（微生物学专业论文）灰色链霉菌s106内肽酶基因的克隆及原核表达.pdf

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2 6 b ( + ) ，构建了p e t 2 6 b ( + ) - r 4 重组质粒，并转化e 矗 b l 2 l ( d e 3 ) p l y s s ，通过菌落p c r 和测序验证，得到了转内肽酶r 4 基因的工程 菌，重组菌经坤1 0 诱导后大量表达重组的内肽酶，对表达结果进行了s d s 队g e 分析和酶活性分析。结果显示，内肽酶的溶菌活性较低，但这可能一方面使由于 内肽酶本身的溶菌活性就很低，另一方面可能是由于没有找到合适的底物和反应 条件所致。 山东大学硕士学位论文 此外还对实验室已经研究过的r 2 基因的上游调控序列进行了初步研究，运 用t 儿- p c r 技术克隆得到了一段序列，该段序列包括r 2 信号肽序列，部分的氧 化还原酶基因序列和3 0 2 b p 的两个0 r f 之间的间隔序列。对3 0 2 b p 的间隔序列进行 分析，未发现明显的启动子特征，是否具有启动子活性还有待进一步研究。 关键词：链霉菌，内肽酶酰胺酶，t m l p c c o d e h o p 6 坐查查塑主兰堡兰兰 a b s t i 鼍c t 唧f o 雠sg r 妇搬s 1 0 6a n d 蛳伽咖6 印d n 岱剐邵p o s s s i n gh i 出 i ”i ca c t i v 时a g a i l l s t 勋印 d 拼埘积墨缸d 岛叩砂z d c c 琊口钟淞w 罄i s o l a t c d 丘d m i l sb yt h ed o u b l el a y 盯p l 抛础gi n 锰i c tc e l l so f 翻印胁c c 淞棚盯伽w e h a v ec l o n c d 也en ，o _ d 哟曲铷黜i d a g e n e 丘o mt h es 1 0 6g e n o m e l y s o z y r n ec a n c l 鹤s i f i c di n t 0 删城i i n i d a 印d o p c p t i d a 蹁n a c e t y l m 咖o y l - b a l a n i 鹏a m i d a e t c w h i c h to l l l yh 舢，eb a c t e r i o l y t i c ，b 毗a l p l a yc f i t i c a lr o l e si n ng r o w t h s ow e 眦d e 也e d 叩e p i i d a o rn 一鲫啊l 舶眦锄o y l - l - a l 锄妯e 觚l i d a g 钮e s c q u e n c e s ，“p 托s st h e mi ne c o l ia i l d 他眦ht h e i r z y 玎舱c h m n e r i c d c s w 引1 矗忱a c q u i r e dm a n y d o 咿虹d a 辩s e q n c 嚣锄dn - a c 亭l y l m 咖o y l l a l 龇i 锄i d a 辩 s e q u 豇i 淄o f & 侈即哪哪的nn c b lp 加幢i m l 越d h a 锄da l i 鲫e dn l e 卵s e q 懈髓sb yc l u s t v r 鹤p e c t i v e l y i 锄l t e dt l i cs u i 组b l e m 州锄i i d sb a s e d t h ec i ) dd 砒a b a s c ，d 鹤i 印c d 幢c o d i m o pp 酊m c 玮i i m ，t l l cp a r t 湖蜘d o p c p 【t i d a s e q u e n s 卸dp a n i a l 锄i d a s e q u 蜘。瞄 w 啪锄p l i 丘e db yt o u c h d o 帅p c r 矗姗s 吗口f 口唧哪矿捃e 础l 觚d 跏咧唧优fg 劬趣哪 1 8 6 9 印o m i c d 盱蛆地锄p l 墒酬p r o d u c 姆w e 托l i g a l c d t o p u 锄- t v e 咖锄d 仃a m 恸衄e d i n l de c o l i 阴5 a 血e 畔h i wc i o n i n gw 站s l e c e t e d 锄di d e 耐f i e d t h en c s tp n m e 墙w e 他d e s i 朗酣b a s e dm ea c q u 砌p a n i a l 蛐d o p c p 忙i d a 鸵s c q 嘲c e s ，a n d t l l e5 a n d3 5 e q 嘲雠sa d j o i l t ot h ep a n i a l 曲d o p e 叩d a q u e l i c 骼o f 劢唧 鲫l 弦g 廊p w 1 0 6 w 哪锄p l i f i c d b y t a i l p c i 乙a n 咖嗍d 崦胁e ，d e s i g n a 删p r 4 ，o f 7 1 l b p l l l 砒 c o d e dap o l y p e p t i d eo f 2 3 7 锄如扯i d 瞄i d 峨w 雏i d 翎n f i c d t i i eb i a s t p 嘟u i 乜砌i c 删m 越 m e p r 4 9 吣眦o f m e m 啪b c f s “吐l c p c p n d m 2 3 ，3 7 细i l y ，s h o w 酣6 9 i d 蹦哪w i t i i a p e p t i d 私e 触nt h e 勘印f d j 母螂e 眈d 妣w ea l 删y e dt i i eb a s i cp r o p e r 哼o f t l l em 拙 e n d o p e p n d a s eb yt h eb i o 脚嬲，n l e 枷d y z e d 瞄u b 砌i c 醐一t h e t h ep r 4g 即ew 笛咖唧；c d o f a 3 9 m i n o a c - d s i d ss i 酬p e 砸d e 觚d a l 9 8 m m o 粒i d 傩s 翅s m a 觚m p o b l 婶p t i d e w h i c h w a s d e s i 印a l e d 邪r 4g e 鹏恤p i 如d m w o f t h er 4 9 e w e 坤9 5 7 d1 9 9 7 1 1 0 d a ，w e a l s oc o 枷c t l 甜t l l ep h y l o g e n e t i c 缸o f 5 0p e p t i d a 辩辩q 嘲c 嚣缸胁湘蜘啦鹏 t b e r 4 9 鲫e w 鹤锄p i i 矗e d b ya p a i 飓o f p r 皿e r s 矗_ o m m e 跏印l 鲫1 ) i c # s 寥l 删m i c d n a ， ar e c 哪b i n a mp l 硒m i dp e t 2 6 b ( + ) _ r 4w 硒c o n 仉l c t e db yi n s e f t i n gt 量l ep c rp r o d u di n l d p e t 2 6 b ( + ) v e c t o r 柚d 仃拍s f o 啪e di 咖e ，fb l 2 l ( d e 3 ) p l y s s ， a f c e rb e i n ga n a l y z e d 7 山东大学硕士学位论文 b yc o l o n yp c r 觚ds e q u e n c i i l g ，“w 鹬c o n f i m e d t l l a ：tl l e t c 舒m o 惦鲈鹏w 笛i i i 辩巾e dt i l c r e c 伽b i n 锄tv e c t 舛t 1 1 er e c 锄b i t l a l i tp f i 啦i f i 啪s h i 曲l ye x p 瞄s e da f t e r 酽r gi n d u c t i o l l a l l d 锄a l y z e db yt 砖s d s - e a g e n 忙c n 巧m ea c t i v 时m s e a r c hs h o w c dn 僦e l l d o p e p t i d a 辩r 4i i | l d w 扯t i v i 谚邝舯m i l gt h es 口埘叩淞a n d 脚f d c d c c 船m “细蟮，b i i tt l l i sp h e m e 咖 m a y u s e db yt l i c 岫s u i t a b l es u b s 缸a l e 锄dr e a c t i 伽d m o i l w ba l 锄p l i f i e dt t l cu p l s i r ms e q u e n c 豁o f r 2g c n c ，t h e 哪吼r 锄s e q u 锄a c q i i i r e db y t a i l p c rh k i i l d e dp a m a l 硎d o f e d u c h 睇固cw h i c hc o d e2 4 0 锄i 谢螂i d u e s 7 7 珊i l i o 证r 龆i d 峭o f r 2s i 夸l a ip c p t i d ea i l d3 0 2 b p 删盯v a ls e q 雠n b e t w 矧i 佃d0 幢f s m 3 0 2 b ps e q u e ew 踟tf o i m do b v i o 峭舯m 吼盯m p 坞f h m 财嘲hw 鹳m c d e d t o i d e n t i 母w h e i l l 盯j tp o 豁髂s e dp r o n l o t 盯a c m 咕够 k 咿o r d s ：斯咧n 缈鲫，e n d o p l e p t i d 獬，n - 拟= i y i i i i i 咖o y i 山a l 锄m e 锄i d 嘲，t a i l 砌l 0 山东大学硕士学位论文 前言 溶菌酶是一类专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶，广泛 存在于各种生命体中，小到细菌噬菌体、细菌、真菌，大到植物、动物，都有该 种物质的分布。按照作用对象划分，溶菌酶分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁 溶菌酶【”。鉴于霉菌和酵母菌细胞壁结构复杂，缺乏共同性，作用于它们的酶也 没有一个统一的归类，因此大部分的研究工作只以细菌细胞壁溶菌酶作为研究对 象。 一，溶茵酶的分类 溶细菌酶，又称细菌细胞壁水解酶，肽聚糖水解酶，是一类水解细菌细胞壁 肽聚塘的酶的总称。主要有五类肽聚糖水解酶；1 ，n 乙酰胞壁质酶 ( n - e t ) ，l i n u m m i d a ) ；2 ，n 乙酰胞壁酰一l 丙氨酸酰胺酶( n a c 啊l n l u r 锄y l - i 广a l 蛆k 锄i d ；3 ，内肽酶( e n d o 脚t i d 墩) ；4 ，n 乙酰氨基葡萄糖苷酶 ( n a c 啊l 酉u s 锄血i d a s c ) ；5 ，转糖苷酶g l y c o s y l a ) 【2 】五种类型的溶菌酶 在肽聚糖上的作用位点见图l ( 以叩 咖c c 淞口舯甜细胞壁为例) 。 图l 五种类型的溶菌酶在肽聚塘上的作用位点 9 山东大学硕士掌位论文 这些酶的生理功能目前还不是完全明白，但其中有些酶的功能已经被揭示， 它们在细胞壁生长，细胞分离，细胞壁转换，遗传转化竞争，鞭毛形成，孢子形 成，细菌发病机理等方面有着重要的功能【加】，此外，溶菌酶在科学研究，疾病 防治，食品防腐方面也有着广泛的应用，它是获取细胞壁和细胞质膜结构和免疫 化学信息的有力工具：作为一种工具酶，它在分子生物学技术如制备原生质体、 获取染色体及质粒d n a 等方面发挥了重要作用；在实用上，溶菌酶可用作食品、 药品的杀菌剂，并由于它的杀菌作用直接用于医疗行业如龋病的防治和& m 艘螂 感染的防止等，在制备菌体内涵物尤其是获得天然微生物蛋白等方面，溶菌酶也 是必不可少的 二，n 乙酰胞壁酰【广丙氨酸酰胺酶和内肽酶的研究进展 溶菌酶研究较多的n - 乙酰胞壁质酶，对n 乙酰胞壁酰b 丙氨酸酰胺酶和内 肽酶的研究较少，现介绍一下内肽酶和酰胺酶在理论和应用方面的研究进展。 1 n - 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶研究进展 n - 乙酰胞壁酰山丙氨酸酰胺酶，能切断细胞壁聚糖部分的n 乙酰胞壁酸的 乳酸的羧基和细胞壁缩氨酸部分的n 末端的l 丙氨酸氨基之间的酰胺键它广 泛存在于许多细菌中，对细胞的生长，分裂，母细胞的转化及孢子形成等有密切 的关系，似乎所有的微生物中都有这种溶菌酶，但是只有在转化能强的菌株中( 如 枯草芽孢杆菌中) ，活性才特别高，n - 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶可以与磷壁酸 质牢固结合，所以，从细胞壁的提取物中有时也能检测到这种酶的活性i l 】 1 9 6 2 年，古伊森等人在白色链霉菌( 勋印l r d 雠s 扔鼬) g 菌株溶菌酶群中， 发现了能分解聚糖和缩氨酸结合部位的溶菌酶。他们巧妙地利用这种酶确定了溶 壁微球菌( 肋翻d 伽咖口如珩池由和金黄色葡萄球菌( 绷理脚的细胞壁结构， 并把这种酶命名为n 乙酰胞壁酰o 丙氨酸酰胺酶后来人们认识到，自溶素酰 胺酶几乎是所有自溶体系的主要成分。这种酶对细胞的生长、分裂和孢子的形成 起重要作用。酰胺酶单独存在时，也对多种菌株显示溶菌活性。但链霉菌0 3 菌 株和白色链霉菌g 菌株例外，须和其他酶( 主要是胞壁质酶) 共同作用才对上述两 种菌株显示溶菌活性。1 9 7 5 年，他们又从枯草芽孢杆菌菌体内提取并精制出了 均匀状态的酰胺酶【”。 山东大学硕士学位论文 2 内肽酶研究进展 内肽酶能切断肽聚糖成分中的肽键，由于作用的位点较多，所以种类也比 较多，而且各种内肽酶的底物特异性和酶切位点可能都不一样。1 9 5 7 年，索尔 顿等人指出，链霉菌产生的细胞壁溶解酶活性，是肽链内切酶作用的结果。到六 十年代，人们已精制出溶葡萄菌素：从白色链霉茵g 菌株中精制出肽酶群；从 粘菌( 坳0 6 卵据，) a i ，l 菌株和堆囊粘细菌d 嗍f 枷) 中精制出a ，p 肽链内切 酶；从气单孢菌似咖哪d 椒0 和无色杆菌口幽m 脚施加r ) 等3 0 多种菌体中，制取 了肽链内切酶。其中，从堆囊粘细菌中精制出的a 肽链内切酶的一级结构已确定。 这期问，小谷等人也开始研制从黄色杆菌a 翻砌6 船衙口绷d 舰叻f c 越d l 1 1 菌株， 表皮葡萄球菌 印胁础s ) 和链霉菌l 3 菌株的菌体中精制肽链内切酶。这些酶 现已成为确定多种细菌细胞壁结构的重要试验工具【l j 。 3 微生物中的n 乙酰胞壁酰- 】l - 丙氨酸酰胺酶和内肽酶 至今，已经从许多微生物中分离得到了n 乙酰胞壁酰l - 丙氨酸酰胺酶和各 种内肽酶，现简述一下各菌株中这两种酶的性质， 从溶性无色杆菌似纱耙埘) 中结晶出了最适p h 为8 o 的肽链内切酶，分子量 为1 8 k d a ，p i 为1 0 ，能作用于细胞壁缩氨酸聚糖的甘氨酰甘氨酰键和甘氨酰6 - 卜 赖氨酰键i ”。 从嗜水气单胞菌口e r d 所d ，掰砂d 却 f 口) 中精制出了一种可以分解口肌埘的 肽链内切酶，它的最适p h 为8 5 ，p i 为9 o 9 5 。该酶最易作用戊氨基乙酸，还 能作用亮氨酰甘氨酰键，d l 亮氨酰甘氨酰甘氨酰键和亮氨酸酪氨酰键，但不 能分解蛋白质【l 】。 c h 孤和g i a s 盯从巨大芽孢杆菌 j ，l 馏口砌e ，f 删) k m 菌株的细胞中，精制出 n - 乙酰胞壁酰b 丙氨酸酰胺酶。该酶的等电点为8 2 ，分子量为2 0 k d a ，最适p h 值为6 8 【l 】 f 勰和b e c i 【n 1 孔从枯草芽孢杆菌 删6 饼捃) 中分离出了两种自溶酶，糖苷酶 和n 一乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶。前者多分泌在培养基中，不耐热，最适p h 值为5 - 8 ，分子量为6 0 l a ，后者多为芽孢杆菌的胞内自溶酶，较耐热，最适p h 值为8 o ，分子量为3 5 k d a f 2 l 【3 】。1 9 7 5 年，h e r b o l d 和g l 珊等将枯草芽孢杆菌 a t c c 6 0 5 1 菌株产生的n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶，用电泳法精制成均匀状 山东大学硕士学位论文 态他们还纯化分离出了一种能和n - 乙酰胞壁酰o 丙氨酸酰胺酶相结合并能提 高该酶活性的改性物( 蛋白质) 该酶容易分解含有磷壁酸质的细胞壁。这种改性 物蛋白质能把酶分解细胞壁的形式，从无规则型变成连锁反应型【4 】。1 9 7 6 年， l i i l d s a y 从枯草芽孢杆菌w 2 3 菌株中精制出了n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶。 分子量和上述的枯草芽孢杆菌a = r c c 6 0 5 1 菌株产生的酶分子量相同这种酰胺 酶，只能结合在w 2 3 菌株的细胞壁上，而不能结合在a r c c 6 0 5 1 的细胞壁上， 也不能和a r c c 6 0 5 l 菌株的n - 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶发生免疫交叉反应 嘲。q l i n a n d 等人发现，一旦枯草芽孢杆菌的芽孢形成时，在所提取的溶菌酶中， 有n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶和“) 谷氨酰l 中- 二氨基庚二酸肽链内切酶， 当球形芽孢杆菌的芽孢形成时，在所提取的溶菌酶中，有时也能检出后一种酶。 两种酶的最适p h 值都为8 o ，因此，g l l i 瑚n d 等人认为这两种酶对细胞壁肽聚糖 的生成有重要意义g h u y s 阻j m 等证实枯草芽孢杆菌的c w 执和地衣芽孢杆菌 的o r n 3 和c w l l 基因都是n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶嘲 从苏云金芽孢杆菌苏云金变种菌a r c c l 0 7 9 2 中分离得到了三种溶菌酶，分 别为n 乙酰胞壁质酶，n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶和能。丙氨酰- d - 谷氨酰 间肽键的内肽酶【n 。 c h 吼和d i m 啪发现，在突破校状芽孢杆菌释放芽孢时，检测到了该菌含有 n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶和能切断d 丙氨酰一甘氨酰键的肽链内切酶。两种 酶的最适p h 为8 o 。这两种酶易于分解不含磷壁酸质的细胞壁。 大肠杆菌的自溶酶复合休中，有n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶和肽链内切 酶。后者能切断d 丙氨酰中二氨基庚二酸键和中一二氨基庚二酰- d - 丙氨酸键。 此外，还有d 丙氨酸羧肽酶i ( i a 、m 和i c ) 和d 丙氨酸羧肽酶，这些酶可用 来研究多种菌体的分解现在已用来研究细胞的成长、分裂、修复掣” 在所有菌的自溶素的研究中，& m 卯淞的自溶体系研究可能是最深入的了， h u 仃等人从s 绷淞8 5 0 7 菌株中，分离出了n - 乙酰胞壁酰山丙氨酸酰胺酶， 它的最适p h 为6 7 ，能分解s 口鹏淞和溶壁微球菌的细胞壁，但不能分解完 整的菌体【7 】。n p p 盱等人和t a k e b e 指出，& 口鹏珊产生的自溶酶是由n - 乙酰胞 壁酰l 丙氨酸酰胺酶和n - 乙酰氨基葡糖苷酶组成的【羽，s i n g c r 等也从& 口埘t 埘h 菌株中纯化出了n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶，该酶的最适p h 为7 3 ，最适离 山东大学硕士学位论文 子强度为0 1 6 m ，分子量为8 0 1 0 0 k d a l 9 1 近期对溶菌酶研究的进展主要是对致病菌，如口册埘，肺炎链球菌，结核 分枝杆菌的细胞壁研究基础上开展起来的，自1 9 5 0 年s 删陀埘中的变溶菌素被 报道以来，一大批细胞内，细胞外的裂解肽聚糖的酶在& 口班淞中被发现，雨p p 盯 等在1 9 6 9 年报道称，在分离得到的细胞壁中，存在酰胺酶和内肽酶的活性，f o s t e r 等在1 9 9 5 年报道成在s 雠埘中发现了一种双功能酶，同时具有n 乙酰胞壁质 酶和n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶的活性，黜m a d u r a i 等在1 9 9 7 年从一株自溶 缺陷性的& 口埘他郴的菌株中分离得到甘氨酰甘氨酰内肽酶的基因，并进行了原 核表达，确定了酶的作用位点等性质【l 川f l l 】。 4 n - 乙酰胞壁酰- 】l 丙氨酰酰胺酶和内肽酶的应用 对n - 乙酰胞壁酰山丙氨酸酰胺酶和内肽酶基因的研究主要是对致病菌检 铡，预防和机体免疫方面的研究。h o n gg e 等人利用p c r 扩增鳗弧菌( m r 细 口，弘】 j ：f 们册) 中的n - 乙酰胞壁酰- l 丙氨酸酰胺酶基因检测确定鱼类是否感染了 鳗弧菌1 1 2 】。l l l l l id 等检测肺炎链球菌中的n 乙酰氨基葡糖苷酶，作为诊断感染 肺炎链球菌的一个非常有效的手段【1 3 】。此外这两种酶还与免疫和抵抗细菌感染 相关，肽聚糖识别蛋白( p g p r s ) 广泛存在于除线虫和植物中之外的昆虫，软体 动物，棘皮类动物和脊椎动物，p g p 黜蛋白是机体存在的天生的免疫分子昆 虫中的p g p i b 能激活免疫缺陷的信号转导途径，或者诱导产生一系列的蛋白溶 解作用而产生抗菌物质，还能诱导产生噬菌作用，水解肽聚糖和保护昆虫免于细 菌感染。哺乳动物中存在四类p g p l b ，其中一种p g i y r p - 2 就是n 乙酰胞壁酰 - l - 丙氨酸酰胺酶，它能水解细菌的肽聚糖成分而减少细菌的炎症反应【m 由 p g l y 啦基因编码的n - 的啊l m 啪o y l l - a i 姐i n e 锄i d a 辩( n a m i ，a a ) 和肽聚糖识 别蛋白2 ( p g i y r p 2 ) 也是一种存在于人类血清中的细菌肽聚糖水解酶【圩】。 从倒陀埘的一个突变株中分离纯化得到了一个肽聚糖水解酶，该酶与细 胞分离息息相关，该酶分子量为3 2 k d a ，经鉴定为一n 乙酰胞壁酰l 丙氨酰酰 胺酶，并命名为s l el ，该酶的一个插入突变削弱了细胞的分离能力，从而使细胞 趋向于形成细胞群。该酶的突变会显著降低最口舭甜的致病能力，a n 是s 口z 胛埘 自溶菌素的主要组分，也已近证明在细胞分离中起重要作用，a t l 和s l el 双突变 的& 删烨搬的细胞分离能力被大大削弱了，这证明s 口舯淞使用这两种酶实现 山东大学硕士学位论文 细胞分离的，只是s l el 并不是直接起作用的。& 鲥阳埘的主要的自溶菌素a 吐a 和a n e 是两个早就被研究过的蛋白质，最近的研究显示，它们的主要成分就是 n 乙酰胞壁酰山丙氨酸酰胺酶【阍结核分枝分枝杆菌是主要的全球性病原菌之 一，其危害也随着多抗性菌株的出现与日俱增，它的细胞壁厚，坚固，而且是疏 水性的，能保护它在环境中生存而且阻止了传统抗菌药物的渗透作用，目前对于 分枝杆菌的白溶菌素还了解的很少，从分枝杆菌的基因组中鉴定了一个1 2 1 8 b p 的0 r f 的c w l m 基因，对表达产物进行分析，发现其能分解n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸d 谷氨酸，释放出n 乙酰胞壁酸。c w l m 基因为抗菌药物提供了一个新 的设计药物的靶点，从而改变分枝杆菌的渗透性和对药物的有效性l 川 此外，n 乙酰胞壁酰- l 丙氨酰酰胺酶可能是诱导b 内酰胺酶的一个负调控 因子，可能是由于细胞壁水解的水解产物的是作为诱导p 内酰胺酶的信号的【嘲 三，链霉菌溶茵酶的研究进展 本文介绍的s 1 0 6 和s 1 8 6 都是链霉菌，本文研究的也是链霉菌中的溶菌酶 系，所以这里对链霉菌产溶菌酶的研究进行一下简单介绍 大家都知道，链霉菌属是产生抗生素最多的一个属，其产生溶菌酶的研究 很早也受到了微生物学家的重视。1 9 3 6 年，w 幽曲等人从土壤中首次分离到了 产生溶菌酶的链霉菌白色链霉菌( s 口，6 凇) g 菌株，它产生的溶菌酶能够溶解 最倒惮郴五十年代以后，国际上有关链霉菌产生溶菌酶的报道层出不穷，由于 该属细菌产生的溶菌酶多属c h 型，溶菌谱比其他类型溶菌酶广泛，因此得到了 广大学者的青睐。七十年代，日本学者对微生物尤其是链霉菌产生的溶菌酶进行 了大量细致的工作，并卓有成效八十年代以后，该属细菌产生的溶菌酶同 l y z y m e 一样开始作为一种工具酶出现在生命科学的各个领域，并在食品防腐、 医疗保健等行业发挥着其独特作用。 在链霉菌产生的溶菌酶中，按酶的性质分，多数为内- n 乙酰胞壁质酶，其 次为内肽酶，最少的是酰胺酶和内- n 乙酰氨基葡糖苷酶【嘲目前，该属细菌研 究的最多的当属sg f o 施唾聊懈，其产生的变溶菌素( m u l a 】l y s i n ) 在分子生物学 方面己作为一种普遍的工具酶，其次是s 口z 6 埘、s 妇埘等产生的溶菌酶，下面 分别进行叙述。 l 山东大学硕士学位论文 1 球孢链霉菌假咖蚰p 口，淞) 及变溶菌素( m u t a n o l y s i n ) 最早研究该菌的是日本学者y 0 k o g a w a ( 1 9 7 2 ) ，他发现菌株1 8 2 9 的发酵液 ( 即m u t a i l o l y s i n ) 能够溶解龋齿的主要致病菌变链球菌( & 唧f o c d c c 淞小绷口凇) ， 因此发现了一种治疗龋病的新方法溶菌酶法1 2 0 】。从1 9 7 2 年到1 9 8 3 年，y b k o g 撇 所在的研究所共纯化了m 1 1 t 翘o l y 咖中的四种主要成分，即n - 乙酰胞壁质酶m l 和m 2 ，址1 3 内肽酶以及n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶口在这四种组分中， m l 和m 2 起主要作用，研究的最为详细，其中m 1 具有n ，o - 二乙酰胞壁质酶活 力，可能属c h 型溶菌酶，而m 2 更接近于c 型。m l 的酶基因已于1 9 9 0 年被克 隆。通过该酶n 端序列同源性比较可以发现，其与a 硎唧括，c 口c e f d 她0 一妇册 及几种噬菌体溶菌酶类似，属于典型的c h 溶菌酶捌另外，m l 的晶体结构也 已进行了测定田】洲。 目前，m u t a i l o i y s i n 已经商品化生产( s i 印嗡公司) ，主要是作为工具酶用于 分子生物学方面的工作，这对很多革兰氏阳性球菌尤其是链球菌来说尤为重要。 2 白色链霉菌 扔埘) 最早研究的是w e l s c h 发现的g 菌株。该菌株能够产生十余种作用于细胞壁 的溶解酶。其中研究较多的有3 2 酶和f 1 酶( 二者均属于n o 二乙酰胞壁质酶) ， m a 酰胺酶及s a 、m l 、m r 内肽酶等。g h u y s 吼等人( 1 9 6 2 ) 利用m a 酰胺酶 确定了m 撇珩耙懈和s 口姗埘的细胞壁结构l ” s 口晒甜l a 7 菌株能够产生分解火落菌( 如植物乳酸杆菌) 的内n - 乙酰氨 基葡糖苷酶【l 】，这在分解细胞壁的糖苷酶中是很少见的。 h e y l i 咐等人( 1 9 7 5 ) 从一株扔榔的培养液中纯化出一种内- n 乙酰胞壁 质酶【2 5 】，这种酶与g 菌株产生的3 2 酶、f 1 酶不同，它能够作用于大肠杆菌， 已有人利用该酶处理a 族链球菌细胞壁制备多种免疫佐剂。 3 灰色链霉菌 譬妇嘲 研究较多的有s 3 5 菌株、h _ 4 0 2 菌株、p - 5 l 菌株和1 9 6 8 年w a r d 等人发现 的一株矿栅一”，1 9 8 8 年，z 捌c l l i u t e 等人也有s g r 加珊产溶菌酶的报道口日。 s 3 5 菌株产生的溶菌酶有两种，一种属n ，0 二乙酰胞壁质酶( f 2 酶) ，一 种是内肽酶( f 1 酶) 。其中m 1 酶分子量为5 5 ，o o o ，等电点5 3 ，最适p h 为7 0 ( 底 物为s 口埘淞完整菌体) ，可被1 m m o l l 的h 9 2 + 和o 5 舢o l l 的d f p 所抑制；f 2 山东大学硕士学位论文 酶与其他c h 型溶菌酶不同的是它不能分解膨枷o 如激f c 埘，其等电点为l o o ， 最适p h 为7 0 8 o ( 底物为口甜_ ；e 埘完整菌体) 【” h - 4 0 2 菌株产生内- n 乙酰胞壁质酶，属c 型，不能分解金葡，能作用于变 链球菌。分子量为2 3 ，o o o ，等电点为9 5 ，分解细胞壁最适p h 为6 o 【n p 5 1 菌株产生的溶菌酶仅对铜绿假单胞菌( 觑砌嗍d 麟钾n f 驴圮似) 有显 著的分解作用，属内n 乙酰胞壁质酶，但又与其他的该类酶不同。其分子量为 1 9 ，0 0 0 ，等电点9 8 1 1 1 。 w 硼等人( 1 9 6 8 ) 发现的最妇搬能够产生e 1 和e 2 两种酶，均为c h 型。 其中e 1 分子量l l ，8 0 0 ，等电点8 5 1 0 0 ；e 2 分子量1 3 ，5 0 0 ，等电点l o 左右， 分解& 口l 胖淞最适p h 为7 8 【1 1 。 最近一次对该菌株产溶菌酶的报道为1 9 8 8 年，础v i c h i u k 等人通过分级 沉淀的方法从一株s 栅淞发酵液中获得溶菌酶纯品，该酶溶菌谱较窄，对链 球菌、葡萄球菌活性较高，等电点为8 1 0 5 嗍 4 其他链霉菌 除上面的菌株之外，在红霉素链霉菌( & 叼砌胛淞) 、光滑( 制酵母) 链霉 菌( & 跆v d 廊) 、墨西菲链霉菌( s 腭c 的脑括) 、吸水链霉菌( s 咖c o p 缸锄) 以 及天蓝色链霉菌( s c 卯脆口 d ，) 中均有产溶菌酶的报道其中比较有趣的是， & 烨c 琚附括v 以西咖淞2 4 3 5 产生的溶菌酶系具有溶酵母菌、溶葡萄球菌及胞壁质 酶三种活力。而三种活力的比例却与该菌株利用不同碳源时的形态学类型有关， 尤其是后两种活力，只有在形态学i 型时，该菌株才有广泛的溶菌谱和较高的溶 葡萄球菌活力唧s c d p 抛d 口r 产生的溶菌酶( c e i l o s y l ) 分子量2 3 ，o o o ，等电点 大于1 0 ，是立体结构研究的最为详细的c h 型溶菌酶。 四，本课题立题依据及前景分析 溶菌酶，常狭义的认为就是n - 乙酰胞壁质酶，它作用于微生物细胞壁肽聚 糖分子的n 乙酰胞壁酸州a m ) l 位碳原子与n 乙酰葡糖胺( n a g ) 4 位碳原子之 间的p 1 4 糖苷键，造成细胞壁瓦解，从而溶解微生物，它在自然界中分布广泛， 从细菌噬菌体、细菌、真菌到植物以及高等哺乳动物，都有该种酶的存在，其在 生物体抵御外来微生物侵染方面发挥了关键作用，成为生物体自身防护体系的重 要组成部分从氨基酸组成、溶菌特异性及免疫学交叉反应等几个方面比较， 1 6 山东大学硕士学位论文 n 乙酰胞壁质酶可以分为4 类4 种类型的典型代表分别为鸡卵清溶菌酶( h 饥 e g g 砌t e1 y s o z y m e ，h e w l ) 、鹅卵清溶菌酶( 9 0 0 s ee g g 一d l i t el y s o 巧m e ，g e w l ) 、 细菌噬菌体t 4 溶菌酶( b a c t e i i o p h a g et 4l y 巧m e ，t 4 l ) 及拟内串生孢霉溶菌 酶( c h a l a r o p s i sl y 巧m e ，c h l ) 广义的溶菌酶应包括一切能溶解微生物的酶，包括内n 乙酰己糖胺酶( 常 说的胞壁质酶即属于此类酶) ，酰胺酶，内肽酶，肛1 4 、p 1 6 葡聚糖和甘露聚糖 酶，壳多糖酶。研究除胞壁质酶外的溶菌酶，不仅能提炼出作用位点不同的溶菌 酶，彻底降解微生物，在预防和治疗微生物感染，食品防腐等方面起重要作用， 而且研究这些酶能有助于我们了解各种微生物的细胞壁组成，微生物细胞壁的生 长分化以及微生物原生质体的制备等。 本实验室运用双层平板从土壤中分离得到两株能溶解变形链球菌的链霉菌， 经鉴定其中一株为球孢链霉菌，命名为sg f d 6 坪聊伽1 8 6 ，简写为s 1 8 6 1 2 8 】鲫， 一株为灰色链霉菌，命名为& g r 妇口淞1 0 6 ( 又名g 胁p 淞r x 一1 7 ) ，简写为s 1 0 6 【3 们。其中对s 1 0 6 的发酵产物进行分离，得到两种能溶解变形链球菌的成分r l ， r 2 ，在对发酵产物的分离过程中发现，层析的透过液中仍保留相当大的酶活性【3 i 】 【3 2 】，而且在已有的微生物产溶菌酶的报道中，所产的溶菌酶并非仅有胞壁质酶， 还包括内肽酶及酰胺酶等，本课题拟从s 1 0 6 和s 1 8 6 中( 由于s 1 0 6 的发酵产物 酶活性远高于s 1 8 6 ，所以本课题主要研究的对象为s 1 0 6 ) 克隆出溶菌酶的其他 组分，内肽酶及酰胺酶，并进行原核表达，得至4 有活性的内肽酶或酰胺酶。因为 有报道称，在微生物产的溶菌酶中，胞壁质酶产量最大，内肽酶次之【l 】【1 9 1 ，所以 本实验只克隆了内肽酶的全基因和原核表达。 随着生物技术( 特别是d n a 测序技术) 及信息资讯的迅速发展，各基因数 据库的信息量飞速增加，克隆出相关基因很大程度上不再需要很多的预备信息， 建库筛选，纯化出蛋白质再克隆基因，杂交筛选等传统的克隆基因的方法不仅耗 时耗力，在效果上也不尽人意。本实验克隆基因的思路为：先从蛋白质数据库中 找到相关蛋白质序列，找出较为保守的几个氨基酸序列，设计 c o d e h o p ( c on s l e n s 啦d e g e n e m t eh y b r i do l i g o n u c l e o t i d ep m n e r s ) 引物1 3 s 1 克隆出 基因的部分序列，再根据得到的序列运用t a i l p c r 克隆出基因的全长序列口3 1 。 飞速发展的蛋白质数据库为这种方法提供了足够的原材料，实验的结果也证实， 7 山东大学硕士学位论文 这种方法在克隆同源基因方面，效果显著，而且耗时较短，一两个星期的时间就 能得到基因的全长序列 从土壤中筛选出的产溶菌酶的微生物，通常进行发酵优化，再进行蛋白质纯 化得到电泳纯的蛋白质，进而研究该酶的性质，但是一方面，这种方法耗时很长， 耗费的材料也较多，另一方面，还得经过蛋白质的测序等方法确定其基因序列， 而且有些蛋白质即使通过优化发酵条件，也未必能得到大量的酶蛋白，特别是某 些对细胞有毒性的蛋白质，另外，如果需要克隆某些细胞内表达的蛋白质的基因， 这种方法就更有优势了目前，实验室从土壤中又筛选出了几株产溶菌酶的放线 菌和真菌，拟准备采用这种方法克隆出这几株菌中的胞壁质酶，酰胺酶和内肽酶 基因，并进行原核及真核表达，以期找出应用潜力最大的溶菌酶基因 此种克隆基因的方法有一不足之处就是，某些微生物中执行同一功能的酶基 因可能不止一种，在很多链霉菌中就纯化出了不止一种胞壁质酶，这在已经测序 的天蓝色链霉菌和阿维链霉菌中也可以发现，天蓝色链霉菌中存在三种可能的胞 壁质酶基因，阿维链霉菌中也存在两种可能的胞壁质酶嗍嘲，由于引物扩增的 偏向性，此种方法可能就遗漏掉一些同源酶基因，但是通过结合一种抑制性的 p c r 就可以解决这个问题闭该抑制性p c r 原理见图2 ，简并引物l ，2 为根据 蛋白质家族序列设计的引物，内部引物l ，2 的序列是根据已经克隆出来的同源 基因序列设计，5 端和简并引物l ，2 的3 端有3 5 b p 的序列重叠，且3 端 为氨基化，这样在p c r 扩增的过程中，高浓度的内部引物l ，2 结合在已知基因 序列上而使简并引物l ，2 和内部引物l ，2 不能扩增已知序列的区域，从而使可 能存在的另外一个同源基因被扩增出来。 吨茎! ! 塑! 内部引物l = = = = = 登坠 图2 抑制性p c r 原理示意图 h 2 n - 一 内部引物2 葡丽 山东大学确士学位论文 五，本课题的研究方法 文献报道的溶菌酶的组分包括胞壁质酶，a m 3 内肽酶和酰胺酶等，有几种 酶的基因序列已经报到，而且天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的基因组测序也已完 成，故我们准备通过c o d e h o p ( c o 心m s 睁d e g e l l 锄士eh 姗do l i g o n u c l e o t i d c p r i n l e 岱) 的方法设计简并引物来克隆溶菌酶系各酶基因的一部分，再通过 1 a i l p c r 等方法来克隆各酶全长的基因，以期克隆出s 1 8 6 和s 1 0 6 中的溶菌酶 基因。下面对这两种方法作一下介绍。 1 c o d e h o p 技术 c o d e h o pp c n c s 即嗣l 如e g c n 啪l ch y b r i do l i g o n u c i 虹d ep r i m c 鸺) 是一 种用来扩增某一蛋白质家族内未知成员基因片段的p c r 方法圈。它克服了利用 单纯的简并引物或专一性引物扩增未知基因片段的缺点，每个引物包括一个较短 的1 1 1 2 个碱基左右的37 端简并性核心区和一个较长的5 端专一性“c l a m p 区。c o d e h o p 引物和普通简并引物的区别见图3 。根据仅仅3 4 个高度保守的 氨基酸残基就足够用来设计3 端简并核心区。在引物与模板结合的过程中，由 于5 端“c 1 锄p 区的作用使核心区能够牢固地与模板结合。在扩增过程中，引 物可以通过5 端的c l 锄p 区与上一轮扩增的产物完全匹配结合，大大提高了扩 增的效率，尽可能少的3 端简并性碱基减少了引物中不同单个引物的数目，从 而提高了发挥作用的引物的浓度。较长的5 端“c l 锄p ”区使p c r 反应可以使用 较高的复性温度，而不会引起引物简并值的增加。这一引物设计方法可用在仅有 极短氨基酸序列可用来设计引物的情况下网【3 町 i ，| 姗啊柏啪呻伽童m 喇i 吲m a 虬卵嘶咄 ： 岁回匦里照二 c o 蜘陀r p i 嘲哟i c i 叩l 疵硼l c a l 如氧l 触蹦料a 毗 c 0 麟瑕s d c 酾料批+ a 锄mi 吣 ! 匠面面盘! n 电n 呻把m p i 棚喀l 嗽帕i 1 1 9 【胡l 白t ，c f