（植物学专业论文）植物络合素合酶基因的功能分析及其应用.pdf

中文摘要 植物络合素( p h y t o c h e l a t i n s ，p c s ) 是含有y g l u c y s 重复结构的小分子多 肽，其结构通式为：( y 。g l u c y s ) 。g l y ( n - - 2 1 1 ) 。植物络合素( p c s ) 由植物 络合素合酶( p c s ) 催化谷胱甘肽( g s h ) 聚合而成，能够络合重金属离子而具 有解毒功能，这是植物解毒重金属胁迫的重要机制之一。本文克隆了来源于重金 属抗性植物绊根草( c y n o d o nd a c t y l o nc vg o l d e n s u n ) 的植物络合素合酶基因，通 过基因工程手段使其在烟草中过量表达，得到了一些有望用于植物修复 ( p h y t o r e m e d i a t i o n ) 的工程植株。同时，在水稻( o r y z a s a t i v a ) 种子中利用r n a i 技术抑制植物络合素合酶基因的表达，以降低重金属离子在人类最重要的粮食作 物水稻的籽粒中的积累。 1 通过r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ) 方法从抗性植物绊根草中克 隆了植物络合素合酶基因c d p c s l ，其1 515b p 的读码框编码一个含5 0 5 个氨 基酸的蛋白质，蛋白质序列分析表明它具有植物络合素合酶的结构特征，同 时还具有磷酸化位点和亮氨酸拉链结构。 2 c d p c s l 基因可以互补对铜和镉离子敏感的酵母突变株a b d e 1 ( c u p l ) 中 缺失的金属硫蛋白基因c u p l 的功能，也可以互补对砷离子敏感的酵母突变 体f d 2 3 6 6 a ( a c r - 3 ) 中的离子外排载体基因a r c 3 的缺失。 3 将c 卯c s j 转入烟草，共获得过表达c d p c s l 的烟草4 4 个株系，其中融合 g f p 的株系1 6 个。对t o 代的转基因植株的p c s 含量以及重金属抗性和吸收 能力进行了分析，其中抗性实验表明，在3 0 0 l am o l l 的c d 2 + 离子胁迫1 1 天 之后，野生型植株的叶片出现斑点状坏死，而两个转基因烟草株系s 6 和k 4 9 的植株没有出现受伤害症状。在l o oum o l l 的c d s 0 。处理一周后，转基因 植株中的p c s 含量比对照有不同程度的提高，最多提高了2 8 8 倍。当用3 0 0 l am o l lc d 2 + 处理9 天再用6 0 0l am o l l c d 2 + 处理2 天后，c d 的积累量比野生 型植株增加了2 倍多；用5 0 l am o l l a s ”处理7 天再用1 0 0um o l l a s ”处理2 天后，转基因植株对a s 的积累量最多增加了3 倍多。说明转入绊根草p c 合 酶基因的烟草增加了植物络合素的合成，并由此增加了对镉离子的抗性以及 植物络合素合酶基园的功能分析及其应用 对镉离子和砷离子的积累。 4 对转基因烟草中的c d p c s l 进行了亚细胞定位研究。在激光共聚焦显微镜和 荧光显微镜下分别用转基因烟草叶片组织和叶肉细胞原生质体观察融合g f p 的c d p c s l ，结果表明融合蛋白定位于细胞核中。 5 利用r n a i 技术抑制水稻种子中植物络合素合酶基因的表达，共获得3 9 个转 基因株系。其中3 5 个株系为种子特异性z m m l 启动子驱动o s p c s l 基因的 r n a i ，其余4 个株系由组成型的u b i q u i t i n 启动子驱动。r t - p c r 的分析结果 表明：一个由z m m l 启动子驱动的r n a i 转基因水稻株系的种子中，o s p c s l 的m r n a 水平比对照中的下降了一半。 关键词：绊根草，水稻，烟草，植物修复，植物络合素，植物络合素合酶，转 基因，镉，砷，r n a i ，g f p i l 摘要 f u n c t i o n a la n a l y s i sa n da p p l i c a t i o n o fp h y t o c h e l a t i ns y n t h a s eg e n e s j i a n g c h u a nl i ( b o t a n y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rm im aa n dp r o f e s s o rk a n gc h o n g a b a s t r a c t ： p h y t o c h e l a t i n s ( p c s ) ，af a m i l yo fl o wm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i ns p e c i f i ct ob i n d h e a v ym e t a li o n s ，h a v et h eg e n e r a ls t r u c t u r eo f ( y - g l u c y s ) n g l y ( n = 2 11 ) p c sa r e s y n t h e s i z e de n z y m a t i c a l l yf r o mg l u t a t h i o n e ( g s h ) b yp h y t o c h e l a t i ns y n t h a s e ( p c s ) i ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n td e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s m sf o rp l a n t st h a tp c sc h e l a t e a n ds e q u e s t r a t eh e a v ym e t a l s ac d p c s l ，e n c o d i n gap h y t o c h e l a t i ns y n t h a s ef r o m c y n o d o nd a c t y l o n ，w a sc l o n e da n do v e r e x p r e s s e di nt o b a c c op l a n t st op r o d u c er o b u s t g e n e t i cm o d i f i e d ( g m ) p l a n t sp r o m i s i n gi np h y t o r e m e d i a t i o n i nc o n t r a s t ，p c si nr i c e s e e dw a se n g i n e e r e dt or e d u c eb ya na p p r o a c ho fr n a it op r o d u c es a f ef o o dw i t hf e w h e a v ym e t a l i o n s 1 ap h y t o c h e l a t i ns y n t h a s eg e n e ，c d p c s lw a sc l o n e df r o mc y n o d o nd a c t y l o n w h i c hi sr e s i s t a n tt oh e a v ym e t a l s c d p c s lh a dao r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) o f1 ，515 b pi nl e n g t ha n dc o d e da5 0 5a m i n o a c i dp r o t e i n a n a l y s i so fp r o t e i ns t r u c t u r es h o w e d t h a tt h ep r o t e i np r o b a b l yh a sp h o s p h o r y l a t i o ns i t e sa n dl e u c i n ez i p p e r 2 t h er o l e so ft h ec d p c s li nh e a v ym e t a ld e t o x i f i c a t i o nw e r ep r o v e db yy e a s t c o m p l e m e n t a t i o na s s a y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t ht h ed e f i c i e n c yo f ac r 3 i na na s s e n s i t i v ey e a s tm u t a n tf d 2 3 6 一aa n dt h ed e f i c i e n c yo fc u p li nac ds e n s i t i v ey e a s t m u t a n ta b d eic o u l db ec o m p l e m e n t e db yt h ee x p r e s s i o no fc d p c s ii nt h e m t h i s s u g g e s t e dt h a tt h ec d p c s lp l a yak e yr o l ei nh e a v ym e t a ld e t o x if i c a t i o ni np l a n t s i i i 檀物络合景合酶基因的功能分：v r 反其应用 3 c d p c s la n dc d p c s l 一g f pw e r et r a n s f o r m e di n t ot o b a c c op l a n t sm e d i a t e db y a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s f o r t y - f o u ro v e r e x p r e s s i n gt r a n s g e n i cl i n e sw e r eo b t a i n e d ， a n d16l i n e so ft h e mh a v et h er e p o r tg e n eg f pf u s i o n st oc d p c s l s o m et og e n e r a t i o no fp l a n t sw e r ea n a l y s e dw i t ht h et r e a t m e n to fh e a v ym e t a l s i ti sf o u n dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n t sp r o d u c em o r ep c su n d e r10 0l am o l lc d s 0 4f o r 7d a y s t h em o s to n ei n c r e a s e db y2 8 8f o l d c o m p a r e dw i t hw i l d t y p et o b a c c o c o n s i s t e n t l y , a c c u m u l a t i o no fc d 2 + i nt h et r a n s g e n i cp l a n t sw a s t w om o r et i m e sa st h e w i l dt y p eu n d e r3 0 0m o l lc d 2 + f o r9d a y ss u b s e q u e n t l y6 0 0um o l lc d 2 + f o r2 d a y s a r s e n i cl e v e lo ft h et r a n s g e n i cp l a n ta l s oi n c r e a s e du pt o3f o l du n d e rt r e a t m e n t o f5 0um o l la s 3 十f o r7d a y sf o l l o w i n gw i t h10 0um o l la s 3 + f o r2d a y sm o r et h a n t h a to ft h ew i l dt y p e t h ep h y s i o l o g i c a lr e s u l t sa l s os h o w e dt w ot r a n s g e n i cl i n e s s u r v i v e du n d e r3 0 0um o l lc d 2 十f o r11d a y sw h i l en e c r o t i cs p o t sa p p e a r e do nl e a v e s o fw i l dt y p ep a n t s t h a td e m o n s t r a t e dg m p l a n t si n c r e a s e dn o to n l yr e s i s t a n c eb u t a l s oa c c u m u l a t i o nt oh e a v ym e t a l s 4 t h es u b c e l ll o c a l i z a t i o no fc d p c s1w a ss t u d i e dt h r o u g ht r a n s g e n i ct o b a c c o p l a n t sw i t hg f pa st h er e p o r t e r t h a tw a st h ef i r s tt i m et oa r g u et h a tp c sl o c a t e di n t h en u c l e a ro fl e a fc e l l so b s e r v e db yc o n f o c a la n df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e 5 r n a id r i v e nb yz m m lp r o m o t e ra n du b i q u i t i np r o m o t e rw e r eu s e dt os i l e n c e p h ”o c h e l m i ns y n t h a s eg e n ei n r i c es e e da n da l lt i s s u e s ，r e s p e c t i v e l y t h i r t y - n i n e t r a n s g e n i cl i n e sh a v eb e e no b t a i n e d t h i r t y f i v eo ft h e mb e l o n g e dt ot h o s ef r o m z m m lp r o m o t e rw h i c ho n l yf u n c t i o ni ns e e da n dt h er e s tl i n e sf r o mc o n s t i t u t i v e u b i q u i t i np r o m o t e r d a t ao fr t - p c rs h o w e dt h a te x p r e s s i o no fc d p c s lw a sr e d u c e d t oh a l fi ns e e d so fz m m1p l a n t sc o m p a r i n gw i t ht h ew i l dt y p e k e y w o r d s ： c y n o d o n d a c t y l o n ，o r y z as a t i v a ， n i c o t i a n a t a b a c u m ， p h y t o r e m e d i a t i o n ，p h t y t o c h e l a t i n ，p h y t o c h e l a t i ns y n t h a s e ，t r a n s g e n i c ， c a d m i u m ，a r s e n i c ，r n a i ，g f p 缩写词 缩写词 a m pa m p i c i l l i n a sa r s e n i c b p b a s ep a i r c d c a d m i u m c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a d - g a l a c t o s i d e d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d n a d e o x y r i b o s en u c l e i ca c i d d t n b 5 , 5 - d i t h i o b i s 一( 2 一n i t r o b e n z o i ca c i d ) e be t h d i u mb r o m i d e e d t ad i d o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e g f p g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g s h g l u t a t h i o n e g u s 1 3 - g l u c u r o n i d a s e h y gh y g r o m y c i n i p t g i s o p r o p y l d d t h i og a l a c t o s i d e k bk i l o b a s e k i n ( k a n )k a n a m y c i n n p t n o n p r o t e i ns u l f h y d r y l o d o p t i c a ld e n s i t y p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c s p h y t o c h e l a t i ns y n t h a s e p c s p h y t o c h e l a t i n r a c e r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s r n a o x y r i b o s en u c l e i ca c i d r p m r e v o l u t i o np e rm i n u t e r t p c rr e v e r s et r a n s c r i p tp c r s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e x g a l 5 一b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l b d - g a l a c t o s i d e 氨苄青霉素 砷 碱基对 镉 互幸b d n a d 一、 ，i 乳糖苷 焦碳酸_ 二乙酯 脱氧核糖核酸 5 ，57 一二硫硝基苯甲酸 溴化乙啶 乙二二胺四乙酸 绿色荧光蛋白 谷胱甘肽 d 一葡萄糖苷酸酶 潮霉素 异丙基d d 一硫代y - 孚l 糖茁 千碱基对 卡那霉素 非蛋白巯基 光密度 聚合酶链式反应 植物络合素合酶 植物络合素 c d n a 末端快速扩增 核糖核酸 每分钟转速 反转录聚合酶链式反应 十二烷基磺酸钠 三羟基甲基氨基甲烷 5 - 溴4 一氯一3 吲哚一d d 半乳糖苷 v 第一章前言 1 重金属污染现状 在世界范围内随着工业的发展，重金属污染也越来越成为一个严重威胁人类 生存的问题。重金属是指密度大于5g c m 3 的金属元素( 陈怀满，1 9 9 6 ) ，约有 4 5 种，如铜、铅、锌、铁、钴、镍、钒、铌、钽、钛、锰、镉、汞、钨、钼、 金、银等。尽管锰、铜、锌等重金属是生命活动所需要的微量元素，如铜和锌等 是多种转录因子以及酶的辅助因子，然而他们属于生物体所需要的微量元素，一 旦过量将对生物体造成很大的伤害。大部分重金属如汞、铅、镉等并非生命活动 所必须，而且所有重金属超过一定浓度都对人体有毒。砷是一种准重金属，但由 于其化学性质和环境行为与重金属有很多相似之处，一般将它算在重金属之内。 重金属在地壳中的本底浓度并不高，只是由于人类的开采、冶炼、加工及商 业制造等活动才引起严重的环境污染。在天然水体中只要有微量重金属即可产生 毒性效应，一般重金属产生毒性的范围大约在1 1 0m g l 之间，毒性较强的金 属如汞、镉等产生毒性的浓度范围在0 0 1 - - 0 0 0 1m g l 之间。 重金属对大多数植物也有很强的毒性，植物受伤害的主要的表现是细胞膜损 伤、参与光合以及呼吸代谢的大分子结构被破坏、核酸分子降解等。此外，重金 属还引起严重的氧化胁迫( c u y p e r s e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。在较低浓度的重金属胁迫下， 植物表现为生长受阻，产量下降等，经过食物链的生物放大作用，在较高级生物 体内成千万倍地富集起来，然后通过食物进入人体，在人体的某些器官中积蓄起 来造成慢性中毒，危害人体健康。例如，1 9 5 1 年以来由于汞污染造成的水俣病、 1 9 5 5 年以来由于慢性镉中毒所引起的骨痛病以及后来发生的慢性砷中毒，被列入 日本的四大公害病之中。这些都是在历史上著名的因为重金属污染引起的灾难。 镉和砷污染是最常见的危害比较严重的两种重金属污染。 镉( c a d m i u m ) ，元素符号为c d ，原子序数4 8 ，周期表里第l i b 族元素， 相对原子质量1 1 2 4 1 1 ，银白色过渡金属，熔点为3 2 1 1 8 ( 2 ，沸点为7 6 5 ，密 度为8 6 5g c m 3 ( 3 0 0k ) 。镉是重要的工业和环境污染物，主要来源于锌、铜、 铅矿的冶炼，电镀、蓄电池、合金、油漆和塑料等工业生产中。职业人群遭受镉 污染的主要途径是吸入，非职业人群镉污染的主要来源是食物和吸入。镉较其他 重金属容易为农作物、蔬菜、稻米所吸收，因此更容易对人造成危害。 植物络合素合酶基因的功能分析及- g g 应用 镉中毒会造成肾小管再吸收障碍，低分子量蛋白质和钙质等由尿中流失，长 期下去容易形成骨质软化，关节疼痛、骨折及骨骼变形等。长期摄入过量的镉， 会影响体内其它有益元素的效能，造成肝肾损害、肺气肿、支气管炎、内分泌失 调、食欲不振、失眠等问题。镉转移至动脉，使血压上升，导致血管脂肪化。另 外，镉也是一种致癌物质，可能诱发前列腺癌症。 砷( a r s e n i c ) ，元素符号a s ，原子序数3 3 ，周期表里第v a 族元素，相对 原子质量7 4 9 2 1 5 9 ，脆的灰色非金属薄片，熔点为8 0 8 ，沸点为6 0 3 ，密度 5 7 2 为g c m 3 ( 3 0 0 k ) 。 砷化物是毒性很强的物质，砒霜就是砷化物的一种。在工业生产中，砷化物 的用途非常广泛，冶炼和锻炼各种夹杂物的矿石时，砷蒸气逸散到空气中，迅速 氧化成三氧化二砷( 俗称砒霜) ；如开采雄黄、雌黄等含砷的矿石及冶炼炉的烟 道灰或矿渣，含有三氧化二砷粉尘；用三氧化二砷做原料制造消毒剂、杀鼠、杀 虫灭菌剂，玻璃工业的脱色剂；皮毛工业中用砷盐或三氧化二砷作为消毒防腐剂； 制造和使用含砷颜料，如雄黄、雌黄、巴黎绿等；制造和使用含砷农药；砷化合 物常用于医药，例如抗癌药、皮肤用药等：含砷合金的制造等。砷化物急性中毒 在生产中较少见，表现为呼吸困难、头痛、头晕、恶心、呕吐、乏力、皮炎、结 膜炎等，甚至昏迷死亡。而且，无机砷有致癌作用尤其容易诱发皮肤癌。 目前我国的重金属污染很严重。据报道，我国受镉、砷、铬、铅等重金属污 染的耕地面积近2 0 0 0 万公顷，约占总耕地面积的1 5 ；全国每年就因此造成粮食 减产1 0 0 0 多万吨；另外被重金属污染的粮食每年也多达1 2 0 0 力吨；合计经济损 失至少2 0 0 亿元。我国某些地区的水稻、蔬菜等农作物含镉量严重超标，接触人 群通过各种途径的镉摄入量达到5 3 6 5 2l a g 天人，远远超过我国平均水平 3 7 4 6l a g 天人、也远远超过w h o 的建议限量5 7 - 。7 1l a g 天人。沈阳某 污灌区稻米的含镉浓度高达0 4 1 0m g k g ，这已经达到或超过诱发“骨痛病” 的平均含镉浓度。 2 2 植物修复和食品安全问题 治理被污染的土地有客土法、淋溶法、化学抽提法等等，这些传统的方法 往往花费大，操作不便，而且应用范围小，还容易造成二次污染。因此，迫切需 要发展新的技术来治理重金属污染，保护环境。植物修复( p h ”o r e m e d i a t i o n ) 近 年来在国际上兴起，它是利用绿色植物从环境中清除污染物或者降低污染物毒害 的技术( c u n n i n g h a me ta 1 ，1 9 9 3 ；r a s k i ne ta 1 ，9 9 4 ) 。对于重金属污染来说，即利 用植物的吸收和富集从土壤中将其清除( c h a n e ye ta 1 ，1 9 9 7 ) 。它依托成熟的农业 技术和管理模式，所以操作方便，费用低廉，而且对于化学方法无力对付的大范 围的低浓度污染有着很好的治理作用。近年来人们在这方面做了一些尝试，但是 由于对超富集物种的筛选不足以及受植物修复的效率不高所限，这一技术在实际 应用中仍有一定的困难。 我们国家的污染状况日益严重，重金属超标的食品成为威胁人们生活质量和 健康的一大隐患。和植物修复不同，食品安全要求降低植物中重金属的含量，除 了对土壤的选择，重金属污染的控制之外，针对植物本身，使用稀土肥料等办法 也可以在一定程度上降低重会属离子从土壤向植物体迁移。但是针对大面积农田 被污染的情况，由于使用复杂和成本较高使得这些办法在实际中难以被应用。 3 植物络合素合酶研究进展 目前的研究结果表明，植物对重会属的抗性机制主要表现为络合作用和区室 化作用( h a l l ，2 0 0 2 ) 。重金属离子与植物体内专一性的结合肽结合后，会降低 其在胞内的自由离子浓度，从而减轻其对植物的毒性。同时，植物会进一步将重 金属加以区域化隔离，如将其富集于液泡中，以避免细胞中具有重要生物学功能 的大分子结构受到会属离子的伤害。目前研究最多的重金属结合肽为植物络合素 ( p h y t o c h e l a t i n s ) 和金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ) ( c o b b e t t ，2 0 0 2 ) 。金属硫蛋 白是一类由基因家族编码合成的多肽，而植物络合素是一类酶促反应合成的富含 半胱氨酸的多肽。 目前的研究认为：植物络合素在解毒重金属胁迫中起重要作用( c o b b e t t ， 2 0 0 0 a ，2 0 0 0 b ) 。 植物络合素合酶基因的功能分析及其应用 3 1 植物络合素( p h y t o c h e l a t i n s ，p c s ) 3 1 1 植物络合素的结构 植物络合素通常由三种氨基酸组成：g l u 、c y s 、g l y ，其一级结构通常是由 重复的y g l u c y s 结构加上一个末端的g l y 组成：( y g l u c y s ) 。一g l y ( n = 2 一1 1 ) 。 p c s 发现于多种植物与微生物中，而且在一些高等植物中，除了以g l y 为c 末端 氨基酸的p c s 分子之外，还存在以其它氨基酸为c 一末端氨基酸的p c s 分子，如 ( y g l u c y s ) 。- g l u 、( y - g l u - c y s ) 。- 1 3 一a l a 、( y - g l u c y s ) 。- s e r ，这类分子常 被称为异植物络合素( i s o p h y o t c h e l a t i n s ) ( r a u s e r ，1 9 9 5 ，1 9 9 9 ；z e n k ，1 9 9 6 ) 。 p c s 在结构上与g s h ( y g l u c y s g l y ) 有一定相似性。很多生理生化和遗 传学的研究都证明了g s h 是p c s 合成的底物( r a u s e r ，1 9 9 5 ，1 9 9 9 ：z e n k ，1 9 9 6 ) 。 如g s h 缺陷的酵母与拟南芥突变体均表现为p c s 缺失并对镉敏感( h o w d e ne t 口正，1 9 9 5 ；h ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 3 1 2 植物络合素在植物中的作用 a ) 植物络合素在植物对重金属抗性中的作用 1 9 9 5 年，h o w d e n 等的实验结果有力地证实了p c s 在植物对重金属c d 抗性 机制中的重要作用。他们分离了对c d 敏感的拟南芥突变体c a d - i 及相应的等位 基因突变体系列，这些突变体都不同程度地表现对c d 的敏感，而且都不能合成 c d 多肽复合物。它们都丧失了p c s 的累积能力，并且它们对c d 的敏感程度与 其体内p c s 的水平相关。与野生型相比，突变体中p c s 合成的底物g s h 水平并 无明显差异，只是缺失了p c s 合酶的活性( h o w d e nr ，1 9 9 5 a ，1 9 9 5 b ) 。可见， 拟南芥对c d 的敏感是由于p c s 合成受阻而引起的。p c s 对砷的解毒也有一定的 作用，拟南芥的p c s 合成的突变体对砷酸盐敏感( h ae la 1 ，1 9 9 9 ) 。m a r c u s ( 2 0 0 0 ) 证明砷酸盐与亚砷酸盐都可以诱导p c s 的生物合成，而且体外实验中，砷酸盐还 可以提高p c s 合酶的活力。j e a n e t t e 等( 2 0 0 1 ) 的研究也表明砷酸盐能够诱导使 h o l c u sl a n a t u s 根中的p c s 的含量增加，h o l c u sl a n a t u s 可耐受砷酸盐的抗性品种 中的p c s 的含量比敏感品种中的p c s 的含量高1 5 - - 2 0 倍。 p c s 主要通过络合与区室化作用来对重金属离子起解毒作用。在植物和酵母 中，p c s 中的c y s 巯基可与胞内的c d 2 + 形成配位键，进而形成p c s c d 复合物， 相对于游离的c d 2 + 而言，此复合物对细胞的毒性已大为降低。进一步，p c c d 复 4 合物被转运到液泡中。在酵母中，通过研究c d 敏感的h m t l 突变株( o r t i ze t a l ， 1 9 9 2 ) ，这种转运过程已经得到充分了解。在酵母提取物中发现两种p c c d 复合 物( h m w 和l m w ) ，它们是植物络合素和c d 的络合产物( m u r a s u g ie ta 1 ，19 81 ) 。 而h m t l 突变株无法形成h m w 复合物。h m t l 基因编码一类定位于液泡膜的a t p 结合的跨膜转运蛋白，它与a t p 对于转运l m w 都是必需的。在重金属镉处理 的烟草叶肉细胞的原生质体中，几乎所有的c d 与p c s 的积累都发现于液泡中 ( v o g e l i - l a n g ea n dw a g n e r ，l9 9 0 ) ；在燕麦( a v e n as a t i v a ) 中，p c s c d 复合物可 经过一种依赖于m g a t p 及p h 梯度的转运方式进入液泡d ? ( s a l ta n dw a g n e r ， 1 9 9 3 ：o r t i ze ta 1 ，1 9 9 5 ) 。类似地，在酿酒酵母sc e r e r v i s i a e 中也发现了a b c 型的离子载体，称为y c f l ，它可介导c d 与g s h 形成的复合物的跨液泡膜转运 ( l ie l a l ，1 9 9 7 ) 。 经过不同途径进入液泡的各分子在液泡中最终形成了h m wp c s c d 复合 物，c d 被有效地与细胞中的其它生物分子隔离。在液泡的酸性环境中，虽然s 2 。、 s 0 3 2 。可稳定h m wc d 2 + - p c s ，但是此复合物还是很可能发生降解。降解后游离出 图1 1 植物与真菌中p c s 介导的c d 抗性机制模型 细胞吸收的c d 离子激活p c 合酶并且诱导了p c s 的合成。p c s 络合胞质中的c d ， 从而形成低分子量c d - p c s 复合物( l m w ) 。h m t l 以主动运输方式将此复合物转运过液 泡膜。在液泡内，s 也加入此复合物中而形成稳定的高分子量复合物( h m w ) 。在此模 式中，l m w 作用为胞质中的载体，而h m w 是金属离子的储存形式。h m w 中c d ：p c s 比 l m w 中的c d ：p c s 要高，多出那部分c d 是由c d h + 反向转运体转运过液泡膜的。当c d 经过c d h + 反向转运体转运时，p c s 分子也可能是由h m t 转运进入液泡膜的( 引自 c o b b e t t 。2 0 0 0 ) 。 植物络合素台酶基因的功能分析及其应用 的c d 2 + 可被液泡中含量丰富的有机酸如苹果酸、柠檬酸、草酸等所沉淀，而复合 物中的多肽成分将被分解为氨基酸，又可进入细胞质中，参与下一轮p c s 的合成 或其它代谢过程。如此细胞则完成对c d 2 + 的解毒过程。图1 1 是c o b b e t t 提出的 由p c s 介导的c d 抗性机制模型，将有助于我们对于此机制的理解。 在一种海藻中( d u n a l l i e l at e r t i o l e c t a ) ，通过解毒重金属离子，植物络合素 还能够减轻植物的氧化胁迫压力( t s u i ，2 0 0 2 ) 。 b ) 植物络合素在维持细胞内会属离子平衡方面的作用 植物络合素可以络合过量的金属离子，从而保护相应的敏感酶，而且还可以 作为胞内金属离子的存储形式，从而维持胞内相对稳定的金属离子水平。 体外实验中，c u p c s 与z n p c s 复合物可以作为某些酶的金属离子供体，如 豌豆幼苗中的d i a m i n o 氧化酶的酶原可被c u p c s 激活；失去z n 离子的牛碳酸 酐酶可被z n p c s 重新激活。 另一方面，p c s 可以保护细胞内对重金属离子敏感的酶。如对c d 与z n 敏 感的r u b i s c o 、硝酸还原酶、乙醇脱氢酶、脲酶等，在z n 与c d 与植物络合素结 合成复合物时，它们对这些酶的半抑制浓度将提高1 0 0 1 5 0 倍。 但是，由于植物中存在多种离子的络合分子及其转运途径，在有些植物中 p c s 在维持必需离子的稳态方面并不起明显的作用。 3 2 植物络合素合酶( p h y t o c h e l a t i ns y n t h a s e ，p c s ) 3 2 1p c s 合酶基因的发现与结构 p c s 是以g s h 为底物，通过酶促反应催化而合成的。g r i l l 等在19 8 9 年首先 在膀胱麦瓶草s i l e n ec u c u b a l u s 的细胞培养物中发现了一种酶。这种酶在体外特 定的反应系统中可利用g s h 先合成( y g l u c y s ) 2 g l y ，1 5 分钟后产生( y g i u c y s ) 3 g l y ，继而是( y g i u c y s ) 4 g l y 。这种将g s h 的半分子y g l u c y s 转移到另一个g s h 分子上的酶被命名为y 谷氨酰半胱氨酸二肽转肽酶，简称为 p c s 合酶。然而，直到1 9 9 9 年，p c s 合酶基因才被三个独立的研究小组从拟南 芥、酵母和小麦中分离得至l j ( v a t a m a n i u ko k ，e ta 1 ，1 9 9 9 ；h as - b ，e la 1 ，1 9 9 9 ； c l e m e n ss ，e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。其中，v a t a m a n i u k 与c l e m e n s 的研究小组利用拟南芥 和小麦的c d n a 表达文库来筛选镉抗性基因并得到a t p c s l 与t a p c s l ：而h a 则 利用拟南芥c a d l 基因缺矢的突变体筛选得到a t p c s l 基因。大量分子生物学与生 6 化资料显示这些基因编码了p c s 合酶。 拟南芥a t p c s l 基因编码一个5 5 k d 的多肽，含4 8 5 个氨基酸残基。氨基酸 同源序列比较显示a t p c s 与酵母p c s 合酶( s p p c s ) 的n 端具有较高的同源性 ( 4 5 ) ，而c 端具有较低的同源性。c 端结构域最明显的特征是半胱氨酸的重 复出现，而且经常成对出现。拟南芥和酵母的c 端分别有1 0 个和7 个半胱氨酸， 其中的4 个与6 个是成对出现的。然而，这些半胱氨酸并没有明显的位置保守性。 小麦中t a p c s 与拟南芥a t p c s 全序列同源性有5 5 ( c l e m e n se la 1 ，1 9 9 9 ) ，其 中t a p c s 有1 4 个c y s ( 在c 端结构域形成2 个c y s 残基对) 。图1 2 表示了四种 p c s 合成酶的氨基酸序列比较图。目前已分离的p c s 合酶基因的氨基酸序列比较 结果说明，n 端氨基酸序列中有5 个c y s 和1 个h i s 是保守的，据推测p c s 合酶 的活性中心即位于此结构域中。而拟南芥c a d l 的等位突变体c a d l 5 属于无义突 变，其在n 端保守区域的下游翻译提前终止，从而产生一个截短了的多肽( 缺少 c 一端1 0 个c y s 中的9 个) ，但是，此突变的p c s 合酶活性并未受很大影响，在 c d 离子存在时仍表现其催化作用。由此可见，c 端序列对于p c s 合酶活性不是 必需的( c o b b e t t ，2 0 0 0 ) 。由于v a t a m a n i u k ( 1 9 9 9 ，2 0 0 0 ) 证明了重金属离子如 c d 增强了p c s 合酶的合成主要原因是成为酶促反应的底物g s h c d ，因此c 端 半胱氨酸残基的主要作用是通过结合重金属g s h 复合物并将它们带入催化中心 来提高酶的催化活性。 c a d l - $ a t l l| g ! ll l iil 必l !ll4 8 5 t a 2li i l 。! ! 一工一一i 一i 雎业 l删5 0 0 s p 卫 旺 匾噩 二二工二珂4 1 4 c e 匹。一上一l 堕一 ! i ! ll 叫| l 1 3 7 1 图1 2 四种不同物种的p c s 合成酶氨基酸序列比较的模式图。 a t ，a r a b i d o p s i s ( c a d i a t p c s l ；g e n b a n ka c c e s s i o nn o e ! 三曼1 5 量a n d e q 苎主2 三q ) ；t a , t r i t i c u ma e s t i v u m ( t a p c s1 ；a c c e s s i o nn o e q 壁三2 主2 ) ；s p ，f i s s i o ny e a s t ( s p p c s ；a c c e s s i o n r i o 丕鱼墨! 垒垒) ；c e ，c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ( c e p c s l ；a c c e s s i o nn o 丕鱼墨! 三j 全序列的氮基 酸数目列于右侧。半胱氨酸残基的位置以竖线表示。( c o b b e t ta n dg o l d b r o u g h ，2 0 0 2 ) r u o t o l o ( 2 0 0 4 ) 等人的研究进一步表明拟南芥p c s 合酶的催化活性中心位 植物络合紊合酶基因的功能分析及其应用 于3 7 2 个氨基酸以前的n 端部分。n 端不但保守而且稳定，可耐受v 8 蛋白酶的 消化，c 端3 7 3 4 8 5 个氨基酸部分则不稳定，但它决定了p c s 合酶跟何种重金属 离子结合。m a i e r ( 2 0 0 3 ) 对保守区的半胱氨酸和谷氨酸残基做了点突变研究之 后，同样支持催化中心在n 端的说法，而且指出对酶活性最为重要的是n 端的 半胱氨酸钱基。 3 2 2p c s 合酶基因的表达调控 在拟南芥和绊根草中，p c s 基因都有两个拷贝( 杨树德，博士后出站报告) 。 通过r t - p c r 方法对拟南芥的两个p c s 基因的表达进行了分析( c a z a l ee ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，a t p c s l 和a t p c s 2 在地上部分和地下部分的转录有明显差别，根中的转 录量大于叶中。在根中a t p c s l a t