（动物学专业论文）用dna序列探讨壁虎科蜥蜴间的关系和云南半叶趾虎的种群结构.pdf

摘要 用d n a 序列探讨壁虎科蜥蜴间的关系和 云南半叶趾虎的种群结构 冯金叶 南京师范大学生命科学学院江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，南京2 1 0 0 9 7 摘要 基于1 2 sr r n a 基因全序列及c m o s 基因序列片段探讨了壁虎科 ( g e k k o n i d a e ) 蜥蜴的属间关系；用c y tb 基因全序列和n d 2 t r n a t y r 基因片段 初步研究了云南半叶趾虎( h e m i p h y l l o d a c t y l u s y u n n a n e n s i s ) 的种群结构：用1 2 s r r n a 基因全序列探讨了中国壁虎属( g e k k o ) 七物种间的系统关系。 1 壁虎科蜥蜴的属间关系 壁虎科包括了壁虎类蜥蜴8 5 的属，广泛分布于所有大陆及几乎全部岛屿。 到目前为止，壁虎科是壁虎类蜥蜴中属间关系最不清楚的一个分支。本研究获得 了壁虎科3 4 个属和鳞脚虎科2 个属的c m o s 基因部分序列和线粒体1 2 sr r n a 基因全序列。最大简约法( m p ) 和最大似然法( m l ) 用软件p a u p 4 o b l o 进行 分析。贝叶斯法分析应用m r b a y e s3 0 8 4 软件。按照多数一致原则( 5 0 ) 构 建一致树。所有的系统发生树都支持壁虎科是单系的。在一致树中，壁虎科共分 为a f 六个支，这六个分支与传统的形态学分组之间有着较大的差异。从构建 的系统发生树中可以发现s p h a e r o d a c t y l u s 位于壁虎亚科的内部。结果同时也显 示除a i l u r o n y x 之外，t e r a t o s c i n c u s + p r i s t u r u s 是壁虎科其他壁虎的姐妹群，这在 一定程度上证明了沙虎亚科的有效性。因此将球趾虎族提升为球趾虎亚科，还是 维持k l u g e ( 1 9 8 7 ) 的球趾虎族，以及沙虎亚科的有效性问题还值得进一步研究。 2 云南半叶趾虎的种群结构 摘要 采自云贵高原的9 个地点的云南半叶趾虎共4 1 个个体，囊括了传统分类的 四个亚种。获得所有样本的c y tb 基因的全序列和31 个样本的n d 2 t r n a t y r 基 因片段。用m e g a3 0 软件分析d n a 序列差异，定义单元型，并计算皿种内及 亚种间的遗传距离( p 距离) 。根据c y tb 基因的全序列和n d 2 一t r n a t y 基因片段 均定义了2 2 个单元型。亚种内c y tb 基因的平均遗传距离为o 0 9 。9 8 8 ； n d 2 一t r n a v w 基因的平均遗传距离为o 3 7 1 0 3 7 。亚种之间的遗传距离( c y tb ： 1 8 3 3 2 1 8 9 ；n d 2 一t r n a t m ：1 4 9 7 1 8 4 3 ) 远远高于亚种内的距离，仅一个例 外就是指名亚种与金平亚种之间的距离( c y tb ：5 3 0 ；n d 2 一t e n p x t y r ：4 3 3 ) 较小。用d n a s p3 1 4 软件计算各地方种群内的核苷酸多样性( 7 c ) 和单元型多样 性( h ) ，分析结果显示，云南半叶趾虎具有极高的核苷酸和单元型多样性。最大 简约法( m p ) 和最大似然法( m l ) 用软件p a u p 4 0 b 1 0 进行分析。贝叶斯法分 析应用m r b a y e s3 0 8 4 软件。基于两段不同的基因和三种不同的方法构建的系统 发生树表明云南半叶趾虎分为两个单系群。用a m o v a1 5 5 软件分析种群的分化 和种群结构的地理格局，结果建议将云南半叶趾虎分为三组。传统的金平亚种与 指名亚种关系比较近，分为一组，而龙陵亚种和独山亚种则分别属于另外两组。 3 中国壁虎属七物种间的系统发生关系 壁虎属( g e k k o ) 在中国有1 1 个种。本研究测定了壁虎属7 个种的1 2 sr r n a 基因全序列。用m e g a 2 0 软件分析d n a 序列差异。最大简约法( m p ) 和最大 似然法( m l ) 用软件p a u p4 0 b 1 0 进行分析。贝叶斯法分析应用m r b a y e s3 0 8 4 软件。分析结果表明大壁虎与小型壁虎之间的遗传距离( 2 3 1 9 2 6 3 6 ，平均为 2 4 9 4 ) 比这6 种小型壁虎之间的遗传距离( 1 0 5 3 1 8 9 8 ，平均为1 5 0 3 ) 要 大很多。而且，大壁虎与小型壁虎之间的遗传距离和已报道的蜥蜴类1 2 sr d n a 的属间距离不相上下。在重建的分子系统树中，壁虎属内除大壁虎之外的6 种小 型壁虎以很高的置信度聚集成一个单系群，大壁虎作为壁虎属中最原始的一员与 属内其他种类以极高的置信度形成姐妹群的关系。因此，是否将大壁虎与小型壁 虎分建新属值得进一步探讨。铅山壁虎与多疣壁虎分别属于两个不同的单系群， 而它们之间的遗传距离达到1 5 2 8 ，从分子水平上进一步证实了铅山壁虎作为 一个种的有效性。从分子水平揭示的小型壁虎亲缘关系与形态特征的差异之间没 有明显的联系。 摘要 关键词：壁虎科蜥蜴；系统发生；云南半叶趾虎：壁虎属；种群结构：c m o $ 1 2 5r r n a ；c y tb ：n d 2 - t r n a t 气 一 一 垒! 坐型 i n t e r r e l a t i o n s h i p sa m o n gg e k k o n i d a el i z a r d sa n d p o p u l a t i o ns t r u c t u r eo fh e m i p h y l l o d a c t y l u sy u n n a n e n s i s i n f e r r e df r o md n a s e q u e n c e s j i n y ef e n g j i a n g s u k e y l a b o r a t o r y f o r b i o d i v e r s i t y a n d g i o t e e k n o l o g y , c o l l e g eo f z i f es c i e n c e s n a m i n gn o r m a lu n i v e r s i 现, n a n j i n g2 1 0 0 9 7 , c h i n a a b s t r a c t i nt h ep r e s e n ts t u d yc m o sn u c l e a ra n d1 2 sr r n am i t o c h o n d r i a ld n aw e r e e m p l o y e da sg e n e t i cm a r k e r st od e d u c et h ei n t e r r e l a t i o n s h i p sa m o n gg e k k o n i d a e l i z a r d s ；c y tba n dn d 2 一t r n a 聊g e n es e q u e n c e sw e r eu s e dt od i s c u s st h ep o p u l a t i o n s t r u c t u r eo f h e m i p h y l l o d a c t y l u s y u n n a n e n s i s ；1 2 sr r n ag e n es e q u e n c e sw e r eu s e dt o r e v e a lt h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gs e v e ns p e c i e so f t h eg e n u sg e k k o 1 i n t e r r e l a t i o n s h i p sa m o n gg e n e r ao fg e k k o n i d a e g e k k o n i d a el i z a r d s ，r e p r e s e n t i n gm o r et h a n8 5p e r c e n to ft h eg e k k o t a ng e n e r a ， a r ef o u n do na l lm a j o rl a n dm a s s e sa n da l m o s ta l lo c e a n i ci s l a n d s i n t e r g e n e r i c r e l a t i o n s h i p so ft h eg e k k o n i d a eh a v eb e e nf a rm o r ed i f f i c u l tt or e s o l v et h a nt h o s e a m o n go t h e rg e k k o t a nf a m i l i e s o u rd a t as e tc o n s i s t e do fal a r g en u m b e ro fc o m p l e t e m i t o c h o n d r i a l1 2 sr r n ag e n es e q u e n c e sa n dp a r t i a ln u c l e a rc m o sg e n es e q u e n c e s f o r3 4g e n e r ao fg e c k o sa n d2g e n e r ao fp y g o p o d s m a x i m u mp a r s i m o n y ( m p 、a n d m a x i m u ml i k e l i h o o d ( m e ) t r e e sw e r eg e n e r a t e db a s e do nu n w e i g h t e da n a l y s i su s i n g p a u p4 0 b 1 0 b a y e s i a ni n f e r e n c e ( b i ) a n a l y s e st r e e sw e r eg e n e r a t e db ym r b a y e s 3 0 8 4 am a j o r i t y r u l e ( 5 0 ) c o n s e n s u st r e ew a sc o n s t r u c t e d a l lp h y l o g e n e t i ct r e e s s u p p o r t e dt h em o n o p h y l yo fg e k k o n i d a ew i t hg r e a tc o n f i d e n c e t h e r ew e r es i x a b s t r a c t l i n e a g e sf r o ma t ofi n d i c a t e db yt h ec o n s e n s u st r e e l i n e a g ea c o n t a i n e do n l yo n e g e n u s ，a i l u r o n y xf r o mt h es e y c h e l l e s ，w h i c hw a ss i s t e rt a x o nt ot h er e m a i n d e ro ft h e i n g r o u pw i t hh i 曲s u p p o r ti na l la n a l y s e s l i n e a g ebc o n s i s t e do ft e r a t o s c i n c u sa n d p r i s t u r u s , w h i c hw a ss u p p o r t e db yh i g hb o o t s t r a pv a l u e sa n dp o s t e r i o rp r o b a b i l i t i e s a n dw a s s t r o n g l ys u p p o r t e da s t h es i s t e r g r o u pt ot h er e m a i n i n gl i n e a g e s s p h a e r o d a c t y l u sw a sf o u n dn e s t e dd e e p l yw i t h i ng e k k o n i dg e c k o s 2 p o p u l a t i o ns t r u c t u r eo f h e m i p h y l l o d a c t y l u s y u n n a n e n s i s at o t a lo f4 1s a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o m9l o c a l i t i e s ，r e p r e s e n t i n gt h er a n g eo f 且y u n n a n e n s i si ny u n g u ip l a t e a u o u rd a t as e tc o n s i s t e do f4 1c o m p l e t ec y tbg e n e s e q u e n c e sa n d31n d 2 一t r n a mg e n es e q u e n c e s m e g a3 0w a su s e dt od e t e r m i n e t h en u m b e ra n dt y p eo f n u c l e o t i d es u b s t i t u t i o n si np a l r w i s ec o m p a r i s o n so f s e q u e n c e s ， t om e a s u r et h ed e g r e eo fd i v e r g e n c eb e t w e e n s e q u e n c e sa n dt oi d e n t i f yt h eh a p l o t y p e s f o rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s 2 2h a p l o t y e sw e r ei d e n t i f i e df r o mc y tba n dn d 2 - t r n a l ” g e n e sr e s p e c t i v e l y a v e r a g ep a i r - w i s eg e n e t i cd i s t a n c e sf o rc y tbw i t h i ns u b s p e c i e s r a n g i n gf r o mo 0 9 t o9 8 8 f o rn d 2 一t r n a r y r , i tr a n g e df r o m0 3 7 t o1 0 3 7 t h ed i s t a n c e s a m o n gs u b s p e c i e s w e r e q u i t eh i g h e r ( c y t6 ：1 8 3 3 - 2 1 8 9 ； n d 2 - t r n a t y r ：1 4 9 7 - 1 8 4 3 ) t h a n w i t h i ns u b s p e c i e se x c e p t h 卫y u n n a n e n s 西v s 丘y f i n p i n g e n s i s ( c y t6 ：5 3 0 ；n d 2 一t r n a t y r ：4 3 3 ) m e a s u r e so fg e n e t i cd i v e r s i t y 0 a a p l o t y p ea n dn u c l e o t i d ed i v e r s i t y ) w i t h i nt h ew h o l ep o p u l a t i o n sw e r ec a l c u l a t e d u s i n gd n a s p3 1 4 t h eo v e r a l lp o p u l a t i o nh a de x t r e m e l yh i g hn u c l e o t i d ea n d h a p l o t y p ed i v e r s i t yf o r as p e c i e s m a x i m u mp a r s i m o n y ( m p ) a n dm a x i m u m l i k e l i h o o d ( m l ) t r e e sw e r eg e n e r a t e db a s e do nu n w e i g h t e da n a l y s i su s i n gp a u p 4 0 b l0 b a y e s i a ni n f e r e n c e ( b i ) a n a l y s e st r e e sw e r eg e n e r a t e db ym r b a y e s3 0 8 4 a l l t r e e ，f r o mt h r e em e t h o d sa n db a s e do nt w og e n ef r a 目a a e n t s ，s t r o n g l ys u g g e s t e dt h a t t h ep o p u l a t i o n so f h y u n n a n e n s i sc a nb ed i v i d e di n t ot w om o n o p h y l e t i cg r o u p s t h e r e s u l t so fh i e r a r c h i c a la n a l y s e so fm o l e c u l a rv a r i a n c eb ya m o v a1 5 5s u g g e s t e dt h a t t h ep o p u l a t i o nc a l lb ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s 3 p h y l o g e n e t i er e l a t i o n s h i p sa m o n g s e v e ns p e c i e so fg e k k o t h eg e k k o t a nf a u n ao fc h i n ac o n s i s t so fe l e v e ns p e c i e so fg e k k o w eo b t a i n e d9 a b s t r a c t c o m p l e t em i t o c h o n d r i a l1 2 sr r n ag e n es e q u e n c e sa n dr e c o n s t r u c t e dp h y l o g e n e t i c t r e e sb ym a x i m u mp a r s i m o n y ( m e ) a n dm a x i m u ml i k e l i h o o d ( m e ) m e t h o d so np a u p 4 0 b l0a n db a y e s i a ni n f e r e n c e i ) a n a l y s e so nm r b a y e s3 0 8 4 m e g a2 0w a su s e d t om e a s u r et h ed e g r e eo fd i v e r g e n c eb e t w e e ns e q u e n c e s t h e g e n e t i cd i s t a n c e s b e t w e e ng g e c k oa n ds m a l l e rg e c k os p e c i e sw e r em u c hl a r g e rt h a nt h o s ea m o n gs i x s m a l l e rg e c k o s m o r e o v e gt h eg e n e t i cd i s t a n c e sb e t w e e ng g e c k oa n ds m a l l e rg e c k o s w e r es i m i l a rt ot h ed i s t a n c ea m o n gl i z a r dg e n e r a i np h y l o g e n e t i ct r e e s ，s i xs m a l l e r g e c k o sc l u s t e r e dt o g e t h e r 谢t l lg r e a tc o n f i d e n c ea n dgg e c k ow a st h es i s t e rg r o u p t o t h e m i ti sw o r t hw h i l et op a ym o r ea t t e n t i o nt oi n v e s t i g a t ew h e t h e rg g e c k oa n dt h e s m a l l e rg e c k o ss h o u l db er e f e r r e dt ot w os e p a r a t eg e n e r a gh o k o u e n s 毋a n dg j a p o n i c u sb e l o n gt od i f f e r e n tm o n o p h y l e t i cg r o u p sa n dt h ed i v e r g e n c eb e t w e e n t h e m w a sl a r g e ，s o ，w es u p p o r t e dt h ev a l i d i t yo fgh o k o u e n s i s t h e r ew a sn oa n y c o r r e l a t i o nb e t w e e nr e l a t i o n s h i p sa m o n gt h es i xs m a l l e rg e c k o sb a s e do nm o l e c u l a r d a t aa n dt h o s eb a s e do nm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s k e y w o r d s ：g e k k o n i d a el i z a r d ；m o l e c u l a rp h y l o g e n y ；h e m i p h y l l o d a c t y l u s y u n n a n e n s 扫；p o p u l a t i o ns t r u c t u r e ；g e k k o ；c - m o s ；1 2 sr r n a ；c y t 6 ： n d 2 t r n a 研； 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、9 0 新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：基垒业 日期：趔! ! ：! ! 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名 日期 塑! i 第一章c y t b 基因在脊椎动物分子系统学中的应用 第一章c y tb 基因在脊椎动物 分子系统学中的应用 1 引言 c y tb 基因是动物线粒体基因组中编码细胞色素b 蛋白线粒体中氧化磷 酸化复合体的一个蛋白亚基( h a t e f i ，1 9 8 5 ) 的基因，它的全长约11 4 0b p ( i r w i n e ta l ，1 9 9 1 ) 。1 9 8 9 年k o c h e r 等首次报导了用于扩增c y tb 基因部分区域的通 用引物，这对引物可以扩增脊椎动物的c y tb 基因的同源区域。该对引物的设计 及其普及，使得c y tb 基因能够被广泛的应用于系统发生的研究工作。该基因很 有可能是脊椎动物中已经被测序最多的基因，而且是对其编码产物的结构和功能 了解最透彻的线粒体基因( e s p o s f ie t a l ，1 9 9 3 ) 。从g e n b a n k 中我们可以获得脊 椎动物各种物种c y t b 基因或长或短的序列，这为我们进行研究提供了大量的信 息资源。本文综述了近年来国内外将c y tb 基因用于脊椎动物分子系统学的研究， 以期对我们今后的相关研究提供一些参考。 2 应用 尽管c y t6 基因发生非同义突变( n o n - s y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o n s ) 的速度比较 慢，但是它的沉默位点( s i l e n t p o s i t i o n s ) 的进化速率还是相对较快的，这使得在 解决种群水平的问题的时候，c ) ，t6 基因能够提供足够的信息( i r w i ne t a l , ，1 9 9 1 ) 。 同时它的保守性又使其可以用于解决从科间到种间各个水平的问题( f a r a se t 口，2 0 0 1 ) 。例如：l a w s o n 等( 2 0 0 4 ) 用c y t6 基因全序列研究了蛇的1 2 个科之间 的系统发生关系；y v o n n e 等( 2 0 0 0 ) 对欧洲一种鼠类( m u r o i dr o d e n t s ) 三个亚 科1 8 个种的c y t6 基因全序列进行分析，得出了以下结论：( 1 ) 支持前人关于 m u r i n a e 和a r v i e o l i n a e 两个亚科单系性的推测，( 2 ) 支持将a p o d e m u s 属分为三个 亚属；w a n g 等( 1 9 9 9 ) 利用c y t6 基因片段研究了游蛇科五个属十二种的演化关 系。结果显示，游蛇科中该五个属可以分为三组：第一组为赤链蛇和水赤链游蛇， 第二组为乌梢蛇和灰鼠蛇，第三组为锦蛇属的蛇。c y t6 基因也被广泛应用于分 子系统地理学的研究中，如：p o u l a k a k i s 等( 2 0 0 3 ) 利用c y t 6 基因片段研究了一 第一章c y tb 基因在脊椎动物分子系统学中的应用 种蜥蜴p o d a r c i se r h a r d i i 的种群结构，结果显示：基于d n a 数据所得到的希腊南 部的p o d a r c i s 生物地理学和系统发生的历史与古地理数据是一致的，进步支持 了d n a 序列是研究古地理学非常有用的工具。 2 1 遗传距离 遗传距离在分子系统学研究中是最基本的信息，无论是系统发育树的构建、 分子钟的计算还是分子系统地理学的研究都必须建立在对已知数据间的遗传距 离的计算上。对于d n a 序列而言，碱基的突变产生了序列之间的差异继而产生 了遗传距离。然而对于一个( 段) 基因而言，它的突变速率在不同物种中是有差 异的。j o h n s 和a v i s e ( 1 9 9 8 ) 等从g e n b a n k 中收集了近20 0 0 条长短不一的脊椎动 物的c y t 6 基因序列，并用这些序列计算脊椎动物各个分类阶元之间的遗传距离， 他们的结果表明在脊椎动物五个主要的纲中： ( 1 ) 两栖爬行类动物的种间( 同 属) 、属间( 同科) 的c y t 6 基因遗传距离都大于其他各类( 种间的平均遗传距 离分别为：鸟类8 0 、哺乳类1 1 2 、鱼类1 1 8 、爬行类1 2 0 、两栖类1 4 0 ) ； ( 2 ) 鸟类种间( 同属) 的遗传距离比其他四类要小；( 3 ) 他们验证了这样一个 显而易见的趋势，即：在同一个物种中利用c y t6 基因计算的属间的遗传距离要 比种问的遗传距离大。对于两栖类动物，h a r r i s ( 2 0 0 2 ) 在j o h n s 和a v i s e ( 1 9 9 8 ) 的基础上增加了数据量，从原先的8 个科增加到1 3 个科、从1 6 个属增3 n 至u 3 5 个属。 h a r r i s 计算的两栖类动物同属( 种间) c y t6 遗传距离为1 3 6 ，大于先前计算的 距离( j o h n sa n da v i s e ：1 2 o ) 。当需要对分类阶元不明确的物种提供一些分 子证据的时候，这些已经获得的遗传距离可以用作为一个标尺。l a m b 和b a u e r ( 2 0 0 0 ) 在对粗皮肥趾虎( p a c h y d a c t y l u sr u g o s u s ) 的研究中，发现在该壁虎中 即使地理距离相隔很近的三个亚种之间c y t6 基因的遗传距离( 1 9 1 - 2 6 8 ) 显著 的高于已经报道的蜥蜴的种内的遗传距离，而且高于爬行动物中大多数姐妹种间 的遗传距离，这一结果为他们将这三个亚种提升为种提供了强有力的分子证据。 2 2 碱基组成 一段线粒体d n a 序列的碱基组成是非常有用的信息，我们可以利用它来确 定所扩增的片段是线粒体d n a 序列还是线粒体d n a 在核内的拷贝( l a m ba n d b a u e r ，2 0 0 2 ) 。动物线粒体d n a 序列的碱基组成与核d n a 是不同的。线粒体 中蛋白编码基因的第三位密码子的碱基含量常常有很大的偏岐( j o h n sa n d a v i s e ， 2 第一章c y tb 基因在脊椎动物分子系统学中的应用 1 9 9 8 ；p r u s a k a n dg r z y b o w s k i ，2 0 0 2 ) 。j o h n s 和a v i s e ( 1 9 9 8 ) 统计了脊椎动物 五个主要类群的c y tb 基因序列的碱基组成( 表1 ) 。从中可以看出，脊椎动物的 c y tb 基因的碱基含量基本上是一致的。在密码子的第三位，g ( g u a n i n e )的 含量都显著的低于其他三种核苷酸，只有爬行动物显得异常的高，而h a r r i s ( 2 0 0 2 ) 在扩大信息量后计算得到的结果也显示了密码子第三位g 的含量显著 偏低( 表1 ) 。 表1 脊椎动物五个主要类群的c y tb 基因序列的碱基组成( 据j o h n s 和a v i s e ，1 9 8 1 ； h a r r i s ，2 0 0 2 修改) t a b l e1b a s ec o m p o s i t i o no fc y tbs e q u e n c e sf r o mf i v em a j o rg r o u p so fv e r t e b r a t e ( m o d i f i e d f r o m j o h n sa n d a v i s e ，1 9 8 1 ；h a r r i s ，2 0 0 2 ) 碱基组成( p e r c e n t a g eb a s ec o m p o s i t i o n ) 全部位点( a i is i t e s )第三位密码子( t h r d - p o s i t i o ns i t e s ) cgtac g t 3 3 91 3 52 5 03 7 74 6 7 3 5 1 2 1 2 8 41 3 32 8 83 9 83 5 9 3 4 2 0 9 2 7 61 6 12 8 62 9 7 2 8 11 8 02 4 2 2 4 31 6 03 2 73 5 53 0 2 5 52 8 8 2 9 91 5 3 2 9 5 3 0 2 4 1 35 52 3 0 2 8 8 1 4 82 8 93 4 63 6 47 22 1 8 2 8 81 3 7 2 9 23 8 53 8 73 61 9 7 鸟类( b i r d s ) 哺乳类( m a m m a l s ) 爬行类( r e p t i l e s ) 两栖类( a m p h i b i a n s ) 鱼类( f i s h e s ) 平均( a v e r a g e ) 爬行类( r e p t i l e s ) ( h a r r i s 。2 0 0 2 ) 2 3 核内插入序列 核内插入序列( n u c l e a ri n s e r t i o n s ) ( z h a n ga n dh e w i r ，1 9 9 6 ) 是在细胞核基 因组发现的线粒体基因序列的拷贝，不同的研究者赋予这种现象各种各样的名 称：n u c l e a re x m i t o c h o n d r i a ls e q u e n c e s ，n u c l e a rc o p i e s ，n u c l e a ri n t e g r a t i o n s ，n u c l e a r c o u n t e r p a r t s ( v a n d e r k u y le t a l ，1 9 9 5 ) 。无论是在脊椎动物还是无脊椎动物中， 都发现了核内插入序列的存在( l o p e z e ta 1 ，1 9 9 4 ；s m i t he ta 1 ，1 9 9 2 ) ，包括了 编码蛋白质的基因、编码r r n a 的基因和控制区序列( c o n t r o lr e g i o n s ) 。可能由 于使用频率的缘故，r r n a 基因、c y tb 基因、c oi 和c o i i 基因是发现核内插 入序列最多的线粒体基因。到目前为止，c y tb 基因在哺乳动物( d e w o o d y e ta 1 ， 1 9 9 9 ) 、鸟类( a r c t a n d e r ，1 9 9 5 ) 和爬行动物( f ue t a ，2 0 0 0 ) 中都报道过核内 插入序列。由于它们与原始的线粒体基因在进化速率、碱基组成等特性上有显著 一6 6 7 o 3 4 2a一孤拽觋觋强扎孤 第一章c y tb 基因在脊椎动物分子系统学中的应旦 的差异，以及它们可被p c r 扩增，这使得在利用线粒体基因作为分子标记时要 特别注意这一点。对于c y tb 基因而言，一般出现了下列情况我们就应该考虑是 否扩增出了核内插入序列：( 1 ) 将获得的某个序列在和近缘种的序列进行比对时 发现有插入、移码或者早熟的终止子；( 2 ) 构建系统发育树时出现了极其异常甚 至是矛盾的结果；( 3 ) 由于线粒体基因的碱基组成具有很大的偏岐，尤其是在密 码子的第三位，而在核内的核内插入序列却没有这样的特性，于是我们可以利用 这一点来检验我们的序列。有一点必须说明的是，虽然在很多物种中，很多基因 都存在着核内插入序列，我们在平时p c r 扩增时能够扩出核内插入序列的几率 并不高。当然，核内插入序列带来的不只是麻烦，它同样带来了一些有用的信息。 如h a y 等( 2 0 0 4 ) 在研究楔齿蜥( 印 p n d 面聆) 的系统发生关系时，由于该物种 是爬行动物中最古老的类群之一，没有与其系统发生关系比较近的物种，因此就 很难找到一个合适外群来确定系统发生树的根。为了解决这个问题，他们利用一 段c y t6 基因在核内的插入序列作为分析的分子外群( m o l e c u l a ro u t g r o u p ) ，这就 很好的利用了核内插入序列进化速率比较慢的特性。 3 问题 c y tb 基因在用作分子标记的时候也遇到许多问题( m e y e r ，1 9 9 4 ) ：( 1 ) 碱 基组成的偏歧( b a s ec o m p o s i t i o n a lb i a s e s ) 。从表2 我们可以看出，在c y tb 基因 第三位密码子中g 的含量都显著的低于其他三种核苷酸。这种碱基组成的偏岐 无形中将d n a 的四种特征状态( a 、t 、c 和g ) 降低为接近三种( a 、t 、c ) ， 这自然就降低了d n a 水平的突变率，使突变更容易达到饱和( g u r y e ve ta 1 ， 2 0 0 1 ：l a m ba n db a u e r ，2 0 0 2 ) 。所以在对亲缘关系比较远的物种进行系统发生 分析的时候常常会去除第三位密码子或者对第三位密码子的转换赋予较低的值 ( z a m u d i o ，1 9 9 7 ：j o h n s o na n ds o r e n s o n ，1 9 9 8 ；g u r y e ve t a l ，2 0 0 1 ) ；( 2 ) c y t b 基因在不同的物种中进化速率有差异。研究发现c y t b 蛋白的氨基酸突变速率 在温血动物中要高于冷血动物( m a r t i na n dp a l u m b i ，1 9 9 3 ；r a n d ，1 9 9 4 ) 。在两 栖动物中，蛙类的突变速率要比蝾螈慢( g - r a y b e a l ，1 9 9 3 ) 。进化速率的差异有 可能会导致错误的推论，比如当我们用c y tb 基因来研究两栖动物高级阶元之间 的系统发生关系时，是建立在c y tb 基因在不同物种中的进化速率是一样的理论 基础上的，可是事实并非如此，那么就很难保证所得结论的可靠性了；( 3 ) 和其 第一章c y tb 基因在脊椎动物分子系统学中的应用 他一些线粒体基因一样，c y tb 基因在核内的拷贝也是我们在应用中必须注意的 个问题。 4 展望 在利用c y tb 基因进行系统发育分析时，由于在三联体密码子的不同位置的 核苷酸的替代速率是有差异的，常常会对它们赋予不同的值来进行权衡。此外， 该基因编码的是一个跨膜蛋白质，由8 个c 1 螺旋组成( h a t e f i ，1 9 8 5 ) ，在线粒体 中起着非常重要的作用。因此c y t b 基因在进化过程中受到了编码蛋白的功能的 限制。如果一个区域的碱基发生了替代，会导致蛋白功能的缺失，那么这些区域 的进化就会受到限制，那么它的进化速率就会比较慢；如果一个区域的碱基发生 替代没有导致功能的很大变化，这个区域的进化速率就会相对的快些。些研 究表明，跨膜区域由于在进化中受功能的限制相对比较小，因此进化速率较快。 相反，膜内及膜外部分，由于担负着一些重要的生物学角色，这使得它们的氨基 酸的进化速率要慢得多( m a r t i na n dp a l u m b i ，1 9 9 3 ；n a y l o re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。基于 这个现象，在用某一段c y tb 基因来进行系统分析的时候，应该搞清楚这段基因 所编码的蛋白所在的位置，这样在与其他文献的所报道的进化速率进行比较的时 候就会得出更准确的结果。当然如果都用c y t6 基因的全长来进行分析就不会出 现上述问题，不过，在用c y tb 基因全长重建系统发育树的时候是否还应该对基 因的不同的区域进行一致性检验( i l dt e s t s ) ( f a r r i se t a l ，1 9 9 4 ) ? 或者亦可以 像对密码子的不同的位置的核苷酸的进化赋予不同的值一样，对c y tb 基因的不 同区域( 跨膜区域和非跨膜区域) 进行赋值? 此外，将c y tb 基因与其他d n a 标记线粒体基因( 1 2 sr r n a 、1 6 sr r n a 、c oi 、n d 4 等) 及核基因( 1 8 s r r n a 、c - m o s ) ( g u r y e ve t a l ，2 0 0 1 ：v e n c e se t a l ，2 0 0 1 ；w h i t i n ge t a l ，2 0 0 3 ； a u s t i ne ta 1 ，2 0 0 4 ：h o d g c sa n dz a m u d i o ，2 0 0 4 ) 等结合起来用于系统发生的分 析也是一个趋势。这样的结合起到了扬长避短的作用，在一定程度上弥补了用单 一分子标记带来的缺陷。 参考文献 a r c t a n d e rp 1 9 9 5 c o m p a r i s o no fam i t o c h o n d r i a lg e n ea n dac o r r e s p o n d i n gn u c l e a r p s e u d o g