（无机化学专业论文）皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子的纯化、性质、结构和功能研究.pdf

摘要 凝血因子i x x 结合蛋白是近来发现的一类具有特殊性质的蛋白质。它们存 在于蝰科蛇毒中，不具有酶活性，通过与凝血因子或凝血因子x 结合来延长 凝血时间。我们首次将它们归类为c 一型动物凝集素超家族中一个亚家族一称 为凝血因子i x x 结合蛋白家族。首次从皖南尖吻蝮蛇毒中分离出一种新的抗凝 血因子a c f i i ，并发现a c f i 和a c f i i 都是凝血因子i x x 结合蛋白家族的成员 。本文对a c fi 和a c fi i 的坌塞缝焦、生些! 圭厦、酶学特性、坌王结撕噬凝 机理进行了系统的研究。( 全文分为七章。 7 第一章：对蛇毒蛋白的研究概况、皖南尖吻蝮蛇毒和抗凝血因子的研究进展 进行了综述。 第二章：首次系统地总结了蛇毒中一类不具有酶活性的抗凝蛋白的发现、结 构、性质和功能，并将它们归类为一个新的蛋白家族一凝血因子i x 凝血因子 x 结合蛋白家族。 第三章：建立了从皖南尖吻蝮蛇毒中纯化抗凝血因子a c fi 和a c fi i 的高 效简捷的分离方法，首次从皖南尖吻蝮蛇毒中分离纯化出一个新的抗凝血因子 a c fi i 。纯化的a c fi 和a c fi i 经p a g e 、s d s p a g e 、i e f - p a g e 和h p l c 检 测为纯蛋白。a c f i 和a c f i i 的等电点分别为5 8 和7 0 。a c fi i 与a c f i 一样， 不具有类凝血酶活性、纤溶活性和磷脂酶a 2 活性，没有出血活性和毒性，具有 显著的抗凝血活性，是一种潜在的有重要医学价值的抗血栓药物。改进了测量抗 凝血活性( p p t ) 的方法。 第四章：对a c fi 和a c fi i 的氨基酸组成、分子量、理化性质和活性等进 行了系统的比较，发现a c fl 和a c fn 的差异属于抗凝血因子的微观不均一性 范畴。它们都是由两条分子量相近的肽链通过二硫键连接在一起的。a c fi 和 a c fi i 除等电点有差异外，它们的氨基酸组成、分子量、紫外吸收系数、含糖量 等都十分接近或相同。它们都没有蛋白水解活性、精氨酸酯酶活性和l 一氨基酸 氧化酶活性，而且二者具有相同的抗凝血活性。 第五章：首次发现皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子a c fi 和a c fi i 在抗凝血反 应中存在一临界浓度，只有在高于其临界浓度时，才表现出显著的抗凝血活性。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱方法，发现a c fi 和a c f i i 均与活化凝 血因子x 在钙离子作用下形成1 ：1 的复合物。a c fi 和a c f i i 都是凝血因子i x x 结合蛋白家族中新发现的成员。 第六章：用平衡透析方法测定出a c fi 和a c f1 1 分子中都含有两个不同亲 合性的钙离子结合位点，并首次测定出a c fi 和a c fi i 与钙离子和部分稀土离 子的结合常数。稀土离子和钙离子在a c fi 和a c fu 分子中有共同的结合位点 。稀土离子和过渡金属离子对a c fi 和a c fi i 的内源荧光有不同程度的淬灭作 用，而c a 2 + 对a c fi 和a c fi i 的内源荧光有一定的增强作用。c a 2 + 对a c fi 和 a c f1 1 分子中微区构象产生影响。稀土离子与a c fi 和a c fi i 的荧光滴定表明， 与稀土离子亲和性较低的位点在结构上有较大的柔性。 第七章：用c d 谱测得，天然a c fi 和a c fi i 的二级结构十分相似，它们 的主要骨架构象都为反平行p 一折叠和a 螺旋结构。其中反平行p 折叠含量分别为 2 6 5 和2 6 2 ；毡螺旋含量分别为1 5 5 和1 3 7 。p h 值增大时，a c fi i 的 a 螺旋含量减少，而反平行6 一折叠含量增大。钙离子和稀土、过渡金属离子对 a c fi i 的主链骨架结构没有明显影响。卜。 i l l 曼型兰垫查查兰苎主兰垡堡兰垒呈塑! 塑 t h es t u d i e so nt h ep u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n ， s t r u c t i 瓜ea n df u n c t i o n o f1 r i i ea n t i c o a g u l a t i o n f a c t o r sf r o mt h ev e n o mo f 4 6 1 磁s t r d d d 彳c u 兀毽 a b s t r a c t t h e c o a g u l a t i o n f a c t o ri x f a c t o r x b i n d i n gp r o t e i n s ( - b p ) d i s c o v e r e d r e c e n t l ya r ew i d e l yp r e s e n ti nt h ev e n o mo f v i p e r i d a es n a k e ，w h i c ha r en o n e n z y m a t i c a n t i c o a g u l a n t sa n df o r ml ：lc o m p l e x e s 埘t l lf a c t o ri x o rf a c t o rxi nt h ep r e s e n c eo f c a 2 + i o n sa n d p r o l o n gt h ec l o t t i n gt i m e t h e s ep r o t e i n sa r ef i r s tc l a s s i f i e da sau n i q u e s u b f a m i l yi n t h ec - t y p ea n i m a ll e c t i ns u p e r f a m i l y , a n dd e s i g n a t e da s c o a g u l a t i o n f a c t o ri x f a c t o rx b i n d i n gp r o t e i nf a m i l y an o v e la n t i c o a g u l a t i o nf a c t o rr a c fi oi s f i r s ti s o l a t e df r o mt h ev e n o m o f a g k i s t r o d o n a c u t u sa n di ti sf i r s td i s c o v e r e dt h a ta c f ia n da c fi ia l et h en e wm e m b e r so fi x x - b pf a m i l y t h i st h e s i sf o c u s e so nt h e i n v e s t i g a t i o no f t h ep u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n ，s t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so ft h et w o a n t i c o a g u l a t i o n f a c t o r s t h e r ea r es e v e nc h a p t e r si nt h i sd i s s e r t a t i o n t h e c h a p t e r ig i v e sar e v i e wa b o u tt h e p r o g r e s so f t h e r e s e a r c hf o rs n a k ev e n o m ， e s p e c i a l l y a b o u tt h e u p d a t es t u d y o nt h ev e n o mo fa g k & t r o d o na c u t u sa n dt h e a n t i c o a g u l a t i o nf a c t o r s i n c h a p t e ri i ，t h ed i s c o v e r i e s ，s t r u c t u r e s ，p r o p e r t i e s a n df u n c t i o n so fn o n e n z y m a t i ca n t i c o a g u l a n tp r o t e i n sf r o m s n a k ev e n o m sa r es y s t e m a t i c a l l yr e v i e w e da n d t h e s ep r o t e i n sa r ef i r s tc l a s s i f i e da sau n i q u es u b f a m i l yi nt h ec t y p ea n i m a ll e c t i n s u p e r f a m i l y - c o a g u l a t i o nf a c t o r i x f a c t o rx - b i n d i n gp r o t e i nf a m i l y i nc h a p t e rl l i ，a n e w , s i m p l ea n de f f i c i e n t m e t h o dt o s e p a r a t ea n t i c o a g u l a t i o n f a c t o r sf r o mt h ev e n o mo fa g k i s t r o d o na c u t u sh a sb e e ne s t a b l i s h e da n dan o v e l a n t i c o a g u l a t i o nf a c t o r ( a c f 1 ni sf i r s ti s o l a t e df r o mt h ev e n o m o f a g k i s t r o d o n a c u t u s b y t h i sm e t h o d t h ea c f ia n da c fi ia l ep r o v e dt oh a v e h i 【g hp u r i t yb yp a g e ，s d s p a g e i e f - p a g ea n dh p l c t h ei s o e l e c t r i cp o i n t so f a c f ia n da c fi ia r e5 8a n d 7 0 r e s p e c t i v e l y l i k e a c fi ，t h ea c fi is h o w sn e i t h e rt h r o m b i n - l i k ea c t i v i t y , f i b r i n o l y t i ca c t i v i t y , p h o s p h o l i p a s e a 2a c t i v i t y , h a e m o r r h a g i ca c t i v i t y , n o rl e t h a l a c t i v i t y , w h i c hm a y b eu s e f u la sa l le f f e c t i v em e d i c a la n t i c o a g u l a n t t h em e t h o do f t h e p l a s m ap r o t h r o m b i nt i m e ( p p na s s a y h a sb e e ni m p r o v e d 主宴型兰垫查查兰堕主兰垡堡奎竺! 翌塑 一一一 i nc h a p t e ri v , t h ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o n s ，p h y s i c a la n d c h e m i c a l p r o p e r t i e sa n d b i o l o g i c a la c t i v i t i e so f a c fia n da c f i ih a v eb e e ns y s t e m a t i c a l l ya n a l y z e da n di ti s f o u n dt h a tt h ed i v e r s i t yb e t w e e nt h e mi sc a u s e db y t h er n i c r o h e t e r o g e n e i t yo f p r o t e i n b o t ha c fia n da c f c o n s i s to ft w op e p t i d ec h a i n sw i t hs i m i l a rm o l e c u l a rw e i g h t s l i n k e dt o g e t h e rb yd i s u l f i d eb o n d a n ds h o wn e i t h e rp r o t e o l y t i ca n de s t e r o l y t i c a c t i v i t i e s n o rl a m i n oa c i do x i d a s ea c t i v i t y t h e yp o s s e s se q u i v a l e n ta n t i c o a g u l a n t a c t i v i t i e s w i t hs i m i l a ra m i n oa c i d c o m p o s i t i o n s ，m o l e c u l a rm a s s e s ，a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t s ( a 。、8 0 ) a n dc a r b o h y d r a t ec o n t e n t s ，b u td i f f e r e n t i s o e l e c t r i cp o i n t s i nc h a p t e rvi ti sf i r s td i s c o v e r e dt h a tb o t ha c fia n da c fi ip r o l o n gp l a s m a p r o t h r o m b i nt i m e ( p p t ) w i t hd o s e d e p e n d e n t m a n n e ra n de x h i b i tm a r k e d a n t i c o a g u l a n ta c t i v i t i e s ，o n l y a tt h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o nt h a nt h e i rc r i t i c a l c o n c e n t r a t i o n s i ti sf o u n da l s ot h a tb o t ha c fia n da c f i if o r ma1 ：lc o m p l e x e sw i t h a c t i v a t e dc o a g u l a t i o nf a c t o rx ( f x a ) i nt 1 1 ep r e s e n c eo fc a “i o n sb yt h em e t h o d so f p a g ea n dh p l c a c fia n da c fi 】a l et h en e wm e m b e r so ft h ei x ，) ( - b pf a m i l yi n t h ec t y p el e c t i ns u p e r f a m i l y i nc h a p t e rv i ，t h ee q u i l i b r i u md i a l y s i sd e m o n s t r a t e st h a tb o t ha c fia n da c fi i h a v et w oc a 2 + b i n d i n gs i t e sw i t hd i f f e r e n ta f f i n i t i e s 1 1 1 ea s s o c i a t i o nc o n s t a n tk z f o r t h e i rh i g h a f f i n i t yc a 2 + - b i n d i n gs i t e sa n dk 2f o rt h e i rl o w a f f i n i t yc a p b i n d i n gs i t e s a r ef i r s to b t a i n e df r o man o n l i n e a rf i t t i n gp r o g r a m t h el a n t h a n i d ei o n sa n dc a 2 + i o n s c a l lb i n dt oa c fia n da c fi ic o m p e t i t i v e l yi nt h eb o t hc a ”b i n d i n gs i t e s t h e l a n t h a n i d ei o n sa n dt r a n s i t i o nm e t a li o n sg i v ed i f f e r e n tq u e n c h i n ge f f e c t so nt h e f l u o r e s c e n c e so fa c fla n da c fi i w h i l ec a 2 i o n se n h a n c et h ef l u o r e s c e n c e so f a c fia n da c fi i t h eb i n d i n g so fc 一+ i o n st oa c fia n da c fi ir e s u l ti nt h e c o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so ft h em i c r o e n v i r o n m e n t so fs o m et r pr e s i d u e s t h er e s u l t s o ft h et i t r a t i o no fa c fia n da c f1 1w i t hl a n t h a n i d ei o n si n d i c a t et h ec o n f o r m a t i o n a l f l e x i b i l i t yo f t h el o w - a f f i n i t yr e ”- b i n d i n g s i t e si na c fia n da c fi i i nc h a p t e rv i i ，h o l o a c fia n dh o l o a c fi ih a v es i m i l a rs e c o n d a r ys t r u c t u r e s a n dt h e i rm a i nb a c k b o n ec o n f o r m a t i o n sa r e a n t i - p a r a l l e l 8 - s h e e ta n dd h e l i x d e t e r m i n e db yc d s p e c t r a t h ec o n t e n t so fa n t i - p a r a l l e lp s h e e ta n d a - h e l i xa r e2 6 5 ，1 5 5 f o rh o l o a c fi ，a n d2 6 2 ，1 3 7 f o rh o l o a c fi ir e s p e c t i v e l y w h e n p h v a l u ei n c r e a s e s t h ec o n t e n to f “- h e l i xo fa c f i id e c r e a s e s ，w h i l et h ec o n t e n to fi t s a n t i p a r a l l e lb s h e e ti n c r e a s e s n oa p p a r e n te f f e c t so f c a l c i u mi o n s ，l a n t h a n i d ei o n s a n dt r a n s i t i o nm e t a li o n so nc o n f o r m a t i o n so ft h em a i nc h a i nb a c k b o n eo fa c f ua r e o b s e r v e d v 致谢 本论文是在导师刘清亮教授的精心指导下完成的。 在我人生最困难时期，整个论文得以顺利完成，离不开刘老师的特别关怀， 离不开刘老师的不断鼓励，离不开刘老师的谆谆教诲，离不开刘老师的渊博知 识，离不开刘老师的创新思想，离不开刘老师对科学的高瞻远瞩，离不开刘老师 千方百计地创造实验条件，更离不开刘老师对我的严格要求。论文的字里行间不 知凝聚了刘老师多少心血和汗水。刘老师深厚的理论功底、严谨的治学作风和高 尚的思想品德对学生产生深刻的影响，使我受益终生。在这里向尊敬的刘清亮 教授致以最诚挚的感谢! 在完成论文过程中得到了张祖德教授的许多指导和帮助，张老师丰富的知 识、不断创新的思想、执着忘我的工作热情，使我终生难忘，在此深表感谢! 在实验过程中，得到了生物系朱中良博士的许多帮助和建议，吴双顶博士和 中科院生态环境中心的赵超博士慷慨惠赠了活化凝血因子x 样品，在此向他们 表示深深的谢意。 在样品测试过程中，北大的周永芬老师、北京医科大的孙徐林先生、生物系 的王玉珍教授和王秀海老师、化学系的淦五二老师、结构中心的宋子台、李碧琳 和李前荣老师、北京研究生院的韩树波博士等给予了大力支持和协助，在此表示 感谢。 感谢解永树和陈真龙博士后、王守业、扬家祥和夏丙乐博士以及张玉慧、卞 建卫、施春华、王雷等同学的热情帮助。 感谢洪法水博士、胡俊青博士、程彬博士、王国富博士和魏正贵博士给予我 的多方面帮助。 感谢所有给予我无私帮助和支持的老师和同学。 我的岳父母、家人和儿子徐薛在我三年的艰苦求学生涯中给予我多方面的理 解和支持，在此表示衷心的谢意! 最后，我要特别感谢我的爱人，在她生命最苦难的时候，独自忍受巨大痛苦， 坚持要我完成学业。没有她的牺牲和奉献，要完成本论文是不可能的。在此致以 最崇高的敬意! 谨以此文献给曾经始终关爱我、鼓励我、支持我、寄希望于我的 爱妻一薛丽君女士! 徐小龙 - - _ 0 0 0 年四月十六日 于中国科技大学 前言 无论是低等的单细胞生物，还是最高等的生物一人类，有许许多多物质参与 了生命活动，其中包含有机分子，无机离子，也有各种各样的生物大分子，但是基 本的物质是水、蛋白质和核酸。在生物体中的蛋白质，其含量不能和水相比，但比 核酸的含量大得多，而且种类极其繁多，生物体就是靠种类繁多的蛋白质来完成生 物体自各的生物功能的。 基因研究是本世纪生命科学的主线。9 0 年代，随着全球性基因计划尤其是人类 基因组计划规模空前、速度惊人的推进，基因研究已近“登峰造极”，人类对生命 世界的理性认识达到了前所未有的深度与广度。但是，人们在欢呼基因组计划辉煌 业绩之时，亦愈来愈清醒地意识到项更艰巨、更宏大的任务即基因组功能的阐明 已经摆在面前，生命科学几乎在转瞬之间开始了新的征程一蛋白质组的研究，进 入了新的纪元一后基因组时代( p o s t g e n o m e e r a ) 。人类经过一个世纪的跋涉，重 返近代生命科学的发源地之一，蛋白质一这一生命活动的执行体。 鉴于蛋白质研究在生命科学中具有重大意义，本文对皖南尖吻蝮蛇毒中抗凝蛋 白质的结构、性质和功能等进行了研究。 第一章蛇毒蛋白的研究概况和进展 蛇类在动物分类上属脊索动物门，脊索动物亚门，爬行纲，有鳞亚纲，蛇目。 目前，世界现存的蛇类有二千七百多种，而我国有蛇二百二十余种，隶属九科；其 中有毒蛇五十余种，隶属四科【l 】：即海蛇科( h y d r o p h i d a e ) ，眼镜蛇科( e l a p e d a e ) ，游 蛇科( c o l u b r i d a e ) ，蝰科( v i p e f i d a e ) 。蝰科可分为两个亚科，没有颊窝的属蝰亚科 ( v i p e r i n a e ) ，有颊窝的属蝮亚科( c e o t a l i n a e ) 。其中蝮亚科可分为两个属，即烙铁头 属( t r i m e r e s u r u s ) 和蝮属( a g k i s t r o d o n ) 。尖吻蝮蛇( a g k i s t r o d o na c u t u s ) 属于蝮属。 蛇毒是从毒蛇的毒腺中分泌出来的一种毒液，内含有丰富的蛋白质，除某些眼 镜蛇和海蛇毒外，一般蛇毒干粉的9 0 9 5 是蛋白质，非蛋白部分占的比例很少。蛇 毒中的毒素和生物活性物质大部分是蛋白质，非蛋白部分包括金属离子、无机阴离 子和有机小分子化合物( 如小肽、脂、核苷酸、糖和胺等) ，一般很少具有生物活性。 从十八世纪起，人类对蛇毒就进行了科学研究。早在1 7 6 7 年，f o n t a n a 首次描 述了蛇毒可作为促凝剂和抗凝剂，这对后人产生了较大的影响。从本世纪三十年代 开始了用现代生物化学方法研究蛇毒。1 9 3 6 年，k l o b u s i t z k i 和k o n i g 第一个从美洲 矛头蝮( b a t h r o p s i a r a r a c a ) 分离到了类凝血酶【2 】，并于1 9 3 9 年采用了电泳法分离了 蛇毒组分口1 。s l o t t a 和f r a e n k a l c o n r a t 4 】第一个从南美响尾蛇恐一( c r o t a l u s t t e r r i f i e u s ) 中获得神经毒蛋白c r o t o x i n 的结晶，并分析了此毒蛋白的各种性质【5 j 。 随着生物化学的不断发展，蛇毒研究的范围越来越广，从早期对蛇毒的研究转 而对其中各组分的研究。目前，蛇毒的研究已进入分子水平，已经立足于精巧的立 体结构之上来理解许多蛇毒蛋白的功能。蛇毒研究已在生物系统和医学问题上取得 了大量重要的信息。蛇毒组分作为药物设计的模板或药剂在治疗疾病和医学并发症 方面，正越来越受到人们的重视。 蛇毒的蛋白部分包括各种毒素、非毒性蛋白、酶以及活性多肽 6 。8 】。一种粗蛇毒 一般含有十几到二十几种毒蛋白和酶类。蛇毒蛋白具有极高的医学价值，蛇毒具有 抗凝和止血、抗癌、镇痛等作用。例如，从蛇毒中分离出来的l 氨基酸氧化酶已经 广泛用于氨基酸构型的研究以及0 【酮酸和甲状腺素的生产；磷酸二酯酶被用作核酸 和核苷酸类辅助因子结构的分析；蛋白酶被用于蛋白质和多肽一级结构的测定；磷 酯酶a 2 用于细胞膜结构和功能的研究；类凝血酶和其它促凝或抗凝组份被用于临 床：精氨酸酯酶、去纤酶等可以用于治疗血栓病、冠心病等。蛇毒粗毒所表现出来 的活性是多种成份共同作用的结果。 所有被研究过的蛇毒都含有金属离子，这些金属离子主要有：n a + 、k + 、c a 2 十、 c u 2 + 、m 9 2 十、m n 2 + 、c 0 2 + 、z n 2 + 和f e 3 + ，其中n a + 和k 十的含量最高，m 9 2 + 、c a 2 + 和 z n 2 + 在蛇毒中最普遍。蛇毒经4 8 小时透析后，大部分金属离子的含量仍然很高，这 说明它们与蛇毒中的大分子结合在一起。实际上在上述金属离子中，有些是酶的固 有成分，有些是酶的激活剂。一般来说，c a 2 + 、m 萨+ 和z n 2 + 等金属离子对某些蛇毒 蛋白的结构稳定性起重要作用，而c u 2 + 、c 0 2 + 、z n 2 + 和f e 3 + 等金属离子可能参与某 些蛇毒蛋白和酶的催化作用。 人们对蛇毒中非金属无机物的研究较少。b i e b e r 等人对蛇毒中非蛋白组成进行 了测定【9 】0 l a p o r t a f e r r e i r a 等对南美洲响尾蛇亚属蛇毒中多种金属及非金属元素 含量的进行了比较。蛇毒中有机小分子化合物如小肽 t t l 等也有些研究，但总的况来 不多。 1 1 蛇毒蛋白和蛇毒蛋白酶 蛇毒是自然界最集中的酶源之一，蛇毒蛋白质中几乎半数以上是具有各种催化 活性的酶类。目前已经发现近4 0 种酶，许多酶已得到了分离和纯化。这些酶无论在 生物化学研究上，还是在临床应用等实践上，都具有重要意义【l ”。关于蛇毒中酶的 性质有不少报道，表1 1 【1 4 1 列举了一些酶的性质。下面分别加以介绍。 1 1 1 氧化还原酶 蛇毒中的氧化还原酶分为l ：氢基酸氢丝醒和乳酸隧氢酶两种。l ：氢垂醺氢丝酶 是催化l 一氨基酸脱氢的酶，其产物为相应的a 一酮酸。l 氨基酸氧化酶的分布十分广 泛，眼镜蛇科、蝰蛇科和响尾科蛇毒大部分都含有此酶。在尖吻蝮蛇毒的粗毒中也 发现含有该酶活性【1 5 】。n a k a n o 等1 6 1 和i n a m a s 等【t t l 对黄绿烙铁头( 7 = 加v o v f d b ) 蛇毒 进行了纯化，并研究了它们的理化性质。最早培养出l 氨基酸氧化酶晶体的是东部 曼型堂垫查盔兰堡圭堂焦丝壅兰二兰一一 表1 1 蛇毒中一些酶的性质 d f p ：二异丙基磷酸：p c m b ：对氟汞苯甲酯；b a e e ：苯甲酰l 精氨酸乙酯；t a m e ：苯甲磺 酰l - 精氨酸甲酯；p m s f ：苯甲基磺酰氟 4 中国科学技术大学博士学位论文第一章 菱斑响尾蛇( ca d a m a n t e u s ) t 鸲l 。蛇毒中的l 氨基酸氧化酶有许多共同的性质，如分 子量在6 00 0 0 140 0 0 ，多数含有f a d 辅基，例如从沙蝰( 矿a m m o a y t e s ) 和烙铁头口 肌l c r o $ q u a m a n u l 蛇毒中分离出来的l 氨基酸氧化酶 1 9 - 2 0 】。 塾酸膛氢匿最早由m c l e a n 等1 2 l 】报道，他们发现许多蛇毒可以催化乳酸变成酮 酸。吴祥堤等 2 2 】发现在眼镜王蛇( d p 舫咿 呼心h a n n a h ) 、尖吻蝮蛇口a c u t u s ) 和青环 海蛇( hc y a n o c i n t u s ) 蛇毒中也存在乳酸脱氢酶。 1 1 2 作用于磷酸酯的酶 蛇毒中至少含有四种作用于磷酸酯的酶：棱酸囱翅醒、熊酸三酯酶、 二燕萱酸 篮和韭挂显世望醢醒。这四种酶的分布均十分广泛，往往同时存在。它们在核酸结 构分析和基因工程上是不可缺少的工具酶。 不少蛇毒中都含有拯酸凼翅酶，如矛头蝮 a t r o x ) 、食鱼蝮口p i s c i v o r u s ) 、东 部菱斑响尾蛇( ca d a m a n t e u s ) 、黑颈眼镜蛇( n i g r i c o l l i s ) 等。从不同蛇毒中分离的 核酸内切酶的特异性不尽相同，有的能水解d n a ，有的能水解r n a ，有的两者均 能水解。 磷酸三壁醒已被广泛用于寡糖和多聚核苷酸顺序的测定。该酶以d n a 或r n a 为底物水解时从3 端开始逐一水解除去5 磷酸单核苷酸，因此也被称为蛇毒核酸外 切酶。磷酸二酯酶广泛存在于各科蛇毒中【2 3 】。在分离制备磷酸二酯酶的方法中， s i n s h e f i m e r 等【2 4 】所介绍的丙酮沉淀法较为成熟，适用于多种蛇毒，如c a d a m a n t e u s 2 5 1 ，p 劬p r aa s p i s 2 6 】等。我国涂光寿等 2 7 】也从浙江产蝮蛇毒中分离纯化了 达到国际商品标准的磷酸二酯酶。段志忠等【2 8 1 发现c a 2 + 和m 9 2 + 对浙江产蝮蛇中磷 酸二酯酶有激活作用。从角蝰( c e r a s t e sc e r a s t e s ) 蛇毒中分离的磷酸二酯酶没有蛋白 酶和5 t 核苷酸酶活性，e d t a 抑制其活性，加入c a 2 + 和m n 2 + 可以使其复活【2 9 】。 5 攘营酸醒可以特异地水解d n a 或r n a 5 一末端的磷酸。在所有的蛇毒中均发 现了该酶的活性，在响尾蛇和蝰蛇毒中的含量要高些。从n a j an a j a 蛇毒中分离 出来的5 核苷酸酶的最适p h6 5 7 0 ，酶的活性可被m 9 2 + 和m n 2 + 激活，被n i 2 + 和 z n 2 + 抑制，该酶对热敏感，对2 和3 核苷酸酶没有水解活性【3 0 】。o u y a n g 等从棕 点竹叶青口g r a m i n e u s ) 蛇毒中分离的5 一核苷酸酶对热较稳定，能水解a d p 和 a m p ，酶的活性可被e d t a 抑制，加入c a 2 + 和z n 2 + 可以使其复活。o u y a n g 等【3 2 1 从 尖吻蝮蛇a c u t u s ) 蛇毒中也纯化出一种5 一核苷酸酶。 四科蛇毒中都含有韭挂是蛙的璧酸堕酯酶，反应的最适p h 分别为5 0 和8 5 ， 分别被称为酸性磷酸单酯酶和碱性磷酸单酯酶。尖吻蝮蛇“a c u t u s ) 、眼镜王蛇( d h a n n a h ) 蛇毒中只含有碱性磷酸单酯酶，而属于四科毒蛇的许多蛇毒中同时含有两 种磷酸单酯酶。覃甲仁等【3 3 】从广西眼镜王蛇毒中分离提纯出碱性磷酸单酯酶 ( a k p ) ，该酶最适p h1 0 一1 0 4 ，m 9 2 + 为激活剂，m n 2 + 、c a 2 + 、z n 2 + 、n i 2 + 、e d t a 、 l 一半胱氨酸等对其活性有不同程度的抑制。蛇毒中的酸性磷酸单酯酶最适p h4 5 5 0 ，能被k f 和e d t a 抑制，但z n 2 + 不能抑制其活性。 1 1 3 作用于糖基化合物的酶 作用于糖基化合物的酶有透明厦酸酶、差旦王耋酶和丛旦：核董酶。蛇毒中的重 明厦酸酶是一种n 一乙酰己糖胺内切酶，能水解己糖胺的c l 和氧桥之间的键，主要 产物为四糖单位( g l c u a g l a - n a c ) 。y a n g 等 3 4 j 对6 种蛇毒中的透明质酸酶的活性进 行了测定，发现眼镜蛇舟山亚种( 胛咖n a j a ) 蛇毒中的透明质酸酶没有什么毒性。 眼镜蛇外里海亚种( 砒和n o x i a n a ) 蛇毒中的透明质酸酶也与毒性无关【3 ”。埃及眼镜 蛇f h a j e ) 毒中的透明质酸酶对热敏感，能被2 ，5 - 二羟基苯甲酸钠抑制1 3 ”。透明质 酸酶对热的稳定性相差很大，有些在室温下能保持数天活性不变性1 3 ”，而有些在4 0 c 时活性很快丧失。一般地说，透明质酸酶对动物没有直接毒性，但它能破坏结缔组 织，从而使其它毒性物质迅速进入体内，所以透明质酸酶有加强毒性的作用p “。 各种能够促凝的响尾蛇毒和不同种的矛头蝮蛇毒中都有水解肝素的酶，它能以 肝素为底物水解其中的糖苷键，这种酶被称为娄赶塞醛p 。 n a d 一撞萱酶能水解尼克酰胺n 核苷键，该酶广泛存在于各种哺乳动物组织 中，后来在蛇毒中也发现了这种酶的活性。b h a t t a c h a r y a 4 0 1 首先证实蛇毒中存在着一 种分解n a d 的酶。s u z u k i 等( 4 l 】对9 种亚洲蛇毒进行了测定，发现棕点竹叶青( r g r a m i n e u s ) 年l 银环蛇佃m u l t i c i n c t u s ) 蛇毒也有该酶活性。t a t s u k i 等1 4 列系统地研究了 3 7 种蛇毒中n a d 核萤酶活性，发现该酶的分布并不十分广泛，主要存在于 a g k i s t r o d o n 类蛇毒中。 中置科学技术大学博士学位论文第一章 y o s t 和a n d e r s o n 4 3 1 从b u n g a r u s f a s c i a t u s 蛇毒中分离出来的n a d 一核苷酶能催化 吡啶碱基的交换反应。n a d 核苷酶除了能水解n a d 等物质外，还具有催化a d p 核糖化和多聚a d p 核糖的作用。蛇毒n a d - 核苷酶能水解吡啶衍生物并能催化吡啶 碱基的取代反应m 1 ，这些特性是哺乳动物组织中的n a d 核营酶所不具有的。 1 1 4 蛋白水解酶 蛇毒中的蛋白水解酶通常作用于肽键，在蛇毒中该酶的含量丰富，主要有内肽 煎、地基和植氢酸醒酶等。 也a 琏主要分布在响尾蛇和蝰蛇毒中。内肽酶有一个共同特点是含有二价金属 离子，大多含有一个或两个c a 2 + ，也有一些含一个z n 2 + ，酶的活性可被e d t a 抑制。 a s s a k u r a 等【4 5 】从b o t h r o p sm o o j e n i 蛇毒中分离出的内肽酶p r o t e a s ea 对酸和热不稳 定，在e d t a 和l ，1 0 一菲哕啉存在时产生沉淀，c a 2 + 和m 9 2 + 可提高其活性，其它二 价金属离子则有抑制作用。k u r e c k i 等1 4 刮从东部菱斑响尾蛇毒中分离出内肽酶 p r o t e a s eb ，可以水解酪蛋白，其活性可被e d t a 抑制。s t r y d o m 等【4 7 1 从咝蝰毒中分 离出来的内肽酶，每摩尔蛋白约含有0 7 7 摩尔z n 2 + ，其活性可被1 ，1 0 菲哕啉抑制， 并已测出该酶的氨基端的部分顺序。a r a g o n o r t i z 等【4 8 1 从巴西矛头蝮( b o t h r o p sa s p e r ) 毒中分离出的金属内肽酶，称为p r o t e a s eg ，m g ”和c a 2 + 使其活性增强，e d t a 和 半胱氨酸对其活性也有强烈的抑制作用。与其它来源的内肽酶相比，p r o t e a s eg 含 有的酸性氨基酸较少。y a m a k a w a 等【49 】从眼镜王蛇毒中分离出的内肽酶，无出血活 性，用胰岛素b 链为底物可以测定其水解链的部位。 眼镜蛇和金环蛇( b u n g a r u sf a s c m t u s ) 毒含有e 盘壁，能迅速水解小肽l e u - g l y 和 l e u g l y g l y 。 擅氢酸醢醛能够水解精氨酸所形成的肽键或酯键，a 1 j o u f i 和b a i l e y l 5 0 1 报道了 多种蛇毒中精氨酸酯酶的活力。纤溶组份是一类作用于纤维蛋白原的精氨酸酯酶。 o u y a n g 等人【5 ”，首先发现尖吻蝮蛇毒有明显的纤溶活性，1 9 7 6 年他从台湾产 烙铁头( zm u c r o s q u a m a t u s ) 毒中纯化了这种组份 5 2 - 5 3 】。d a t t a 等5 4 1 从c r o t a l u s b a s i l i s c u sb a s i l i s c u s 蛇毒中分离得到了一种纤溶酶( b a s i l a s e ) ，其分子量为2 20 0 0 ， 1 m o l 蛋白中含l m o l 锌和2 m o l 钙，是一单链结构的锌金属蛋白酶，不具有出血活性， 其n 端为环化的谷丙氨酸残基。o o m i s r u t h 掣5 5 1 从尖吻蝮蛇蛇毒中亦提纯得到了 纤溶组份。t o s b i a i d 等【5 6 】从西部菱斑响尾蛇毒中纯化的f p 虽然也能水解纤维蛋白原 的a 和b 链，但与人类凝血酶不同，它不能引起纤维蛋白原的凝聚，这说明它水解0 【 和6 链的部位与人类凝血酶不同。 国内涂光寿【5 7 】和舒雨雁等【5 8 l 从浙江产蝮蛇毒中纯化了这个组份。管锦霞等【5 9 1 研究了我国常见的八种蛇毒对纤维蛋白原的作用，认为蝮蛇和眼镜蛇的蛇毒中的纤 溶组份有类胞浆素作用，而其余蛇毒中的纤溶组份起类活化索样作用。叶智彰等【6 0 i 也对浙江产蝮蛇蛇毒纤溶组份作了类似的研究。阮长耿等1 6 l j 也从浙江产蝮蛇蛇毒中 得到了纤溶组份，发现其对纤维蛋白原的水解是谢- p 链哼y 链的连续水解过程。 精氨酸酯酶的活性是防治血栓病、心肌梗塞及抑制癌等所必需的，对纤溶组份的研 究具有极高的医学价值。现在己从不同科属的至少1 5 种蛇毒中获得了2 0 种以上的 纯化纤溶酶。纤溶酶作为溶栓剂的潜在用途已在许多领域被研究和开发。 1 1 5 作用于羧酯键的酶 蛇毒中含有水解羧酯键的酶类，这类酶中最重要且研究最深入的就是磋脂堕。 磷脂酶a 2 ( p l a 2 ) 能专一催化3 一s n - 甘油磷脂的第二位脂酰键的水解反应，生成1 - 酰 基溶血磷脂和脂肪酸【6 2 1 。蛇毒中往往含有多种p l a 2 的同功酶，p l a 2 的这种多样性 可能在捕食时通过p l a 2 相互之间或者与其它的蛇毒蛋白质共同起到补体或协同作 用。 蛇毒中主要含磷脂酶a 2 ，极少数蛇毒中含磷脂酶b 。由于其易于被分离纯化， 故而得到了广泛深入的研究 6 3 6 4 】。p l a