（微生物学专业论文）产表面活性剂菌株的筛选及其特性研究.pdf

摘要 随着石油工业飞速发展，石油的年消耗量逐年增加。同时造成的环境污染现象也随之增加 开展石油污染物的生物降解研究具有重要的理论意义和实践价值。生物表面活性剂具有较好的表 面活性、结构多样性和生物可降解性等优点，在生物修复过程中具有广阔的应用前景。 本实验从大庆油田井出水样品中分离筛选得到4 株产表面活性剂菌株，初步鉴定为芽孢杆菌 对能力最强的菌株w i1 2 产表面活性剂的条件进行了优化，确定最佳碳源为3 麦芽糖，最佳氮 源为0 1 5 的硫酸铵+ 硝酸钠( 1 ：2 ) 混合氮源，培养温度为3 7 ，装液量为1 0 0 m l 5 0 0 a l l ，p h 值为7 0 ，接种量为1 0 。对w 1 1 2 产生的表面活性剂的稳定性进行了研究，发现其具有良好的 温度、p h 和盐稳定性，具有淆在的应用价值。通过红外光谱和t l c 分析，初步确定w 1 1 2 产生 的表面活性剂为一种脂肽类物质。本研究同时从大庆油田油水混合样品中通过失重法和薄层色谱 法筛选得到1 2 株石油降解菌株( 包括1 1 株细菌和1 株放线菌) ，其中7d 对原油的降解率达到 4 0 以上的有4 株( d q l ，d q 3 、d q 6 、d q ( 6 ) ) 。进一步研究发现这4 株对石油的4 种组分( 饱 和烃、芳香烃，沥青质和非烃) 具有不同降解能力，其中d q 6 对4 种组分均具有较强的降解能 力，而d q i 、d q 3 对非烃和沥青质的降解尤为明显，d q ( 6 ) 对饱和烃的降孵比较突出w 1 1 2 产 生的生物表面活性剂对d q 6 的饱和烃和芳烃降解具有促进作用，而对非烃和沥青质的降解无明 显作用。 关键词：石油，生物表面活性剂，条件优化，脂肽 a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fp e t r o l e u mi n d u s t r y , m o r eh a z a r d o u sh y d r o c a r b o nw a s t eh a db e e n g e n e r a t e d b i o s u r f a e t a n t , w h i c hh a dh i g hs u r f a c ea c t i v i t y ，s 订1 l c n j r “d i v e r s i t y , b i o d e 鼬廿o na n ds oo n , p l a y e da l li m p o r t a n tr o l ei nb i o r a m e d i a t i o n i nt h i ss t u d y , 4s t r a i n sb i o s u r f a c t a n t - p r o d u c i n gw e r ei s o l a t e df r o mt h ew a t e rs a m p l e so fo i lf i e l d d a q 矾g a l lo ft h e mw 日ei d e n t i f i e dt o b a c i l l u ss p ，i nw h i c hw 11 2h a dt h eb e s ta b i l i t yo f b i o s u r f a e t a n t - p r o d u c i n g t h ef e r m e n t a t i o ns u p c r n a t a n to fw i 1 2r e v e a l e dh i 曲s u r f a c ea c t i v i t ya n dt h e b i o s u r f a c t a n ts h o w e dh i 曲s t a b i l i t ya g a i n s th e a t ，p ha n ds a l i n i t y t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f b i o s u r f a c t a n t - p r o d u c i n gw e r ed e t e r m i n e d a s3 m a l t o s ea sc a r b o ns u b s t r a t e , 01 5 m i x t u r eo f ( n h 4 ) s o , i + n a n 0 3 ( 1 ：2 ) a sn i t r o g e ns u b s t r a t e ，t e m p e r a t u r e3 7 ，1 0 0m lm e d i u mi n5 0 0m lt o t a l v o l u m e ，p h7 0a n d1 0 i n o e u l u m s t h eb i o s u r f a c t a n tw a so b t a i n e db y a c i dp r e c i p i t a t i o na n dc h e m i c a l e x t r a c t i o nm e t h o d 取a n dt l ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eb i o s u r f a c t a n tc o n t a i n e dp e p t i d eb o n da n df a t t y a c i db o n d ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h eb i o s u r f a c t a n tw a sl i p o p e p t i d e 1 2s t r a i n sp e t r o l e u md e g r a d e d b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mo i l w a t e rm i x t u r es a m p l e sb yw e i g h t - l o s sm c t h e da n dt h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y m e t h o d ，4 0 f t h e m ( o q l ，d q 3 ，d q 6 a n d d q ( 6 ) ) c o u l d d e g r a d e m o r n t h a n 4 0 i n 7d ， a n dh a dd i f f e r e n ta b i l i t yt od e g r a d ef o u rc o m p o s i t i o n so f p e t r o l e u m ( a l k a n e ，a r o m a t i c ，n o n - h y & o c a r b o n a n da s p l m l t e n e ) d q 6c o u l dd e g r a d ea l lf o u rc o m p o s i t i o n sr e m a r k a b l y , d q ia n dd q 3c o u l dd e g r a d e n o n - h y d r o c a r b o na n da s p h a l t e n es i g n i f i c a n t l y , a n dd q ( 6 ) c o u l dd e g r a d e da l k a n er e m a r k a b l y t h e b i o s u r f a c t a n tp r o d u c e db yw l1 2c o u l dp r o m o t et h eb i e d e g r a d a t i o no fa l k a n ea n da r o m a t i cb yd q 6 ， w h i l eh a dn os i g n i f i c a n te f f e c to nt h eb i o d e g r a d a f i o no f a s p h a h e u e k e yw o r d s ：p e t r o l e m n ，b i o s u r f a c t a n t ，c o n d i t i o n so p t i m i z a t i o n ，l i p o p e p t i d e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢关争 帆z 咖年s 肺日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 虢黑q 慨 2 啷邮 导师签名 袁场 时问：2 0 0 7 年6 月1 5 日 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 石油污染及治理现状 1 1 1 1 石油污染现状 第一章绪论 石油是一种天然复杂的烃类混合物，由数百种化学性质不同的物质组成，主要包括饱和烃( 正 链烷烃、支链烷烃和环烷烃) 、芳香烃( 单环、双环和多环芳烃以及带有烷基侧链和融合的环烷 烃) 、沥青质( 环烷酸、硫化物、多元酚、脂肪酸的复合物) 和非烃类( 由嘧啶，喹啉、咔唑， 噻吩、亚礁，氨基化合物组成的复合体) 石油是一种重要的能源物质，对世界各国的经济发展 起到至关重要的作用，但是，自9 , 2 0 世纪初石油开始大规模开采以来，随着石油工业飞速发展， 石油的年消耗量逐年增加，同时造成的环境污染现象也随之增加到目前为止，世界每年石油总 产量约为2 2 亿吨，其中8 0 0 万吨由于天然渗出和石油的生产、转运和储存过程中的泄露等不同途 径进入土壤、地下水、河流和海洋中自1 9 7 8 年以来，我国开发的油气田和油气藏已确- 4 0 0 多个， 统计报告显示，1 9 9 8 年各石油、炼化企业工业固体废物产量为4 2 8 9 8 万吨，利用率低于5 0 ，t 业固体废物捧放量为1 5 6 l 万吨：工业固体废弃物累计堆存量1 8 8 4 5 万吨，占地面积1 8 1 7 0 0 0 m s ， 其中年产石油污染物近l o 万吨，累计堆放量近5 0 万吨( 贾建丽，2 0 0 5 ) 此外在城市中，通过废 物倾倒和垃圾填埋，露天燃烧( 垃圾、轮胎、塑料等) 和焚化，烟草燃烧和汽车尾气给大气和淡 水系统也造成了不同程度的污染。从1 9 6 7 年利比亚籍油轮“托雷坎尼荣”号在英国的锡利群岛 和地角之间的公海沉没导致9 1 9 万吨原油污染( 石油污染，2 0 0 3 ) ，n 1 9 9 1 年的海湾战争使科威 特7 0 0 多口油井遭到破坏，造成1 0 0 0 0 0 0m s 的原油泄漏，使约7 7 0k m 的阿拉伯海湾西海岸线和5 0 l a n 2 的科威特沙漠受到原油污染( 熊汉辉等，2 0 0 5 ) ，再到2 0 0 5 年中石油吉林石化公司的爆炸事 件给松花江流域造成的重大污染和胜利油田给山东省东营市造成的油泥污染种种事件说明，石 油在给全世界带来经济飞速发展的同时也造成了严重的生态破坏和环境污染。 石油污染就是指在石油的开采、炼制、贮运，使用过程中，原油和各种石油制品进入环境而 造成的污染( 石油污染。2 0 0 3 ) 目前石油污染主要集中于海洋、土壤和地下水三个方面。石油 可造成污染，是因为石油本身的各种成分不仅具有直接的生物毒性，而且还可以造成严重的生态 系统混乱。海水和淡水表面上的石油膜层会阻止大气中的氧的进入，妨碍浮游生物的光合作用， 减少氧的产生。石油膜的生物分解和自身的氧化作用，消耗水中大量的溶解氧，致使水中缺氧形 成厌氧状态。土壤中石油烃的降解产生了许多毒性的有机物质并且消耗了土壤中的氧，会导致植 物根系中毒或缺氧，土壤的严重污染会影响土壤的通透性，降低土壤质量，阻碍植物根系的呼吸 与营养吸收，引起根系腐烂，影响农作物的根系生长；石油富含的反应基能与无机氮、磷结合并 限制硝化作用和脱磷酸作用从而使土壤有效磷、氮含量减少，影响作物的营养吸收。石油烃中 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 不易被土壤吸附的部分能渗入地下并污染地下水( 叶为民等，2 0 0 2 ；陆光华等，2 0 0 3 ) 。世界上 约1 的地下水受到了石油的污染。我国部分石油化工区，土壤石油污染导致的地下水水质恶化问 题突出，局部地区地下水中油含量高达2 0 - - 3 0m g , l ，苯含量高达2 0 - 5 0m g l ，对当地工农业造 成严重的危害( 陆秀君等，2 0 0 3 ) 。一些石油烃类进入动物体内后，对哺乳类动物及人类有致癌， 致畸、致突变的作用。石油烃的某些成分，例如苯系物和多环芳烃，可以在稂食中积累，影响粮 食的品质，并通过食物链，危害人类健康。石油污染已经给我们带来了不同程度的问题，石油及 其产物污染的环境治理任务日益紧迫。 1 1 1 2 石油污染治理现状 早在2 0 世纪8 0 年代以前，欧美等国率先对石油污染的治理进行了研究，8 0 年代中后期，石油 污染的修复逐步成为了国内环境保护研究的新热点。现有的石油污染的处理方法包括物理修复、 化学修复和生物修复等( 李凯峰等，2 0 0 2 ；陆光华等，2 0 0 3 ) 。首先，利用物理方法和机械装置 消除环境中的带油污染物的方法称为物理法。其中热处理法是应用最为普遍的物理方法，它是通 过焚烧或煅烧净化土壤和海洋中大部分含油污染物，但同时亦破坏土壤结构和组分，增加海洋大 气的污染程度，且价格昂贵、难于实施。除了热处理法，物理方法还包括隔离法以及针对土壤污 染修复的换土法等：其次，利用化学试剂的化学浸出、萃取等一些化学方法可以较好的除油，但 化学试剂造成的二次污染问题限制了其应用。8 0 年代后期，由于具有处理费用低、处理效果好、 对环境影响低、无二次污染、不破坏植物生长所需要的土壤环境等优点，生物降解技术已逐步成 为生态环境保护领域最有价值和最具生命力的生物处理技术( 陆秀君等，2 0 0 3 ) 生物降解是指 利用特定生物( 植物、微生物或原生动物) 吸收、转化、清除或降解环境中的复杂污染物，实现 环境净化，生态效应恢复的生物措施。其中的微生物降解技术已经成为了重要的治理技术，它利 用环境中的土著微生物或向污染环境补充经驯化的微生物，加速分解污染物，修复被污染环境。 主要包括投菌法，生物培养法，生物通气法，预制床法，生物反应器等。一些微生物可以直接或 间接利用石油烃类物质进行自身的生长代谢，在其生长繁殖过程中产生诸如溶剂，酸类、气体、 表面活性剂和生物聚合物等有效化合物利于其他的微生物进一步氧化分解石油烃成为小分子物 质而达到降解的目的( 王红旗等，2 0 0 6 ) 。微生物降解石油污染物的效率同时受到两种重要因素 的影响。第一是石油烃类物质的结构。一般来说，微生物对烃类韵氧化是从结构筒单，低分子量 物质到结构复杂，高分子量物质逐级进行的。第二是环境条件，包括温度、氧气、p h 以及营养因 素等。温度可以影响石油的物理状态、化学组成、微生物代谢烃的速率及微生物菌群的组成，从 而对石油生物降解产生影响。温度低时，石油黏度升高，溶解度下降，扩散减少，对微生物毒性 增加，从而延迟生物降解的启动：温度高时，石油的溶解性，流动性增加，与微生物的接触面积 增大，增加微生物的代谢速率。微生物在3 0 4 0 之间对石油烃的降解有较好的效果。石油 烃类物质的降解通常在好氧情况下的降解速率比在厌氧条件下快，细菌等微生物在降解烃类的起 始步骤通常是加氧酶氧化底物这一过程需要分子氧的参与。环境中营养物质有限尤其是对微 生物降解石油烃有利的氮和磷，这也在不同程度上限制了石油污染物的降解，一定量的氮素和磷 素的补充可以提高降解效率。此外，p h 接近中性时，有利于大部分微生物对石油烃的降解，石油 烃具有低溶解性和低流动性的特点。所以微生物细胞对烃类的摄取成为降解过程中的关键环节 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 2 生物表面活性剂 目前，微生物细胞摄取石油烃存在三种模式：( 1 ) 微生物细胞摄取溶解在水相中的烃类； ( 2 ) 微生物细胞与比其大得多的烃类颗粒直接接触而进行摄取；( 3 ) 微生物细胞与比其小得多 的假溶、拟溶或被包裹的烃类颗粒作用，进而进行摄取由于表面活性剂可以显著改变油水界面 特征，具有增加石油烃的流动性和溶解度，促进烃类物质出现假溶、拟溶和乳化现象，增加微生 物与烃类颗粒接触面积，提高石油烃类物质的利用率等特性，已经成为微生物降解中广泛应用的 化合物之一，目前，应用的表面活性剂主要分为化学表面活性剂和生物表面活性剂。化学表面活 性剂作为添加剂加入到石油污染环境中，由于它是以石油为原料通过化学法合成而来，在使用中 会造成严重的二次污染问题，所以，生物表面活性剂正日益取代化学合成的表面活性剂应用到石 油污染环境的治理技术中。 生物表面活性剂( b i o s u r f a c t a n t ) 是细菌、真菌和酵母在一定条件下( 合适的碳源、氮源、 p h 及温度) ，在其生长代谢过程中分泌出的具有表面活性的代谢产物，它是集亲水基和疏水基于 一身的两亲化合物。具有与化学表面活性剂不同的优点：( 1 ) 具有较好的表面活性和界面优先 分配能力，可以显著改变气一渡、液一液以及固一液界面特征，使界面张力降低；( 2 ) 具有结构多 样性； ( 3 ) 生物可降解性及对环境温和性； ( 4 ) 较高的热及p h 稳定性； ( 5 ) 增加非水溶性物 质的水溶能力；( 6 ) 增加脂类物质的生物利用率；( 7 ) 调节微生物吸附能力等。表面活性剂的 效能是通过其浓度对表面张力的影响显示出来的，可以由较低浓度形成较高的表面活性 1 1 2 1 组成及种类 ， 生物表面活性剂亲水基团可分为离子型和非离子型，包括糖脂中的糖基、磷脂中含磷部分， 中性脂的酯或醇功能团以及脂肪酸或氨基酸的羧基等，而疏水基团往往是饱和，不饱和或羟基取 代的脂肪酸( 长链脂肪酸或是一个旷烷基，b - 羟基脂肪酸) 与化学表面活性剂根据其活性基团的差异来分类不同，生物表面活性剂主要根据它们的化学 组成和生物来源( 如表1 1 ) 进行分类。从化学组成来分。主要分为糖脂、脂肽类和脂氨酸、磷脂 和脂肪酸聚合表面活性剂和中性脂五大类( p c y p o u xe l4 j ，1 9 9 9 ) ： 表卜1 ；重要的微生物来源的表面活性荆的种类厦产生菌( j i l 翱由ada 1 。1 9 9 7 ) t a b l ei - i ：m i c r o b i a ls o u r c eo f i m p o r t a n tt y p e so f m i c r o b i a ls u r f a c t a n t s b i o s u r f a c t a n t o 喀i m m 糖脂类( g l y c o l i p i d s ) 鼠李糖脂( r h a m n o l i p i d s ) 海藻糖脂( t r e h a l o l i p i d s l p s e u d o m o n a ss p r e r y t h r o p o l i s m e r y t h m p o l 曲 m y c o b a c t e r i u ms p 土曼奎些盔兰鎏圭茎堡篓耋，。，。，。，。暑，。，。，。，。耋：! 坠 呈! 竺皇竺竺旦婴竺l 一 槐稽脂( s o p i o r o l i p i d $ ) zb o m b i c o l a za p i c o l a z p e t m p h i l u m 纤维二糖膳( c e l l o b i o l i p i & ) 脂肚类( l i p o p e p f i d e s a n d l i p o p r 鲥n s ) 肽脂f p e p t i d e - l i p i d ) 沙雷维婷( s e r r a w e t t i n ) 粘液菌素( v i s c o s i n ) 莎梵婷( s u r f a a i n ) 枯草轩蓖豪( s u b t 1 i s l x l ) 短杆菌肽( g r a m i c i d i n s ) 多桔菌素( p o l y m y x i n s ) 脂肪酸中性脂和磷脂类 ( f a t t ya c i d s n e u t r a ll i p l d sa n dp h o s p h o l i p i d s ) 脂肪酸( f a t t ya c i d s ) 中性脂( n e u n ll i p i d s ) 磷骀o 劝o l 硒蠡) 多聚物类( f o l y m e r i es u r f a c t a n 砷 多糖脂( f a n u l s a n ) 生物分散剂( b i o d i s p e r s a n ) 甘露聚糖脂蛋白( m 趴n 舢l i p i 小p 1 d 暖n ) 甲壳素( l i p o s a n ) 碳水化合物蛋白脂 ( c 缸脚d r 毗。1p f l 晡n 4 i p l d ) 蛋白p a ( p r o t e i n p 舢 特殊生物表面活性剂( p a r t i c u l a t e s u r f a c m n o u z c a e , um a y d i s 且l i c h e n 咖r m i $ m a r c e s c e n s r f l u o r c e m 且s u b t i l i s b s u b t i l i s 且b m v i s b p o l y m y x a c l e p u s e r y t h o p o l i s zt h i o o x i d a m s a e a l e o a c e h c u s a c a l c o a c e t i c u s ct r o p i c a l i a c l i p o l y t i c a p f l u o r e s e e n s d v o t y , , v h u pa e r u g i n o s a 囊泡和苗毛陋i c l 岱a n df i m b d a e ) 一地瑚硎缸蜉 1 蝴再( w 丽h o l ec 再e l l s ) 丽磊瓦蒹磊丽磊丽磊丽v a r i e t y 轰o f 鼬b a c t e 二r i a 磊赢脂( 1 ) 糖脂类：大部分己知的生物表面活性剂都属于糖腊类，兵特点是由二疆柏化刘硪修饰州艏 肪酸上构成的一类表面活性物质，常见的糖脂类表面活性剂有鼠李糖脂，海藻稽脂和槐糖脂，其 结构如图1 - 1o 4 旧 鼠李糖脂 棚 海藻糖脂 母 槐糖脂 中田农业大学硕士学位论文 第一章绪论 田1 1 几种常见的糖脂类生物表面活性剂；( a ) 由铜绿假单胞菌产生的李糖庸，两个曩李糖亚基连接两个口一 羟基脂肪酸侧链；( b ) 由红平红球菌产生的海藻糖魔，海藻二糖连接两个长链a 噍基一口一羟基鹰肪酸；( c ) 由球拟酵母产生的槐糖魔，槐糖= 聚体连接个长链( c i s ) 羟基脂肪酸 f i f 1 - is 帅c i 呲o f s d n ec o m m o n y c o l i p i db i o a r f a c 呲( a ) m m m n o i p i dt y p elf r o mp 3 棚d o m o n o a 棚们喀i 榭i n w h i c h t w or h 越n n o s e s u b u n i t s 玳l i n k e d t o t w o 争h y 幻x y d e 鼬l 。i ca c i 出i n 4s i d e c h a i n ( b ) t r e h e l m e d 蛐y c o l 8 姆f r o m r h o d o c o c c 址e r y t h r o p o r s , i nw h i c hd i s a c c h m d et r d l a l o s ei 摹l i n k e dt ot w ol o n g - c h a i n * b r m 西e d - 脚y 击慨yf a t t ya c i d ( c ) s o p h o m l i p i d 蛔nt o r u l o p 曲幻柚洳缸i nw h i c hd i m e t i c 舯曲o r o i sl i n k e dt oal o n g - c h a i n ( c l s ) h y d x o x yf a t t y a c i d ( j i t e l a d r ae ta l ，1 9 9 7 ) ( 2 ) 脂肽和脂氨酸类：此类表面活性剂由短肽基团和脂肪酸组成目前，由枯草芽胞杆菌产生 的一种环脂肽类生物表面活性帮一莎梵婷( s u r f a c t i u ) 一是活性最强的一种生物表面活性剂，含 0 0 0 5 的莎梵婷可使o ，lm o l l 的碳酸氢钠溶液的表面张力从7 2m n m - f 降至4 2 7 9m n l m ，其组成 与其它芽胞杆菌生产的环状寡肽抗生素非常相似，莎梵婷结构如图1 - 2 ； l - a s p d - l e u l - l e u 一0 心 h e ( c h 2 ，。c h 卜v a l c i h 2占h a za i d l e u l - h m l g l u c = 0 图l - 2 由枯草芽胞杆菌产生的环腊肚类表面活性剂一莎蹩婷( s u r f a c t i n ) f i g r l - 2s t t u a u m o f c y c l i c l i p o p e p f i d es u r f a c t i n l a x ，d u c c d b y b a c i l l u s s u b t i l i s ( j i t e n d r a e ta 1 1 9 9 7 ) ( 3 ) 脂肪酸、磷脂和中性脂类：一些细菌和酵母在以烷烃为唯一碳源的培养基中生长时可以产 生大量的此类表面活性剂，其中磷脂作为生物结构物质广泛分布在动物的脏器、神经、植物种子 和微生物中，特别是构成细胞膜的磷腊的生理活性，引起了普遍的重视，磷脂类活性剂的结构如 图1 - 3 ： h 2 c h c h 2 c o o o o 1 c o - c o - p o r ， r 2 o c h z c h 2 挝h 3 图l - 3 磷脂酰乙醇胺的结构，由不动杆菌产生的一种潜在生物表面活性剂r l 和r 2 为脂肪酸的烃链 f i g 1 - 3s t r u c t u r e0 fp | i 伪p l i 撕d y i d l l a i d 枷n c ，a p o t e n t b i w t p f o d u c e d b y a c i n e t o b a c t e r s p r ia n d l l 2 辩 h y d r o c a r b o nc h a i n s o f f a t t y a c i d s ( j i t m d r a e t 柏，1 9 9 7 ) ( 4 ) 其他类型的生物表面活性剂：包括多聚体、中性肽等。目前研究最好的多聚体，包括多糖 脂( e m u l s a n ) 、甲壳素( 1 i p o s a n ) 、单蛋白和多聚蛋白等。在0 0 0 1 - 4 ) 0 1 的浓度下，多糖脂会 产生有效的乳化作用此外，细胞外的膜小泡也能起到表面活性剂的作用，能有效地分割烃类物 质形成微乳化液，促进烃类物质与细胞的接触。 5 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 2 2 生物表面活性剂的应用 与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂的结构多样性为其应用提供更广泛的范围。生 物表面活性剂的应用起始于采油及其相关行业，逐步在医药、化妆品、食品、环境工程、煤炭、 纺织、造纸、铀加工和陶瓷加工等行业中得至应用。 目前，生物表面活性剂在石油工业上应用最多。微生物采油技术( m i c r o b i a l e n h a n c , e d r e c o v e r y o i l ) 是生物表面活性剂最为重要的应用领域，在油井中注入微生物及其生长所必须的营养物质， 微生物在生长的同时，可以产生生物表面活性剂，这些生物表面活性剂能够降低原油和水两相界 面的张力，增加原油的流动性此外，微生物不但可以沿注水压差方向迁移，还可以向油层纵深 迁移，大大增加了水驱和化学驱的效率提高原油的开采量。除了提高采油技术，生物表面活性 剂还应用于石油管道及储油设备的清淤，原油的降粘等。 由于具有良好的热及化学稳定性，生物表面活性剂可以广泛的应用于石油污染土壤和海洋的 生物修复等环境治理技术中。稠油中含有烷烃、芳烃，有机酸和石油胶质，高碳链和芳香类物质 比例较高，以及石油烃的憎水性及其容易被环境中大颗粒吸附的特性，这些都成为其难于达到彻 底生物降解目的的主要原因( 马文漪。1 9 9 8 ) 。生物表面活性剂能够使污染物分散、增溶、乳化， 进而提高生物可利用性，促使污染物的生物降解。k o s a r i c 等人( 1 9 9 3 ) 发现生物表面活性剂能 促进烷烃类拟溶作用并被动扩散进入细胞，从而被降解。当微生物生长缓慢( 温度过低和污染物 浓度过高) 或污染物中含有难降解成份时，可以考虑加入生物表面活性剂。作为一种添加剂，生 物表面活性剂可以强化生物修复这一过程，它能将烃类物质乳化，进而促进其降解。不溶或不易 溶污染物的分散与增溶是生物修复的重要步骤，生物表面活性剂能够将石油从颗粒物上解吸下来 或使其分散成小颗粒以便微生物利用。r a t l e d g e 等( 1 9 8 8 ) 研究生物表面活性剂在石油烃摄取中 的作用总结出石油烃通过与生物表面活性剂结合而与微生物接触，通过两亲分子通道进入微生物 细胞，成为合成生物表面活性剂的前体物质。石油烃可能在生物表面活性剂的作用下出现一种拟 溶现象，增加了石油烃与微生物的接触面积，为微生物快速摄取提供了良好的条件( k o s a r i c “a ， 1 9 9 3 ) 。微生物细胞分泌生物表面活性剂并存在于细胞表面，形成疏水表面，有利于油滴在液相 中的分散并增加两相之间的界面面积( 马文漪，1 9 9 8 ) 。铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) u g 2 产生的鼠李糖脂可以提高从土壤中去除芳香烃污染物的效率( s c h e i b e n b o g e ne t a l ，1 9 9 4 ) 。 效果优于十二烷基硫酸钠，它产生豹糖脂类表面活性荆可以明显增加三环芳烃的东溶性，进而提 高其的生物利用性。k j l b a n e 也指出，多环芳烃之所以难降解是因为被吸附在土壤颗粒上，一旦 用特定的表面活性剂溶剂洗脱下来，多环芳烃在1 4d 的降解率可从1 0 上升至9 0 。综上所述， 生物表面活性剂可以有效地将油从颗粒缝隙中解吸出来，有利于改善油一水一微生物细胞界面的 接触行为，加快了微生物细胞对油类底物的利用速度，促进微生物对石油的利用，从而达到一个较 好的降解效果。 目前，应用生物表面活性剂进行石油污染物的生物修复主要从三个方面入手，第一个方面， 投加已纯化的生物表面活性剂，或以一定浓度的生物表面活性剂溶液和石油降解菌配合共同作用 于石油污染环境。b m s s c a u 等( 1 9 9 9 ) 使用鼠李糖脂形成稳定的油水混合物，促进5 0 0m g l 浓度 的石油污染物从污染土壤中移出7 8 。z h a n g 等( z h a n ge t 以，1 9 9 4 ；7 m a n g “a 1 ，1 9 9 5 ) 发现鼠 李糖脂对十六烷烃和十八烷烃的降解都有明显的促进作用。加入生物表面活性剂能够明显的增强 6 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 憎水化合物的亲水性和生物的可利用性，增大烃类物质的比表面积，提高污染环境中微生物的数 量，继而提高石油烃的降解速度，而且降解速度的提高往往优于单独加入某种营养成分时产生的 作用同化学表面活性剂相比。生物表面活性剂对提高烃类的生物利用率方面更加有效；第二方 面，现场接种微生物产生生物表面活性剂，与石油降解菌株相互作用共同实现对石油污染物的降 解i v s h i n a ( 1 9 9 8 ) 和p a r k ( 1 9 9 8 ) 分别利用从红球菌( r h o d o c o c c u s 难) 和红平诺卡氏菌( n o c a r d l a e r y t h r o p o l l a ) 中产生的生物表面活性剂来促进石油降解菌株对污染物的降解，从沙地中降解几乎 1 0 0 的石油污染物随着现代基因工程的发展，克隆产表面活性荆的基因使其在工程菌种高效表 达，通过投加这种基因工程菌产生大量表面活性剂，从而促进石油烃的降解但是，基因工程菌 的实际应用价值还受环境条件的限制；第三方面，为了解决基因工程菌株不具有广泛的环境适应 性的问题，还可利用环境中已存在的土著微生物进行石油污染物的降解，添加微生物生长所需要 的营养物质、氧气等，促进土著微生物中产表面活性剂菌株产生表面活性物质，与环境中的土著 石油降解菌共同配合对环境进行修复r o s a 等人( 2 0 0 7 ) 通过向石油污染的土壤中投放肥料来刺 激本源微生物的生长，进而促进菌株对石油污染物的降解，实验还进一步证明投放水溶性肥料比 油溶性肥料更能刺激微生物的生长，同时在本源微生物群落中，革兰氏阳性细菌比阴性细菌生长 要好，主要因为其细胞壁的结构比较稳定，适合石油污染地区的极端环境s o n g 等( 1 9 9 0 ) 在实 验室条件下，通过施加n 、p 和k 等永溶性肥料很好的刺激了微生物对石油的降解a l - a w a d l a i 等 ( 2 0 0 5 ) 等在科威特石油污染沙漠中进行实地生物修复时，通过投加营养或供氧来刺激土著微生 物的生长以产生大量的生物表面活性剂，同时促进了石油烃的降解。在海洋石油污染修复中，生 物表面活性剂可以有效地将石油分散成液滴，形成稳定的乳化液，出现石油小颗粒的拟溶现象， 增加石油颗粒与微生物细胞的接触面积，提高生物利用率，促进石油污染海洋的生物修复。另外， 生物表面活性剂对重金属的微生物吸附作用有相当显著的促进作用。 在食品工业中生物表面活性剂因其无毒的特性可作为食品添加剂、乳化剂、风味剂等产朊 假丝酵母( c a n d i d av a n s ) 产生的新生物乳化剂已应用于色拉调味上，它还是食品补充物的重要成 分，提供人体所需的矿物质和纤维素；在造纸工业中，生物表面活性剂可用作制浆造纸废水的絮 凝剂、废水脱色、固体悬浮物的去除、污泥的沉降等。在生物医疗中，枯草杆菌素是最早发现具 有抗菌活性的生物表面活性剂之一，它是由枯草芽胞杆菌( b a c i l l u ss u b 鼬) 产生的抗菌性腊肽， 可以显著增强生物分子液膜的电导率。抑制病原体和葡萄球菌。生物表面活性剂还具有抑制细菌 在固体表面和感染部位黏合的作用。由于生物表面活性剂具有良好的免疫特性，它还可以作为合 适的佐剂参加免疫反应中 此外，生物表面活性剂还能用于杀菌剂效果的监测，发酵工业中细胞数量全程监控，土壤改 良，以及杀虫剂和高效细胞破碎和快速检测微生物数量等方面。 1 2 研究现状 1 2 1 高效菌株的筛选和培育 7 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 微生物修复是环境石油污染物治理中最具潜力的方式，生物表面活性剂在其中所起的作用也 越来越大所以高效降解菌株和高效产表面活性剂菌株的筛选显得十分重要，它是微生物修复的 前提和基础菌株筛选所涉及的因素非常复杂，例如筛选条件、实验室分离高效菌株是否是环境 中优势种群、生物修复中不同微生物的配伍，以及分离得到的高效菌株的稳定性及其可靠的保存 方法等，这些都是影响微生物修复最终成败的关键因素。 一般来说，石油降解菌大多具有产生表面活性剂的能力( p e y l ) o u xe l a l ，1 9 9 9 ) ，迄今为止， 已经发现能够降解石油的微生物有2 0 0 多种，其中细菌有假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) ( d a s e l a ， 2 0 0 7 ) 、棒杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) ( z a j i ce t a l ，1 9 7 7 ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u ss p ) ( b e v i n a k a t t i e ta 1 ，1 9 9 3 ) 、产碱杆菌属( a l c a l i g e n e ss p ) ( m o i l e re la l 。1 9 9 3 ) 等，真菌有海洋中担子菌属 ( b a s i d i o m y c o t i n as p ) ( 0 u d r o z e l a ，1 9 9 0 ) 、假丝酵母属( c a n d i d as 口) ( r u s y ne t a l ，2 0 0 3 ) 和红酵母属( r h o d o t o n d as p ) ( k a t a y a m a h i r a y a m ae l a l ，1 9 9 4 ) ，其中，假单胞菌属l a s e u d o m o n a s s p ) ( j a r v i se l 以。1 9 4 9 ) ，假丝酵母属( c a n d i d as p ) ( k a p p e l ie 口f ，1 9 8 4 ) ，等都是产生表面 活性剂的主要菌属，除此之外，能产生表面活性剂的苗属还包括分枝杆菌属( m y c o b a c t e r i u m 舡) ( c o o p e r e l a l ，1 9 8 9 ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p ) ( a r i r n ae l 以，1 9 6 8 ) 、节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) ( r o s e n b e r g e t a l ，1 9 7 9 ) 、硫杆菌属( t h i o b a c i l l u ss p ) ( b e e b ae t a l ，1 9 7 1 ) 和土壤杆菌 属( a g r o b a c t e r i u ms p ) ( t a h a r a 群a ，1 9 7 6 ) 。目前，分离筛选高效菌株一般由以下几个步骤 组成：( 1 ) 采样：研究表明( a r i a s ，1 9 9 1 ) ，在未受石油污染的生态系统中，石油降解菌占不 到微生物总数的0 1 ；而在受石油污染的生态系统中可达到1 0 0 ，降解菌数升高几个数量级， 所以在石油污染的生态系统中分离降解石油的菌株更为合适。因为其中的降解菌不仅菌数多，而 且由于石油的难溶性和难摄取性诱导出菌株产表面活性剂的能力较强：( 2 ) 分离纯化：由于人 类对微生物生长条件、生长规律了解的限制，主观的，武断的设计微生物的培养基，使自然界9 9 * , 以上的微生物是无法培养出来的，所以利用选择培养基进行分离筛选是最为关键的步骤，筛选方 法的不同所得到的微生物种类也有很大的差异，适当的方法可以大大提高筛选效率。之前的研究 大多利用纯培养技术分离纯化高效菌株，但是由于自然条件的限制和传统培养方法的弊端，活性 菌株的可培养率还相对较低，纯培养技术在分离纯化高效菌株的应用上还存在着不足。为了弥补 传统纯培养方法的不足，新型纯培养方法逐步发展起来，例如利用“寡营养法”及添加信号分子 ( 高丝氨酸。c a m p ) 等。日本的h o h z o h ( 1 9 8 2 ) 将萘溶于乙醚加入到无机盐培养基中作为唯一 碳源，可以明显提高降解萘菌株的筛选，b u s s m a r m 等( 2 0 0 1 ) 在培养基中加入高丝氨酸内酯可以 将微生物细胞的可培养性提高2 9 ，k a e b e r l e i n ( 2 0 0 2 ) 通过扩散生长盒法使微生物成单细胞生长， 并加入不同的碳源物质以及模拟采样地点的自然条件来提高不同代谢特点微生物的生长，通过 1 6 8r d n a 检测不可培养微生物，z g l e r ( 2 0 0 2 ) 采用凝胶点滴法将微生物细胞分散，通过流氏 细胞分析仪对微生物细胞加以分离筛选，此方法可以显著降低不同微生物细胞之间的抑制作用， 增加微生物的可培养性。随着分子生物学技术的发展，通过分子生态学方法( 如d g g e ) 发现微 生物群落中一些真正起作用的不可培养微生物，指导人类进行有目的的分离纯化。在改进分离方 法的基础上，如何从己得到的菌株中筛选出产生物表面活性剂的菌株，成为人们研究的重点。人 们根据生物表面活性剂的不同性质( 可以形成稳定乳化液，溶解血红细胞等) 设计了许多不同的 筛选方法，例如分配系数法( 马文漪，1 9 9 8 ) ，通过测定表面活性剂在一定的油水体系中两相的 分配系数，计算表面活性剂的乳化剂配比值( h l b ) 从而反映表面活性剂的乳化能力，具体方法 8 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 是将菌株发酵液于一定量油类物质混合均匀后