（微生物学专业论文）鸡腿蘑深层发酵技术及其多糖分离纯化的研究.pdf

摘要 鸡腿蘑c o p r i n u sc o m a t u s 是一种味道鲜美，营养丰富、食药兼用的大型真菌。 鸡腿蘑多糖具有降血糖、提高免疫活性、抗肿瘤等作用。目前它已被定为符合联合 国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 要求的集“天然、营养、保健”三种 功能为一体的1 6 种珍稀食( 药) 用真菌之一。由此可见，鸡腿蘑是一种极具开发潜 质和应用前景的食( 药) 用真菌。本试验选择鸡腿蘑作为研究对象，对它的深层发 酵技术及其多糖的提取和分离纯化进行了研究，主要研究结果如下： 1 、通过单因素和正交试验，确定鸡腿蘑发酵优化培养基配方为：玉米淀粉4 0 ， 黄豆饼粉0 2 ，蔗糖3 0 ，k h 2 p 0 40 1 ，m g s 0 40 1 ，c a s 0 40 0 5 ，玉米浆0 5 。 2 、确定摇瓶发酵条件为：起始p h 6 ，转速1 7 0 f r a i n ，装量系数为0 4 ，接种量 1 0 。利用优化后的发酵培养基和培养条件进行发酵周期试验，发酵时间为6 d ，此 时胞外多糖含量可达1 4 6 玑，生物量可达1 7 7 0 9 t , 。p a 在整个发酵周期中由初始 的6 0 5 降到5 4 3 ，变化不大。通过5 0 l 发酵罐试验发现在发酵1 2 0 h 时，镜检菌丝 开始老化，即中止发酵。此时测定生物量为1 5 7 0 9 m ，胞外多糖含量为1 2 4 9 l 。 3 、通过一系列单因素试验，确定鸡腿蘑发酵上清液胞外多糖的提取条件为：将 发酵上清液p h 调整至5 ，然后加入等体积无水乙醇，置于1 5 1 2 温度下醇析2 4 h 。在 此条件下，胞外多糖得率为0 1 8 。通过b ( 3 4 ) 正交试验确定了鸡腿蘑菌丝体胞内水 溶性多糖的提取条件为：湿菌丝体匀浆后微波处理3 m i n ，然后按料水比1 ：2 加水， 在5 5 水浴中抽提6 h ，提取液用无水乙醇醇析。在此条件下，胞内水溶性多糖得率 约为1 0 3 。 4 、采用s e v a g 法除蛋白，透析法脱盐对鸡腿蘑粗多糖进行初步纯化，并利用 b ( 3 4 ) 正交试验确定了s e v a g 法去蛋白的条件为：v 掸目：v - 仿+ 正t m = l ：l ，v 氯仿：v 丁_ = 5 ：i ， 振荡时间为3 0 r a i n 。在此条件下，租多糖中蛋白去除率约为6 9 。 5 、通过d e a e - 纤维素3 2 柱层析对经过初步纯化的鸡腿蘑粗多糖进行了分级分 离，用去离子水、n a h c 0 3 、n a o h 洗脱时，发酵液胞外粗多糖( c e p ) 和菌丝体胞 内粗多糖( c m p ) 都分别至少含有3 个多糖组分，其中c e p - i i ( 酸性多糖) 和c m p i ( 中性多糖) 占大部分然后把c e p - i i 和c m p 1 分别用s e p h a d e xg - 2 0 0 凝胶 过滤色谱再进行分级分离，又分别得到分子量大小十分接近的两个组分c e p - i i - i 、 c e p i i 一2 和c m p - i l 和c m p - i 一2 ，其中c e p ：- i i - 1 与c e p i i 一2 所占比例接近， 分别占5 4 和4 6 ；而c m p i 一1 和c m p i 一2 中c m p i 一1 占8 1 。 关键词：鸡腿蘑；食( 药) 用真菌；深层发酵；多糖；提取：分离纯化 a b s t a c t c o p r i n u s c o m a t u si sad e l i c i o u s ，n u t r i t i o n a le d i b l ea n dm e d i c i n a l f u n 西 p o l y s a c c h a r i d e sf r o mc o p r i n u sc o m a t l 坷p o s s e s saw i d ev a r i e t yo fp h y s i o l o g i c a la c t i v i t y ， s u c ha sb l o o ds u g a r - l o w e r i n g , i m m u n o m o d u l a t i n g ，a n t i t u m o r ，e t c c o p r i n u sc o m a t u sh a s b e e na f f i r m e db e i n go n eo fs i x t e e nv a l u a b l ea n dg a l ee d i b l ea n dm e d i c i n a lf u n g iw h i c hi s n a t u r a l ，n u t r i t i o n a l ，h e a l t hp r o t e c t i v eb yf a oa n dw h o a sar e s u l t , c o p r i n u sc o m a t u si s ae d i b l ea n dm e d i c i n a lf u n g iw h i c hw i l lb ew i d e l yd e v e l o p e d t e c h n o l o g yo fc o p r i n u s c o m a t u ss u b m e r g e df e r m e n t a t i o na n di t s p o l y s a c c h a r i d ee x t r a c t i o n ，i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o nw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r t h em a i nr e s u l t sw e r e a sf o l l o w s ： 1 b ym o n o f a c t o r i a la n do r t h o g o n a lt e s t , a no p t i m u mm e d i u mh a d b e e ns e l e c t e d t h e m e d i u mc o m p o s i t i o nw a sa sf o l l o w ：4 m a i z ea m y l u l n ，0 2 鲫y b e a nc a k em e a l ，3 s u c r o s e ，o 1 k h 2 p 0 4 ，o 1 m g s 0 4 ，0 0 5 c a s 0 4 ，o 5 c o f us t e e pl i q u o r 2 t h es u i t a b l es h a k i n gc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w ：i n i t i a lp ho fm e d i u m6 0 ， s h a k i n gf r e q u e n c y1 7 0 r r a i n , 1 0 0 m lh q u i dm e d i u mi ns i z e2 5 0 m ls h a k i n gf l a s l i n o c u l a t i o nq u a n t i t y1 0 ，f e r m e n t a t i v et i m e6d a y s o nt h i sc o n d i t i o n , t h ep r o d u c t i o no f 1 5 7 0 9 lb i o m a s sa n d1 4 6 9 le x t r a c e l l u l a rp o l y s a c e h a r i d ew e r eo b t a i n e d p hf e l lf r o m 6 0 5t o5 4 3i nc o u r s eo ft h ef e r m e n t a t i o n t h er e s u l to ff e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n ti n5 0 l f e r m e n t e rs h o w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o nh a db e e ne n d e dt l pa f t e r1 2 0h o u r s t h e p r o d u c t i o no f1 5 7 0 9 l b i o m a s sa n d1 2 4 9 le x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ew e r eo b t a i n e d 3 b ym e a t l sm o n o f a c t o f i a lo ft e s t , t h ee x t r a c t i v ec o n d i t i o n s o fe x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d ew e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：p ho ff e r m e n tl i q u i d5 0 ，a d d i t i o no f1 v o l u m eo f e t h a n o l ，t e m p e r a t u r e l 5 c ，p r e c i p i t a t i o nt i m e2 4 h 。t h ee x t r a c t i v ee f f i c i e n c yo f e x t r a e e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ew a s0 1 8 b yo r t h o g o n a lt e s t ，t h ee x t r a c t i v ec o n d i t i o n so f m y c e l i a lw a t e r - s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d ew e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：w a t e r m y c e l i a = 2 1 ， m i c r o w a v eh e a t i n gt i m e3m i n u t e s ，e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e5 5 ，e x t r a c t i n gt i m e6 h t h e e x t r a c t i v ee f f i c i e n c yo fm y c e l i a lp o l y s a c c h a r i d ew a s1 0 3 4 c m d ep o l y s a c c h a r i d e sw e r ep r e l i m i n a r yp u r i f i e db yd e p r o t e i n i z a t i o nw i t hs c r a g s p r o c e d u r ea n dd e i o n i z a t i o nw i t hd i a l y s i s c o n d i t i o n so fd e p r o t e i n i z a f i o nw i t hs c r a g s p r o c e d u r e w e r ed e t e r m i n e da s f o l l o w s ：v 0 m 出：v c 嘶衄+ n 籼t 珊t = 1 ：l ， v d i i o 岫：舢l a n 0 = 5 ：1 ，s h a k i n gt i m ew a s3 0m i n u t e s e f f i c i e n c yo fd e p r o t e i n i z a t i o nw a s a b o u t6 9 5 t h ep a r t i a lp u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d e sw e r ef u r t h e rg r a d e da n dp u r i f i e db yd e a e c e l l u l o s ec o l u m e a sar e s u l t ，t h r e ef a c t i o n si ng l pa n dg m pw e t eo b t a i n e d ，r e s p e c t i v e l y g l p i ia n dg m p 1w e r et h em a i na n dl a r g ef a c t i o n s t h e ng l p i ia n dg m p 1w e r e n f u r t h e rg r a d e da n dp u r i f i e db ys e p h a d e xg - 2 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h et w of a c t i o n sw e r es i m i l a rw h i c ho b t a i n e di n g l p i ia n dg m p - i r e s p e c t i v e l y g l p i i - 1a n dg l p - i i 2r e p r e s e n t e d5 4 a n d4 6 o f t o t a la m o u n t g m p i 1w a sam a i na n dl a r g ef a c t i o n ，r e p r e s e n t i n g8 1 o ft o t a la m o u n t k e yw o r d s ：c o p r i n u sc o i m i b i s ；e d i b l eo rm e d i c i n a lf u n g i ；s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ； p o l y s a c c h a r i d e ：e x t r a c t i o n ：i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：椤即为 时间： m 6 年1 2 - 月j 7 1 3 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 槲：常撇膨呼 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 刖置 l 食( 药) 用真菌深层发酵技术和多糖简介 1 1 食( 药) 用真菌深层发酵技术简介 深层发酵是食( 药) 用菌液体培养的一种，它是将菌种培养在发酵罐或锥形瓶 内，通过不断通气搅拌或振荡，使菌体在液体深层处繁育的方法( 张松，2 0 0 0 ) 。 深层发酵技术属于现代生物技术之一，它比传统的食( 药) 用真菌栽培生产技 术具有明显的优越性：菌丝生长快，生物量高；可提高代谢产物的产量；生 产过程不受季节限制；有效减少污染；占地面积小，易于实现工业化生产( 张 建辉等，2 0 0 2 ) 。 自1 9 4 8 年美国h u m f e l dh 等成功地对蘑菇进行深层发酵和1 9 5 8 年s z u e e sj 等 第一个用发酵罐对羊肚菌深层培养以来，液体深层发酵技术在食( 药) 用真菌制种、 综合利用等方面的应用日趋广泛( 朱金华等，1 9 9 3 ) 。中国是1 9 5 8 年开始研究蘑菇、 侧耳等的深层发酵的，1 9 6 3 年羊肚菌液态发酵开始工业化生产试验。自此以后，大 规模采用液态发酵生产食( 药) 用真菌逐渐展开。当时主要研究灵芝、蜜环菌、银 耳等的液态发酵应用于医药工业，7 0 年代开始研究香菇、冬虫夏草、黑木耳、金针 菇、猴头、草菇等的液态发酵。从已有的试验结果比较来看，深层培养食( 药) 用 真菌菌丝体的营养价值高，从多糖、蛋白质、氢基酸的含量来看均类似或超过了子 实体( 周键等，2 0 0 3 ) 。 1 2 多糖简介 多糖又称多聚糖，是由1 0 个分子以上或者更多的单糖基通过糖苷键线性或分支 连接而成的链状聚合物( 张群等，2 0 0 5 ) 。多糖种类繁多，来源广泛，广泛存在于动 物、植物、微生物( 细菌和真菌) 和海藻的细胞中，是自然界中含量最丰富的生物 聚合物，也是构成生命活动的四大基本物质之一，并与维持生命功能密切相关( 魏 传晚等，2 0 0 4 ；刘颖等，2 0 0 6 ) 。 根据存在的位置不同，多糖可分为胞外多糖和胞内多糖；根据来源不同，可分 为动物多糖、植物多糖、微生物多糖；根据单糖成份组成种类不同可分为均多糖和 杂多糖。 多糖是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。研究表明，多 糖具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等多种生物功能。因此对多糖 的研究愈来愈引起国内外生物学家、化学家和药理学家的兴趣，有关专家曾经预言 “2 1 世纪将是多糖的时代”( 杜丽平和肖冬光，2 0 0 5 ) 。 自从2 0 世纪7 0 年代日本学者千原羽田率先证实了香菇多糖的抗肿瘤活性后， 在生物学、医学、药物学、食品科学等领域掀起了食( 药) 用真菌多糖研究的热潮。 近年来，国内外已从高等担子菌中筛选到2 0 0 余种有生物活性的多糖物质，我国发 现有重要价值的食( 药) 用真菌多糖近3 0 种( 吕长武等，2 0 0 5 ) 。食( 药) 用真菌 多糖作为一种生物非特异性免疫促进剂和非细胞毒性物质，正越来越受到人们的推 崇与喜爱。 2 食( 药) 用真菌多糖的生物活性 2 1 抗肿瘤作用 肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病。现已证明，高等真菌已有5 0 个属1 7 8 种 的提取物具有抑制小鼠s 瑚肉瘤及艾氏腹水瘤等细胞生长的生物学效应，其中绝大 部分是食( 药) 用真菌多糖( 陈传红等，2 0 0 6 ) 。 食( 药) 用真菌多糖的抗肿瘤活性机理至今尚未完全清楚。根据目前研究得知， 食( 药) 用真菌多糖大多并不直接杀灭肿瘤细胞，而是作为一种生物反应修饰剂 ( b r m ) ，增强机体免疫功能，间接地抑制肿瘤细胞生长，起到扶正固本的作用( 陈 金烟和卢政辉，2 0 0 2 ) 。而有些食( 药) 用真菌多稽对肿瘤细胞有直接的细胞毒活性， 在体外可直接杀死癌细胞，而对正常动物细胞无杀伤作用。如姜自彬等在显微镜下 观察到s 1 腹水瘤细胞在糙皮侧耳多糖的作用下，细胞逐渐膨胀，细胞膜上形成一 些小泡状凸起，在1 h 内完全破碎，而糙皮侧耳多糖对脾、肝脏、肾、胸腺等细胞没 有作用，细胞完好无损。还有些食( 药) 用真菌多糖可通过改变细胞膜生化特性， 影响肿瘤细胞新陈代谢而发挥抗肿瘤作用，如茯苓多糖( g g 小定等，2 0 0 2 ) 。 目前经动物实验证明有明显抑制肿瘤效果、化学结构较清楚的食( 药) 用真菌 多糖有香菇多糖、猪苓多蓿、茯苓多糖、云芝菌丝体多糖、姬松茸多糖等，银耳多 糖、灵芝多糖、冬虫夏草多糖、假蜜环菌多糖、竹荪多糖等。 2 2 免疫调节作用 大量免疫实验证明，食( 药) 用真菌多糖不仅能激活t 细胞、b 细胞、巨噬细 胞、自然杀伤细胞、细胞毒t 细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞等免疫细胞，还能促 进白细胞介素1 ( i l - 1 ) 、白细胞介素2 ( n - 2 ) 、肿瘤坏死因子( n 盯) 、干扰素吖( i f n 吖) 等细胞因子的生成，活化补体等，从而在增强机体免疫系统功能、抗肿瘤、抗病毒 等多方面发挥重要的调节作用。( 熊中良和邓春生，2 0 0 6 ) 如王汉涛等研究发现，云 芝多糖2 5 0 5 0 0 m e c k g d x 7 d 灌胃，可显著提高小鼠脾t 细胞产生的i l - 2 、i f n - 7 的水 平；5 0 0 m g k g d x t d 灌胃，可显著增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌t n f 和i l l 的能力( 王 汉涛等，1 9 9 3 ) 。 2 目前具有较强免疫调节作用的食( 药) 用真菌多糖有香菇多糖、银耳多糖、猴 头菌多糖、猪苓多糖、云芝胞内多糖、鸡腿蘑多糖、木耳多糖、虫草多糖、树舌多 糖、金顶侧耳多糖和羊肚菌多糖等。 2 3 降血糖作用 现已发现具有降血糖活性的食( 药) 用真菌多糖有灵芝多糖、虫草多糖、云芝多 糖、银耳多糖、毛木耳多糖、猴头菌多糖、鸡腿蘑多糖、木耳多糖、灰树花多糖等。 k i m 等以5 种不同药用茵菌丝产生的胞外多聚体，对链脲菌素( s t z ) 诱导的糖 尿病大鼠分别用5 0 m g k g 喂养7 d ，香菇和蛹虫草胞外多聚体组的大鼠血浆中的葡萄 糖、总胆固醇和三酰甘油水平显著降低。灵芝胞外多聚体组的大鼠，血浆中的葡萄 糖和总胆固醇水平也降低，但三酰甘油水平无显著变化。喂养3 种药用菌的大鼠的 血浆中的谷氨酸一丙酮酸转酰胺酶水平也显著降低。结果证实了3 种药用菌对s t z 诱导的糖尿病大鼠有降低血糖的作用。( k i m d h e t a l ，2 0 0 1 ) h i r o s h i 等从赤芝子实 体中分离得到两种具有降血糖活性的多糖g a n o d e r a na 和g a n o d e r a nb ，对正常小鼠 及四氧嘧啶诱发的高血糖小鼠都有明显降糖活性。( h i r o s h ic ta l ，1 9 8 5 ) 2 4 降血压、降血脂、抗血栓作用 研究发现，银耳多糖可降低高胆固醇血症小鼠血清胆固醇含量，并随剂量加大 而增强。银耳孢子多糖可使血清中总胆固醇( t c ) 、游离胆固醇( f r e e c h ) 、胆碱酯 酶( c h e ) 、甘油三酯( t g ) 、b 腊蛋白( b - l p ) 含量明显降低。香菇多糖可促进 胆固醇代谢而降低其在血清中的含量。灵芝水提物能防止注射肉毒素诱发播散性血 管内凝血大鼠的血小板和纤维蛋白质减少，延长前凝血酶原时间，增加纤维蛋白降 解产物，防止肝静脉血栓形成。竹荪多糖对降低血压是十分有效的。冬虫夏草多糖 对心律失常、房性早搏有疗效，灵芝多糖对心血管系统具调节作用，可强心、降血 压、降胆固醇、降血糖等。姬松茸多糖能降血脂、提高耐氧能力。真菌多糖可增强 冠体流量与心肌供氧、降低血脂、预防动脉粥样硬化斑的形成( 吴新君等，2 0 0 4 ) 。 2 5 抗氧化活性 超自由基是生物体内有氧代谢过程中产生的重要自由基之一，它能够直接和间 接地引起生物大分子的氧化破坏，诱发膜脂质过氧化，降低膜脂流动性，是生物体 衰老和许多疾病产生的重要原因( 孙运风，2 0 0 6 ) 。目前已发现许多食( 药) 用真菌 多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物 膜和延缓衰老的作用。 研究发现，云芝多糖能明显增强谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) 的活性。给大鼠 灌喂云芝多糖后，发现肝内还原型谷胱甘肽下降，而氧化型谷胱甘肽上升，说明提高 3 了g s h p x 的活性( y e u n g j he ta l ，1 9 9 6 ) 。从长白山野生云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l a r ) 中提取的彩云多糖( c v p s ) ，给予荷瘤或受t 射线全身照射的小鼠，能使多种脏器和 细胞内超氧化物歧化酶( s o d ) 活力升高、脂质过氧化物( l p o ) 水平下降( 谭建权 等，1 9 9 9 ) 。周学军和俞发的研究结果表明，小鼠腹腔注射毛木耳多糖在2 0 1 6 0 m g k g 剂量范围内均能降低小鼠血清中脂质过氧化物的含量，提高小鼠全血超氧化物歧化 酶的活力，并都呈现出一定的剂量依赖性( 周学军和俞发，2 0 0 0 ) 。 目前发现的具抗氧化活性的食药用真菌多糖还有凤尾菇多糖、香菇多糖、虫草 多糖、短裙竹荪多糖、糙皮侧耳多糖、猴头多糖、木耳多糖和虎奶菇多糖等。 2 6 抗病毒作用 食( 药) 用真菌多糖对多种病毒，如艾滋病毒( h i v - 1 ) 、单纯疱疹病毒( h s v - 1 ， h s v - 2 ) 、巨细胞病毒( c m v ) 、流感病毒、囊状胃炎病毒( v s v ) 、劳斯肉瘤病毒( r s v ) 、 反转录病毒和鸟肉瘤病毒( a s v ) 等，有良好的抑制作用。香菇多糖对水泡性口炎病 毒感染引起的小鼠脑炎有治疗作用，对阿拉伯耳氏病毒和十二型腺病毒有较强的抑 制作用。带有肽残基的云芝多糖，也具有明显的抗病毒作用，已经制成药物用于临 床治疗慢性肝炎，并用于肝癌的预防( 李金灿等，2 0 0 5 ) 。 食( 药) 用真菌多糖的抗病毒作用主要是通过免疫调节机制产生宿主免疫功能， 以抵抗病原体的侵袭( 孟庆虹和张守文，2 0 0 3 ) 。 2 7 保肝健胃作用7 香菇多糖、树舌提取物有保肝并增强排毒能力，降低由四氯化碳引起的血清转 氨酶水平的作用。猴头菌多糖可增加肾液分泌、稀释胃酸、保护溃疡面、促进粘膜 再生，对胃癌、慢性萎缩性胃炎、食道癌、十二指肠溃疡有显著疗效。云芝多糖对 慢性肝炎、乙型肝炎皆有防治作用。茯苓多糖含有茯苓酸、层孔酸等1 6 种具有药理 作用的物质，具有增强机体免疫能力，有护肝解毒作用( 秦俊哲等，2 0 0 4 ) 。周昌 艳等研究了几种真菌多糖预防酒精肝损伤的影响，结果发现，灵芝多糖具有一定预 防酒精肝损伤的作用( 周昌艳等，2 0 0 2 ) 。 2 8 其它活性 食( 药) 用真菌多糖除了以上这些生物学活性外，还具有抗衰老、抗辐射、抗 毒物损伤、抗水肿、抗疲劳、祛痰镇咳，促进核酸和蛋白质的生物合成、修复损伤 的组织细胞等多种功效( 陈传红等，2 0 0 6 ) 。具有抗辐射作用的真菌多糖有灵芝多糖 和猴头多糖，具有抗衰老作用的真菌多糖有香菇多糖、虫草多糖、毛木耳多糖、灵 芝多糖、猪苓多糖、云芝多糖和猴头菌多糖。黑木耳多糖、银耳和银耳孢子多塘、 灵芝多糖能促进核酸和蛋白质的合成( 李小定等，2 0 0 2 ；陈红霞，2 0 0 5 ) 。 4 总之，随着对食( 药) 用真菌多糖生物活性研究的不断深入，使其研究、开 发和应用成为一个热点。但由于食( 药) 用真菌多糖结构复杂。导致其构效关系 的研究很不完善，从而限制了它的研究与开发。因此对于未开发的食( 药) 用真 菌资源来说，还需要进一步加强研究和开发的深度和广度，进一步了解它的化学 结构、生物活性和构效关系，使其在食品工业、发酵工业、医疗保健等领域得到 更广泛的应用。 3 食( 药) 用真菌多糖的化学结构与构效关系 3 1 食( 药) 用真菌多糖的化学结构 食( 药) 用真菌多糖的化学结构是其生物活性的基础，认识和了解它的结构有 助于更好的利用和开发多糖。 3 。1 。1 食( 药) 用真菌多糖的组成方式 通过近二十年来的研究发现，食( 药) 用真菌多糖的组成方式主要有以下几种 类型：以葡聚糖为主要组分：这种葡聚糖由d ( 1 ，3 ) 糖苷键连接的主链和p ( 1 ，6 ) 糖苷键连接的支链组成。例如：香菇多糖、茯苓多糖、云芝多糖等都是这种结构( 吴 新君等，2 0 0 4 ) 。以a 糖苷键连接的甘露聚糖为主的结构：如蛹虫草多糖由a ( 1 ，2 ) 糖苷键连接，银耳多糖和黑木耳多糖由a ( 1 ，3 ) 糖苷键连接，灵芝多糖由a ( 1 ，4 ) 糖苷键连接( 朱建华和杨晓泉，2 0 0 5 ) 。杂多糖：如冬虫夏草多糖，其单糖组分半 乳糖与甘露糖之比为6 ：5 ，是含少量蛋白有高度分支结构的杂多糖，它以p ( 1 ，2 ) 糖苷键连接的甘露糖为主干，支链由p ( 1 ，6 ) 糖苷键连接的半乳糖和d ( 1 ，2 ) 糖苷 键连接的呋喃半乳糖构成( 王斌和连宾，2 0 0 5 ) 。糖蛋白和多糖肽：如云芝多糖是 以葡聚糖为主要组分的糖蛋白，当彻底除去蛋白质或多肽后，其抗肿瘤活性将大大 降低( 曾凯宏等，2 0 0 1 ) 。糙皮侧耳多糖是一种多糖肽，其中多肽和多糖的含量分别 是1 7 1 1 m g m l 和1 3 8 8 z g m l ( 李华等，1 9 9 4 ) 。 3 1 2 食( 药) 用真菌多糖的结构层次 食( 药) 用真菌多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构及四级结构。 一级结构包括单糖残基的组成、排列顺序、连接方式、异头物构型及糖链有无分支、 分支的位置与长短性等，与蛋白质和核酸相比，糖的一级结构更加复杂，例如，两 种氨基酸只能构成一种二肽，而两种相同单糖能结合成1 1 种不同的多糖；二级结构 是指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体，只关系到多糖分子中主链的构 象，不涉及支链的空间排布；三级结构是指二级结构由于糖单体的羟基、羧基、氨 基及硫酸基之间的非共价相互作用而导致的有规则而粗大的构象：四级结构则指多 糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集体。真菌多糖的结构有四种物理形状： 可拉伸带状、卷曲螺旋状、皱纹状、不规则卷曲状( 黄芳和蒙义文，1 9 9 9 ；曾凯宏， 2 0 0 1 ；朱建华和杨晓泉，2 0 0 5 ) 。 3 2 食( 药) 用真菌多糖的构效关系 多糖的构效关系是指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系。研究食 ( 药) 用真菌多糖的构效关系具有十分重要的意义，它是寻找具有生物活性多糖和 多糖药物及多糖功能性食品的基础，为活性多糖的目的性筛选提供必要的理论基础 ( 李燕杰，2 0 0 5 ) 。 3 2 1 一级结构对生物活性的影响 食( 药) 用真菌多糖的一级结构包括单糖的组成、连接方式、糖苷键的类型、 分支度以及一些侧链基团等。每一个因素对其生物活性都有不同程度的影响。 3 2 1 1 分支度对生物活性的影响 具有生物活性的食( 药) 用菌多糖的分支度( d e g r e e o f b r a n c h ，d b ) 变化较大， 一般为0 0 2 0 7 5 。研究结果表明，只有分支度在0 2 0 - 0 3 3 的那些d ( 1 ，3 ) d 葡 聚糖才具有较强的生物活性( 吴新君，2 0 0 4 ) 。 3 2 1 2 主链连接方式对生物活性的影响 研究表明，一般多糖以p ( 1 ，3 ) d ( 1 ，6 ) 连接或以d ( 1 ，4 ) d ( 1 ，6 ) 连接的 糖昔键是有活性的，而单纯p ( 1 ，4 ) 糖苷键连接具有活性的多糖至今未见报道。多 数抗肿瘤活性多糖是带有d ( 1 ，6 ) 单个葡萄糖残基侧链的d ( 1 ，3 ) d 葡聚糖( 肖 建辉等，2 0 0 2 ) 。另据报道，只有在c 6 上被d 葡聚糖基、d 一阿拉伯糖基的基团所取 代的食( 药) 用真菌多糖才具有很强的抗肿瘤活性。含有舻阿拉伯糖基和d 一甘露 糖基分支的改性d ( 1 ，3 ) - d 葡聚糖具有较强的抗肿瘤活性。而类似改性的d ( 1 ，4 ) ，d 葡聚糖则无抗肿瘤活性。这些结果表明，d ( 1 ，3 ) 连接的骨架对于抗肿瘤活性是 必需的。同时也证明了d ( 1 ，3 ) 主链在抗肿瘤活性上的重要性( 吴新君等，2 0 0 4 ) 。 3 2 1 3 侧链基团的性质对生物活性的影响 一些食( 药) 用真菌多糖的活性与其中是否含有某些特定的化学基团有关。连 接在d 。d 葡聚糖骨架上的一些基团如聚羟基、聚醛基、羧甲基、乙酰基、硫酸基等 对真菌多糖的生物活性发挥起重要作用。如香菇多糖本身只有抗肿瘤活性，硫酸化 后具有抗h i v 活性，能抑制h i v - 1 产生的细胞裂变( 黄芳和蒙义文，1 9 9 9 ) 。硬脂 酰化和磷酸酯化的甘露聚糖有抗肿瘤活性是因为取代基取代了糖链的空间位置，而 右旋葡聚糖在棕榈酰化和磷酸酯化后才有抗肿瘤活性( 肖盛元和郭顺星，2 0 0 0 ) 。从 茯苓菌核中得到的茯苓多糖，基本没有抗肿瘤活性，但制成羧甲基多糖后，水溶性 增大，并具有强烈的抗肿瘤活性( 孟庆虹和张守文，2 0 0 3 ) 。此外，在螺旋结构的外 周，许多多羟基化基团的存在可能增加葡聚糖的潜在免疫活性( 吴新君等，2 0 0 4 ) 。 6 3 2 2 高级结构对生物活性的影响 多糖的高级结构与生物活性的关系目前尚不十分清楚，但高级结构对生物活性 的影响比一级结构还重要，这一点已为科学家们所首肯( 田庚元，2 0 0 0 ) 。研究表明， 食( 药) 用真菌多糖的特异空间构象是其生物活性的基础。一般地，具有规则空间 构象的食( 药) 用真菌多糖，其生物活性较强，而且结构呈螺旋的多糖活性较高， 呈带状的多糖活性较低甚至没有活性。x 衍射结果显示三股螺旋构型是真菌多糖最 具活性的空间构象( 王兆梅等，2 0 0 2 ) 。天然香菇多糖的空间结构为b 三股绳状螺旋 立体结构，具有生物活性，但用脲或胍处理过的香菇多糖却没有活性，这种现象是 由于脲或胍的作用改变其空问构型雨弓l 起的( m a t s u o k ah ，1 9 9 9 ；z h a n gpo ta l ， 2 咖) 。茯苓多糖的空间结构与香菇多糖相似，但无抗肿瘤活性，如果将其中的一些 b ( 1 ，6 ) 侧链切除，茯苓多糖则表现出强烈的抗肿瘤活性。x 射线分析表明此时它 己形成三股螺旋结构( h u a n gch c ta l ，2 0 0 1 ) 。但灰树花多糖的空间结构与其活性 似乎没有太大关系( 边杉等，2 0 0 4 ) 。 食( 药) 用真菌多糖的生物活性除了与其结构密切相关外，还和其分子量、溶 解性、粘度、旋光度等理化性质有关。尽管多糖构效关系的研究一直是人们关注的 焦点，但由于多糖结构的复杂性，使得对其构效关系的研究并未获得重大突破。还 有待于在多糖构象、大分子间相互作用的影响、多糖活性中心、金属离子、化学修 饰作用等方面加大研究力度，来有目的的改造食( 药) 用真菌多糖，提高它的生物 活性，为人类的健康做出更大的贡献。 4 食( 药) 用真菌多糖的研究方法 4 1 食( 药) 用真菌多糖的提取 食( 药) 用真菌的菌丝体和发酵液的化学成分复杂，种类繁多，多糖类物质是 其中的主要药用成分，因此有必要对其进行提取。提取多糖的方法有水提取、酸溶 液提取、碱溶液提取以及盐溶液提取等，为防止糖苷键的断裂和多糖活性的损失， 应尽量避免酸性条件下提取( 张惟杰，1 9 9 9 ) 。除上述提取方法外，近年来还出现了 一些多糖提取的辅助方法，如超声波法、微波法。提取液中多糖类的析出常用有机 溶剂沉淀法，此法可广泛地用于所有多糖类的分离和精制。最常用的有机溶剂有乙 醇、甲醇、丙酮等，也可用c t a b ( 十六烷基三甲基溴化铵) 和c p c ( 十六烷基氯 化毗啶) 等季胺盐来沉淀提取酸性多糖( 徐任生和陈仲良，1 9 8 9 ) 。 4 2 食( 药) 用真菌多糖的分离纯化 采用一般提取工艺得到的食( 药) 用真菌多糖是粗品，其中混有蛋白质、色 素、低聚糖、无机盐等杂质，这些杂质的存在可能会影响多糖的生物活性和外观 7 品质，从而影响其在医药上的使用价值。因此需要对初步制取的粗多糖进行分级 分离和纯化。 食( 药) 用真菌粗多糖的纯化包括去除杂蛋白、色素及其它低分子物质等步骤。 去除杂蛋白的方法主要有：可选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂来处理， 如1 鞣酸、4 - - 氯醋酸等；s e v a g 法处理；蛋白酶处理与题v 驾法交替脱蛋白 ( 张惟杰，1 9 9 9 ) ：离子交换树脂法，此法特别适合大规模工业化生产的需求( 王 翎和程显好，1 9 9 6 ) 。色素的去除常采用活性炭吸附法和h 2 0 2 脱色法( 张惟杰，1 9 9 9 ) 。 其它无机离子、低聚糖等杂质可通过透析去除。 通过去除杂蛋白、色素及其它低分子物质等处理后的多糖样品，仍然是多糖的 混合物，还不是均一的组分。其进一步纯化常按分子量大小、分子形状或化学组成 等特点进行分级分离。分级的方法有许多种，如有机溶剂分级沉淀法、超过滤法、 透析法、超速离心法、电泳法、离子交换色谱以及凝胶过滤色谱法，但目前分离精 制食( 药) 用真菌多糖类的有力手段主要是离子交换色谱和凝胶过滤色谱。离子交 换色谱主要是利用氯型或氢氧根型的d e a e 纤维素柱层析，凝胶过滤色谱主要是采 用s e p h a d e xg - 1 0 0 2 0 0 、s e p h a r o s e 、s e p h a m s eg l - 2 b 6 b 凝胶过滤色谱。d e a e 纤维素是一种阴离子交换树脂，在接近p h 6 时，酸性多糖很容易吸附在d e a e 纤维 素柱上，酸性基团越多，吸附能力越强，提高洗脱液的离子强度可将吸附的多糖洗 脱下来，常用的洗脱液为不同离子强度的缓冲液。对于中性多糖，在p h 5 6 时，通 常不能吸附或很少吸附在柱上。因此，采用d e a e - 纤维素可使酸性、中性多糖得到 很好的分离。凝胶是一种分子筛，利用其分子筛作用，可将分子量大小不同的多糖 组分分开，从而实现多糖混合物的分级分离( 陈石良，2 0 0 0 ) 。 4 3 食( 药) 用真菌多糖的纯度鉴定 食( 药) 用真菌多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因此即使是 多糖纯品其微观也是不均一的。多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。我们通常 所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。常用的纯度鉴定方法有4 种： 超离心、高压电泳、凝胶层析和高效液相色谱，现在应用较多的是高效液相色谱法， 也有人将旋光测定作为一种纯度测定标准。通常要肯定某一多糖的均一性，必须要 有两种方法以上的鉴定结果才能肯定( 魏传晚等，2 0 0 4 ) 。 4 4 食( 药) 用真菌多糖的分子量测定 多糖的分子量只代表一定分子量范围的平均分布。过去常用的测定分子量的方 法有：渗透法、超离心法、超过滤法、高压电泳法、粘度法、光散射法、还原末端 法及聚合度法等，这些方法比较麻烦且误差较大。目前，由于耐压合成凝胶的出现， 使得高效液相色谱法广泛应用于多糖的纯度和分子量测定上，它具有快速、高分辨 率和重现性好等优点。实验室中最简便可用的是凝胶过滤法。多糖的分子量测定至 今仍是一个复杂的问题，现在还没有一种准确的测定方法，即使是同一多糖，往往 用不同的方法会测得不同的分子量( 魏传晚等，2 0 0 4 ) 。 4 5 食( 药) 用真菌多糖的结构分析 分析食( 药) 用真菌多糖结构的方法发展至今，有三大类：化学法、物理学法、 生物学法。在组分分析中，一般采用酸水解法( 部分或全部水解) ，检测水解产物可 通过纸层析、薄层层析和气相层析分析。一些特殊的取代基团有专门的测定方法， 甲基化分析用来阐明多糖中相邻单糖基的连接键型；相邻单糖基间的连接方式最经 典的方法是采用高碘酸氧化和s m i t h 降解法分析，另外还有b a r r y 降解、二氧化铬 氧化降解及脱氨基降解等。物理分析法有红外光谱、激光喇曼光谱、核磁共振光谱 ( n m r ) 、气相层析( g l c ) 、质谱( m s ) 以及g l c - m s 联用等方法。其中红外光 谱是用于分析确定多糖中吡喃糖的糖苷键构型，以及观察其它官能团的吸收；喇曼 吸收光谱作用与红外光谱类似，其优点除测水溶液外还可测固体样品；n m r 用于分 析多糖中糖苷键的构型、单糖基的连接方式以及重复结构中单糖的数目与顺序；g l c 用来分析可挥发糖类衍生物，所需样品少、灵敏、准确；日前，高效液相色谱和圆 二色性及旋光色散分析法在多糖结构中应用也很普遍( 朱建华和杨晓泉，2 0 0 5 ) 。 5 鸡腿蘑的研究概况， 鸡腿蘑c o p r i n u sc o m a t u s ( m u l l c xf r 1s e g r a y 又名鸡腿菇，学名毛头鬼伞，在 真菌分类上属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，鬼伞科，鬼伞属，是世界性分布的 一种食药兼用茵( 黄年来，1 9 9 3 ) 。从2 0 世纪6 0 年代起，德国、原捷克斯洛伐克和 英国的食用菌研究者就开始鸡腿蘑的驯化栽培工作，目前有些国家已开始大规模的 商业化栽培。我国是在进入2 0 世纪8 0 年代后，开始进行鸡腿蘑菌株的分离筛选、 生物学特性、栽培管理及加工方面的研究工作，并探索出一整套适于我国推行的高 产栽培方法，在山东、江苏、浙江、上海等地已形成了一定生产规模( 何培新等， 1 9 9 9 ) 。由于鸡腿蘑生长周期短，生物转化率较高，易于栽培，售价高，近年来种植 规模迅速扩大。 5 1 鸡腿蘑的营养价值 鸡腿蘑子实体味道鲜美，营养丰富。据分析测定，每1 0 0 9 鸡腿蘑干品中，含蛋 白质2 5 4 0 9 、脂肪3 3 0 9 、总糖5 8 8 0 9 ( 其中无氮碳水化合物5 1 5 0 9 ) 、粗纤维7 3 0 9 、 灰分1 2 5 0 9 、热能值3 4 6 千卡( 罗星野等，1 9 9 1 ) 。鸡腿蘑所含氨基酸种类繁多且比 例合适。据报道，在鸡腿蘑子实体中含有2 0 种氨基酸，其中人体必需的8 种氨基酸 占氨基酸总量的3 4 8 3 ，其它1 2 种氨基酸占氨基酸总量的6 5 1 7 。据分析，鸡