（微生物学专业论文）皮革霉变真菌拮抗菌zt229的筛选、鉴定与发酵条件优化.pdf

四川大学硕士学位论文 表格目录 第一章皮革霉变真菌的分离鉴定及拮抗菌的筛选与鉴定 表1m 4 m 5 m 6 在p u f f e r 液中的生长情况 表2 拮抗菌生理生化试验结果 第二章真菌拮抗菌株z t - 2 2 9 的1 6 sr d n a 序列测定及系统发育学分析 第三章真菌拮抗菌株z t - 2 2 9 的发酵条件优化。 表1 正交试验试验计划表 表2 正交试验直观分析表 表3 正交试验方差分析表 1 0 1 7 2 3 3 3 7 4 7 4 8 4 8 膏r ， 四川大学硕士学位论文 图形目录 第一章皮革霉变真菌的分离鉴定及拮抗菌的筛选与鉴定 图1m 1 菌株菌丝及孢子形态( 1 0 0 x ) 、 图2m 2 菌株菌丝及孢子形态( 4 0 0 ) 。 r ， 图3m 3 菌株菌丝及孢子形态( 2 0 0 1 图4m 4 菌株菌丝及孢子形态( 4 0 0 x ) 图5m s 菌株菌丝及孢子形态o o o x ) 图6m 6 菌株菌丝及孢子形态( 4 0 0 ) 第二章真菌拮抗菌株z t - 2 2 9 的1 6 5r d 姒序列测定及系统发育学分析 图1z t - - 2 2 9 的1 6 sr d n a p c r 产物琼脂糖凝胶电泳图谱 图2z t - 2 2 9 的重组质粒琼脂糖凝胶电泳图谱 图3 菌株z t - - 2 2 9 在e n t e r o b a c t e d a 中的系统发育地位 第三章真菌拮抗菌种z t - - 2 2 9 的发酵条件优化 图1z t - - 2 2 9 菌的生长曲线 图2 豆饼粉浓度对菌体生长和抑菌圈直径的影响 图3 豆饼粉水提时间对菌体生长及抑菌圈直径的影响。 图4 磷酸盐浓度对菌体生长和抑菌圈直径的影响 圈5 金属离子对菌体生长的影响 图6 金属离子对抑菌圈直径的影响 图7 发酵韧始p h 值对菌体生长和抑菌圈直径的影响 图8 接种鼍对菌体生长和抑菌圈直径的影响 图9 种龄对菌体生长和抑菌圈直径的影响 4 m 墙 堪 堪 竭 均 坞 驺 驺 ” “ 盼 钙 铂 拍 盯 盯 褐 四川大学砺士学位论文 皮革霉变真菌拮抗菌z t 一2 2 9 的筛选鉴定与发酵条 件优化 研究生赵婷 微生物专业 中文摘要 指导教师刘成君 从成都地区自然霉变的皮革制品中分离纯化到6 株霉菌，分别编号为m 1 、 m 2 、m 3 、m 4 、m 5 和m 6 。通过形态学观察及生理生化特征初步鉴定为白曲霉 m 1 ( a c a n d i d u s ) 、拟青霉m 2 ( p a e c i l o m y c e s v a r i o t i ) 、黄绿青霉m 3 ( p n i c i l l i u m c i 抑e o v i r i d e b i o u r h e ) 、黄曲霉m 4 ( a s p e r g i l l u s f l a v u s ) 、产黄青霉m 5 ( p e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u mt h o r n ) 和黑曲霉m 6 ( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 。从西藏地区( 吉隆佩古 错期距湖边0 5 m ，林周澎波农场堆肥地鲥- o o m ，日喀则孜龙青稞地4 0 0 0 m ) 采 集的土样中初筛得到人株拮抗菌，分别编号为儿、j 2 、j 3 、j 4 、j 5 和j 6 ，它们 对白曲霉m 1 、拟青霉m 2 和黑曲霉m 3 有较好的拮抗作用。儿、j 2 、j 3 、j 4 革 兰氏染色为阳性，j 5 、j 6 易变：芽孢染色均为阳性，故六株拮抗菌均为芽孢杆 菌属( b a c i l l u s ) 。六株拮抗菌均芽孢囊不明显膨大，芽孢椭圆形或柱状，中生 5 ，- j ， r ， 四川大学硕士学位论文 或近中生，生长在葡萄糖营养琼脂上的幼龄细胞，用美蓝淡染色，原生质中没 有不着色的颗粒，在7 n a c i 中生长，石蕊牛奶不产酸，p h 5 7 生长，v p 阳 性，水解淀粉。其中j 1 、j 2 、j 5 、j 6 兼性厌氧，利用丙酸盐，故初步鉴定为地 衣芽孢杆菌( b a c , l i c h e n i f o r m i s ) ，j 3 、j 4 好氧，不利用丙酸盐，故初步鉴定为 为枯草芽孢杆菌( b a c s u b t i l i s ) 。用杯碟法复筛，得到一株枯草芽孢杆菌 ( b a c s u b t i l i s ) z t - 2 2 9 对白曲霉m 1 、拟青霉m 2 和黑曲霉m 3 有良好的广谱拮 抗作用。 采用文献报道的细菌的通用引物，以菌株z t - 2 2 9 的总d n a 为摸板扩增出 1 5 0 0 b p 左右的1 6 sr d n a 的片段，将p c r 片段进伊r a 克隆到载体p g e m - ti - ，转 化e c o i l 感受态细胞j m l 0 9 得到转化子，选取阳性克隆的重组子进行序列测定， 选用通用测序引物t 7 、s p 6 测定2 个反应，每个反应测8 0 0 b p 左右，将两个序列 结果拼接为完整的1 6 sr d n a 序列，为1 ，4 9 9 b p 。将菌株z t 一2 2 9 的1 6 sr d n a 序 列在g e n b a n k 中进行b l a s t ，所获得的同源序列均为芽孢杆菌科的1 6 sr d n a 序列，其中相似性最高的为b s u b t i l i s 属的菌株。该序列与b s u b t i l i s 属的几个模 2 l 劬s u b t i l i ss 打饵加b s k , b s u b t i l i ss 打口l 咒c 2 丑s u b t i l i s 啪加m 0 3 ，b s u b t i l i ss t r a i n i d c c l l 0 3 的相似性分别为9 9 8 ，9 9 4 ，9 8 5 和9 6 5 。在此基础上以一株 假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 1 6 sr d n a 序列为外种群构建系统发育树。由于 g e n b a n k 中获得的序列长短不同，为了获得更可信的系统发育树，根据 c l u s t a l 的结果将比对好的序列均截短为相当于z t - 2 2 91 6 sr d n a 序列6 2 b p 1 4 3 0b p 的片段应用p h l i p 软件包得到以1 6 sr d n a 序列为基础的系统发 育树( 分支旁的数值为聚类的置信度) 。 本实验对影响枯草芽孢杆菌z t - 2 2 9 ( b a c s u b t i l i s ) 摇瓶发酵生产抑菌活性 物质的相关因子：豆饼粉水提时间，水提液浓度、磷酸盐浓度，金属离子，发 酵培养基初始p h 值接种量和接种龄等采用单因素试验进行了研究。在参阅相 关文献和单因子试验基础之上，选取p h 、续种量、m 9 2 + 、磷酸盐和转速五个因 素，各取四个水平，进行l 。( 4 5 ) 正交试验。由方差分析可知，发酵培养基p h 值对产抑菌活性物质影响极显著，磷酸盐缓冲液浓度对产抑菌活性物质性影响 不显著。当发酵初始p h 值7 5 ，接种量1 0 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 4 ，磷酸盐 缓冲液浓度为o 2 0 m o l l ，摇床转速为1 2 0 r m i n 时，产抑菌活性物质最高，抑 6 7 四川大学硕士学位论文 i s o l a t i o n 、i d e n t i f i c a t i o na n d o p t i m i z a t i o no f 、 f e r m e n t a t i o n a lc o n d i t i o no f a n t i f u n g a lb a c t e r i a s t r a i nz t - 2 2 9 m a j o r ：m i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t e ：z h a o t i n g d i r e c t o r ：l i uc h e n g - j u n a b s t r a c t s i xs t r a i n so ff _ i l n g iw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e df r o mm o u l do fm i l d w e d l e a t h e r , w h i c hi d e n t i f i e dw i t ho b s e r v a t i o no fi n d i v i d u a la n di n t e g r a lm o r p h o l o g y , t h er e s u l t ss h o w ：m 1w a s a c a n d i d u s ，m 2w a sp a e c i l o m y c e sv a r i o t i ，m 3w a s p n i c i l l i u r ac i t r e o - v i r i d eb i o u r h e ，m 4w a s a s p e r g i l l u s f l a v u s ，m 5w a sp e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u mt h o r n ，m 6w a s a s p e r g i l l u s n i g e r s i xs t r a i n so fa n t i f u n g a lb a c t e r i a w e r es e l e c t e df r o ms o i ls a m p l e sw h i c hc o l l e c t e df r o mv a r i o u sa r e a so f t i b e t p l a t e a u t h er e s u l t ss h o w ：r l i c h e n i j o r m i sa n db s u b t i l i sh a v et h eg o o d a r t i f u n g a le f f e c tt om 埘c a n d i d u s m 2 p a e c i l o m y c e sv a r i o t ia n d m 6 a s p e r g i l l u s n i g e r a tl a s t ，b yr e s c r e e n i n gw i t ht e s ta n t i f u n g u sa c t i v i t y ，a h i g hy i e l ds t r a i no f b s u b t i l i sz t - 2 2 9w a ss e l e c t e d b yo b s e r v a t i o no ft h ec u l t u r ec h a r a c t e r s ，m e a s u r e m e n to ft h eb i o c h e m i s t r i c a l 8 四川大学硕士学位论文 f e a t u r ea n da n a l y s i so f1 6 sr d n a s e q u e n c e sh o m o l o g y , t h es t r a i nw a s i d e n t i f i e d a sb a c i l l u ss u b t i l i sa n dn a m e da 8b s u b t i l i sz t - 2 2 9w h i t hw a sr e g i s t e r e di n g e n b a n ko nn c b la n da c c e s s i o nn u m b e rw a sa f l 9 9 4 6 4 t h ef a c t o r sr e l a t et oa n t i f u n g u sa c t i v i t ya n db i o m a s s e si nf l a s kc u l t u r ew e r e i n v e s t i g a t e db yo n ef a c t o re x p e r i m e n t s b a s e do nf o r m e re x p e r i m e n t ，t h e o r t h o g o n a l i t yt e s tw a st m d e r t a k e nt od e t e r m i n et h es i g n i f i c a n tf a c t o ra n do p t i m a l l e v e l sw i t hp h ，i n o c u l a t i o nc o n t e n t ，r o t a t es p e e d ，t h ec o n c e n t r a t i o no fm a g n e s i u m a n dt h ep h o s p h a t eb u f f e rf a c t o r sw i t hf o u rl e v e l sr e s p e c t i v e l y t h er e s u l ts h o w e d t h a tc u l t u r eo r i g i n a lp hv a l u e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fp h o s p h a t eb u f f e ra r e s i g n i f i c a n tf a c t o r sa n dc u l t u r eo r i g i n a lp h v a l u e7 5 ，i n o c u l a t i o nc o n t e n t1 0 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 0 4 t h ec o n c e n t r a t i o no f p h o s p h a t eb u f f e r0 2 0 m o l l a n d r o t a t es p e e d1 2 0 r m i nc a ng a i nt h eh i g h e s ta n t i f u n g n sa c t i v i t yw i t ht h ed i a m e t e r o fi n h i b i tc i r c l e4 1 8 c r a k e y w o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i s ；a n t i f u n g a lb a c t e r i a ；1 6 sr d n a ；f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n 9 四川大学硕士学位论文 第一章皮革霉变真菌的分离鉴定及拮抗菌的筛选与鉴定 随着皮革制品使用的日益广泛，需求量逐年增加，其霉变问题越发突出。 美国基于卫生原因制定了皮革进口的限制法规【”。我国皮革生产量大，其保存 运输中消除霉变的问题就显得尤为重要，研制高效广谱低毒的皮革防霉剂成为 当务之急。 皮革易于真菌的生长繁殖【8 1 1 0 i ，研制皮革防霉剂可从多种途径出发，目前 市场上采用的多为化学杀菌剂，其对环境的有一定的污染【2 l ，如果从皮革霉变 的原理出发，用微生物学观点来认识其规律，分析存在的主要菌种的特征i ”， 科学的筛选出最佳防霉剂的活性成分，从而研制出新型的生物防霉剂，有着很 强的实用价值i ”j 。 本文通过对成都地区自然霉变皮革制品霉变真菌的分离纯化鉴定以及拮抗 菌的筛选| 1 0 1 ，为研制新型无污染的皮革生物防霉剂打下了基础。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 土样 采自西藏地区( 吉隆佩吉错湖距湖边0 5 m ，林周澎波农场堆肥地3 4 0 0 m ， 日喀则孜龙青稞地4 0 0 0 m ) 1 1 2 培养基 查氏( c z a p e k ) 琼脂培养基：蔗糖3 0 9 ，n a n 0 33 9 ，k z h p o 。l g ，m g s 0 4 7 h 。00 5 9 ， k c l0 5 9 ，f e s 0 40 o l g ，琼脂1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。1 2 l ，2 0 m i n 湿热灭菌。 查氏( c z a p e k ) 液体培养基：蔗糖3 0 9 ，n a n o , 3 9 ，k i p o 1 9 ，m g s 0 4 - 7 h 2 00 5 9 ， k c l0 5 9 ，f e s o , 0 o l g ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。1 2 1 。c ，2 0 m i n 湿热灭菌。 1 0 四川大学硕士学位论文 葡萄糖营养琼脂培养基：蛋白胨l o g ，牛肉膏5 9 ，葡萄糖l o g ，n a c i5 9 ，琼脂 2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，调p h 为7 2 7 4 ，1 1 5 c ，2 0 m i n 灭菌。 1 i 3 分类鉴定培养基【3 l 【4 j 葡萄糖的氧化发酵培养基 蛋白胨2 9 n a c l 5 9 kd伊嘎029 葡萄糖log 琼脂5 6 9 ， l 澳百里酚蓝水溶液 3 m l 蒸馏水 l 0 0 0 m l 调节p h 6 8 7 0 ，分装试管，1 1 5 灭菌2 0 分钟，备用。 溴百里酚蓝先用少量9 5 乙醇溶解后再加水配成i 浓度。 其它糖或醇类培养基 ( m 。) 2 i p 仉l g 酵母膏0 2 9 m g s o , 7 h z o0 2 9 k c i 5 9 ， 糖或醇类( p 蔗糖、d 一麦芽糖、d 果糖、d - 山梨糖、d 一鼠李糖、d - 甘露醇、d 一 木糖、d - 阿拉伯糖) l o g ( d - 孚l 糖、d - 半乳糖1 5 9 ) 0 。4 溴甲酚紫乙醇液 2 m i 琼脂5 6 9 蒸馏水1000ml 调节p h 6 8 7 0 ，分装试管，1 1 5 c 灭菌2 0 分钟，备用。 甲基红( m r ) 试验和v 。p 试验培养基 蛋白胨5 9 葡萄糖5 9 n a c l ( 或k z h p o )5 9 1 1 四j t l 大学硕士学位论文 蒸馏水1000ml 调节p h 7 0 7 2 ，分装试管，1 1 5 c 灭菌2 0 分钟，备用。 淀粉水解试验培养基 蛋白胨log 牛肉膏5 9 n a c l 5 9 可溶性淀粉2 9 调节p h 7 2 7 4 ，固体培养基加琼脂1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，1 2 1 c 灭菌2 0 分钟 后倒平板，备用。 s i m m o n s 氏培养基 柠檬酸钠( 或丙酸钠)2 9 n a c l 5 9 m g s 仉7 h 2 0 0 2 9 ( n 儿) 。职n l g k 。h p 0 4 3 比0i g l 溴百里酚蓝水溶液l o m l 琼脂2 0 9 蒸馏水1000ml 以上成分除指示剂外加热溶解，调节p 1 6 8 6 9 ，再加入指示剂，培养基分装 试管，1 2 1 灭菌2 0 分钟后摆成斜面，备用。 石蕊牛奶反应培养基 2 5 石蕊水溶液，脱脂牛奶l o o m l ， 配制后石蕊牛奶应呈丁香色，分装试管，1 1 5 c 灭菌3 0 分钟，备用。 p h 5 7 营养肉汤培养基 蛋白胨log 葡萄糖2 0 9 蒸馏水1000ml 调节p h 5 7 ，若做成固体斜面，加入2 琼脂，分装试管，1 1 5 c 2 0 分钟灭菌。 耐盐性试验培养基 四川大学硕士学位论文 以牛肉膏蛋白胨培养基根据鉴定需要， 2 、3 5 、5 、7 、1 0 、1 1 、1 2 、1 3 、 备用。培养基要求十分澄清。 过氧化氢酶测定培养基 蛋白胨 1 0 9 牛肉膏5 9 葡萄塘log n a c i 5 9 琼脂 2 0 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l 配制成不同浓度的n a c i ，如0 5 、 1 4 、1 5 等。1 2 1 灭菌2 0 分钟， 调p h 为7 2 7 4 ，做成固体斜面，加入2 琼脂，分装试管，“5 ，2 0 m i n 灭 菌。 叠氮化钠葡萄糖肉汤培养基 胰冻1 5 9 牛肉膏4 5 9 葡萄糖7 。5 9 n a c l 7 5 9 叠氮化钠029 蒸馏水 1 0 0 0 i 调p h 7 2 ，分装试管，1 1 5 。c ，2 0 r a i n 灭菌。 产生吲哚培养基 胰冻水溶液l n a c l0 5 p h 7 5 分装试管，每管约5 毫升，1 1 5 c ，3 0 r a i n 灭菌。 形成芽孢的培养基( 淡薄培养基) 酵母膏0 7 9 蛋白胨 l g 一 葡萄糖1 9 (nl)：so,029 四川大学硕士学位论文 m g s o , 7 心00 2 9 k 2 职仉l g 琼脂 2 0 9 蒸馏水1000ml 调节p h 7 2 ，分装试管，1 1 5 。c3 0 分钟灭菌。 需氧性试验用培养基 酪素水解物2 0 9 n a c i 5 9 巯基醋酸钠( h s c h 2 c o o n a )2 9 甲醛次硫酸钠( h 0 c h ：s 0 2 n a )i g 琼脂 1 5 9 蒸馏水1000ml 调节p h 7 2 ，分装试管，1 1 5 c2 0 分钟灭菌，培养基不摆斜面。 i i 4 分类鉴定用试剂和溶液 革兰氏染色液 a 结晶紫液( h u c k e r 的配方) a 液：结晶紫2 9 9 5 乙醇 2 0 m l b 液：草酸铵o 5 9 蒸馏水8 0 m l 将a 、b 两液相混合，静置4 8 h 后使用，染色液应放置棕色瓶中保存。 b 卢哥尔( l u 9 0 1 ) 氏碘液 碘片l g 碘化钾2 9 蒸馏水 3 0 0 m l 先用少量( 3 5 m i ) 蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，将碘全部溶解后， 加入水稀释至3 0 0 m l 。放置棕色瓶贮存数月。也可先配制成l o o m l 母液，使用 时加两倍水稀释成卢哥尔氏碘液。 1 4 甲基红 9 5 乙醇 蒸馏水 v p 试剂 n a o h ( 或k o h ) 肌酸 过氧化氢酶试剂 3 1 0 过氧化氢酶( h 。0 2 ) 石蕊液 石蕊 蒸馏水 吲哚试剂 对二甲基氨基苯甲醛 乙醇( 9 5 ) 浓h c l 1 2 方法 0 i g 3 0 0 m l 2 0 0 m l 4 0 0 3 或原粉 i m l 2 5 9 l o o m l 5 9 7 5 m i 2 5 m i 1 2 1 霉菌的分离、纯化。 用接种针直接从霉变皮革样品表面蘸取极少分散在霉斑上的孢子( s p o r e ) ， 四川大学硕士学位论之 移到查氏固体培养基上，于2 8 c 霉菌培养箱中培养3 1 4 d ，期间不断进行菌落、 菌体形态镜检观察。若菌落、菌体不纯，混有杂菌时，将平板上长出的菌落上 的孢子，用接种针挑取少许，再转接于查氏固体培养基平板上，培养3 1 4 d ， 观察菌落、菌体形态，直至菌体纯化为止【”。编号并液体石蜡法试管4 保存。 1 2 2 形态特征观察及鉴定 菌落形态：选取菌龄为7 d 的霉菌，直接用肉眼观察平板上菌落的大小、颜 色、质地、有无气生菌丝体、渗出物、气味等。 菌体形态：滴一滴乳酸苯酚液( 用锥虫蓝染色) 于洁净载玻片中央，用一无菌 解剖针挑取少量平板中的培养物，浸入载玻片上的乳酸苯酚液内，而后用2 根 无菌解剖针将菌丝团撕开，使其全部打湿，盖上盖玻片，做成l 临时性载片标本 4 1 。在显微镜下观察霉菌菌丝形态，孢子形态，孢子产生方式及其排列特征并 照相。； 霉菌鉴定：根据菌体菌落形态观察记录，及在p u f f e r 液中2 8 3 7 、4 5 不同温度下的生长情况，对照文献 4 6 霉菌分类检索表，将各菌株做出初步 鉴定。 1 2 3 拮抗菌的筛选 将编号霉菌制成孢子悬液，d y 8 8 b 型涡旋混和器振荡6 0 s ，每毫升约含孢子 l 1 0 x1 0 6 个。取0 2 m l 涂布在查氏平板上。随机从2 6 8 份土样中取样，用1 8 0 目，孔径为0 0 9 m m 的分样筛筛至平板上，置2 8 培养箱中培养4 7 d t n 。后观 察结果，挑选有抑菌圈的，用三点点样法再次培养，后用牛津杯抑菌圈实验复 查拮抗效果，测量抑菌圈直径，编号并斜面培养，液体石蜡法置冰箱4 保存。 1 2 4 拮抗菌的分类鉴定 参考文献 3 7 的方法，依次采用了革兰氏染色，芽孢染色，吕氏美蓝 染色，过氧化氢酶的测定，需氧性试验，葡萄糖的氧化发酵试验，葡萄糖、阿 拉伯糖、木糖、甘露醇的发酵试验，腿试验，v p 试验，淀粉水解试验，产生吲 哚试验，石蕊牛奶反应，柠檬酸盐及丙酸盐的利用，对叠氮化钠的抗性，对溶 菌酶抗性的测定，耐盐性试验，生长温度的测定，在p h 5 7 营养肉汤上的生长。 1 6 四川大学硕士学位论文 2 结果与讨论 2 1 霉变真菌的鉴定 从霉变皮擎中分离纯化出六个霉变菌株，分别编号为m l 、m 2 ，m 3 、m 4 、m 5 和m 6 。 将m 4 、m 5 和m 6 菌接p u f f e r ，各6 支，每个菌种各取2 支分别置2 8 9 c ，3 7 4 5 培养7 2 h ，观察结果。( 见表1 ) 表1 在p u f f e r 液中的生长情况 m 4 - 1n 4 - 2h 5 - lm 5 _ 2m 6 一l鹏一2 2 8 m 4 3m 4 - 4n 5 - 3惦- 4啪一3惦_ 4 3 7 h 一5n 4 - 6h 5 - 5m 5 - 6m 6 - 5 m 6 6 4 5 在2 8 下m 4 、m 5 和m 6 菌呈阳性，在3 7 和4 5 下m 4 、m 5 和m 6 菌株均星 阴性，基本排除掉m 4 、m 5 和m 6 为毛霉的可能性。 m 1 菌株：菌落呈乳白色，绒状，菌落背面淡褐色，边缘毛糙。营养菌丝体由 具横隔的分枝菌丝组成，从菌丝特化形成厚壁而膨大的足细胞，在其垂直方向 生出直立的分生孢子梗，分生孢子梗顶端膨大形成顶囊，生成分生孢予，孢子 头白色至奶油色，分生孢子梗光滑。菌落表现同心环。有透明滴渗出物。( 见图 1 ) 检索文献 3 】 7 ，该菌株为：半知菌亚门( d e u t e r o m y c o t i n a ) 、丝孢纲 ( h y p h o m y c e t e s ) 、丝孢目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) 、曲霉 属( a s p e r g i l l u s1 1 f i c h e l i ) 、白曲霉群( 彳c a n d i d u s ) 。 四川大学硕士学位论文 图lm l 菌株菌丝及孢子形态( 1 0 0 x )图2 舵菌株菌丝及孢子形态( 4 0 0 x ) m 2 菌株：菌落呈浅褐色，绒状，菌落背面深褐色，边缘毛糙。分生孢子梗有 横隔，分生孢予梗顶端生有帚状枝，分生孢子为卵圆形，生成较长的纠结链状， 瓶梗基部膨大，上部逐渐变尖，形成一个产生分生孢子的管状体，略弯曲。( 见 图2 ) 检索文献 3 7 ，该菌株为：半知菌亚门( d e u t e r o m y c o t i n a ) 、丝孢纲 ( h y p h o m y c e t e s ) 、丝孢目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) 、拟青 霉属( p a e c i l o m y c e sb a i n 衙) 、拟青霉( p a e c i l o m y c e sv a r i o t i ) 。 m 3 菌株：菌落呈淡黄色，绒状，菌落背面浅褐色，边缘粗糙。分生孢子梗有 横隔，分生孢子梗顶端有帚状分枝，分生孢子很小，大部分生自基质，分生孢 子梗作为一个短分枝生自气生菌丝。( 见图3 ) 检索文献 3 7 ，该菌株为：半知菌亚门( d e u t e r o m y c o t i n a ) 、丝孢纲 ( h y p h o m y c e t e s ) 、丝孢目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) 、青霉 属( p e n i c i l l i u m ) 、斜卧青霉系( p d e c u m b e n s ) 、黄绿青霉( p n i c i l l i u mc i t r e o v i r i d e b i o u r h e ) 。 图3 咐菌株菌丝及孢子形态( 2 0 0 x ) 图4m 4 菌株菌丝及孢子形态( 4 0 0 x ) 1 8 四川大学硕士学位论文 m 4 菌株：菌落呈白色略发土黄，絮状，向空间伸展，气生菌丝发达。营养菌 丝体由具横隔的分枝菌丝组成，分生孢子梗粗糙，分生孢子梗顶端膨大形成顶 囊，生成分生孢子，孢子头淡黄绿色，球形至放射状。有菌核状结构，杆形或 椭圆形。( 见图4 ) 检索文献 3 】 7 ，该菌株为：半知菌亚门( d e u t e r o m y c o t i n a ) 、丝孢纲 ( h y p h o m y c e t e s ) 、丝孢目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) 、曲霉 属( a s p e r g i l l u sm i c h e l i ) 、黄曲霉群( a s p e r g i l l u s f l a v u s ) m 5 菌株：菌落呈鲜艳的黄色，菌落背面黄色，老时变为褐色，周围培养基也 呈黄色，绒状，质地细密。分生孢子梗有横隔，分生孢子梗顶端有帚状分枝， 呈絮状，放射样向外扩展，分生孢子壁光滑。有大量渗出物。( 见图5 ) 检索文献 3 7 ，该菌株为：半知菌亚门( d e u t e r o m y c o a n a ) 、丝孢纲 ( h y p h o m y c e t e s ) 、丝孢目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) 、青霉 属( p e n i c i l l i u m ) 、不对称青霉组c 4 s y m m e t r i c a ) 、绒状( v e l u t i n a ) 青霉亚组、 产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u mt h o m ) 系。 图5 惦菌株菌丝及孢子形态( 1 0 0 )图6 黼菌株菌丝及孢子形态( 4 0 0 ) m 6 菌株：菌落呈暗灰色，絮状，向空间发展，气生菌丝发达。营养菌丝体由 具横隔的分枝菌丝组成，分生孢子梗顶端膨大形成顶囊，生成分生孢子，孢子 头暗褐色，分生孢子梗光滑。( 见图6 ) 检索文献 3 7 ，该菌株为：半知菌亚门( d e u t e r o m y c o t i n a ) 、丝孢纲 ( h y p h o m y c e t e s ) 、丝孢目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) 、曲霉 属( a s p e r g i l l u s m i c h e l i ) 、黑曲霉群( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 。 四川大学硕士学位论文 2 2 拮抗菌的筛选与鉴定 从西藏地区( 吉隆佩古错湖距湖边0 5 m ，林周澎波农场堆肥地3 4 0 0 m ，日 喀则孜龙青稞地4 0 0 0 m ) 采集的土样中筛选到六株拮抗菌，分别编号为j l 、j 2 、 j 3 、j 4 、j 5 和j 6 ，它们对白曲霉、拟青霉和黑曲霉有较好的拮抗作用。对该六 株拮抗菌的初步鉴定结果( 见表2 ) 。表中各项结果中，j 1 、j 2 、j 3 、j 4 革兰氏 染色为阳性，j 5 、j 6 易变；芽孢染色均为阳性，故六株拈抗菌均为芽孢杆菌属 ( b a c i l l u s ) 。六株拮抗菌均芽孢囊不明显膨大，芽孢椭圆形或柱状，中生或近 中生，生长在葡萄糖营养琼脂上的幼龄细胞，用美蓝淡染色，原生质中没有不 着色的颗粒，在7 n a c l 中生长，石蕊牛奶不产酸，p h 5 7 生长，v p 阳性，水 解淀粉。其中j 1 、j 2 、j 5 、j 6 兼性厌氧，利用丙酸盐，故为地衣芽孢杆菌 ( b a c 1 i c h e n i o r m 妇) ，j 3 、j 4 好氧，不利用丙酸盐，故为枯草芽孢杆菌 ( b a c s u b t i l i s ) 。 表2拮抗菌生理生化试验结果 论缸 j 1 j 2j 3j 4j 5j 6 菌株 菌体宽( t a m ) 0 6 、o 8o 6 、o 80 7 0 80 7 0 80 6 0 80 6 0 8 长( i i m ) 1 5 31 5 32 、32 31 5 、31 5 3 革兰氏染色+ +vv 原生质中不着色颗 粒 芽孢椭圆或柱状+ 中生或近中+ 生 -_ 芽孢囊膨大 过氧化氧酶+ 运动性+ + 厌氧生长 + m r 反应 v p 反应+ 2 0 四川大学硕士学位论文 v p 中的p h 值 5 15 15 35 35 05 2 生长盘度( ) 最高 5 0 5 55 0 5 54 5 5 54 5 5 55 0 5 55 0 5 5 最低 1 51 55 2 0 5 2 0 1 51 5 抗溶菌酶( 0 0 0 1 ) bb 生长在n a c l ( 7 ) 上+ 生长在p h 5 7 培养基 a a a+ 上 葡萄糖氧化发酵+ f+ t + t+ t+ t+ t 产酸木耱 a aaaaa 葡萄糖+ 阿拉伯糖+ 甘露酵+ 石蕊牛奶的反应 淀粉水解+ 柠檬酸盐利用+ 丙酸盐利用+ 抗叠氮化钠( 0 0 2 ) 形成吲哚 注：具有指示特征的菌株百分数：+ = 8 5 1 0 0 ；a = 5 0 8 4 = b = 1 5 4 9 ；一= 0 1 4 ；v = 易变特征；t = 产气 参考文献： f i j 张天恩，张一宾，防菌防霉剂手册【m j 上海：上海科学技术文献出版社，1 9 9 3 【2 】程京绯，皮革防霉技术，北京：中国进出口商品检验技术研究所，1 9 9 2 ，1 - - 4 【3 】张纪中，微生物分类学上海：复旦大学出版社，1 9 9 0 ，6 2 - - 7 2 ；8 9 一1 0 9 ；3 1 0 - - 3 2 5 【4 l 魏景超，真菌鉴定手册 m 1 上海：上海科学技术出版社，1 9 7 9 【5 1 王学川t 霉变羊毛脂加脂剂的霉菌分离与鉴别博士学位论文，四川大学，2 0 0 3 ，1 - - 4 。 【6 】邢来君，李明春，普通真菌学北京：高等教育出版社，1 9 9 9 ，6 1 1 - - 6 2 1 【7 】周德庆t 微生物学实验手册上海：上海科学技术出版社，1 9 8 6 ，1 0 1 - - 1 0 8 ；2 5 3 - - 2 6 5 四j i f 大学硕士学位论文 【8 】戴芳澜，真菌的形态和分类一e 京：科学出版社，1 9 8 7 【9 】中国科学院微生物研究所真菌名词及名称北京：科学出版社，1 9 8 6 f l o l 中国科学院微生物研究所常见与常用真菌编写组常见与常用真菌北京：科学出 版社，1 9 7 8 【1 1 】c d c n i h b i o s a f e t yi nm i c r o b i o l o g i c a la n db i o m e d i c a ll a b o r a t o r i e s , 4 “e d i t i o n w a s h i n g t o n ：u s g o v e r n m e n tp r i n t i n go f f i c e , 1 9 9 9 【1 2 】s m i t hd ，o n i o n sa hs t h ep r e s e r v a t i o na n dm a i n t e n a n c eo fl i v i n gf u n g i 2 “ e d i t i o n w a l l i n g f o r d ，o x o n ，e n g i a n d ：c a b i ，1 9 9 4 【1 3 】s e i f e r tk a , g a m sw t h et a x o n o m yo f a n a m o r p h i cf u n g i i n ：t h em y c o t av o l u m e ，p a r t a ：s y s t e m a t i c sa n de v o l u t i o n e d i t e db ym c l a u g h l i nd j ，m c l a u g h l i neg ，l e m k ep a b e r l i n ：s p r i n g e r2 0 0 1 一 四川大学硕士学位论文 第二章真菌拮抗菌株z t 一2 2 9 的16 sr d n a 序列测定及系统发 育学分析 分子生物学理论与技术的迅速发展给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革 新。当代微生物学利用遗传学原理和方法分析微生物种属间的亲缘关系。遗 传分类法是根据核酸分析得到的遗传相关性( g e n e c t i cr e l a t e d n e s s ) 所做的 分类。因为这种分类方法是以决定生物表型特征的遗传物质核酸作为比较 的准绳，所以它是一种客观和可信度较高的分类方法。本文通过对菌株z t 一2 2 9 1 6 sr d n a 序列的测定，分析了其在系统发育学中的地位，并将其鉴定到了种。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 z t - - 2 2 9 ( 本实验室保藏) 1 1 2 主要仪器 p c r 热循环仪p t c l 0 0 琼脂糖凝胶电泳系统 d y - - 8 8 b 型漩涡混合器 5 4 1 5 d 小型e p 管离心机 移液器 h a i e r 冰箱 电热手提压力蒸汽消毒器 j a s 0 0 3 电子天平 h z q c 空气浴摇床 m jr e s e a r c h 1 n c h o e f e r 金城国胜仪器厂 德国e p p e n d o r f 德国e p p e n d o r f 国产 上海医用核子仪器厂 上海精科天平 东明医疗仪器厂 琼脂糖( a g a r o s ei ) m i n e r a lo i l 试剂 t e n 缓冲液 l o m m o lt r i s h c ip h8 0i m m o l l e d t ap h 8 0 l o m m o l n a c l 1 5 磅灭菌2 0 m i n t e 缓冲液 上海生物工程有限公司 上海华书瞬生物工程有限公司 l o m m o l l t r i s c 1 ，p h 7 4 ，7 5 ，或8 0 i m o l e d t a ，p h 8 0 t r i s ( 三羟甲基) 氨基甲烷 l o ( w v ) s d s i o o g s d s ，慢慢的转入含0 9 l 水的烧杯中，磁力搅拌到完全溶解，定容至 l l 无需灭菌 s d s ( 十二烷基硫酸钠) 2 0 m g m l 蛋白酶k n a c l ，5 m o l l 2 9 2 9n a c i 加h ：0 至l l c r a b n a c l ( 1 0 9 6 c t a b 0 7 n a c i ) 在8 0 m i h 2 0 中溶解4 i g n a c l 缓慢加入i o g c t a b ，同时加热搅拌，需要可加 热至6 5 溶解。定容体积至1 0 0 m 。 网川大学硕士学位论文 酚氯仿 2 5 ：2 4 ：1 酚氯仿异物醇 将2 5 份酚 在1 5 0 m o l ln a o h 5 0 珊o l lt r i s c l ( p h 7 5 ) l 姗o l le d t a 和2 4 份的氯仿及1 份异戊醇混合。加终浓度为0 1 的8 一羟基喹啉。分成几 分储存于- - 2 0 ，超过6 个月则废弃。 异丙醇 t a e 电泳缓冲液 5 0 贮存液，p h 约8 5 ： 2 4 2 克t r i s 碱 5 7 1 m l 冰醋酸 3 7 2 9n a 2 e d t a 。2 h 2 0 加水至l l 溴化一锭染色液 1 0 0 0 贮存液，0 5 m g m l 5 0 m g 溴化一锭 l o o m lh 。0 工作液：0 5 p g m l 4 x d n t p