（有机化学专业论文）含膦过渡金属羰基碎片在生物分子标记中的应用研究.pdf

南开大学硕士论文 中文提要 厂 生 物 分 子 示 踪 子 种 类 包 括 放 射 性 同 位 素 、 酶 、 化 学 发 光 物 质 、 荧 光 色 素 等 ， 这 种生物探针技术在免疫分析， 激素 ( 如雌二醇， 皮质醇)的受体分析 ， 放射性治疗 一 - 、 、 及 显 影 技 术 ， d n a 结 构 分 析 ， 自 动 定 序 等 方 面 均 有 广 泛 的 应 用 。 少 本文研究了一种新型生物探针过渡金属拨基碎片对生物分子的标记。 过渡 金属拨基在 2 1 0 0 - 1 8 5 0 c n i ， 这一波段有强的红外吸收，而一般生物分子在此区域无 吸收，借助高灵敏度的傅立叶变换红外光谱仪 ( f t - i r )可对标记 对象进行示踪分 析。 本文利用了磷配体对过渡金属的较好的配位能力， 合成了两大系列含麟的生物 分子配体及其金属碳基化合物。 1 - n ,n 一 双 ( 2 一 二苯基腾基) 一 氨基酸甲 醋 c d p p - a a e ) 及其铁的拨基化合物 ( t r a n s - f e ( c o ) 2 1 2 田p p - a a e ) 2 . 1 目 标分子 ( 氨基酸、药物分子地高辛) 的2 一 二苯基磷基苯甲酸酷 ( 或酞胺) ( d p p b a d r v ) ， 及其饿的 拨基化合 物 ( o s 3 ( c o ) 1 1 ( d p p b a d r v ) ) 2 .2 金 属拨基化b o l t o n - h u n t e r 酞化 试剂o s 3 ( c o ) , i ( d p p a b - n h s ) 及其与芳胺的 _ _ 一 尸 一 一 酞 化 产 物 o s 3 (c o ) u (d p p b a -b a ) ) 本文对标记反应的反应性能、 标记 产物的稳定性、金属挨基化 b o l t o n - h u n t e r 酞化试剂的酞化反应性能、 化合物的单晶结构及红外谱图、 核磁磷谱数据进行了 研 究讨论，认为用金属拨基碎片标记生物分子作为一种新型生物探针是可行的。 关键词: 非放射性示踪子 以 标记过渡金属拨基碎片金属碳基免疫分析 匕丫 麟配体 南开大学硕士论文 ab s t r a c t l a b e l i n g o f b i o l o g i c a l l y a c t i v e m o l e c u l e s i s a n i m p o r t a n t m e t h o d i n b i o l o g i c a l a n d c l i n i c a l c h e m i s t ry . h o w e v e r , m o s t o f t h e t r a c e r s w h i c h a r e b e i n g e m p l o y e d a r e r a d i o a c t i v e . s o , i t i s v e ry n e c e s s a ry t o d e v e l o p n e w , s e n s i t i v e , n o n r a d i o s o t o p i c t r a c e r s . i n m i d d l e o f 1 9 8 0 , g e r a r d u s e d t r a n s i t i o n - m e t a l c a r b o n y l fr a g m e n t s a s a n o t h e r n o n r a d i o a c t i v e t r a c e r i n i m m u n o a s s a y ( c a r b o n y l m e t a l l o i m m u n o a s s a y , c m i a ) .m o s t b i o lo g ic a l r e l e v a n t m o l e c u le s h a v e a n w i n d o w a r o u n d 2 1 0 0 - 1 8 5 0 c m、 .m e ta l c a r b o n y l s , o n t h e c o n t r a r y , h a v e a s t r o n g a b s o r p t i o n i n t h i s r e g i o n . i n t h i s t h e s i s , t w o s e r i e s o f t r a n s i t i o n m e t a l c a r b o n y l c o m p l e x e s a r e s y n t h e s i z e d w h i c h c a n b e m o n i t e r e d b y f t - i r . 1 . i r o n c a r b o n y l c o m p l e x e s w h i c h a r e o b t a i n e d b y c a r b o n y l a t i o n o f i r o n ( 川 h a l i d e in p r e s e n c e o f c h e l a t e d i p h o s p h i n e l i g a n d s 困, n - b i s ( d i p h e n y l p h o s p h in o - ) a m i n o a c i d - m e t h y l e s t e r ) . 2 . o s m i u m c a r b o n y l c o m p l e x e s c o n t a i n i n g p h o s p h i n e l i g a n d s w h i c h a r e b i o l o g i c a l l y a c t i v e d e r i v a t i v e s o f 2 - ( d i p h e n y p h o s p h i n o ) b e n z o i c a c i d . t h i s k i n d o f m e t a l c a r b o n y l c o m p l e x e s a r e s t a b l e i n t h e a i r . i t i s p o s s i b l e f o r t h e l a b e l i n g o f p e p t i d e s , p r o t e i n s a n d d r u g s w i t h t h e t h e s i m i l a r m e t h o d s . k e y w o r d s : n o n r a d i o a c t i v e t r a c e r l a b e l i n g t r a n s i t i o n m e t a l c a r b o n y l f r a g m e n t c a r b o n y l m e t a l l o i m m u n o a s s a y ( c mi a )p h o s p h i n e l i g a n d 南开大学硕士论文 缩略词: aae .hcl: a l a s g l y s p h e : dp p - aae: d p p - a l a s d p p - g l y : d p p - p h e : d p p b a : dp p b adrv: d p p b a - g l y s d p p b a - a l a s d p p b a - p h e s nhs : d p p b a - n h s , b a: d p p b a - b as d p p b a - d g x, .p r : b u : d p p e : dcc: 氨荃酸甲酉 旨 盐酸盐 丙氨酸 甘氨酸 苯丙氨酸 n ,n 一 双( 2 一 二苯基磷基卜 氨基酸甲 酷 n ,n 一 双( 2 一 二苯基0基) - 丙 氨酸甲n n ,n 一 双( 2 一 二苯基腆基 ) - 甘 氨酸甲 酷 n ,n 一 双( 2 一 二苯基磷基) - 苯丙氨酸甲 酷 2 一 二苯基麟基苯甲酸 2 一 二苯基麟基苯甲酸醋 ( 或酞胺) 甘氨酸甲醋基一 2 一 二苯基麟基苯甲酞胺 丙氨酸甲酷基一 2 一 二苯基腾基苯甲酞胺 苯丙氨酸甲酷基一 2 一 二苯基麟基苯甲酞胺 n - 基丁二酞亚胺 2 一 二苯基嶙基苯甲酸丁二酞亚胺酷 爷胺 节基一 2 一 二苯基嶙基苯甲酞胺 ( 1 2 一 乙酞) 地高辛配基一 ( 2 一 二苯基麟基) 苯甲 酸酷 异丙基 异丁基 p h 2 p ( c h 2 犷 p h 2 二环己基碳二亚胺 南开大学硕士论文 dcu: dmap: p h 2 p p y : 矿 - c s h s : bo c : 二环己基19 4 - ( n ,n 一 二甲 基) 氨基w 2 一 二苯基麟基毗咙 环戊二烯基配体 叔丁氧酞基 南 开 大 学 硕 士 论 文一 第一章前言 近四十年来，金属有机化学得到了迅猛的发展。生物金属有机化学作为其新兴 的分支，在生物学，医学领域的应用潜力已得到了越来越多化学及相关学科科学工 作者的重视。 五 十 一 年代美国 免疫学 家p r e s s m a n 和e i s e n 首 先 将放射 性核素 ( 如 2 5 1 , 3 h ) 标 记 物 应 用 于 免 疫 分 析 ( i m m u n a s s a y ) 以 来 ii i ， 放 射 免 疫 分 析 ( r a d i o i m m u n a s s a y , r i a ) 以其迅速，高灵敏度， 特异性好等特点，可对蛋白质，多肤，激素，核营酸，药物 等生物分子进行放免分析。 但是用放射性同 位素做示踪子 ( t r a c e r ) 存在以 下缺陷: ( 1 )可 供标记用的 放射性同 位素种类有限; ( 2 )测定时需进行放射保护，对放射性污染物要小心处理; ( 3 )标记物寿命短， 存在自 身放射衰变; ( 4 )测试时受法律约束，需获公安部门许可。 所以， 人们一直试图寻找新型的生物探针( 示踪子) 取代放射性同位素， 其中以 酶标记， 化学发光标记及荧光标记为三大类型。 八十年代中后期， 法国的g .j a o u e n 小组提出了以过渡金属拨基碎片为示踪子的一种新型的非放射性免疫分析方法一 一金属 c 基免疫分析( c a r b o n y l m e t a l l o i m m u n o a s s a y , c mi a ) 得到了越来越多的关 注和研究。除了 在免疫分析方面做标记物外，过渡金属拨基碎片在激素( 如雌二醇， 皮 质醇 ) 的 受 体分 析12 .3 1 ，放射 性 治 疗及 显 影 技 术 队 d n a结 构分 析， 自 动 定 序15 1等 方面 均有很大的应用潜力。 1 . 免疫分析原理il l 免 疫分析的 基本原理是 建立 在 标记 抗原 和非 标记 抗原 ( a n t i g e n ) 和特异 性抗 体( a n t i b o d y ) 的竞争性反应上。 抗原和抗体的结合反应具有特异选择性( s e l e c t i v i ty ) ， 这是分子识别( mo l e c u l a r r e c o g n i t i o n ) 范畴 在生 物学 领域的 扩展， 此外酶和底 物 ( e n z y m e - s u b s t r a t e ) ,激素和受 南 开 大 学 硕 士 论 文_ _ 体 ( h o r m o n e - r e c e p t o r ) 之间的结 合也具有 这种选择性1 6 1 1 . 1 竞争抑制反应 标记 抗原 ( a g * ) ， 非标记 抗原 ( a g ) 对 特异性 抗体( a b ) 的 竞争反 应过 程如 下p i . s c h e me 1 a v *a g * - - - a b( 标记抗原一 抗体复合物) 十ab科 a ga g - - - a b ( 抗原一 抗体复合物) 在这一 免疫化学反 应体系中， 标记抗原 和非 标记 抗原 ( a n t i g e n ) 和特异性抗体 ( a n t i b o d y ) 的结合能力认为是相同的。 标记抗原和非标记抗原彼此竞争着与有限量 的抗体发生反应。 以放射性免疫分析为例， 标记抗原在反应达到平衡时， 其放射强度按照一定比 例分布在游离态和结合态两种状态之间。在反应体系中当非标记抗原的量增加时， 就会抑制标记抗原与抗体的结合，呈游离状态的标记抗原的数量相对增加，而且随 非标记抗原的量的增加，标记抗原一 抗体复合物的量相对减少， 这种特异性竞争抑制 反应就是放射免疫分析的定量基础。 抗原和抗体之间的反应是相当复杂的， 这一定 量基础是建立在以下基本假设上的: ( 1 )抗原，抗体的化学性质是均匀的; ( 2 )一个抗体分子只结合一个抗原分子 ( 即抗原，抗体都只有一个结合位点); ( 3 )抗原。抗体的反应服从一级质量作用定律，不存在协同效应 ( c o o p e r a t i v e e f f e c t s ); ( 4 )标记抗原和非标记抗原具有相同的参加反应的性质; ( 5 )反应过程能完全达到平衡; ( 6 )结合在抗体上的抗原可以与游离抗原完全分离，其反应平衡不受影响; ( 7 )结合抗原和游离抗原的比率能够精确测定。 1 . 2 标准曲 线的绘制h l 南开大学硕士论文 以 ， 系列非标记抗原的 标准浓度为横坐标， 纵坐标可以 选c p m , b / t , ( b / b o ) %, b / f 等，其中: e p m : 每分 钟 放射 衰 变 记 数 ( c o u n t p e r m in . ) ; b : 标记抗原一 抗体复合物浓度; b o : 未加非标记抗原时的标记抗原一 抗体复合物浓度; f : 游离的标记抗原浓度; t: b + fo 先精确配制好一系列非标记抗原的标准物剂量浓度， 标记抗原与特异性抗体的 量一定， 用浓度一定的非标记抗原分别与标记抗原一 抗体体系温育， 当反应体系达到 平衡后进行游离的标记 抗原与标记 抗原一 抗体复合物的分离， 通过一些测试手段( 如 放射性同 位素标记， 可用y 一 闪烁计数器或液体闪烁计数器; 对荧光标记， 可 用微量荧 光 光 度计) ，可得 到 相应的 物 质 浓度 值。 如以 非 标记 抗原 的 标 准 浓 度( c a s ) 为 横坐 标， 以 ( b bu ) %为纵 坐标， 可 得到类 似下图的 标准曲 线: f i g u r e 1 以908c 7060 罗山 一: c , , n g / m l 南 开 大 学 硕 士 论 文_ _ 这样，当 被测物在与标准曲 线相同的实验条件下得到的( b / $ 0 ) %值在标准曲 线 上相对应的横坐标即为被测物的实测浓度。 2 几种免疫分析方法的比 较11 .7 1 ta b l e 1 免疫分析 方法 示踪子 灵敏 度 标记对象 应 坦 范围 缺陷 放射性免疫分析 ( r a d i o i mmu n - - o a s s a y , ri a ) 放 射 性 同 位 素 ( 1 2 5 1 ， 13 11 , 3 h等) 1 0 2 9 抗原 包括半 抗原): 寿命短， 有放 射性自衰 半抗 原 及 大 分 子 化 合物 污染环境， 对人体 有害; 受法律限制 较大: 标记寿命短 酶免疫分析 ( e n z y m e i m u n o a - s s a y , e i a ) 酶， 如辣根过 氧 化 物 酶 ( h r p ) . 1 0 -9- 1 l ) - g 抗体; 可长久保存 半抗 原 及 蛋 白质 类 大 分 子 化 合物 反应底物与产物 在生理条件 卜 稳 定性差 荧光免疫分析 ( f l u o r o i mmu n o - a s s a y , f i a) 荧光色素 如f i t c , t mr i t c , d a n s , s i t s . 1 0 -9 g 抗原 包括半 抗 原 )或抗 体; 可稳定存在 抗原，半抗 原及抗体 受非特异性影响 较大 发光免疫分析 ( l u mi n e s c e n t i - mmu n o a s s a y , li a ) 化学发光物 ( 如氨基苯 二酞脱) 及生 物发光物 ( 荧 光素酶) 1 o 1 2 - 1 0 1 5 ( mo l ) 抗原 ( 包括半 抗 原 )或抗 体: 可稳定存在 蛋白质，激 素，酶， 月 旨 肪酸，维 生 素 及 药 物 略 金属拨基免疫分 析( c a r b o n y l m e - t a l l o i mmu n o o s s - a y , c mi a ) 过渡金属拨 基碎片 c r ( c o ) 3 . mn ( c o ) 3 , c 0 2 ( c o ) 6 等 10 is(m o l) 抗原 ( 包括半 抗原) 可稳定存在 药 物 ，激 素，多肤， 蛋白质，核 营酸等 略 3 过渡金属拨基碎片 - - - 一种新型的标记物 1 9 7 7年， c a i s最早提出用金属有机标记物( o r g a n o m e t a l l i c m a r k e r s ) 做示踪 子， 用原子吸收光谱( a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o m e t r y ) 作为检测手段的免疫分 析 方 法 ( m e t a l l o i m m u n o a s s a y , m i a ) ， 但由 于 测 定 结 果 与 标 准曲 线 偏 离 太 大， 一 直未用于实际的免疫分析。 南 开 大 学 硕 士 论 文_ _ _ 以过 渡 金 属 拨 基 碎 片 ， 如 c r ( c o ) 3 , m 0 2 c p 2 ( c o ) 4 ( c p = t l 5 - c s h 5 ) , mn ( c o ) 3 , c o 2 ( c o ) 6 等做标记物， 生成的标记抗原( 或半抗原) 对特异抗体仍 应具有相当的结合力，一般在室温下稳定。借助高分辨的富立叶变换红外光谱仪 ( f t - i r ) 可对金属m基进行定性及定量的检测。 过渡金属的拨基配体一般在 2 1 0 0 - 1 8 5 0 c m “ 这一波段有很强的红外吸收，而蛋 白 质等大的生物分子在此区 域却无吸收叭这样可以 通过游离态的 标记 抗原和标记 抗原一 抗体复合物的分离测定b / f 或b b。 值，绘制出标准曲线。 3 1 标记药物分子 许多药物在患者血浆中的浓度很低 ( - n g )，而其治疗量与其中毒剂量又很接 近， 所以对患者血药浓度的测定是免疫分析的一 个主要任务。 3 . 1 . 1 标 记 苯巴 比 妥 ( p h e n o b a r b i t a l u m ) 19 0 1 s h e me 2 c o r n e d c o m p d . 2 只 3 . 1 .2 标记 苯妥英 钠( p h e n y t o i n u m n a t r i c u m ) 16 9 1 iich zco ch zch 2母 c r ( c o ) 3 c o m p d . 3 南 开 大 学 硕 士 论 文_ 3 .1 .3 标记 卡 马 西 平 ( c a r b a m a z e p i n u m ) is a l n h c c h z - c 八 下c 日 c 0 2 ( c o) 6 c o m p d . 4 3 . 2 标记幽 体类 激素 ( h o r m o n a l s t e r o i d ) 对有些与激素相关的癌症的患病机理的研究集中在激素与受体的作用方式，受 体的结构及激素一 受体复合物对 d n a的遗传信息的表达的影响上，即受体分析 ( r e c e p t o r a s s a y ) 2 3 i， 一 般 可 通 过 标 记 激 素 而 达 到 示 踪目 的 。 另 外 放 射 性 的 金 属 ( 如 1 s 6 r e s s r e ) f 基 碎片 标记可同 时 用做显影剂 ( i m a g i n g a g e n t ) 和放射性治 疗药物 ( r a d i o p h a r m a c e u t i c a l s ) . f4 1 3 .2 . 1 标记 可 地 松 ( c o r t i s o l) 6 9 l a ch2c n h ch2- c 下 c h c 0 2 ( c o ) 6 c o m p d . 5 南 开 大 学 硕 士 论 文_ 3 .2 .2 标 记雌二 醉( e s t r a d i o l) 1z .3 .6 .9 1 h o ( c h z ) 3 0 a - c r ( c o ) 3 c o m p d . 6c o m p d . 7 3 . 3 标记氮荃酸、多肤及蛋白 质 3 .3 . 1 金属拨墓化的b o l t o n - h u n t e r 酞化试剂 在放射免疫分析中，象多肤、蛋白质、酶等类抗原一般采用直接在其酪氨酸残 基( t y r o s i n e ) 上直接碘化标记。 但有时 这种直接碘化法易引 起标记抗原分子免疫活 性( i m m u n o a c t i v i ty ) 或生物活性( b i o l o g i c a l a c t i v i t y ) 的降 低或失活， 而且有些抗原 分子本身没有酪氨酸残基 ， 不能直接标记 f i l l 。放射性b o l t o n - h u n t e r 酞化试剂就 是一酞化反应的活泼酷，其结构如下: 0- c o m p d . 8 它可与带有氨基的抗原分子进行酞化反应: 南开大学硕士论文 s c h e me 3 c o m p d . 8+ h 州- p r o t e i n ( o r p e p t id e ) 1 j a v p r o t e i n ( o r p e p t i d e ) c o mp d . 9 类似的，g e r a r d 等制得以下化合物，并分别与氨基酸甲醋、多肤、牛血清 蛋白( b s a ) 及p 一 氨基酸乙酷 进行了 酸化反应， 实现了目 标分子的金属拨基化标记。 1 1 1 , 1 2 , 1 3 -为 弋s(co o o ( c o ) 3 o-n (c o )30 s 令岁 、 c o m = mo m =co l =c p l = co. c o m p d . 1 0 c o m p d . 1 1 c o m p d . 1 2 南 开 大 学 硕 士 论 文_ 一0q 0- n n !1.l 瑞e m=mo ， l= c o， n = 2 m =f e ， l = c o，n =1 c o m p d . 1 3 c o m p d . 1 4 3 . 3 . 2 标记氮基酸及多肚1 4 1 对二肤及多肤的标记常用于肤类激素与其受体的相互作用原理的分析中。对 多肚既可通过酞化试剂进行间接标记， 也可在多肤上链接一些有配位能力的官能团 而直接实现金属拨基化。具体过程如下图所示: s c h e me 4 x- nhchcooyx- nh c hc ooy c 0 2 ( c o ) 6 o r m0 2 c p ( c o ) 4 c h 2 祥m 2l 2(c o )4 c c h 3 场场 c!clllllllllcic a . x = a c ， y = e t ， m= m o ， l = c p ; b . x = a c , y = e t , m二c o , l = c o; c. x = b o c , y = me , m = c o ， l= c o c o m p d . 1 5 c o m p d . 1 6 、 c o m p d . 1 7 s c h e me 5 南 开 大 学 硕 士 论 文_ bo c - p h e7一nh c o o c 比 b o “ 一 ” hc- n h c h c o o c h 3 甲 h 2 c 0 2 ( c o ) 8 t hf/ rt/ 3 h c 比 仁c 0 2(c o )6 甲 c h 3 h(玩 ces|cles八.丫111尸丫| h c o m p d . 1 8 c o m p d . 1 9 3 .4 标 记 低 聚 核 昔 酸 ( o l ig o n u c l e o t i d e ) 15 1 s c h e me 6 -0 q u -n n h 2 ( c h 2 ) 6 0 p ( o ) 2 o g t t t t c c c a g t c a c g a c +( a m in o - lin k e r -m 1 3 u n iv e r s a l p r im e r) 1.人七0 c o m p d . 2 0 b u ff e r ， p h = 9 ( c h 2 ) 6 0 p ( o ) 2 0 g t t t t c c c a g t c a c g a c dm s o c o m p d . 2 1 4 金属ira免疫分析( c m i a ) 中的超徽a制样技术( u l t r a m i c r o s a m p l in g t e c h n i q u e s ) 4 1 固体试样的制备11 5 1 以c o m p d . 4 的f t - i r分析为例 将c o m p d . 4 溶于2 0 m l绝对无水乙 醇中制 】 0 鱼巫些丝些鱼色一一一 成 浓 度 大 约 为1 0 -1 - 1 0 -, m的 溶 液， 将 其 注 入 装 有s m g 的 千 燥k b r 粉 末的 磨口 试 管， 真空抽溶剂至千， 制成3 m m厚的压片可供测试。 其检测限 可达8 0 p m o l . 4 2 液体试样的制备 在幽体类激素的受体分析及一些免疫分析中对 f t - 1 1 1的检测限要求达到 1 0 p m o l 或更高， 上述压片法不能满足其要求。 g e r a r d 等设计出 一超低体积，内附 着 一薄层金的红外样品池，并装配液氮冷却的锢的锑化物 ( i n s b )的红外检测器，检 测限 可 达0 .3 p m o l a 5 b e e r 一 l a m b e r t 定律一 金属裁基免疫分析的定f依据19 1 红 外光谱是吸收光谱的 一 种，同 样遵守b e e r 一 l a m b e r t 定 律 a=l o g l o 1 i =l o g 1 / t= 一 l o g t= s e l= c n ( l 1 码 其中: i o : 入 射 光 强 度;e : 摩 尔 吸 光 系 数 l . m o l -1 . c m 1 ) ; i :透 射光 强 度 ;c : 样 品 浓 度 ( m o l. l - 1) ; t : 透光率;n :样品所含分子数 ( m o l ) ; l : 样品池的长 度;v :样品 池体积 ( l ) . 用红外光谱法进行定量测量的根据是 化合物中 某一官能团( 或基团 ) 的极化度和 力常数相对于整个分子具有相对独立性，因此通过测定特征基团 ( 如过渡金属拨基) 吸收峰的强度可计算出 试样中 待测物质含量的 大小。 11 7 1 由 b e e r 一 l a m b e r t 定律可知， 一定，当l/ v的值越大，其检测限越低，所 以 选用 光程长 度( l ) 越大， 样品 池体积( v ) 越小， 检 测效果 越好。 6 含麟生物配体在金属毅基化标记的应用及展望 含磷配体的过渡金属有机化学是金属有机化学领域中一个极为重要而活跃 的 分 支 1i s 1 单 齿 或多 齿含 麟 配体 具 有和 过 渡金 属 强的 配 位能 力， 可 形成 一系 列的 含磷过渡金属拨基化合物: m ( c o ) 5 ( p h 2 p p y ) , ( m = c r ,m o ,w ) 1 9 1; m ( c o ) 4 ( p h 2 p p y ) ,( m = m o ,w ) 1 v i . 南 开 大 学 硕 士 论 文_ n i 2 ( p - d p p m ) 2 ( v - c o ) ( c o ) 2 0 i, f e ( c o ) 2 x 2 ( d p p e ) ,( x = i ,b r ) 12 1 1 ; 1 f e c l2 ( d p p e ) 2 1 f e z ( c o ) 2 c ia iz i l 。 其结 构分 别 如下: o o c 、 厂 c n 厂 c on i n i 咬 上 i/ c; 仁0 m|c( o c. . o c 1 - 1 c o m p d . 2 2 c o m p d . 2 3 c o m p d . 2 4 m=c r ; m= m o. c o m p d . c o m p d c o m p d . 2 7 cl x 二 x/ c- o c l , /_ 0 一 c / r eo - c c 1 ， / re , c i c i 丫广。 / /址、hzp 鄂从 co林co x二i ;c o m p d . 2 8 x=b r . c o m p d . 2 9 c o m p d . 3 0 本文提出以下标记思路: 通过把单麟或双麟配体链接到目 标分子上， 然后利用 磷配体对过渡金属强的配位能力而实现目 标分子的金属拨基化标记。 6 1 用 含f e ( i i ) 的 拨基 碎片 做标 记物 f e l : 在室温下， t h f做溶剂， 鼓入c o, 可与链接双嶙配体的氨基酸鳌合配位， 生成新型的二价铁离子的金属拨基化合物，此类化合物在固态下可稳定存在。此法 可推广用于多肤、蛋白质及含有氨基的目 标分子的金属拨基化标记。 6 2 用。 ， 的拨荃碎片标记 o s 3 ( c o )( me c n ) 可与单磷配体发生配体交换反应， 生成具有相当 稳定性的金 属 拨 基 化 合 物 12 2 1 2 一 二苯基磷基 苯甲 酸 ( d p p b a ) 在d c c及d m a p 存在下， 于室 温下与目 标分 1 2 南 开 大 学 硕 士 论 文_ _ _ 子的氨基或梭基发生缩合脱水反应12 3 1 ， 从而完成目 标分子的麟配体链接， 可与 o s 3 ( c o ) , t ( c h 3 c n ) 发生配体交换反应完成标记 。 6 3 展望 本文主要探讨了含麟金属锁基化合物在金属拨基化标记中的应用。作为一种金 属拨基化标记方法， 三价麟配体通过自 身携带的反应官能团 ( 如c o o h , c h o等) 可与许多目 标分子 ( 如氨基酸， 激素， 药物，蛋白 质，多 肤及d n a ) 键合而实现配 位，完成拨基化标记。而且经实验证实，本文所合成的两大系列金属拨基化合物 在室温下，空气中为可稳定存在的固体。尤其对于 o s 的系列拨基化合物，在溶剂 中也有相当好的稳定性。 p k ff ; ,ic 渔生鱼竺一一一一一一一一一 第二章含麟过渡金属f e ( i i ) , o s 拨基碎片标记目 标分子 凡含三价磷的化合物参与的合成实验， 均在高纯氮 s c h l e n c k 操作线下进行。 试 剂、溶剂均经过标准脱水、脱氧处理。中间体的制备因与文献方法有所不同，故也 一 1 一列出，仅供参考。熔点、沸点、压力均未经教正。 测试仪器: 红外光谱仪: 核磁共振仪: 元素分析仪 x 一 衍射仪: f t - i r , e q u i n o x 5 5 b r u k e r f x - 9 0 q; a c - p 2 0 0 h n m r : c d c 13 做 溶剂 3 p n mr: 以8 5 %h 3 p o ; 为外标， c d c 1 3 为溶剂。 y a n a c o c h n c o r d e r mt - 3型 bruker s mart 1 中间体的制备 l 一 丙氮酸甲 阳盐酸盐12 4 1 在 2 5 0 m l的圆底烧瓶中，加入 “m l无水甲醇，用冰盐浴冷却到一 1 0 以下， 搅拌下慢慢滴入2 0 m l , 二氯业矶 ( 重蒸)， 0 .5 h 滴完，室温反应l h 后加入1 2 g ( 0 . 1 3 5 m o l ) l 一 丙氨酸，室温下搅拌3 h ，再加热回流4 0 m i n 。 水泵减压除溶剂， 得 白 色固 体， 用c h 3 0 h / e t 2 0重结晶， 得1 5 . 4 8 白 色固 体。 母液浓缩， 再用c h 3 0 h / e t 2 0重结晶，又得到0 .4 g 白 色固体， 共得到1 5 . 8 8 产品，收率8 3 .8 %. m . p . 1 5 8 - - 1 6 0 1 c， f w : 1 3 9 . 1 8 . 南 开 大 学 硕 士 论 文_ _ 4 . 1 7 g ( 3 0 m m o l ) l 一 丙 氨酸甲 h 9 盐酸盐悬浮于1 0 0 m l甲 苯中， 缓慢滴入1 2 .6 m l ( 9 0 m m o l ) 三乙 胺 ( 重蒸) ， 室 温下 搅拌6 m i n ， 冰 浴下缓 慢滴入1 0 . 8 m l ( 6 0 m m o l ) 三 苯基氯化磷，室温搅拌2 4 h ， 抽滤，并用5 0 m l甲苯洗涤滤饼 ( 三乙胺盐酸盐)，浓 缩滤液，向棕黄色油状残留物中加入 i o o m l无水乙醚，强烈搅拌，滤去不溶物， 浓缩后得黄色油状固体。搅拌下加入无水甲醇，有大量白色沉淀物析出，过滤并用 无水甲 醇洗涤， 干燥后得白 色固体5 .9 1 g ， 收率4 6 .3 %. m . p . 1 1 8 - 1 2 0 r, f w: 4 2 5 .0 7 将2 . 8 3 g ( 2 0 m m o l ) 二氯亚 a搅拌下滴 入冷却到 一 1 0 的1 5 m l的甲 醇中。 然后加 入1 . 6 5 g ( i o m m o l ) l 一 苯丙氨酸， 0 左右搅拌4 0 m i n ， 室温下再搅拌l h ，回流2 h . 浓缩， 得油状物，冷却后析出白 色固体。 用甲 醇 / 乙 醚重结晶得2 . 0 g 白 色固体，收 率9 0 %e m .p . 1 5 4 - - 1 5 6 1c , f w : 2 1 5 . 5 0 一 l - n ,n - 5 r ( : - 崖 盛4) a e组 更t s 坚 5 1 6 . 4 6 g ( 3 0 m m o l ) l 一 苯丙 氨酸甲 酷盐 酸盐 悬浮于1 0 0 m l甲 苯中， 缓慢滴入1 2 . 6 m l ( 9 0 m m o l ) 三乙胺( 重蒸) ， 室温下搅拌6 m i n ， 冰浴下缓慢滴入1 0 .8 m l ( 6 0 m m o l ) 二苯基氯化嶙，室温搅拌2 4 h ， 抽滤，并用5 0 m l甲苯洗涤滤饼 ( 三乙 胺盐酸盐)， 浓缩滤液，向棕黄色油状残留 物中加入1 0 0 m l无水乙醚， 强烈搅拌，滤去不溶物， 浓缩后得黄色油状固体。搅拌下加入无水甲 醇，有大量白 色沉淀物析出，过滤并用 无水甲 醇洗涤， 干燥后得白 色固体8 .2 2 g ， 收率5 0 .3 % o m . p . 1 4 9 - 1 5 0 1 c , f w: 5 4 7 . 6 甘低酸甲 酮盐酸盆 7 . 4 5 g ( o . l m o l ) 甘氨酸 悬浮5 0 m l 无水甲 醇中 通入 干 燥的h c i ( 可由 浓硫酸滴入浓 盐酸， 经浓硫酸干燥制得) ， 约1 5 m i n 后甘氨酸全部溶解。 室温搅拌0 .5 h ， 浓缩， 抽 干， 有白 色固体生成， 用甲 醇 / 乙 醚重结晶， 得白 色固体1 1 . 5 g ，收率9 2 %. m. p . 1 7 5 1c( d e c . ) , f w: 1 2 5 . 1 2 . 鱼3 t 3 c一一一一一一一一一一一一- 3 .7 5 g ( 3 0 m m o l ) l 一 苯丙氨酸甲醋盐酸t h 悬浮于 1 0 0 m l三氯甲烷中， 缓慢滴入 1 2 . 6 m l ( 9 0 m m o l ) 三乙胺 ( 重蒸)，室温下搅拌 1 0 m i n ，冰浴下缓慢滴入 1 0 . 8 m l ( 6 0 m m o l ) 二苯基氯化m， 室温搅拌2 4 h , 浓缩至千，向反应瓶中 加入1 5 0 m l水，充 分搅拌 0 . 5 h ，有大量油状固体沉积，倾去水层。搅拌下向 残留物中加入2 0 0 m l乙 醇， 有大量白 色沉淀物析出，过滤并用乙醇洗涤， 干燥后得白 色固体 6 . 7 9 g ，收率 4 9 .5 %, m . p . 1 2 0 - 1 2 1 c , f w: 4 7 3 . 5 在一个装有机械搅拌、回 流 冷 凝 管 、温 度 计 。 ，。 。 口 圆 底 烧 瓶 内 力。56g(0.44m ol 和6 0 0 m l 水。 电 热 包加热到7 0 1c， 然后每隔0 . 5 h 分五次 加入1 3 7 g ( 0 . 8 8 m o l ) 高 锰酸 钾。加毕后升温至8 5 c ，反应2 4 h .紫色反应混合液倒入1 l烧杯内，冰水浴下慢 慢倒入i o ml浓盐酸， 紫色消失， 有大量白色沉淀物生成， 过滤， 用水洗滤饼数次， 室温晒于， 称重为3 9 . 8 8 ，收率5 7 . 8 % . m . p . 1 3 9 - 1 4 0 1c , f w: 1 5 6 . 5 7 , 2 一 二 苯蕃麟 善苯甲 酸12 8 1 在一带支管的2 5 0 m l的圆底烧瓶内 加入2 8 .4 g ( 0 . 1 0 8 m o l ) 三苯基磷， 8 o m l 干燥 的四 氢峡喃， 氮气流下剪入1 . 5 2 g ( 0 .2 1 9 m o l ) 金属铿， 剪入过程可观察到溶液颜色逐 渐变为暗红色。完毕后室温搅拌2 4 h ， 直至锉粒全部消失。滤去未反应的铿，然后 机 械搅拌冰盐 浴下滴加1 1 .5 g ( 0 . 0 9 1 m o l ) 邻氯苯甲 酸的四 氢吠喃溶液4 0 m l ， 大 约需 3 0 m i n s 滴加完毕， 有大量沉淀析出， 室温下继续搅拌2 4 h 。 反应混合物倾入3 0 0 m l 水中， 沉淀物溶解， 水层上有薄的油层出 现。 用乙醚萃取( 3 x 4 0 m l ) ， 弃去醚层， 用 6 n的盐酸酸化水层至p h = 2 ， 有大量沉淀析出， 用二氯甲 烷萃取产物， 合并萃取液 并用水洗 ( 2 x 2 0 m l )。用无水硫酸钠千燥，浓缩，得黄色固体。 用甲醇重 结晶， 得到浅黄色固 体1 0 . 0 1 g ， 收率3 5 . 9 0% m . p . 1 8 0 - 1 8 2 c , f w: 3 0 6 . 1 6 e 在一个装有机械搅拌、 回 流冷凝管、 温度计的i l四口 圆 底烧瓶内 加入5 6 g ( 0 . 4 4 m o l ) 对抓甲 苯和6 0 0 m l 水。 电热包加热到7 0 1 c ， 然后每隔0 . 5 h 分五次加入1 3 7 g 鱼玉瞪皿兰些生一一一一一一一一一 ( 0 .8 8 m o l ) 高 锰酸钾。 加毕后升温至8 5 1c ， 反应2 4 h 。 紫色反应混合液倒入1 l烧杯 内，冰水浴下慢慢倒入1 0 m l浓盐酸，紫色消失，有大量白色沉淀物生成，过滤， 用水洗滤饼数次， 室温晒干， 称重为4 1 . 6 g ，收率5 9 .8 %. m. p . 2 3 9 - 2 4 1 c ， f w: 1 5 6 . 5 7 . 4 一 二 苯基麟 蒸苯甲 酸12 8 1 在一带支管的2 5 0 m l的圆 底烧瓶内 加入2 8 .4 g ( 0 . 1 0 8 m o l ) 三苯基嶙， 8 0 m l干燥 的四 氢吠喃， 氮气流下剪入1 . 5 2 g ( 0 . 2 1 9 m o l ) 金属铿， 剪入过程可观察到溶液颜色逐 渐变为暗红色。完毕后室温搅拌2 4 h ， 直至铿粒全部消失。滤去未反应的铿，然后 机械搅拌冰盐浴下滴加1 1 . 5 g ( 0 . 0 9 1 m o l ) 对氯苯甲 酸的四氢吠喃溶液4 0 m l ， 大约需 3 0 m i n s 滴加完毕， 有大量沉淀析出， 室温下继续搅拌2 4 h 。 反应混合物倾入3 0 0 m l 水中， 沉淀 物溶解， 水层上 有薄的油 层出 现。 用乙 醚萃 取( 3 x 4 0 m l ) ， 弃去醚层， 用 6 n的盐酸酸化水层至p h = 2 ， 有大量沉淀析出， 用二氯甲烷萃取产物， 合并萃取液 并用水洗 ( 2 x 2 0 m l )。用无水硫酸钠干燥，浓缩，得白色固体