（植物学专业论文）盐地碱蓬液泡膜ca2主动运输体及其在耐盐性中的作用.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名 一 导师签字：多互、山 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 姊守 j ， 导师签字： 多分 签字同期：2 0 0 年月日签字日期：2 0 0年月 日 m 东师范大学博士学位论文 盐地碱蓬液泡膜c a ”主动运输体及其在耐盐性中的作用 韩宁 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 摘要 盐分胁迫主要包括渗透胁迫及离子胁迫。渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一 系列次级胁迫如氧化胁迫等，严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的 水分及离子稳态，造成植物细胞分子损伤，生长减缓甚至死亡。植物对盐胁迫的 反应是由复杂的信号转导系统介导完成的。其中胞质中c a 2 + 作为第二信使对盐刺 激信号起传递和放大作用。c a 2 + 信号主要是胞质中c a 2 + 水平的波动，其波动的幅 度及持续的时间决定植物对刺激的反应。因此，植物胞质c a 2 + 稳衡态的维持对 n a + 外排或区域化非常关键。植物主要利用c 矿通道、c a 2 + 转运体等来精确控制 胞质c a 2 + 水平，维持胞质中的c a 2 + 的稳态。本实验以典型的积盐型盐生植物盐 地碱蓬为材料，分两部分探讨了盐胁迫下液泡膜c a ”- a t p a s e 、c a 2 + h + a n t i p o r t e r 和h + - a t p a s e 在植物抗盐中的作用。第一部分主要是对盐地碱蓬进行c a 2 + 、n a + 处理，测定有关生理指标及液泡膜旷a t p a s e 、ca _ h a t p a s e 活性并对h + a t p a s e 进行w e s t e r n - b l o t 免疫杂交。第二部分主要是克隆了盐地碱蓬液泡膜 c a 2 + h + a n t i p o r t e r 的基因s s c a x t 并进行表达特性分析，同时构建了含有s s c a x t 的酵母表达载体和植物表达载体分别转化酵母突变体k 6 6 7 和拟南芥，以分析此 基因的主要功能及过量表达对拟南芥耐盐性的影响，其主要结果如下： 1 c a 2 + 、n a + 处理对盐地碱蓬生长的影响 赫对盐地碱蓬生长的影响依赖于根际c a 2 + 供给水平。c a 2 + 供应充分的条件 下，n a c i 处理使植株相对生长量明显增加。但在c a 2 + 处理浓度为0m m o l l 情况 下，n a c l 处理对整株植物的生长无显著作用。说明了n a + 对盐地碱蓬生长的促 进作用依赖于一定浓度的外源c a z + 。 2 c a 2 + 、n a + 处理对盐地碱蓬叶片k + 、n 一、c a 2 + 等无机离子含量的影响 盐地碱蓬叶片细胞汁液k + 、c a 2 + 浓度随盐处理浓度的增大面降低，细胞汁 液n a + 浓度变化则相反。但在缺c a 2 + 培养条件下，细胞汁液k + 、c a 2 + 浓度随盐处 理浓度升高而下降的幅度明显大于高c a 2 + 培养条件下( p o 1 ) w h e nc a 2 + 1 e v e l i nt h e n u t r i e n ts o l u t i o nw a s0m m o l l 2 e 仃e c t so fc a 2 + o nn a + k + a n dc a 2 + c o n c e n t r a t i o n si n1 e a fe e l ls a po fs u a e d as a l s a s e e d l i n g su n d e rn a c lt r e a t m e n t k + a n dc a 2 + c o n c e n t r a t i o n si nl e a fe e l ls a pw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s eo fn a c lc o n c e n t r a t i o nf p o 0 5 ) i r r e s p e c t i v eo fw h e t h e rp l a n t sg l r o w ni n0 m m o l lo ri n2 0m m o f lc a 2 + m e d i u m c o n v e r s e l y , n a 十c o n c e n t r a t i o nw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df p o 0 0 1 ) n e v e r t h e l e s s ，u n d e rc o n d i t i o no fb o t h1 0 0i n l n o i l m a d4 0 0m m o l ln a c lt r e a t m e n t i ( 十a n dc a 2 + c o n c e n t r a t i o n sw e r es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e da n dn a 十c o n c e n t r a t i o nw a sr e d u c e df p o 1 ) 。 口0 m m 帆n a c i t 团 1 0 0 m m o l n a c i c a c r 2 ( m m o i 几) 4 0 0m m o l ln a c i 8 6 4 j 鲁n b li篆j6曼芷 山东缔范大学搏学位论文 图7 盐处理条件下c a 2 + 对盐地碱蓬相对生长量的影响 图中数据为5 个重复的平均值士s d ，+ 和t 分别代表p 0 0 5 和o o l f i g 7 e f f e c to f c r + o nr e l a t i v e g r o w t hq u a n t i t yo f s u a e d as a l s as e e d l i n g su n d e r0 m m o l l n a c l 1 0 0m m o l ln a c i ，a n d4 0 0m m 0 1 l n a c lt r e a t m e n t d a t aa r et h ea v e r a g eo f f i v eg r o u p so f p l a n t st r e a t e dw i t hn a c iu n d e rc o n d i t i o n so f 0m m o l la n d 2 0m m o l lc a c l 2 ( n = 5 ) 士s d + a n d + + & r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tf r o mc o n t r o la tp 0 0 5a n do 0 1 ， r e s p e c t i v e l y 2 c a 2 + 、n a + 处理对盐地碱蓬质膜透性的影响 由图8 可知，培养液中无c 2 + 条件下，1 0 0 m m o l l 和4 0 0 m m o l l n a c l 盐处 理均显著增加地上部分细胞质膜透性，而在2 0m m o l lc a 2 + 培养下只有4 0 0 m m o l l n a c l 明显增加了细胞质膜透性( p 0 0 1 ) 。并且在0 m m o l l c a 2 + 条件下 1 0 0 m m o l l 和4 0 0 m m o l l n a c l 处理的质膜透性分别要高于2 0 m m o l l c 2 + 培养 下盐处理。 口0 m ”。， c a c l 2 ( m m o l l l 图8 盐处理条件下c a 2 + 对盐地碱蓬叶片质膜透性的影响 图中数据为5 个重复的平均值士s d ，十十和+ 分别代表p o 叭和o 0 0 1 f i g 8 ，e f f e c to fc a 2 + o nl e a fp l a s m a l e m m ap e r m e a b i l i t yo fs u a e d as a l s ap l a n t su n d e r0m m o l l n a c i ，1 0 0m m o l ln a c i ，a n d4 0 0m m o l ln a c it r e a t m e n t d a t aa r e t h ea v e r a g eo f f i v eg r o u p so f p l a n t s t r e a t e d w i t h n a c iu n d e rc o n d i t i o n so f o m m o l la n d 2 0m m o l lc a c l 2 ( n = 5 p s d + + a n d + ”a r es i g n i f i c a n t l yd i f f e m mf r o mc o n t r o la tp 0 0 1a n d o 0 0 i r e s p e c t i v e l y 3 c a “、n a + 处理对盐地碱蓬细胞汁液f 、c a 2 + 、n 矿浓度的影响 无论培养液中有无c a 2 斗，随n a c l 处理浓度的增加细胞汁液k 斗、c a 2 十浓度都 明显降低( p 0 0 5 ) 。相反，n a + 浓度明显增j j n ( p 0 0 1 ) ( 表2 ) 。在无盐处理的条件 下，细胞汁液k + 和n a 十的浓度在有无c a 2 + 条件下都无差异，而c a 2 + 浓度却随培 养液c d + 的增加而明显增加。然而，盐处理条件下细胞汁液k + 、c a 2 + 浓度在2 0 帖 器 一基一鲁高嚣e置meemi磊正 山东牺范大学博士学位论文 m m o l lc a 2 + 条件下比相应的0m m o l lc a 2 + 条件下的高，细胞汁液n 矿却降低 ( p o 0 1 ) 。 表2 盐处理条件下ca ：2 斗对盐地碱蓬叶片细胞汁液k + 、c a 2 + 、n a + 浓度的影响 表中数据为9 个重复的平均值s d 。a 和b 分别代表与对照差异显著性p 0 0 5 和0 0 1 t a b l e 2 e f f e c t so fc a 2 + o nn a + ，k _ ，a n dc a 2 + c o n c e n t r a t i o n si nl e a fc e l ls a po fs u a e d as a l s a s e e d l i n g su n d e rn a c it r e a t m e n t 。d a ma l eb q e a nv a l u e so ft h r e ei n d e p e n d e n te x p e r i m e n t sa t t 4 t h d a yb yc a 2 + a n dn a + t r e a t m e n t ( n 司) ：t ：s daa n dba r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e mf r o mc o n t r o la t p 0 0 5 ，0 0 1 ，r e s p e c t i v e l y o 1 0 0 o 2 0 0 2 0 6 6 7 士6 6 6 7 3 7 士1 5 3 3 7 7 土2 5 2 8 6 1 3 士3 0 6 8 3 0 8 ：1 ：1 4 4 4 2 ，2 土o 2 9 1 7 3 ：e 2 8 3 8 2 8 8 士o 7 28 4 2 0 i 20 0 5 0 7 * 3 ，0 6 1 8 4 7 4 - 7 5 7 。 1 2 0 ，壮3 5 5 b 4 0 002 0 7 k o 5 8 。 1 3 6 ：i ：0 5 2 。2 5 7 3 士6 2 0 o 2 05 40 + 1 7 3 8 2 6 6 士0 8 081 9 8 o a ：2 1 0 b 4c a 2 + 、n a + 处理对盐地碱蓬叶片液泡膜上v 二i i + - a t p a s e 、v - c a 2 + a t p a s e 水解 活性的影响 4 1v i - i + a t p a s e 活性 由图9 结果可知，根际c a 2 + 供给缺乏时，v - h + 一a t p a s e 在1 0 0m m o l l n a c i 处理后活性比对照显著增加( p 0 0 5 ) 。而根际c a 2 + 供应充足( 2 0m m o l l ) 时，用1 0 0 、4 0 0m m o l l n a c t 处理后v - 一一a t p a s e 活性都明显比对照高。 ：3 0 2 4 1 8 1 2 苟6 旦 罟 20 o c a c l 2 ( r r r n 0 i l ) 口0 m r r t o l ln a c l 团 1 0 0m m o l ，ln a c i 困4 0 0 m m o l ln a c i lrl也啊e!n五e3扫堇芍叮毋乱上v 山东卿范大学博士学位论文 图9 盐处理条件下c a 2 十对盐地碱蓬叶片液泡膜、l h + - a t p a s e 活性的影响 图中数据为9 个重复的平均值士s d ， ，和 + 分别代表p 山东瓣范大学博壬学位论文 图l lc a 2 + 、n a + 处理对盐地碱蓬叶片液泡膜微囊蛋白w e s t e r n 。b l o t 分析 图左边字母代表v - h f - a t p a s e 的基a ，b ，d 和c ，图右边代表蛋白分子量。泳道a ：0m m o v l c a ”0 m m o l 儿n a c l 处理；b ：0 m m o l l c a 2 + 1 0 0 m m o l l n a c i 处理；c ：0 m m o l l c 一 4 0 0 m m o l f l n a c i 处理；d ：2 0 m m o l l c a + 0 m m o l , l n a c i 处理：e ：2 0 m m o l l c a 2 十，1 0 0 m m o l 几n a c l 处理；f ：2 0 m m o l l c 一+ 4 0 0 m m o l l n a c i 处理。 f i g 1 1 w e s t e r nb l o ta n a l y s i so ft o n o p l a s tv e s i c l ep r e p a r a t i o n si s o l a t e df r o ms u a e d as a l s a e a v e s e x p o s e dt od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a c i1 4d a y su n d e r0m m o l 几a n d2 0m m o i lc 一+ 1 m m u n o s t a i n i n gw a sp e r f o r m e du s i n ga n t i s e r u ma t p 9 5 l e t t e r so nt h el e f tm a r g i ni n d i c a t et h e p o s i t i o no f s u b u n i ta ，b ，da n dc n u m b e r so nt h er i g h ti n d i c a t et h em o l e c u l a rm a s s e so f s u b a n i t s l a n ea ：0m m o l lc a 2 + 0m m o l ln a c it r e a t m e n t ；l a n eb ：0m m 0 1 lc a 2 + 10 0m m o i ln a c i t r e a t m e n t ；l a n ec ：0m m o l lc a 2 + ，4 0 0m m o ln a c it r e a t m e n t ；l a n ed ：2 0m m o l lc a 2 + 0 m m o l ln a c it r e a t m e n t ；l a n ee ：2 0m m o l lc d + 1 0 0m m o l ln a c it r e a t m e n t ；l a n et2 0m m o l l c f + ，4 0 0m m o l j l n a c it r e a t m e n t 1 5i t gp r o t e i nw a sa d d e dp e rp o c k e t 讨论 在根际c a 2 + 供应充足的条件下，n a c i 处理( 1 0 0 4 0 0m m o l l ) 能显著提高 赫地碱蓬生长速率( r g q ) ( 图7 ) ，而在c 矿亏缺条件下n a c i 处理几乎不能影 响盐地碱蓬的生长速率。说明n a c i 对盐地碱蓬生长的影响受根际c a 2 + 浓度的限 制，c a “在盐地碱蓬耐盐中起重要作用。 细胞表面是n a + 干扰的原初部位。随n a c l 浓度的增加，植物叶片细胞质膜 透性明显增加，然而在c a 2 + 亏缺条件下n a c l 处理的盐地碱蓬叶片细胞质膜透性 要明显高于2 0n u r t o l lc a 2 十条件下n a c i 处理的伊 0 0 5 ) ( 图8 ) 。这些结果表明 盐土中的n a + 能破坏质膜的完整性和功能。但增规外源ca _ ”能缓解n a 的这些伤 害。早期的研究也指出增加的c a 2 + 能减少n a + 与细胞壁和质膜的耦联，缓解质膜 的渗漏，有利于维持胞质离子的稳态。 在n a c i 胁迫下，盐地碱蓬叶片细胞汁液f 和c a ”浓度随n a c i 处理浓度 的增加而降低，相反汁液n a + 浓度明显增加( p 0 ，0 0 1 ) ( 表2 ) 。小麦中曾有相似的 结果出现1 13 9 1 。结果说明增加外源c a 2 + 可能能增加k 十的吸收从而降低n a + 在植物 由东灏范大学礴学位论文 中的积累。增加的外源c a 2 + 可能通过一种未知的途径提高质膜k 十n a + 的选择性 吸收，从而缓解盐害“。而且c a 2 + 能抑制k + 内流通道的活性以减少n a + 从低亲 和k + 系统的进入4 “。 植物液泡膜质子泵( 一一a t p a s e 和h + - p p a s e ) 在维持胞质p h 和离子稳态方 面起关键作用。它能驱动跨液泡膜的次级运输，因此在植物耐盐中起重要作用。 在正常c a 2 + 供应条件下已存在很多数据来说明盐胁迫下液泡膜h + a t p a s e 水解 和h + 转运活性的变化。通常盐胁迫能使盐生植物v - h + a t p a s e 的活性增加，而 非盐生植物v - h + - a t p a s e 的活性减少或没有变化。当盐地碱蓬生长在2 0m m o l l c a 2 + 条件下n a c l 处理使v - h + 一a t p a s e 的活性增加，1 0 0m m o l l 和4 0 0m m o l l n a c l 处理后v - h + - a t p a s e 的活性分别约是对照的1 8 0 和2 1 0 ( 图9 ) 。而当盐 地碱蓬生长在0m m o l lc a 2 + 条件下，1 0 0m m o l l 和4 0 0m m o l ln a c i 处理后 v _ w a t p a s e 的活性分别约是对照的1 2 7 和1 1 5 。因此推测在盐胁迫条件下胞 质c a 2 + 信号可能会激活或和抑制蛋白激酶或蛋白磷酸酶的活性从而影响他们对 、，- 霄a t p a s e 的调节。q i ue ta l l i4 2 j 也指出液泡n 矿1 t + a n t i r i o r t o r 的活性受s o s 2 的调控，而s o s 2 受c 2 + 依赖型蛋白激酶s o s 3 的激活，但机制尚不清楚。 简单说，c a “营养在影响盐地碱蓬叶片v - h + a t p a s e 活性调控方面起重要作 用，它涉及到植物的耐盐性。v - r a t p a s e 活性的改变既可能是酶活性调节的变 化也可能是酶数量( 亚基蛋白量) 的变化。从图1 l 可看出v - h + - a t p a s e 的活性 和各亚基蛋自量的变化呈正相关。在c a 2 + 亏缺条件下n a 十很难影响v 一时a t p a s e 各亚基的蛋白量，从而活性变化也不大。然而2 0m m o l lc a 2 + 条件下，n a + 明显 增加v - h 十- a t p a s e 的各亚基蛋白量和活性。 总之，n a c l 胁迫对盐生植物碱蓬叶片v - r a t p a s e 活性的影响是c a 2 + 依赖 性的，并且其活性的变化是此酶亚基蛋白量的变化引起的。 在植物耐盐过程中除了大量表达耐盐基因外，还要提高c a 2 + 转运系统的活 性，尽可能快的将胞质中增加的c 矿转运至液泡以维持胞质正常的c a 2 + 浓度。 在n a c i 处理的番茄、烟草和拟南芥中c a 2 + a t p a s e 转录积累1 4 ”。表明随n a c l 处理时间的延长，钙泵数量增加，从而使胞质中增加的c a 2 + 浓度快速降低到对照 水平。本实验也检测了液泡膜c a 2 + a t p a s e 的活性，发现无论有无外源c 矿，盐 处理前后液泡膜c a 2 + a t p a s e 的活性无明显变化，但无论是否赫处理，无c a 2 + 条 件下液泡膜c a 2 + - a t p a s e 的活性要比有c a 2 + 条件下低( 图1 0 ) 。这一方面说明一 定浓度的外源c a 2 + 对维持液泡膜c a 2 + - a t p a s e 的活性的重要性，另一方面也说明 了盐处理对液泡膜c a 2 * - a t p a s e 的活性影响不大，这一点与非盐生植物不同。盐 胁迫下非盐生植物番茄液泡膜c a 2 十- a t p a s e 基因表达量明显增加【4 ”，而 v h + a t p a s e 活性不变甚至减少。因此，推测盐处理后由于盐地碱蓬v h + 一a t p a s e 活性增加，一方面为n a + 区域化提供能量，另一方面可能为液泡膜上的c a 2 + h + 逆转运蛋白提供能量，加速胞质中增加的c a 2 + 区隔化至液泡中，而液泡膜 由东牺范大学博士学位论文 c 酽+ - a t p a s e 的活性不增加，有利于节省更多的a t p 被液泡膜v _ h + a t p a s e 所利 用。有关液泡膜c w 脯逆向转运蛋白与盐地碱蓬抗盐性关系将在第二部分做进 一步研究。 综上所述，盐地碱蓬作为一种稀盐型的真盐生植物，在充足外源c a “前题下 生长受盐促进，否则生长仍表现出一定盐害。提高外源c a 2 + 浓度在一定程度上可 以维持质膜的稳定性，防止胞内k 十外流，对维持跑质中c a 2 + 、k + 、n 矿的离子稳 衡态有重要意义。同时，提高外源c a 2 + 浓度也使盐地碱蓬在盐处理后液泡膜 v - a t p a s e 活性提高，有利于盐地碱蓬抗盐。另外，盐处理后液泡膜c a 2 + a t p a s e 的活性变化不大，从而问接说明盐地碱蓬主要利用液泡膜c 矿，h + 逆向转运蛋白 来维持盐胁迫后胞内c a 2 + 的稳定。这一特性与菲盐生植物不同。 山东师范大学溥学位论文 第二部分盐地碱蓬液泡膜c a 2 + 逆向转运蛋白基因的克隆、特 性分析及功能鉴定 实验材料及实验方法 1 实验材料 1 1 植物材料 1 1 1 盐地碱蓬( s u a e d a s a l s a l ) ：将盐地碱蓬种子( 采自黄河三角洲) 播种于酸 洗过的细沙中，萌发后用h o a g l a n d 营养液浇灌4 周或1 0 周。光照1 6 小时，黑 暗8 小时，相对湿度6 0 8 0 ( 白天晚上) ，温度：2 5 3 5 2 0 2 5 ( 白天晚 上) ，白天最高光照强度约6 0 0i _ t m 0 1 m - 2s 一。 用于n o r t h e r n 分析的盐地碱蓬材料，除特别指出，均为1 0 0m m o f lc a c l 2 盐激处理4 8 小时。 1 1 2 拟南芥似r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 哥伦比亚生态型：播种于土：蛭石：珍珠岩 ( 4 ：3 ：1 ) 的混合土中，用h o g l a n d 营养液每三天浇一次，温度：2 0 。c - 2 2 。c ，相对 湿度6 0 7 0 ，光照1 6 小时，黑暗8 小时，光照强度1 1 0p m o l m 2 s 一。 1 2 菌种 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) ：d h 5 a 菌株为本实验室保存。 农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ：g v 3 1 0 1 菌株为本实验室保存。 1 3 质粒载体 p m d1 8 一t ( 附录1 a ) 、p r o k i i ( 附录1 b ) 为本实验室保存。 1 4 酶及化学试剂 r n ap c rk i tt a k a r a 公司产品 限制性内切酶及连接酶t a k a r a 公司产品 卡那霉素( k a n ) 、s i g m a 公司产品 四环素( t e t ) x - g a l l p t g 其它化学试剂均为国产或进口分析纯。 1 5 引物序列 s i g m a 公司产品 s i g m a 公司产品 s i g m a 公司产品 本实验中所用引物由上海博亚生物公司合成。 1 6 培养基 山东爆范大学薅学位论文 l b 培养基：参照分子克隆实验指南第二版附录。 m s 培养基：m u r a a s h i g eta n ds k o o gf 1 9 6 2 。 1 7 质粒提取液 参照分子克隆实验指南第二版附录。 l 。8 主要仪器设备 仪器型号产地 蛋白质电泳仪 m i n ip r o t e a ni i b i o r a d 自动凝胶成像系统t h e r m a li m a g i n gs ”t e mf t i 5 0 0 p h a r m a c i a p c r 仪 超速冷冻离心机 双光束分光光度计 放射性探测仪 d n at h e r m a lc y c l e r4 8 0 g e n e a m pp c r 。s y s t e m9 7 0 0 m o d e lj 2 - 2 1c e n t r i f u g e u v _ 2 1 0 a s e r i e s9 0 0m i n i m o n i t o r 冷冻台式离心机 c e n t r i f u g e5 4 1 7 r 台式离心机b i o f u s ep i c o 超低温冰箱s e r i e s1 0 0k e l v i n a t o r 紫外透射反射分析仪 z f 型 p e r k i ne l m e r b e c k m a n s h i m a d z u b r i t i s h 。m i n i i n s t r u m e m sl t d e p p e n d o f h e r a e u sl n s t r u m e n t s u s a 上海康华生化仪器制造厂 自动双蒸纯水蒸馏器石英管加热式1 8 1 0 b上海玻璃仪器一厂 2 实验方法 2 1 盐地碱蓬及拟南芥总r n a 的提取 利用t r i z o l 试剂少量提取盐地碱蓬及拟南芥叶片总r n a ，用于r t - p c r 和 r a c e 。利用异硫氰酸胍法大量提取盐地碱蓬叶片总r n a ，用于n o r t h e r n 杂交。 2 1 1t r i z o l 试剂提取植物总r n a 1 ) 称取o 1 9 新鲜盐地碱蓬或拟南芥叶片，液氮研磨成粉末移入1 5m l 离心 管。 山东师范大学博士学位论文 2 ) 加入l m lt r i z o l 试剂，充分混匀。( 样品体积不能超过t r i z o l 体积的1 1 0 ) 。 4o c 离心，1 2 0 0 0 9 ， 1 0 m i n 。 3 ) 上清液移入新管，室温放置5m i n 以使核酸复合物分开。加入0 2m l 氯 仿，摇动1 5 秒混匀后，室温放置3 m i n 。 4 ) 4o c 离心，1 2 0 0 0g ，1 0m i n 。上清液移入新管。加入1 倍体积异丙醇， 室温放置1 0 m i n 。 5 ) 4 c 离心，1 2 0 0 0g ，1 0r a i n 。7 5 酒精洗涤沉淀。 6 ) r n a 溶于2 0p ld e p c h 2 0 ，5 5o c 放置1 0m i n 。7 0 。c 贮存进行下一步 实验。 2 1 2 异硫氰酸胍法提取总r n a 1 ) 称取3g 新鲜盐地碱蓬叶片，液氮研磨成粉末移入5 0d 离心管中。 2 ) 加入4m o l l 异硫氰酸胍裂解液6m l 涡旋9 0 秒，加入2m o l l n a a c ( p h 4 8 ) 2r n l ，涡旋9 0 秒，再加入6 m l 苯酚，2 m l 氯仿，混匀。4o c ，8 0 0 0r p m ，离 心1 5 m i n 。 3 ) 弃沉淀，取上清液至另干净d e p c 水处理过的离心管中加入2 倍体积 无水乙醇，- - 2 0o c ，放置lh 。 4 ) 4o c ，8 0 0 0r p m ，离心1 5m i n 。弃上清液，在沉淀中加入1m l2m o l l l i c l ，使沉淀溶解。 5 ) 移入1 5 m l e p p e n d o r f 管中。 6 ) 3 0 0 0r p m ，离心1 5m i n ，弃上清液。在沉淀中加入4 0 0l a l 水( 经d e p c 处 理) ，再加入4 0 0p l 氯仿，混匀。 7 ) 1 3 0 0 0 r p m ， 离心6m i n 。上清液加入1 1 0 体积3 m o l l n a a c ( p h 5 f 2 ) 和 两倍体积的无水乙醇，2 0o c 放置过夜。 8 ) 1 3 0 0 0r p m ， 离心1 3m i n 。将沉淀r n a 用7 0 乙醇洗涤2 次( 7 0 乙 醇用d e p c h 2 0 配制) 。 9 ) r n a 沉淀室温下稍干燥。加4 0p 1d e p c h 2 0 溶解，- - 7 0o c 保存备用。 2 3 植物基因组d n a 的提取 1 ) 取4g 新鲜盐地碱蓬叶片，在液氮中研磨成粉末。 2 ) 转移至5 0 “离心管中，加入1 6 m l 细胞提取液，充分混匀。6 5o c 水浴 保温2 0r a i n 。( 提取液成分：t r i s h c l1 0 0m m o l l ( p h 8 0 ) ； e d t a5 m m o l l ( p h 8 ； n a c l5 0 0m m o l l ) s d s1 - 2 5 ) 。 3 1 加入5 m l5 m o l l k a c 溶液，冰浴放置3 0 m i n 以上。 4 ) 加入5 m l 氯仿：苯酚( 1 ：1 ) ，混匀，6 0 0 0r p m 离心1 0 m i n 。 5 ) 上清液转移到一个干净的5 0 m l 离心管中，加入5 m l 氯仿，6 0 0 0 r p m 离 山东师范大学博士学位论文 。- _ - - - _ - _ - _ _ _ _ - 一 心1 0 r a i n 。 6 ) 上清液转移到一个干净的5 0m l 离心管中，加入等体积冰冻的异丙醇， 一2 0o c 放置两小时以上。 7 ) 4o c 高速离心5r a i n ，在冰冷的7 0 乙醇中快速震荡以洗涤d n a 沉淀。 8 ) 水溶解沉淀，分光光度法测a 2 6 0 及a 2 8 0 以确定浓度，7 0 。c 贮存备用。 2 3 基因克隆 2 。3 1 反转录p c r 扩增 1 ) 反转录反应 反转录反应利用t a k a r a 的r n ap c rk i t ( a m v ) v e r 2 1 进行。按下列反应组成 调制反转录反应液( 2 0 山体系) ： m g c l 2 lo x r n ap c rb u f f e r r n a s ef r e ed h 2 0 d n t pm i x t u r e r n a s ei n h i b i t o r a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e o l i g od t - a d a p t o r 盐地碱蓬总r n a ( 茎l 肛g ) 4u l 2l l l 8 5i 土i 2u l 0 5u l 1g l 1 “ 1u l 按以下程序进行反转录反应：4 2 。c3 0 m i n ，9 9 。c5 r a i n ，5 。c5 m i n 。 2 ) p c r 扩增：按下列反应组成调制反应液( 5 0 “1 ) ： m g c l 2 1 0 x p c rb u f r c r 灭菌蒸馏水 s s c a x 基因上游简并引物 3u 1 4u l 3 0 7 5u l 0 2 5u l i 山 山东涵范大学德学位论文 s s c a x 基因下游简并引物 模板( 反转录产物) 1l a l l o l 轻轻混匀后，按以下条件进行p c r 反应：预变性9 4o c5r a i n ；变性9 4 。c7 5 s ，退火4 6o c2 r a i n ，延伸7 2 2 r a i n ，3 5 个循环；保温7 2o c1 0 m i n 。利用 1 的琼脂糖凝胶电泳检测基因扩增情况。 2 3 2 快速扩增c d n a3 ，末端( 3 r a c e ) 根据已知片段序列进行基因上游特异引物的设计和高质量r n a 的提取。利 用t a k a r a 的r n ap c rk i t ( a m v ) v e r 2 i 进行反转录反应( 同上) 。以反转录产 物为模板，调翎p c r 反应液： m g c l 2 3u l 1 0 x p c rb u f f e r 灭菌蒸馏水 基因上游特异引物 m 1 3p r i m e rm 4 模板( 反转录产物) 4 l 3 0 7 5 山 0 2 5 l 1p l 1 “1 1 0u l 轻轻混匀后，按以下条件进行p c r 反应：预变性9 4 0 c3 r a i n ；变性9 4 0 c3 0 s ，退火5 5o c2 r a i n ，延伸7 2o c1 5 r a i n ，3 5 个循环；保温7 2o c1 0 r a i n 。利用 l 的琼脂糖凝胶电泳检测基因扩增情况。 2 3 3 快速扩增e d n a5 ，末端( 5 r a c e ) 首先要进行基因特异引物的设计和高质量r n a 的提取，然后利用下面的步 骤快速扩增e d n a 的末端。 1 ) c d n a 第一链的合成 a ) 按如下体系加入o 5m 1 离心管中： g s p l ( 特异引物1 ) 2 5p m o l ( 1 0 2 5n g ) r n a(膜板)l-5g d e p c t t 2 0 补齐至1 5 5 “l b ) 将上述体系混匀并于7 0o c 保温1 0m i n 后放于冰上1m i n 。随后按顺序加 入以下试剂： 1 0 ) ( p c r b u f f e r2 5u l 山东师范大学博士学位论文 2 5m m m g c l 2 1 0m md i n t pm i x t u r e 0 1md t t 2 5l l l 1u 1 2 5u l 将上述反应液混匀，4 2 。c 温育lm i n 。随后加入s u p e r s c r i p ti ir t 反转 录酶1 “l ，轻轻混匀，4 2o c 继续温育5 0r a i n 。接着7 0 。c 温育1 5m i n 以终止反 应。 反应混合液离心2 0s ，并置于3 7o c 。加入l 儿lr n a s e ，充分混匀，3 7o c 保温 3 0m i n 。反应后离心收集反应液于管底，并放置于冰上。 2 ) e d n a 的纯化 a ) 将结合溶液( b i n d i n gb u f f e r ) 平衡至室温，约1 0 0 “l 超纯水温育至6 5 。c 。 b ) 加1 2 0 “l 结合溶液于上述反应液，随后转移至g l a s s m a x 纯化分离柱，1 3 ， 0 0 0 r p m 离心2 0s 。转移管中的液体保留至确定c d n a 已纯化出，纯化柱插于另 一转移管中。 c ) 加入0 4 m l 预冷的1 洗脱液于柱中，1 3 ，0 0 0r p m 离心2 0s ，弃掉滤 出液，上述过程重复3 次。再加0 ,