（植物学专业论文）电离辐射对枯草芽孢杆菌抗氧化酶的效应研究.pdf

r l l f l | f i j f l l l l f i i f i l l ( i 舢l l l y 18 2 d 。12 7 工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 戳：飞豸 嗍k 六7 o w ，o p o j 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 弋菟 聊虢扮咖弋趴 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 生物体在长期对环境的适应中已形成了自身防御系统，来保护自身的安 全。超氧化物歧化酶( s u p e ro x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 作为抗氧化酶系统成员之 一，主要负责清除细胞内外的o ：，在抵御外界逆境胁迫中有相当重要的作用。 为了研究电离辐射对生物体抗氧化酶系统的效应，及外源抗氧化酶的保 护和修复能力，本课题首先考察了影响s o d 活性测定的因素，发现保存时间 对s o d 活性影响很大，细胞破碎条件、样品保存温度和保存形式也会影响 s o d 活性。制成酶液后保存于7 0 冰箱对酶活性影响相对较小；溶菌酶结 合超声波清洗机处理能有效破碎细胞。 从细胞存活率、胞内s o d 活性、d n a 双链断裂水平综合考察了丫辐照 对枯草芽孢杆菌的损伤效应以及外源s o d 在y 辐照中的保护和修复效应；研 究结果表明，受到丫辐照后，枯草芽孢杆菌的存活率和s o d 活性随剂量明显 下降，d n a 双链断裂水平( p r 值) 不断上升并趋于饱和；y 辐照前、后分 别添加外源s o d ，均能明显增加细胞耐受性，在8 0 0 、1 4 0 0 g y 剂量下存活率 提升尤为显著；外源s o d 可显著减弱d n a 双链断裂水平；两种作用方式下 的胞内s o d 活性变化差异很大，辐照前添加s o d 使胞内s o d 活性低于对照， 辐照后则使s o d 活性提高，且改变了s o d 随剂量的变化趋势，呈先升高后 降低的趋势。 本课题另以紫外线和枯草芽孢杆菌1 6 8 菌株为模拟对象，系统分析了紫 外线对s o d 同功酶的效应，建立一种研究辐射对抗氧化酶损伤效应的研究方 法。研究结果显示，u v 可使胞内s o d 总活性下降；s o d 同工酶活性随剂量 表现为原有条带的消失和新的条带出现，条带强度随剂量减弱；u v 对s o d 两个同工酶基因的影响不一致，s o d a 基因在u v 刺激下表达减弱：对s o d f 的影响相对较大，增强了s o d f 基因的表达，但无明显剂量相关性。 综上所述，通过研究优化出一组对酶活性影响最小的参数并获得了一种 进行微生物细胞破碎的简便方法；辐射通过引起d n a 双链断裂、抗氧化酶 活性降低、自由基累积引发氧化损伤等过程对枯草芽孢杆菌有明显的损伤效 应。外源s o d 可以减小辐射对细胞的损伤，保护细胞。辐射对抗氧化酶同工 酶的效应不同，系统的研究辐射对抗氧化酶的影响才能深入揭示电离辐射的 损伤效应。 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i 页 关键词：s o d 活性d n a 双链断裂同工酶 丫辐照 紫外辐照 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1 i i 页 a bs trac t o r g a n i s m sh a v ee v o l v e das e to f d e f e n s es y s t e mt op r o t e c tt h e i rs e c u r i t yi na l o n gt e r ma d a p t a t i o nc o u r s e a sam e m b e ro ft h ea n t i o x i d a n te n z y m es y s t e m ， s o d ( s u p e ro x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) i sp r i m a r i l yr e s p o n s i b l ef o re l i m i n a t i n g0 2 e x t e r n a la n d i n t e r n a l ，a n dp l a y s a n i m p o r t a n t r o l e a g a i n s t t h eo u t s i d e e n v i r o n m e n t t h ea i mo ft h i sr e s e a r c hi st os t u d yt h ee f f e c t so fi o n i z i n gr a d i a t i o no n l i v i n go r g a n i s m s a n t i o x i d a n te n z y m es y s t e m s ，a n dt h ep r o t e c t i o na n dr e p a i r i n g c a p a b i l i t i e so fe x t e r n a la n t i o x i d a n te n z y m e s t h ef a c t o r so fe f f e c t i n g s o d a c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e df i r s t l y t h er e s u l t ss h o wt h a tp r e s e r v et i m eh a sag r e a t i m p a c to nt h es o da c t i v i t y c e l ld i s r u p t i o nc o n d i t i o n s ，p r e s e r v et e m p e r a t u r ea n d p r e s e r v ef o r mw i l la l s oa f f e c tt h es o da c t i v i t y t h ee n z y m es a m p l ep r e s e r v e da t - 7 0o h a sas m a l le f f e c to nt h es o da c t i v i t yr e l a t i v e l y c e l l sc o u l db eb r o k e n e f f e c t i v e l yb ya n du l t r a s o n i cc l e a n i n gm a c h i n ec o m b i n e dw i t hl y s o z y m e t h ed a m a g ee f f e c t so f 丫i r r a d i a t i o no nb a c i l l u ss u b t i l i sa n de x o g e n o u ss o d e f f e c t sa g a i n s t 丫i r r a d i a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e db yt h em e t h o d so fc e l lv i a b i l i t y , i n t r a c e l l u l a rs o d a c t i v i t y , a n dd n a d o u b l e s t r a n db r e a k sl e v e l t h er e s u l t ss h o w s u r v i v a lr a t ea n ds o d a c t i v i t yo fb a c i l l u ss u b t i l i sd e c r e a s es i g n i f i c a n t l yw i t ht h e yr a d i a t i o nd o s e d n ad o u b l e - s t r a n db r e a kl e v e l ( p rv a l u e ) r a i s e s c e l lt o l e r a n c e t o 丫r a d i a t i o nc o u l db ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y u n d e ra d d i n ge x o g e n o u ss o d b e f o r ea n da f t e r 丫i r r a d i a t i o n ，t h es u r v i v a lr a t e sw e r eu p g r a d e ds i g n i f i c a n t l y u n d e r8 0 0 ，14 0 0g y d n ad o u b l e s t r a n db r e a k sl e v e lc o u l d b e r e d u c e d s i g n i f i c a n t l yb ye x o g e n o u ss o d i n t r a c e l l u l a rs o da c t i v i t yw a sd i f f e r e n tu n d e r e x o g e n o u ss o db e f o r ea n da f t e ri r r a d i a t i o n i n t r a c e l l u l a rs o da c t i v i t yd e c r e a s e s u n d e re x o g e n o u ss o db e f o r ei r r a d i a t i o n t r e n do fi n t r a c e l l u l a rs o dw i t h 丫一r a y s i sc h a n g e da n di n t r a c e l l u l a rs o da c t i v i t yi n c r e a s eu n d e re x o g e n o u ss o da f t e r i r r a d i a t i o n u v ca n db a c i l l u ss u b t i l i s16 8a r eu s e da st h es i m u l a t i o no b j e c t st oa n a l y z e e f f e c t so fu vo ns o di s o e n z y m e sa n de s t a b l i s has e r i e so fr e s e a r c hs y s t e m t h e r e s u l t ss h o wt h a ti n t r a c e l l u l a rs o da c t i v i t yd e c r e a s eu n d e ru vi r r a d i a t i o n 0 r i g i n a le l e c t r o p h o r e s i sb a n d so fs o di s o e n z y m e sd i s a p p e a ra n dn e wb a n d s a p p e a r s o di s o e n z y m e sa c t i v i t yd e c r e a s e sw i t ht h eu v d o s e u ve f f e c t so nt h e t w os o di s o e n z y m eg e n e sw e r ei n c o n s i s t e n t s o d ag e n ee x p r e s s i o nd e c r e a s e d a f t e ru vs t i m u l a t i o n u vh a sal a r g e ri m p a c t eo ns o d fr e l a t i v e l y s o d fg e n e e x p r e s s i o nw a se n h a n c e dw i t h o u ts i g n i f i c a n td o s e d e p e n d e n t i nt h es t u d y ，as e to fm i n i m a li m p a c t i n go p t i m i z a t i o no nt h es o da c t i v i t y a n de a s yw a yo fc e l ld i s r u p t i o nw a se s t a b l i s h e d i ns u m m a r y , r a d i a t i o nd a m a g e s b a c i l l u ss u b t i l i so b v i o u s l yb yi n d u c i n gd n ad o u b l e s t r a n db r e a k s ，d e c r e a s i n g a c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n te n z y m e s ，o x i d a t i v ed a m a g ew i t hf r e er a d i c a l e x o g e n o u s s o dc a nr e d u c et h ec e l ld a m a g ef r o mr a d i a t i o n r a d i a t i o ne f f e c t so na n t i o x i d a n t i s o e n z y m e sa r ei n c o n s i s t e n t t h em e c h a n i s mo fi o n i z i n gr a d i a t i o nd a m a g ea n d p r o t e c tc o u l db er e v e a l e db ya n a l y s e se f f e c to f r a d i a t i o no na n t i o x i d a n te n z y m e s s y s t e m k e yw o r d s ：s o da c t i v i t y ；d n ad o u b l e s t r a n db r e a k s ；i s o z y m e s ； r i r r a d i a t i o n ；u l t r a v i o l e t ；i r r a d i a t i o n 西南科技大学硕士研究生学位论文第v 页 目录 1 绪 仑1 1 1 电离辐射及其生物效应l 1 1 1电离辐射的来源1 1 1 2 电离辐射的生物效应2 1 2抗氧化酶系统及其防护效应3 1 2 1 自由基及其生物损伤4 1 2 2抗氧化酶系统的功能5 1 3 超氧化物歧化酶6 1 3 1超氧化物歧化酶的结构6 1 3 2超氧化物歧化酶的功能7 1 3 3s o d 的研究方法及进展8 2 影响超氧化物歧化酶活性测定的因素研究12 2 1 材料与方法1 2 2 1 1 材料1 2 2 1 2 试剂12 2 1 3仪器设备12 2 1 4样品制备l3 2 1 5细胞破碎条件探究1 3 2 1 6样品保存条件探究13 2 1 7s o d 活性的测定1 4 2 1 8数据处理与分析14 2 2 结果与分析1 4 2 2 1细胞破碎条件对酶活性的影响l4 2 2 2 短时间保存对s o d 活性测定的影响16 2 2 3长时间保存对s o d 活性测定的影响l8 2 3 结论与讨论2 0 2 3 1探究细胞破碎条件2 0 2 3 2探究样品保存条件2 0 38 0 d 对y 辐照枯草芽孢杆菌的保护效应一2 2 3 1材料与方法2 2 西南科技大学硕士研究生学位论文第v i 页 3 1 1 材料。2 2 3 1 2 试剂2 2 3 1 3仪器设备2 2 3 1 4样品制备2 3 3 1 5辐照处理2 3 3 1 6细胞存活率检测2 3 3 1 7胞内s o d 活性测定2 3 3 1 8d n a 双链断裂分析2 4 3 1 9数据处理2 4 3 2 结果与分析2 4 3 2 1s o d 对y 辐照枯草芽孢杆菌存活率的效应2 4 3 2 2 s o d 对y 辐照枯草芽孢杆菌胞内酶活的效应2 6 3 2 3s o d 对y 辐照枯草芽孢杆菌d s b 的效应2 7 3 3 结论与讨论2 8 3 3 1研究方法及指标的建立2 8 3 3 2 y 辐照对枯草芽孢杆菌的损伤效应2 8 3 3 3 外源s o d 对y 辐照对枯草芽孢杆菌的保护效应2 9 4s o d 对y 射线辐照枯草芽孢杆菌的修复研究31 4 1材料与方法31 4 1 1材料31 4 1 2主要试剂31 4 1 3 主要仪器设备3 1 4 1 4 辐照处理3 2 4 1 5 外源s o d 处理3 2 4 1 6数据处理3 2 4 2 结果与分析一3 2 4 2 1外源s o d 对细胞存活率的影响3 2 4 2 2外源s o d 对枯草芽孢杆菌胞内s o d 活性的影响3 3 4 2 3外源s o d 对枯草芽孢杆菌d s b 的修复效应3 2 4 3 结论与讨论3 5 4 3 1 外源s o d 对y 辐照枯草芽孢杆菌的修复效应3 5 4 3 2外源s o d 对y 辐照枯草芽孢杆菌的效应比较3 6 士研究生学位论文第v i i 页 化酶同功酶的效应3 7 ：；7 ：；7 ：；7 ：1 7 5 1 4样品制备3 8 5 1 5紫外辐照3 8 5 1 6s o d 同工酶检测3 8 5 1 7半定量r t - p c r 分析枯草芽孢杆菌m r n a 3 9 5 1 8数据处理与分析4 1 5 2 结果与分析4 1 5 2 1紫外线对枯草芽孢杆菌s o d 活性的影响4l 5 2 2紫外线对枯草芽孢杆菌s o d 同功酶的影响4 2 5 2 3紫外线对枯草芽孢杆菌s o dm r n a 的效应4 3 5 3结论与讨论4 7 5 3 1研究方法的建立4 7 5 3 2紫外线对枯草芽孢杆菌s o d 酶的效应4 9 1 5 6 1 5 5 5 6 果 一 成 一 究 研 及 一 之 文 一 一 一仑 一 论 术 学 一 一向7 的 表 一 一 1 h ， a 发 问 一期论谢献位文学考读结致参攻 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1 绪论 随着人们生活节奏的加快，及对环境破坏的加剧，各种电离辐射也越来 越多的对人类健康、动植物生长、生态系统、生物化学循环等方面造成影响 和危害。辐射除了可以直接造成生物体的电离激发，改变机体结构功能外， 还可以通过直接和间接方式使细胞内外环境中产生各种具有生理毒性的活性 氧自由基，从而导致生物体内核酸、蛋白质等生物大分子变性，造成d n a 链 断裂，破坏生物细胞膜结构物质，使其透性发生变化，导致细胞自溶。生物 体在长期对环境的适应中已形成了自身防御系统，抗氧化酶系统就担负着清 除电离辐射过程中产生的多种自由基，起到抵御逆境胁迫的作用。 1 1 电离辐射及其生物效应 1 1 1 电离辐射的来源 电离辐射是一切能引起物质电离的辐射总称，主要有高速带电粒子和不 带电粒子。其中高速带电粒子包括a 粒子、p 粒子、质子，a 射线具有很强 的电离本领，所到之处很容易引起电离，对人体内组织破坏能力较大。由于 其质量较大，穿透能力差，在空气中的射程只有几厘米，只要一张纸或健康 的皮肤就能挡住：p 射线电离本领比a 射线小得多，但穿透本领比a 射线大， 很容易被铝箔、有机玻璃等材料吸收。不带电粒子包括中子、x 射线、丫射 线，x 射线和y 射线的性质大致相同，是不带电波长短的电磁波，因此把他 们统称为光子。两者的穿透力极强，要特别注意意外照射防护。 地球生物接收来自于自然界的天然辐射和人类活动所产生的各种人造辐 射。天然辐射主要来源于太阳，宇宙射线和在地壳中存在的发射性核素。宇 宙射线包括能量化的光量子，电子，y 射线和x 射线；地壳中发现的放射性 核素主要有铀，钍和钋及其他发射性物质，它们释放出仅，b 或y 射线，并且 伴随氡的析出。同时，人造辐射也广泛存在，它主要来自于医用设备( 例如医 学及影像设备) 、研究及教学机构、核反应堆及其辅助设施( 如铀矿以及核燃 料厂) 。人们日常的消费，如夜光手表，釉料陶瓷，人造假牙，烟雾探测器 等也是放射性的主要来源。 现将几种辐射的特征列于表1 1 中。 科技大学硕士研究生学位论文第2 页 表1 - 1 几种主要辐射的特征 t a b 1 - 1t h ec h a r a c t e ris t i c so ft h er a d ia t i o n 1 1 2 电离辐射的生物效应 电离辐射所致生物损伤的研究既是放射生物学和放射医学中重大的理论 和前沿领域，也是当前各方面所关心的热点问题。地球环境中的生物和人类 受到电离辐射后，辐射能量丧失，而生命物质则吸收了辐射能量而产生效应。 电离辐射将能量传递给有机体引起的任何改变，统称为电离辐射生物学效应 ( i o n i z i n gr a d i a t i o nb i o l o g i c a le f f e c t ) 。电离辐射的一个重要特点是能够在局 部释放能量，引起被作用物的电离和激发。一般来说，在电离辐射过程中每 个电离事件的能量平均损失约为3 3 e v ，这样的能量足以破坏很强的化学键 j 。因此，生物体受到电离辐射照射后，可以使很多生物活性物质受到损害。 生物分子损伤是一切辐射生物效应的物质的基础。电离辐射可以直接引起分 子电离激发与化学键断裂等化学变化，从而影响生物分子的结构与功能；此 外，电离辐射还可以作用于生物体内的水分子，激发水分子生成自由基( f r e e r a d i c a l ) ，再与生物大分子作用，引起重要生物大分子的结构与功能改变。我 们把前者称为电离辐射的直接作用，后者称为辐射的间接作用。有研究证实， 对于低传能线密度( l i n e a re n e r g yt r a n s f e r ，l e t ) 辐射( 包括所有能量的x 射线 与丫线) 间接作用占主要地位；对于高传能线密度辐射( 包括中子、仅粒子、b 粒子) ，直接作用占主要地位1 2 j j 。 电离辐射对生物组织的损伤主要表现为对细胞膜、d n a 和蛋白质的损 伤。电离辐射作用于生物体后，通过脂质过氧化作用造成生物膜中饱和与不 饱和脂肪酸的比例失衡，膜结构的刚柔特性改变，膜的通透性改变等。d n a 作为电离辐射作用的靶分子，在细胞辐射损伤中起重要作用。非修复性的 d n a 双链断裂( d o u b l e s t r a n db r e a k ，d s b ) 被认为与细胞致死有密切关系【4 1 。 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 d n a 的结构中，碱基、核糖及磷酸全都有可能遭受到自由基的攻击，造成碱 基与核糖氧化，造成d n a 单链断裂( s i n g l e s t r a n db r e a k ，s s b ) 、d n a 双链 断裂( d s b ) 及d n a 蛋白交联等多种类型的损伤。电离辐射对蛋白质和酶的影 响包括对分子结构及合成影响，对分解代谢的增强等。蛋白质和酶分子在照 射后可发生分子结构的破坏，包括肽键电离、肽键断裂、巯基氧化、二硫键 还原、旁侧羟基被氧化等；l i p f 等的研究发现，经h 2 0 2 处理后蛋白质在一 级结构中呈现出肽链断裂，氨基酸组成改变，异常氨基酸产生，羰基产生， 蛋白质空间结构由紧密变为松散，无规则卷曲明显增加等【5 1 。辐射对蛋白质 生物合成的影响比较复杂，有的被激活，有的被抑制，有的呈双相变化，即 先抑制而后增强；另外，辐照可以显著增强蛋白质分解代谢，主要是许多蛋 白质水解酶活力的增加。此外，电离辐射对生物体的损伤还表现为改变细胞 周期的变化，形成g 2 m 期阻滞和s 期阻滞，加剧细胞凋亡。 图卜1 辐射对d n a 的直接和间接作用 fig 1 1 d ir e c ta n din dir e c te f f e c t so fr a dia tio no nd n a 1 2抗氧化酶系统及其防护效应 生物体自身对逆境胁迫有一定的抵御能力，由s o d 、c a t 和p o d 组成 的抗氧化酶体系，在生物体内负责清扫活性氧自由基，增强机体对逆境的耐 受性。此体系酶活性的高低与生物抗逆性和抗辐射能力有关。 第4 页 个或多个不成对电子的 不稳定性和高反应性， 寿命很短，o h 的平均寿命为1 0 一。1 0 - s s ，生物分子自由基也多在1 - 6 1 0 q s 之间。2 0 世纪7 0 年代，电离辐射可产生o h ，h 自由基现象的发现，及超 氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 的成功提取为辐射损伤自由基学 说和自由基清除剂应用的研究拉开了序幕，奠定了基础【_ 7 8 1 。随着抗氧化剂研 究的不断深入，电离辐射的自由基学说得到了国内外学者认同，t e m p l e t e t o n 等证实，低l e t 射线诱导的d n a 损伤大致9 0 都是由- o h 引起【9 , 1 0 。 r j 墅l r 一十p 一_ 丁+ 日一+ p 丁一塑垄丁一+ 日 图1 - 2 a电离激发产激发自由基 f i g 1 2 a f r e er a d i c a is t in l i il a t e db yi o n i z a t i o ns t i mul a t e r o hh 1 0 一。l l + ；o h e , o 二1 1 ，o _ l 工c 电赢 h h ，0 。l l o h h e i 图1 - 2 b水的电离辐解 f i g 1 2 b i o n i z a t i o no fw a t e rr a d i 0 i y s is 加成：r + , o h r + o h 抽氢：t + o o h r 。+ 日2 0 电子俘获：r + p 水合_ r 2 ( 阴离子自由基) 图1 - 2 c自由基与生物分子的作用 f ig 1 2 0t h er e ia tio n s hipo ff r e er e dio aisa n db i0 i o g ic ai m eie cl il e $ 生物机体接受到电离辐射后，可以通过直接电离激发作用产生自由基， 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 也可以通过水的辐射分解产生自由基。自由基的产生及其与生物大分子的作 用如图1 2 所示。 地球上除厌氧生物外，所有动植物和需氧生物都离不开氧气。氧气在参 与生物体的新陈代谢的同时，又是一切氧自由基的来源和引起氧自由基损伤 的物质基础。也就是说，氧气对生命体具有两面性，即氧在生命代谢的良好 和恶性方面的刀刃上保持着平衡。 d 2 与d ：丝坠_ 2 d 2 屿伽! 坐_ 2 0 图卜3氧分子还原生成活性氧的过程示意图 f i g 1 3 s c h e m a t i co fo x y g e nr e d u c t i o nt or e a c t i v eo x y g e n 1 2 2 抗氧化酶系统的功能 电离辐射所致自由基的氧化损伤是电离辐射损伤的一个重要的方式，得 到了国内外研究者的承认和重视。生命有机体在进化过程中形成并发展了清 除活性氧的系统，如抗氧化酶系统和非酶类小分子抗氧化体系。体内氧自由 基和防御系统间组成的循环系统( 图1 4 ) 保证了自由基和抗氧化物的平衡】。 、s o d o ； o z h 2 0 z 千 幽1 0 z 。o h 气 1 r v t e , 一t c r o f - 0 r 0 0 ：兰兰 图卜4氧自由基连锁反应过程与抗氧化系统的关系 f i g 1 4 t h er e i a t i o n s h i po fo x y g e nf r e er a d i c a ic h a i nr e a c t i o nw i t h a n t i o x i d a n ts y s t e m 抗氧化酶系统中，c a t 和p o d 能有效地移走h 2 0 2 ，s o d 能清除0 ：；c a t 学位论文第6 页 能将h 2 0 2 f 茸io ：转化为h 2 0 和0 2 ， 减少细胞受到的伤害。研究发现，s o d 、c a t 、g s h 。p x 三者相对水平的高 低对于其抗氧化作用的有效发挥很重要。例如，增加的s o d 消耗了o - ，但增 多了h 2 0 2 ，过多的h 2 0 2 若不能被c a t 、g s h p x 及时清除，就会有害于机体， 然而过多的g s h p x 并不必要，它过分消耗了g s h 和n a d p h 1 1 】。 ( 1 )超氧化物歧化酶( s o d ) 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是一种具有抗活性氧毒性 的金属酶，普遍存在于需氧、微需氧以及一些厌氧生物体内【1 2 】。s o d 作为抗 氧化酶系统成员之一，广泛分布于动植物、微生物中，它催化超氧阴离子自 由基o - ，通过歧化反应清除o ：，在生命体的自我保护系统中起着重要的作用， 在免疫系统中也有重要的功能。s o d 在生物体内主要催化如下反应： 20 2 + 2 h 一h 2 0 2 + 0 2 ( 2 ) 过氧化氢酶( c a t ) 过氧化氢酶( h y d r o g e np e r o x i d a s e ) 又称触酶( c a t a l a s e ) ，其系统名称是 h 2 0 2 ：h 2 0 2 氧化还原酶。一般来说，生物体内过氧化氢酶均属血红素过氧化 氢酶，分子量2 2 2 4 万，由四个亚基组成，但是乳酸菌等含有以m n 为辅基 的m n c a t 。c a t 在生物体内主要催化如下反应： 催化反应式如下： h ，o ，+ h ，o ，墼2 h ，o + o ， ( 3 ) 过氧化物酶( p o d ) 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) ，也称为过氧化酶，其系统名称是供体： 过氧化氢氧化还原酶。能在有供体存在的情况下有效清除体内的h 2 0 2 ，催化 如下反应： h 2 0 2 + ( r h o ) 2 马2 h 2 0 + r 0 2 1 3超氧化物歧化酶( s o d ) 1 3 1超氧化物歧化酶的结构 1 9 8 3 年m a n n 和k e i l i n 首次从牛红血球中分离出一种蓝色铜蛋白，定名 为血铜蛋白( h e m o c u p r e i n ) ：1 9 6 9 年m c c o r d 和f r i d o v i e h t l 3 】重新发现了这种 蛋白，且弄清了它催化发生歧化反应的性质，正式将其命名为超氧化物歧化 酶。同时，a r e n a v 提出电离辐射可产生自由基，为辐射损伤自由基学说拉开 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 对s o d 的研究不断深入，近年来的研究表明s o d 在维持生 物体内o 的动态平衡中起重要作用，能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能 力，还可预防衰老，在一些疾病如肿瘤、炎症及自身免疫疾病等的治疗中有 良好的疗效【l4 1 。目前对s o d 的研究已成为自由基生物学的热点，并且在现 实生活中也得到了广泛的应用。国内s o d 已越来越多的进入化妆品、食品、 医药等领域，而国外s o d 已经临床用于治疗一些疾病。无可置疑，s o d 的 应用与开发将有不可估量的前景。 根据s o d 活性位点金属离子的不同分为c u z n s o d ，m n s o d ，f c s o d 。 此外有报道在s t r e p t o m y c e ss p 中尚有n i s o d 存在，在s c o e l i c o t o r 中有f e z n s o d 存在【1 4 , 1 5 l 。真核生物的胞浆、胞膜、溶酶体、细胞外基质以及原核 生物的胞浆、外周胞质中主要是c u z n s o d ，原核生物和真核生物的线粒体 中主要是m n s o d ，而f e s o d 主要分布于原核生物中。 各种天然存在的s o d ，虽然活性中心的离子不同，但催化活性部位却具 有高度的结构同一性和进化的保守性，即活性中心金属离子都是与三或四个 组氨酸( h i s ) 、咪唑基( m n s o d 含一个天门冬氨酸羧基配位) 和一个h 2 0 分子 呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位【i 6 。 虽然s o d 的类型不同，结构不一，但其催化机理相似。作为金属酶类， s o d 所含的金属离子必然与酶活性有特殊关系。用e d t a 鳌合剂除去酶的金 属离子后s o d 活性失去；用d d c 除去单一金属离子的实验结果表明c u 2 + 是 c u z n s o d 活性所必须的，z n 2 + 则与酶的稳定性有关。几种不同结构的s o d 在催化过程中均涉及到活性部位内金属离子的交替还原与氧化，可以用下列 通式表示其反应： e m ( n ) + o ，+ e m ( n ) + 0 2 e m ( n ) + 0 一+ e m ( n ) + h 2 0 2 1 3 2超氧化物歧化酶的功能 超氧化物歧化酶作为抗氧化酶系统成员之一，广泛分布于动植物、微生 物中，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，在免疫系统中也有 重要的功能。s o d 主要的作用是清除体内的o - ，将其还原成h 2 0 2 。生物体 内产生的s o d 不是恒量的，当细胞内0 ：的水平增高时，诱导s o d 生成，细 胞的这种调节机制已经在一些微生物和动植物细胞中得到证实，大多数情况 下增加与外界氧的接触是诱导s o d 生成的主要原因，但是在固定氧分压下造 南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 的条件也能诱导该酶的生成。诸多研究显示电离辐照改 变了s o d 活性，说明s o d 与电离辐射损伤密切相关。研究发现m n s o d ( 生 物半衰期5 6 h ) 较c u z n s o d ( 6 1 0 m i n ) 具更好的抗辐射效果。 由于o - 与人类及动、植物的许多疾病的发生和形成有关，因而可确定 s o d 是生物体内防御氧化损伤( 抗氧化) 的一类生物酶，对机体具有保护作用， 受到全世界学术界的广泛关注，使之成为涉及生物学、生物化学、分子生物 学、物理化学、微生物学医药学、医学等学科领域以及医药、化工、食品等 生产行业的一个热门研究课题。通过几十年的努力，在s o d 的基础研究方 面取得了巨大成果，搞清了s o d 的种类和大致分布、s o d 的物理化学性质、 s o d 的分子结构及生理功能原理；建立了分析测定方法和制备方法。 黎嫒i l7 j 等的结果表明，s o d 对辐射损伤生物的保护作用表现为防护与恢 复两种不同的作用，恢复作用表现于对细胞膜，而对d n a 不表现恢复效应； 向紫外照射后的大肠杆菌、钝齿棒杆菌和啤酒酵母3 种微生物添加细菌s o d ， 发现细胞存活率显著提高【i 引。对比研究电离辐射对野生型和s o d 突变菌株 ( c u z n s o d 和c u z n s o d a m n s o d 双缺失) 的效应，发现突变株比野生 株更具辐射敏感性，进一步说明了s o d 在辐射中对细胞的防护作用：在高剂 量辐照下，野生型和突变株的s o d 、c a t 活性虽有所下降，但整体来说活性 均提高了。双缺失与单缺失相比，生存能力没有降低，但是蛋白质和脂质的 氧化产物却有明显增加【l 引。 1 3 3s o d 的研究方法及进展 1 3 3 1s o d 活性测定 s o d 酶活性测定的方法很多，主要有化学法、免疫法、等电聚焦法等。 化学法中以黄嘌呤氧化酶法、邻苯三酚法、化学发光法和n b t 法最常用。 n b t 法是利用超氧物歧化酶抑制氯化硝基四氮唑蓝( 简称氮蓝四唑，n b t ) 在 光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还 原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生o ：，o ：可将氮蓝四唑还 原为蓝色的甲腙，后者在5 6 0 n m 处有最大吸收。而s o d 可清除o ：，从而抑 制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低， 反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 删活忸咖( f w ) = 等揣 a _ 1 ) 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 其中，a c k 照光对照管的吸光度。 a e 样品管的吸光度。 v t 样品液总体积，m l 。 v 1 测定时样品用量，m l 。 w 样品鲜重，g 。 黄嘌呤氧化法是利用黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶法产生超氧阴离子自由基， 与氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，利用可见光分光 光度计测其吸光度。当被检测样品含s o d 时，对超氧阴离子自由基有专一的 抑制作用，形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管。通过 计算公式可求出被测样品中的s o d 活力。 总渤活力( u = 塑罱嘉驴5 似反应体系的稀释倍数 样本测试前的稀释倍数 ( 1 - 2 ) 1 3 3 2s o d 同工酶研究