u a t t r oj m ，1 9 9 2 ) 和w i n a m o v a1 5 5 软件( e x c o f e 1 9 9 3 ) 进一步分析东亚 七筋姑种群内和种群间的遗传变异及其分布。用p a u p 4 o ( d a v i dl s w o 娲r d ， 1 9 9 8 ) 软件进行单倍型的分析，并用n e t w o r k4 5 0 o 软件( f 1 u x u st e d m 0 1 0 9 y l t d ，2 0 0 7 ) 构建东亚七筋姑c p d n a 单倍型的网络进化图。 第三部分结果与分析 1 植物基因组d n a 提取结果 如图2 所示，d n a 样品在凝胶上呈现出清晰、迁移率低的整齐条带，由此 可见，用本文所述的方法可基本去除杂质的干扰，得到较纯的基因组d n a 。样 品的d n a 成整齐划一的带型，说明样品在d n a 提取过程中保存了较好的完整 性。用该方法提取的基因组d n a 样品进行p c r 扩增可产生清晰、稳定的带谱， 也证明了d n a 的质量已达到后续实验操作的要求。 图2 东亚七