（微生物学专业论文）产河豚毒素微生物的研究.pdf

摘要 中文摘要 1 、从河豚鱼的卵巢中分离出3 5 株野生菌，其中1 5 株菌株遗传性状稳定。用小 鼠生物检测法对1 5 株菌株的发酵产物进行了检测，初筛选出1 1 菌株进行复筛，结 果有6 株菌毒素含量均在4 0 0 n g m l ，其中菌株b - 3 3 3 毒素含量最高为4 8 9 4 0 n g m l ， 因此选择菌株b - 3 3 3 作为出发菌株，并命名为z y 一2 3 。 2 、通过对z y - 2 3 菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征进行了研究与分析。 结果表明，z y 一2 3 菌株具有沙雷氏菌的典型的形态特征和生理生化特征。该菌株最 适生长温度2 6 c ，最适p h 7 0 ，最适n a c l 浓度2 。 3 、通过提取z y 一2 3 菌株的基因组d n a ，利用1 6 sr r n a 基因通用引物，进行 扩增、转化感受态大肠杆菌，将阳性克隆测序，获得z y - 2 3 菌株的1 6 sr r n a 基因 序列，构建进化树，证实z y 一2 3 菌株与s e r r a t i a 印r p 5 有9 9 的同源性。 4 、通过小鼠生物法测定发酵离心液和破壁后的菌体细胞上清液，结果表明发酵 离心液中含有毒性成分，破壁后的细胞上清液不含毒性成分，z y - 2 3 产生的毒素为 胞外产物。采用荧光分光光度计对发酵离心液进行测定，结果在4 2 3 n m 处标准品与 z y 一2 3 提取物都有相同的发射峰，初步证实发酵液含有河豚毒素。 5 、通过研究确定了高效液相检测法测定t t x 的条件：流动相乙腈：水1 5 ：8 5 ， 流速0 5 m l m i n ，检测波长1 9 1 n m ，柱温2 3 ，进样量：2 0 u l 。h p l c 检测结果显示， z y - 2 3 菌株的发酵产物中提取得到的毒性成份保留时间与标准品基本一致。初步证 实菌株z y 一2 3 的发酵产物为河豚毒素或河豚毒素衍生物。 关键词：河豚毒素，z y - 2 3 菌株，小鼠生物法 中文文摘 中文文摘 河豚毒素是一类重要的海洋生物毒素，其存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动 物和海底沉积物中。无色棱柱状晶体，对热不稳定。难溶于水，可溶于弱酸的 水溶液。在碱性溶液中易分解，在低的p h 值溶液中也不稳定。 虽然河豚毒素毒性强，但随着科学的进步，河豚毒素在治疗人类疾病方面 发挥着越来越重要的作用。河豚毒素可以治疗癌症、止痛、止喘、镇痉、止痒、 治疗哮喘、百日咳。河豚毒素在医学上的广泛应用，导致河豚毒素的需求量逐 步增加。但是，由于河豚毒素提取的原材料来源于野生河豚，人工养殖的河豚 鱼几乎不含t t x 或含量极低，原料来源不足，限制了河豚毒素在临床的使用。 研究显示，多种河豚鱼和海洋动物体内的一些细菌和放线菌等微生物可以产生 河豚毒素，因此，通过分离筛选产河豚毒素的海洋微生物，再经过发酵技术生 产河豚毒素，可以解决原料来源不足，产量低的问题，来满足日益增长的市场 需求，具有较大的经济社会效益。本研究主要通过分离、筛选产河豚毒素的微 生物，并对产河豚毒素的微生物进行初步研究，以期待提取微生物源的河豚毒 素来满足市场对河豚毒素的需求，进一步证实河豚毒素是由微生物产生。具体 实验结果如下： 一、河豚毒素产生菌的筛选 本文以野生河豚鱼为研究对象，通过小鼠生物法对产河豚毒素微生物进行了分 离筛选。从河豚鱼的卵巢中分离出3 5 株野生菌，分离纯化的野生菌传代三次后得到 1 5 株性状稳定的菌株。用小鼠生物法对1 5 株菌株的发酵产物进行初步检测，其中1 1 株菌株的发酵产物可以致小鼠死亡，继而对1 1 株菌株进行复筛，结果有6 株菌株致 死小鼠时间不多j l o m i n 。根据小鼠死亡时间倒数一单位体重毒素剂量关系，计算菌株 所含毒量，其中这6 株菌株的毒素含量均在4 0 0 n g m l 以上，分别是4 7 4 0 4 n g m l ( b - 3 0 1 菌株) 、4 2 0 9 1n g m l ( b 一3 0 4 菌株) 、4 2 5 0 6n g m l ( b 一3 0 7 菌株) 、4 8 2 3 1n g m l ( b - 3 2 0 菌株) 、4 8 9 4 0n g m l ( b 一3 3 3 菌株) 、4 2 5 0 6n g m l ( b - 3 3 5 菌株) ，其中b 一3 3 3 菌株的毒素含量最高。因此，选择菌株b 一3 3 3 作为出发菌株，并命名为z y 一2 3 。 二、产毒菌株z y - 2 3 的形态学及生理生化性状研究 i i i 中文文摘 微生物的生理生化特征、生长p h 值及温度范围，可以为探索微生物发酵培养 条件、培养基组成提供实验依据。本文根据伯杰氏细菌鉴定手册，对出发菌株 的菌落形态、细胞形态等进行了观察，并进行了温度、p h 、n a c l 耐受等实验和糖发 酵、盐利用等生理生化实验。结果初步鉴定菌株z y 一2 3 为沙雷氏菌属的一个种。该 菌株菌落较小，呈圆形，直径o 5 一l c m ；白色，表面湿润、光滑；菌落突起不明显， 边缘光滑。菌体呈短杆状、革兰氏阴性、无芽孢、无荚膜、有鞭毛。能利用的糖类 为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、d 一山梨醇，不能分解 乳糖。可以分解明胶，不能分解淀粉。可以还原柠檬酸盐、丙酸盐，硝酸盐；接触 酶反应、v - p 反应阳性、氧化酶反应、硫化氢试验、甲基红试验阴性。最适生长温 度为2 6 ，最适p h 为7 0 ，最适n a c l 浓度为2 。 三、产毒菌株z y - 2 3 的1 6 s r r n a 基因序列分析 提取z y - 2 3 菌株的基因组d n a ，利用细菌的通用引物进行1 6 sr r n a 基因扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增成功后，转化大肠杆菌感受态细胞，菌落p c r 检测，阳性克隆送交上海生工进行测序，将序列进行比对，利用生物软件构建其系 统进化树。结果表明，z y 一2 3 菌株与s e r r a t i as p t p 5 具有紧密的亲缘关系，同源 性达到9 9 。 四、z y 一2 3 菌株发酵产物的分离提取 采用小鼠生物检测法分别对z y - 2 3 菌株的发酵离心液和破壁后的菌体细胞上清 液进行毒素检测，初步证实发酵离心液中含有毒性成分而破壁后的菌体上清液不含 毒性成分，z y - 2 3 发酵产生的毒性成分为分泌型的胞外产物。为了提取发酵离心液 中的毒性成分，将发酵离心液经过d 1 0 1 大孔吸附树脂、d 1 5 2 离子交换树脂处理 后，用醋酸水溶液洗脱，将洗脱液用小鼠生物检测法检测，结果表明，当洗脱液p h 6 5 、6 0 时，所注射小鼠出现明显的中毒症状及死亡，p h7 0 以上的洗脱液注射小 鼠，小鼠没有出现死亡现象。收集p h6 5 、6 0 的洗脱液，采用荧光分光光度计进 行检测。在p h6 5 、6 0 的洗脱液加入等体积的4 m o l l n a o h 沸水浴4 5 m i n ，迅速冷却 到室温，在激发波长3 7 0 n m ，发射波长4 9 5 n m 处检测，标准品与菌株z y - 2 3 提取物 在4 2 3 n m 都出现一明显的发射峰，初步证实发酵产物中含有河豚毒素。 五、高效液相检测菌株z y - 2 3 的发酵产物 高效液相色谱法是检测河豚毒素的一种重要的检测方法。本文研究了高效液相 色谱法测定河豚毒素的条件，探讨了色谱柱的种类、流动相的种类、柱温、流速等 i v 中文文摘 对色谱分离效果的影响。结果表明：用z o r b a xs b a q 柱测定标准品的保留时间比 h y p e r s i lo d s 反相柱长。在1 9 1 n m 处，标准品的峰面积最大，1 9 0 n m 处峰面积次之， 峰面积随波长的增大呈下降趋势。采用o 1 5 醋酸、0 1 5 醋酸：甲醇= 9 5 ：5 、乙腈： 水= 1 5 ：8 5 、磷酸钠缓冲液( p h 6 8 ) 等作为流动相测定标准品溶液，结果表明乙腈： 水= 1 5 ：8 5 做流动相时，基线平稳，峰形堆成，杂峰较少，物质之间的分离度较大。 采用不同的柱温，t t x 的出峰面积不同。当柱温为23 时，t t x 的出峰面积最大。 随着流速的增大，保留时间呈下降趋势。当流速为0 5 m l m i n ，保留时间较长，峰面 积较大。 因此，确定了在本实验室条件下测定河豚毒素的高效液相色谱检测方法：流动 相为乙腈：水1 5 ：8 5 ，流速为0 5 m l m i n ，检测波长1 9 1 n m ，柱温2 3 ，进样量： 2 0 u l 。在最佳色谱条件下，检测了z y - 2 3 菌株的发酵产物。结果显示，z y - 2 3 菌株 的发酵产物中提取得到的毒性成份保留时间与标准品基本一致。初步证实菌株 z y - 2 3 的发酵产物为河豚毒素或河豚毒素衍生物。 v ab s t r a c t a b s t r a c t t h ee x p e r i m e n tr e s e r c h e db a c t e r i a p r o d u c i n gt e t r o d o t o x i na n d15s t r a i nw a s d i s c o v e r e da n di s o l a t e df r o mt h eo v a r yo ff i s h m o u s eb i o a s s a ym e t h o dw a su s e di no r d e r t oa n a l y z et h ep r o d u c t i o no ft h e s es t r a i n s t r a i nb 一3 3 3h a v i n gt h em o s tt o x i nc o n t e n tw a s s t u d i e da n dn a m e dz y 二2 3 t h ec h a r a c t e r i s t i c so fm o r p h o l o g y , c u l t u r e ，p h y s i o c h e m i s to fz y - 2 3s t r a i nh a sb e e n r e s e r c h e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts t r a i nz y - 2 3h a dt h et y p i c a lc h a r a c t e r i s t i co f m o r p h o l o g y , p h y s i o c h e m i s to fs e r r a t i a t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n so fs t r a i nz y - 2 3 w e r et e m p e r a t u r e 2 6 。c ，p h 7 0 ，s a l i n i t y2 t h e1 6 sr r n ag e n eo f z y 0 2 3w a sc l o n e d ，a m p l i f i e d ，l i k e dw i t hp m d 1 8t v e c t o r ， t h e nt r a n s f e r r e dc o m p e t e n te s c h e r i c h i ac o l ia n dt h em a s cc l o n e sw e r e s e q u e n c e d t h e16 s r r n ag e n es e q u e n c ew a ss u b m i t t e dt ob l a s t nt oc o n s t r u c t c l a d o g r a mi no r d e rt o u n d e r s t a n dt h eg e n e t i cb a c k g r o u n do ft h i ss t r a i n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e16 sr d n ao f z y - 2 3w a sh i g h l yh o m o l o g yt ot h a to fs e r r a t i as p r p 5 m o u s eb i o a s s a ym e t h o dw a su s e di no r d e rt oa n a l y z ef e r m e n t a t i o nb r o t ha n dc e l l s u p e r n a t a n t t h er e s u l ts h o w e df e r m e n t a t i o nb r o t hp r o d u c e dt o x i na n dc e l ls u p e r n a t a n td i d n o tp r o d u c et o x i n 。t h et o x i nw a se x t r a c e l l u l a rp r o d u c t s t h er e s u l to ff l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t r yp r o v e ds t r a i nz y - 2 3 w o u l dp r o d u c et e t r o d o t o x i n d e t e r m i n i n gt h ec o n t e n to ft t xb yh p l c ，t h ed e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw e r ez o r b a x s b a qc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n ，c o l u m nt e m p e r a t u r e2 3 。c ，d e t e c t i o nw a v el e n g t hl91n m ， a c e t o n i t r i l e ：w a t e r1 5 ：8 5 ，f l o wr a t e0 5 m l m i n t h er e s u l to f h p l cs h o w e dt h a tt h er e t i o n t i m eo ft h ep r o d u c t i o no fs t r a i nz y - 2 3i ss i m i l a rw i t hs t a n d a r ds u b s t a n c e 。t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ep r o d u c t i o ni st e t r o d o t o x i no ri t sr a m i f i c a t i o n k e y w o r d s ：t e t r o d o t o x i n ，s t r a i n z y = - 2 3 ，m o u s e b i o a s s a y h 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)超重学号2 q q 鱼q 鱼z 鱼专业邀生塑堂 所呈交的学位论文( 论文题目：产河豚毒素微生物的研究 ) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除论文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研究工作做出贡 献的个人或集体，均已在论文中作了明确说明并表示谢意，由此产生的 一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 学位论文作者签名：幺f 莺 签字日期：砂罗年石月g 日 指导教师签名： 签字日期：例彳年莎月磊 绪论 绪论 1 海洋生物毒素的研究概况 1 1 产毒素的海洋生物种类和生物毒素类型 浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮。海洋中的生物资源丰富、种类繁多，它们产 生了多种多样的生物活性物质，如生物信息物质、药用活性物质、海洋生物毒素和 生物功能材料等。其中海洋生物毒素是海洋生物活性物质中研究进展最为迅速的 领域。国外早在二战之前，就对以海鱼为主的海洋毒物进行了研究，获得了许多有 关海洋毒物的资料。战后，随着对生物学、药理学的研究，河豚毒素、石房蛤毒素 等毒素被分离出。此后，随着生物学技术的发展，海洋生物毒素的研究迅速发展。 岩岩沙海葵毒素、西加毒素、利尾鱼毒素等毒性极强的聚醚类毒素的出现是海洋生 物毒素的最大进展【2 1 。另外，海洋毒素中的肽类毒素也发展迅猛，多种的肽类毒素 被报道，其中研究较多的是海葵毒素、芋螺毒素和海蛇毒素等3 大类【2 】。 迄今为止，报道过的海洋生物毒素的种类达数百种，能够产生毒素的海洋微生 物也有数百种，其中包括细菌、真菌、放线菌、微藻等种类。目前，产毒素的细菌 是研究较多的一类，主要产生的毒素有河豚毒素、石房蛤毒素等，主要分布在以下 这些属【l 】：假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、弧菌属( r 乍b r i o ) 、发光杆菌属 ( p h o t o b a c t e r i u m ) 、气单胞菌属( a e r o m o n a s ) 、邻单胞菌属( p l e s i o m o n a s ) 、交替单胞 菌属( a l t e r o m o n a s ) 、不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、棒杆菌属 ( c o r y n e b a c t e r i u m ) 和莫拉氏菌属( m o r a x e l l a ) 。海洋真菌也会产生真菌毒素，主要分 布在青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、镰刀霉属( f u s a r i u m ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 和麦角属 ( c l a v i c e p s ) 。海洋微生物中，霉菌也是产毒的一种菌群，主要产生一类单端孢霉烯族 化合物的霉菌毒素【7 1 。海洋放线菌也可产生毒素。海洋微藻是海洋微生物中产毒种 类较多的一个类群。 海洋生物产生的毒素种类主要有【8 】：河豚毒素( t e t r o d o t o x i n ) 、石房蛤毒素 ( s a x i t o x i n ) 、膝沟藻毒素( g o n y a u t o x i n ) 、鱼腥藻毒素( a n a t o x i n ) 、海参毒素( h o l o t o x i n ) 、 冠柳珊瑚毒素( l o p h o t o x i n ) 、海兔毒素( a p l y s i a t o x i n ) 、岩沙海葵毒素( p a l y t o x i n ) 、刺鱼 毒素( m a i - - - t o t o x i n ) 、轮状鳍藻毒素( d i n o p h y s i s t o x i n ) 、鞘丝藻毒素( 1 y n g b y s t o x i n 彳) 、 短裸甲藻毒素( b r e v e t o x 加j ) 和西加毒素( c i g u a t o x i n ) 等。这些海洋毒素产生的化学结 构类型非常广泛，主要包括：生物碱、皂甙、萜类、大环内醑、聚醚类、肽类及蛋 白质等种类。其中，河豚毒素、石房蛤毒素、膝沟藻毒素、鱼腥藻毒素、鞘丝藻毒 福建师范大学郑莺硕士学位论文 素属于生物碱类毒素；短裸甲藻毒素、西加毒素、岩沙海葵毒素属于聚醚类生物毒 素。聚醚类生物毒素是海洋天然产物特有的一类化学结构，其毒理和药理作用十分 特殊，对海洋毒素的发展产生十分重大影响。 海洋生物毒素的种类繁多，但它们都具有某些共同的特征【3 1 ：( 1 ) 化学结构新 颖并呈现多洋性：海洋生物毒素的化学结构远远超过细菌毒素和陆生动物毒素的化 学结构类型。部分结构在陆生动物中极为罕见或为海洋生物毒素所特有，这种多样 性和新颖性对人类而言却极为重要。海洋生物毒素的化学结构类型非常广泛，主要 包括：氨基酸、脂肪酸、生物碱、皂甙、萜类、大环内醑、聚醚类、肽类及蛋白质 等。( 2 ) 作用机理特殊：海洋生物毒素显著的特点是其主要特异作用于神经和肌肉 可兴奋细胞膜上的神经受体或离子通道，从而影响与受体有关的一系列细胞调控活 动具有广泛的神经系统活性、心血管系统活性和细胞活性；( 3 ) 毒性强烈，生物 活性高：海洋生物毒素对受体作用具有高选择性和高亲和性，因而很少的量就可以 起到巨大的作用。目前，许多剧毒性海洋毒素比现有毒剂毒性高数十倍至数百倍。 ( 4 ) 易于化学合成：与其他天然毒素如植物毒素相比，一些海洋生物毒素分子小， 为低分子化合物或低肽类物质、结构稳定、易于化学合成，使其工业化生产成为可 能。目前，已人工合成的海洋毒素有河豚毒素、石房蛤毒素、岩沙海葵毒素、短裸 甲藻毒素等1 2 。其中，河豚毒素由于在医学上具有多种重要的应用价值，是当前海 洋生物毒素中研究热点。 1 2 海洋生物毒素的作用机理 海洋生物毒素的作用机理尚不完全清楚，其中大部分毒素选择性作用于细胞膜 的受体、各种阳离子通道及蛋白质等具有高度敏感的靶分子，因而产生非常特殊的 作用。河豚毒索与海藻毒素是典型的钠离子通道阻滞剂【4 】，它们对细胞膜钠离子通 道的作用并不是简单的“分子嵌塞作用”，而首先通过毒素与膜专一性受体结合，再 通过关启机制控制钠离子通道的关启。西加鱼毒素是电压依赖性n a + 通道的激动 剂，可增加细胞膜对n a + 的通透性，产生强去极化，致使神经肌肉兴奋性传导发生 改变 。此外，一些细菌和藻类产生的石房蛤毒素也属n a + 通道的阻滞剂，引起 神经肌肉信号传导故障，导致麻痹性中毒【1 】。刺尾鱼毒素能特异性激活细胞膜钙离 子通道，增加钙离子的通透性，从而引起膜持续的去极化作用，导致一系列病理和 临床改变。某些地纹芋螺毒素是主要的阳离子通道阻滞剂。它们既作用于神经末梢 突触前膜又作用于突触后膜，阻滞各种阳离子通道【4 1 。 绪论 1 3 海洋生物毒素的应用 海洋生物毒素虽然具有强毒性，给人类带来的危害和损失是难以估量的，但随 着对毒素的研究的深入，其潜在的应用价值受到人们的广泛关注。目前的研究主要 是对毒素在神经系统、心血管系统、抗肿瘤等方面的作用进行药物开发。海洋生物 毒素作为开发新药的重要资源库，目前，毒素的研究应用已取得一系列重大进展。 由于河豚毒素能够有选择地与神经和肌肉细胞膜表面的n a 十通道上的蛋白质结 合，阻断n a + 通过，从而影响神经肌肉间兴奋性的传导，使神经肌肉呈麻痹状态【5 】o 因此，河豚毒素具有镇痛、镇痉、抗心率失常、降压等作用。极微量的河豚毒素对 脑外伤、脑神经疾病、心血管病的治愈率很高，也可制成药效长的止痛药，并可用 于帮助海洛因、吗啡成瘾者有效戒毒。 石房蛤毒素已开发为局部麻醉用药物，药效比普鲁卡因或可卡因强1 0 万倍， 且不会成瘾。有研究表明西甲鱼毒素能兴奋交感神经纤维使心率加快、心脏收缩力 增强，可开发做强心剂【6 j 。定鞭金藻素等毒素，具有抗菌和溶血作用，有望用作治 疗心血管疾病的药物。 美国“9 1 1 ”恐怖事件之后，伴随着呼吸性炭疽病病例的发现，具有毒性强 等特点的海洋生物毒素，引起广大研究者的关注，人们对毒素在军事方面及其相关 领域进行了研究。随着生物领域各项技术的高速发展，生物毒素的改造和合成已成 为了可能。恐怖活动所用到的毒剂易于获取且难以控制，因此，人们对毒素被滥用 的担忧加重。所以，如何防范和控制生物毒素在在战争及恐怖活动中的破坏作用， 值得人们深思和研究。而出于我国自身安全考虑，应该加强毒素在军事应用和防范 领域的研究。 海洋生物毒素是一类具有独特化学结构和毒理特性的活性物质。随着生物技术 的发展，今后对于海洋生物毒素，可以运用基因工程、发酵工程等生物技术手段培 植新的可产生海洋生物毒素的微生物，从而获得大量的海洋生物毒素，保护海洋生 物资源，具有广阔的实际应用前景。 2 河豚毒素的研究概况 2 1 河豚毒素的研究历史 河豚鱼又名吹肚鱼、气泡鱼，其鱼肉鲜嫩味美，营养丰富，味觉美感远盛于鱼 翅、海参，“长江三鲜 之首，被誉为“菜中皇后”、“鱼中王”。我国古谚云：不食 河豚，焉知鱼昧，食了河豚百无味。足见其久负盛名。在亚洲国家，人们自古就有 福建师范大学郑莺硕士学位论文 吃河豚的习惯，而在日本，更是被视为国宴佳肴。但河豚鱼是近海底肉食性有毒海 产鱼类【9 】，其体内含有剧毒，人畜误食后均能致死。我国最早关于河豚致人死亡的 记载见于两千年前的古书山海经，其记载“敦水出焉，东流注于雁门之水，其中 多世之鱼，食之杀人”。本草拾遗、神农本草经都有关于河豚毒素的记载。虽 然人们对河豚鱼的毒性很早就有记载研究，但对河豚鱼体内的毒素的分离一直不成 功。直到日本人田原良纯【1 0 】在1 9 0 9 年首先提纯出了0 2 的河豚毒素的粗品，并命 名为t e t r o d o t o x i n 。其后，日本对河豚毒素进行了大量的研究，取得了重大的突破。 横尾( 1 9 5 0 ) 等人首次从红鳍东方豚的卵巢中分离出河豚毒素结晶，而后，津 田、荒川、平田等人从不同的河豚鱼卵巢中提出河豚毒素的结晶【1 1 。上个世纪5 0 年代以前，我国学者对河豚毒素的研究基本是空白，5 0 年代后，才正式开始了对 河豚毒素的研究。1 9 8 5 年后，河北水产研究所、大连海洋渔业公司，江苏泰州康特 生物工程公司成功提取了t t x ，并作为工业产品投入市场。 2 2 河豚毒素的理化性质 河豚鱼中的毒性物质主要是河豚毒素，此外，河豚毒素有多种衍生物：脱水河 豚毒素、河豚酸、1 1 一脱水河豚毒素和5 一脱氧河豚毒素等【12 。河豚毒素主要存在性 腺、肝脏、脾脏、眼睛、皮肤、血液等部位。研究结果显裂1 3 j ：器官组织中以卵巢 和肝脏的毒性最强，皮肤和肌肉无毒或弱毒，不同的河豚种系间毒力有很大的差异， 雄鱼组织的毒素低于雌鱼。同一种属的河豚鱼在不同的海域或不同的季节捕获，其 毒性强弱也有十分明显的差别。一般在产卵期间( 1 2 6 月) 毒性最强，产卵后毒性减 弱。即使是同一鱼种，在同一时间捕获，也存在着个体差异。 河豚毒素( t e t r o d o t o x i n ，t t x ) 是一种小分子生物碱类的神经毒素，毒性很 强，毒力是剧毒物氰化钠的1 2 5 0 倍，是自然界毒性最强的非蛋白物质之一。分子 式为c 1 1 h 1 7 n 3 0 8 ，分子量3 1 9 2 7 。其结构特征为具有多羟基氢化5 ，6 苯吡啶母核， 含有碳环、胍基、羟基，在c - 5 和c - 1 0 位有一个与半醛糖内酯连的分开的环 1 4 】。 t t x 通过胍基特异结合于钠通道上，抑制神经细胞n a + 内流，阻断神经兴奋的传导 1 5 1 。结构式如图1 所示【5 6 】： 绪论 旷 图1 河豚毒素结构式 t ab 1t h ec o n s t r u c t i o no ft e t r o d o t o x i n t d ( 粗制品为棕黄色粉末，纯品为无色晶体，呈针状或菱形，不溶于无水乙醇、 乙醚、苯等有机溶剂，微溶于水，极易溶于稀酸水溶液 1 6 1 。1 1 x 以两性形式存在 1 7 1 。 理化性质较稳定，在中性和酸性下对热稳定。在碱性条件下易被分解，生成2 - 氨基 一6 羟甲基一8 羟基一喹唑啉【l 引。 2 3 河豚毒素的中毒症状及解毒研究 t t x 中毒后出现症状的快慢、严重程度除了与毒素摄入量有关外，还与人本身 的体质有关。毒素作用于脑干、运动、感觉等神经而引起中枢神经、神经肌肉、心 血管和胃肠道功能障碍等临床特征。人食用河豚鱼中毒时，潜伏期短，为1 0 m i n 至 3 h 。通常症状【2 0 为初感全身不适，继而出现恶心、呕吐、腹痛等胃肠症状，然后口 唇、舌尖及手指末端刺痛发麻，接着感觉消失而麻痹，四肢肌肉麻痹，身体共济失 调，全身麻痹( 瘫痪状态) ，最后呼吸衰竭而死。特点是中毒速度快，最快在发病后 1 0 m i n 死亡，最迟亦可在8 小时以内致死，一般是4 6 小时，如抢救及时病程超过 8 9 h 未死亡者多能恢复，病死率4 0 - - , 6 0 1 9 。2 1 1 。 1 1 x 对小鼠的l d s o 是8 , , , , 1 0 u g k g ( 腹腔注射) ，成人( 5 0 k g ) 最小致死剂量 ( m l d s o ) 为i 0 ，0 0 0 m u ，相当于2 m g 2 2 j 。1 1 x 中毒目前无特效解毒药，临床的治 疗方法主要是用洗胃及对症治疗。中毒的话应彻底催吐、洗胃和导泻，以排出尚未 吸收的毒素。呼吸困难可用洛贝林等药物注射，肌肉麻痹可用1 盐酸士的宁肌肉 注射，同时用高渗葡萄糖液输液以保护肝脏【2 们。 除了上述常规治疗河豚毒素中毒外，一些学者对中草药解毒作用进行了研究。 张永贵【捌的研究表明新斯的明和东莨碱都能不同程度地拮抗t t x 。谢克勤 2 4 】等在 i 临床中也发现碳酸氢钠、氢溴酸东莨菪碱对t 1 1 x 有明显的拮抗作用。 此外，t t x 中毒病人可饮入大量新鲜芦柑果汁，同时注射剂s p ( 亚硫酸氢钠 福建师范大学郑莺硕士学位论文 和磷酸的混合液) 2 5 】来解毒。廖永岩 2 6 】等的研究还建议可用蜀葵煎剂来治疗t t x 中 毒。此外，国外学者还研制了防1 1 中毒的新途径，即将抗血清和单克隆抗体用于 t t x 中毒【2 7 】。 2 4 河豚毒素毒性机理 t 的作用机制 2 0 】为：t d ( 选择性地抑制神经细胞膜对钠离子的通透性，从而 阻断神经冲动的传导，使神经呈麻痹状态。t d ( 活性基团是胍胺基和羟基，胍胺基 发生质子化后形成正电活性区域，与钠通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，阻滞 钠离子进入通道。1 1 x 受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，1 1 x 与受体 部位结合，阻碍钠离子接近通道外口。1 1 特异性作用于钠通道，不直接影响钾、 钙通道。1 1 x 对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周神经的共同作用的结果【2 0 , 2 8 】。 3 河豚毒素的药理作用 河豚毒素( t t x ) 是一类重要且有用的药理学工具药。其药理作用归纳起来主 要有以下几点： 3 1 对n a + 通道的作用 s u s a n 等以浣熊为实验动物研究了t t x 作为麻醉的电生理机制，结果证明t t x 的麻醉效果优于利多卡因 2 9 1 。张永健 3 0 】通过河豚毒素对局麻药的局麻作用和毒性 的影响实验中，表明微量的t t x 可增强局麻药的麻醉效力，但不增加局麻药的毒性。 3 2 抗心律失常作用 奎尼丁、利多卡因是临床常用的抗心律失常药，不仅阻断心肌n a + 通道，也同 时影响c a 2 + 、k + 通道。而t t x 选择性阻断n a + 通道，不影响c a 2 + 、k + 通道。朱成 华等口1 】研究表明微量的t t x 可显著增强抗心律失常药的疗效，不能增强奎尼丁的 抗心律失常作用。此外，有研究显示微量的t t x 可增强心得安或戊脉安的抗心律失 常作用l 圳。 3 3 对心血管的作用 t t x 作用是会产生严重的低血压【3 3 1 。李蕴山等【3 4 】入的研究结果表明尽管腹腔 注射极微量t t x 不影响猴的收缩压和舒张压，微量的t t x 与心得安合用时可短时 降低舒张压。蔡志基日5 】的实验证明国产河豚毒素也具有降压功效。 3 4 镇痛作用 于丽华等【_ j b j 人的实验研究的结果显示注射微量的t t x 具有镇痛作用。此外， 局部注射t t x 可抑制家兔齿髓刺激所引起的疼痛反应【3 列。徐英在研究致痛实验时， 绪论 发现t t x 有镇痛作用，与吗啡联合应用具有协同镇痛效应【3 8 1 。 3 5 呼吸抑制作用 t t x 所致的呼吸衰竭与其抑制呼吸中枢有关，但也有学者的研究结果显示呼吸 神经和呼吸肌麻痹是t t x 导致呼吸衰竭的主要因素。研究证明，t t x 引起的呼吸衰 竭以至死亡与中枢和外周成分都有关唧j 。 3 6 其他药理作用 l - 删等人在急性肾衰模型上观察了t t x 对肾衰的保护作用。结果发现，t t x 对 急性缺血性肾衰有保护作用，肾衰前后给予t t x ，保护作用相同。但抗肾衰作用的 机理尚未明确。于丽华等【4 1 】人通过小鼠精子畸变试验及小鼠脊髓细胞微核试验和染 色体畸变试验观察，证实t t x 无致突变性。陈松强【4 2 的研究表明t t x 明显的影响 小鼠骨髓细胞徽核及分裂指数。 河豚毒素的药理研究为其临床应用奠定了理论基础。t t x 具有多种药用价值。 有国内学者【珥纠报道t t x 具有抗肿瘤作用，此外，t 还具有抑菌作用。但由于t t x 毒性极大，限制了它在临床上的应用及开发，一些潜在的药用价值有待开发。随着 科学技术的发展，提取的t t x 纯度的提高以及药理学的更深入的研究，河豚毒素的 临床应用必将得到更大的发展。 4 河豚毒素的分布与起源 4 1t t x 的分布情况 原本人们认为t t x 只存在于各类鲔科鱼类中，但随着检测方法的目益更新，逐 渐发现t t x 还广泛分布于其他动物中。1 9 0 9 年，田园良纯【1 0 】从河豚卵巢中提取出 t t x 粗品。1 9 6 4 年，m u s h e r 等l q q j 从美国加州蝾螈内分离到t t x ，才打破了河豚毒 素只存在于河豚体内这种说法。已报道的t t x 及其类似物的生物见表1 4 s ，4 6 1 福建师范大学郊莺硕士学位论文 表1 检测到能产1 1 x 的生物 f a b 1 a n i m a l sw i t ht i no ro nt h es u r f a c eo ft h eb o d y 1 1 或r 类似物的生物作者年份 蝾螈( t a r i c h at o r o s a )m o s h e r ，1 9 6 4 ；w a k e l ye ta l ，1 9 6 6 虎鱼( g o b i u sc r i n i g e r )a s h i m o t o a n d n o g u c h l ，1 9 7 1 ； n o g u c h ia n dh a s h i m o t o ，19 7 3 青蛙( a t e l o p u sv a r i u s ) 蟾蜍卵( a t e l o p u sc h i r i q u l e n s l s ) 章鱼( h a p a l o c h l a e n am a c u l o s a ) 海螺( c h a r o n i as a u l i a e ) 象牙贝( b a b y l o n i a j a p o n i c a ) 海星( a s t r o p e c t e np o l y a c a n t h u s ) 腹足纲软体动物( n i o t h ac l a t h r a t a ) 河豚( l a g o c e p h a l u sl u n a r i sl u n a r i s ；n i p h o b l e s ) 螃蟹( z o s i m u sa e n e u s ；a t e r g a t i sf l o r i d u s ) 青蛙( b r a c h y c e p h a l u se p h i p p i u m ) 扁形虫( p l a n o c e r ar e t i c u l a t a ) 扁形虫( p l a n o c e r am u l t i t e n t a c u l a t a ) 蝾螈( c y n o p se n s i c a u d a ) 丝虫( l i n e u sf u s c o v i r i d i s ；t u b u l a n u sp u n c t a t u s ) 箭虫( e u k r o h n i ah a m a t a ；p a r a s a g i t t ae l e g a n s ) 青蛙( a t e l o p u so x y r h y n c h u s ) 环节动物( p s e u d o p o t a m i i l ao c c e l a t u s ) 蝾螈( t g r a n u l o s a ；t v u l g a r i st r i t u r u sa l p e s t r i se ta l 丝虫( c e p h a l o t h r i xl i n e a r i s ) 贝( n a t i c al i n e a t e ) 蟾蜍( a t e l o p u so x y r h y n c h u s ) 青蛙( c o l o s t e t h u si n g u i n a l l s ) 中华绒餐蟹( a t e r g a t i sf l o r i d u s ) 河豚( f u g up o e c i i o n o t u s ) a 1 ，1 9 9 5 马蹄蟹( c a r c l n o s c r p o u sr o t u n d i e a u d a ) 蟾蜍( a t e l o p u ss u b o m a t u s l ；a p e r u e n s l s ) 蟹( l o p h o z o z y m u sp i c t o r ) 蟹( a t e r g a t o p s i sg e r m a i n l ) 腰鞭毛虫( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 蟹( a t e r g a t i sf l o r i d u s ；d e m a n i ar e y n s u d i ) 海星( a s t r o p e c t e ns c o p a r i u s ) 河豚胚胎( f u g un i p h o b l e s ) 河豚( s p h o e r o i d e sa n n u l a t u s ；s 1 0 b a t u s ；s 1 i s p u s ) 丝虫( c e p h a l o t h r i xs p ) k i me ta l ，1 9 7 5 p a v e l k ae ta l ，1 9 9 7 s h e u m a c ke ta 1 19 7 8 n a r i t ae ta l ，1 9 8 i n o g u c h ie ta 1 19 8 1 n o g u c h ie ta i 1 9 8 2 m a r t l y a m ae ta 1 19 8 5 m i y a z a w ae ta 1 1 9 8 6 j e o ne ta 1 ，1 9 8 4 n o g u c h ie ta 1 1 9 8 4 h w a n g 1 9 9 2 s h i o m ie ta 1 ，1 9 8 5 y a s u m u r a 19 8 6 s e b b e ne ta 1 ，1 9 8 6 j e o ne ta 1 19 8 6 m i y a z a w ae ta 1 1 9 8 7 m i y a z a w ae ta 1 19 8 6 n o g u c h i 1 9 9 1 y a s u m o t oe ta 1 ，1 9 8 8 m i y a z a w ae ta 1 1 9 8 8 t h h e s e ne ta 1 19 8 8 m e b sa n ds c h m i d t ，l9 8 9 y a s u m o t oe ta 1 19 8 9 y o t s ue ta 1 19 9 0 a l ie ta 1 1 9 9 0 h w a n ge ta 1 ，1 9 9 1 y o t s ue ta 1 1 9 9 2 d a l ve ta 1 1 9 9 4 a r a k a w ae ta 1 ，l9 9 4 y o t s u - y a m a s h i t ae t k a n c h a n a p o n g k u l ，19 9 5 m e b se ta 1 1 9 9 5 t s a ie ta 1 1 9 9 5 t s a i 1 9 9 6 k o d a m ae ta 1 1 9 9 6 ，i 、s a i 1 9 9 7 l i ne ta 1 1 9 9 8 m a t s u m u r a , 19 9 8 n u n c z v a z q u e ze ta 1 ，2 0 0 0 a s a k a w ae ta 1 ，2 0 0 0 8 绪论 续表1 检测到能产1 1 x 的生物 t a b 1a n i m a l sw i t ht r i no ro nt h es u 晌c eo ft h eb o d y t t x 或n x 类似物的生物作者年份 菲律宾河豚( a r o t h r o nm a p p a ；a s t e l l a t u s )s a t o ，2 0 0 0 台湾虾虎鱼( p r a c h a e